对经历电活动改变的单条活体斑马鱼骨骼肌生长进行实时和重复测量

摘要

斑马鱼在细胞生物学和生理学研究中具有显著的光学透明优势。本文描述了在个体动物中测量细胞生长的可靠方法，这些方法能够提供新的见解，揭示骨骼肌及邻近组织的生长如何与整体身体生长相协调。

摘要

有多种方法可用于在活体斑马鱼胚胎、幼虫或幼鱼的全身中观察单个细胞。我们展示了一种方法：利用共聚焦激光扫描显微镜对质膜带有荧光标记的活鱼进行扫描，以测定肌肉组织的体积以及存在的肌纤维数量。文中描述并验证了在活体动物中随时间推移测量细胞数量和大小的有效方法，其结果与更为繁琐的分割方法相比具有一致性。同时介绍了可调控肌肉电活动（从而调控收缩活动）的技术。骨骼肌收缩活动的丧失会显著降低肌肉的生长。在幼虫阶段，文中描述了一种允许重新引入模式化电刺激诱导收缩活动的方案。所描述的方法可最大限度地减少个体间差异的影响，从而能够在活体生物背景下分析电刺激、遗传因素、药物或环境刺激对多种细胞和生理生长参数的影响。此外，还可对个体在生命早期接受特定干预后的长期效应进行追踪观察。

引言

受调控的组织生长，包括细胞数量的增加（增生）和/或细胞体积的增大（肥大），是发育、再生以及生态和进化适应过程中的关键因素。尽管近几十年来在细胞和发育生物学的分子遗传学方面取得了巨大进展，但对组织和器官大小调控机制的理解仍处于初级阶段。造成这一知识空白的原因之一，是在活体生物中以必要的空间和时间精度量化组织生长存在困难。

整个生物体生长的各个方面均可随时间进行重复测量，从而揭示每个个体的生长曲线^1,2,3,4,5。日益精密的扫描方法，如双能X射线吸收测定法（DXA）、计算机断层扫描（CT）和磁共振成像（MRI），使得在单个个体（包括人类和模式生物）中追踪整个器官及其他身体区域（例如特定的骨骼肌）的生长成为可能^6,7,8,9,10。然而....

方案

所述所有研究均按照英国动物科学程序法（1986年）及其后续修订的规定，在符合机构指南并获得英国英国内政部适当许可的情况下进行。胚胎/幼虫应在完成原肠胚形成前于28.5 °C下培养，之后可置于22–31 °C环境中以调控发育速度。鱼类可在室温下进行扫描或刺激处理。

1. 麻醉斑马鱼幼体

1. 将合适的荧光报告基因成年鱼（如 Tg(Ola.Actb:Hsa.HRAS-EGFP)^vu119Tg 参考文献³⁶ 或 Tg(α-actin:mCherry-CAAX)^pc22Tg 参考文献³⁷）进行杂交，并按文献所述方法收集胚胎³⁸。
2. 在选定时间点（例如受精后2天（dpf）），使用含Tricaine的鱼类培养液（鱼用清水或E3培养基）短暂麻醉胚胎，并在荧光显微镜（如Leica MZ16F）下筛选表达EGFP或mCherry的胚胎。若胚胎数量较多，应选择荧光信号最强的个体。筛选后立即将胚胎放回正常的鱼类培养液中。

2. 共聚焦扫描用鱼类样本的制备

1. 打开共聚焦激光扫描....

结果

一种快速且精确的体节体积测量方法
本文描述了一种样本制备、数据采集和体积分析的方法，可用于快速测量斑马鱼幼体的肌肉生长。通过在血浆膜上标记膜靶向的GFP（β-actin:HRAS-EGFP）或mCherry（α-actin:mCherry-CAAX）的鱼类，可在活体动物中测量肌肉大小。实验中，将幼鱼短暂麻醉于三卡因中，包埋于低熔点琼脂糖内，并通过共聚焦荧光显微镜成像。选择体节17进行肌肉大小分析，因其位于躯干与尾部交界处，易于观察³¹。在实际操作和理论基础上，肌节体积可通过肌节长度（L）与三个横截面积（CSA）测量值的平均数的乘积来计算（图2A，该方法称为四切片法）。

为验证该方法，获取了活体斑马鱼幼鱼的体节全层共聚焦 Z-堆栈图像（图2B），并通过将每一片层中第17体节轮廓面积之和（80–100片层）乘以片层间距（1–1.......

讨论

本文报道了一种准确且高效估算活体斑马鱼幼虫肌肉体积的方法，适用于色素沉积对成像影响较小的发育阶段或遗传变异体，且在短暂麻醉和/或固定处理耐受性良好的情况下使用。尽管我们采用了激光扫描共聚焦显微镜，但所描述的方法同样适用于转盘共聚焦显微镜、光片显微镜，以及任何能够生成不同焦平面图像堆栈的技术。文中介绍了一系列逐步精细化的组织大小与细胞含量估算方法，每种方法均有其优势与局限性，且这些优缺点可被量化评估。研究组织生长的一个主要限制在于难以实时分析生长变化，因为生长速率会随着急性施加刺激所引发的一系列分子或亚细胞事件而动态改变。此外，在比较不同个体时，个体间差异可能带来分析难题。本方法可在单个活体个体中实现对不足一天时间内的组织生长进行测量，该方法的应用甚至可设想扩展至分钟级的时间尺度。

所述方法使得此前难以实现的分析成为可能。使用4切片法，经过培训的操作人员可在约1小时内完成约20条鱼样本的肌肉生长检测成像部分。这与传统的全堆栈法形成鲜明对比，后者处理相同数量的鱼至少需要3小时（即耗时长三倍）。若后续亚细胞分析需要高分辨率图像，全堆栈法每条鱼可能轻易耗时30分钟，使得对处于相似发育阶段的.......

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
粘合剂，Blu Tack	Bostik	-	-
气溶胶真空泵	-	-	-
琼脂糖	Sigma-Aldrich	A9539	-
低凝胶温度琼脂糖	Sigma-Aldrich	A9414	熔化后，需在恒温金属浴中保持 37oC，以维持液态，便于重复使用。
恒温金属浴	Cole-Parmer	SBH130	-
BODIPY FL C5-神经酰胺	Thermo Scientific	D3521	需用鱼用培养液稀释，终浓度为 5 µM，用于过夜孵育。
鳄鱼夹及导线	-	-	-
Fiji/ImageJ	美国国立卫生研究院（NIH）	-	-
鱼用培养液，鱼用清水	-	-	从鱼类饲养系统中收集的循环用水。
鱼用培养液，E3 培养液	-	-	E3 培养液的配方见《斑马鱼手册》（The Zebrafish Book）。http://zfin.org（含 5 mM NaCl、0.17 mM KCl、0.33 mM CaCl2 和 0.33 mM MgSO4 ，溶于蒸馏水中）。
荧光显微镜	Leica	Leica MZ16F	其他类型的荧光显微镜也可适用。
玻璃针	World Precision Instruments, Inc.	1B100-6	需经火焰抛光，以避免操作过程中损伤胚胎。
电刺激仪	Grass Instruments	S88	其他类型的电刺激仪也可适用。
Kimwipes，精密擦拭纸巾	Kimberly-Clark Professional	13258179	-
激光扫描显微镜（LSM）	Zeiss	Zeiss LSM 5 Exciter Zeiss LSM 880	其他类型的激光扫描显微镜也可适用。
Nunc 细胞培养处理 6 孔板	Thermo Scientific	140675	-
物镜，20×/1.0W 水浸	Zeiss	-	-
巴斯德移液管，1 mL 刻度	Starlab Group	E1414-0100	-
巴斯德移液管，1 mL 微细尖头	Starlab Group	E1414-1100	-
培养皿，60 mm	Sigma-Aldrich	P5481	-
质粒，CMV-Cerulean	Christina L. Hammond（布里斯托大学）		在单细胞期注射 pCS2+_cerulean_kanR 质粒，剂量为 25–75 pg。  引用文献：Bussman J, Schulte-Merker S. (2011) Development 138:4327-4332. doi: 10.1242/dev.068080。
质粒，pCS-mCherry-CAAX	Henry Roehl（谢菲尔德大学）	-	用于 SP6 启动子介导的体外转录（也可使用含其他膜标记的质粒）； 合成带帽的 mRNA，在单细胞期注射，剂量为 100–200 pg。
脉冲控制器	Hoefer Scientific Instruments	PC750	-
电烙铁	-	-	-
三卡因	Sigma-Aldrich	E10521	乙基-3-氨基苯甲酸甲磺酸盐 / MS-222；需溶于鱼用培养液中，使用浓度为 0.6 mM。
Volocity	Perkin Elmer/Quorum Technologies Inc	-	-
钟表匠镊子，No. 5	-	-	-
铂丝	Goodfellow	PT005142/12	直径 0.40 mm；为银丝的昂贵替代品。
银丝	Acros Organics	317730010	直径 0.25 mm（已测试多种直径，如 0.25–0.5 mm，结果相似）。
斑马鱼，myog:H2B-mRFP	David M. Langenau（麻省总医院；哈佛干细胞研究所）	-	ZFIN 官方名称：Tg(myog:Hsa.HIST1H2BJ-mRFP), fb121Tg。  http://zfin.org/ZDB-ALT-160803-2  引用文献：Tang Q, Moore JC, Ignatius MS, Tenente IM, Hayes MN, Garcia EG, Torres Yordán N, Bourque C, He S, Blackburn JS, Look AT, Houvras Y, Langenau DM. 将肿瘤细胞移植至光学透明的免疫缺陷斑马鱼后观察细胞异质性。Nat Commun. 2016 Jan 21;7:10358. doi: 10.1038/ncomms10358。
斑马鱼，α-肌动蛋白:mCherry-CAAX	Peter D. Currie（澳大利亚再生医学研究所，蒙纳士大学）	-	ZFIN 官方名称：Tg(actc1b:mCherry-CAAX), pc22Tg。  http://zfin.org/ZDB-ALT-150224-2 引用文献：Berger J, Tarakci H, Berger S, Li M, Hall TE, Arner A, Currie PD. 斑马鱼 träge 突变体中 Tropomodulin4 的缺失导致细胞质棒状结构形成及肌肉无力，类似杆状体肌病。Dis Model Mech. 2014 Dec;7(12):1407-15. doi: 10.1242/dmm.017376。
斑马鱼，β-肌动蛋白:HRAS-EGFP	-	-	ZFIN 官方名称：Tg(Ola.Actb:Hsa.HRAS-EGFP), vu119Tg。http://zfin.org/ZDB-ALT-061107-2  引用文献：Cooper MS, Szeto DP, Sommers-Herivel G, Topczewski J, Solnica-Krezel L, Kang HC, Johnson I, Kimelman D. 利用 BODIPY TR 甲酯染料作为 GFP 的活体复染剂，在转基因斑马鱼胚胎中可视化形态发生过程。Dev Dyn. 2005 Feb;232(2):359-68. doi: 10.1002/dvdy.20252。
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