本方案描述了从人血浆中富集星形胶质细胞来源的细胞外囊泡（ADEVs）的方法。该方法基于通过聚合物沉淀分离细胞外囊泡，随后利用ACSA-1进行ADEVs的免疫捕获。对ADEVs的分析可能为研究活体患者炎症通路的变化提供线索，并可通过液体活检实现无创检测。
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摘要
摘要
细胞外囊泡（EVs）是由所有细胞分泌的生物纳米颗粒，参与细胞间通讯和废物清除。在生理和病理条件下，EVs通过将其携带的分子 cargo 传递给其他细胞，介导多种生物学功能。由于EVs存在于各种生物体液中，因此是研究疾病过程的宝贵资源，可被视为用于生物标志物发现的液体活检。EV分析的一个显著优势在于，可根据其来源细胞的特异性标记物对EVs进行筛选，从而使其携带的内容物反映特定组织的微环境状态。然而，目前EV分离技术面临的主要挑战之一是缺乏统一的方法学共识和标准化操作流程。星形胶质细胞是一类在大脑中发挥关键作用的胶质细胞。在神经退行性疾病中，星形胶质细胞的反应性改变可能导致EV cargo 异常以及细胞间通讯紊乱，进而促进或加剧疾病进展。因此，对星形胶质细胞来源的EVs（ADEVs）进行分析，有助于发现潜在的生物标志物和治疗靶点。本实验方案描述了一种从人血浆中富集星形胶质细胞来源EVs（ADEVs）的两步法。首先，从去纤维蛋白原血浆中富集EVs 通过 基于聚合物的沉淀法。随后通过基于ACSA-1的免疫捕获结合磁性微珠对星形胶质细胞来源的细胞外囊泡（ADEVs）进行富集，即将重悬的细胞外囊泡（EVs）加载至置于磁场中的层析柱中。磁性标记的ACSA-1阳性EVs被截留在柱内，而其他EVs则流穿。当将层析柱移出磁场后，ADEVs被洗脱，即可用于储存和分析。为验证星形胶质细胞标志物的富集效果，可在洗脱液和流穿液中检测胶质纤维酸性蛋白（GFAP）或其他来源于细胞内的特异性星形胶质细胞标志物，并进行比较。本方案提出了一种简便、省时的方法，用于从血浆中富集ADEVs，可作为检测与星形胶质细胞相关标志物的研究平台。
引言
细胞外囊泡（EVs）是一类由所有类型细胞分泌的、具有异质性的膜性纳米颗粒，携带蛋白质、脂质和核酸1。根据其来源位置的不同，主要EV类型包括微囊泡（100–1000 nm）、外泌体（30–100 nm）和凋亡小体（1000–5000 nm）2,3。EVs调控多种重要的生理过程，例如抗原呈递和免疫应答4、受体再循环、代谢物清除5以及细胞间通讯6。这些过程的调控可通过EV细胞膜中富集的蛋白质与靶细胞中的目标分子直接结合实现，和/或通过将内容物内化并释放到受体细胞的细胞质中来完成7。尽管EVs执行重要的细胞功能，但在癌症和神经科学等病理学领域，它们正受到越来越多的关注。事实上，多项研究表明，EVs可促进肿瘤细胞迁移8,9，或在阿尔茨海默病等神经退行性疾病中播毒性蛋白聚集体10,11。
可以根据与EVs....
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方案
本方案所述研究使用了来自西班牙巴塞罗那圣保罗神经退行性疾病倡议队列（SPIN队列）的健康成年男女捐赠者的血浆样本（年龄范围65.9–81.3岁，女性占45.5%）36参与者均签署了知情同意书。本研究遵循《赫尔辛基宣言》中规定的国际医学研究伦理准则及西班牙法律。圣保罗研究伦理委员会（CEIC）已审查并批准了来自SPIN队列的人体血浆样本采集与储存方案（#16/2013）。
1. 从人血浆中富集星形胶质细胞EVs
注意：本方案涉及人源血浆样本的使用。本方案中所用试剂和实验材料的所有详细信息均包含在材料表中。本实验无需特殊设备，但请参照各生产商提供的说明，仔细查阅每种试剂的安全使用注意事项。
- 样本采集与保存
- 使用紫色EDTA真空采血管，按照血浆采集的标准操作规程采集血液36,37. 以 2000 x g 10 min 4 °C 采集后30-120分钟内进行血浆分离。分离上层澄清的液体部分，即血浆，作为上清液置于 500 µL 等分试样
- 为去除细胞碎片，将等分试样在3000 x g下离心
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结果
从健康供体采集的血浆中成功分离出ADEVs。采用基于聚合物的沉淀法获得总EV组分，随后使用磁性微珠进行免疫捕获以获得ADEVs。
在免疫捕获步骤之前，对总EV组分进行的蛋白质印迹分析表明，EV制备物中不存在钙联蛋白（细胞污染标志物），但含有Alix和跨膜蛋白CD9（图2A）。
免疫捕获后，对ADEV组分中囊泡和星形胶质细胞标志物的存在及富集情况进行验证。与无ADEV组分（流穿组分）相比，ADEV中GFAP浓度显著升高，富集达六倍（p = 0.008），证实ADEV组分中的细胞外囊泡主要来源于星形胶质细胞（图2B）。对10个相同样本制备的ADEV中GFAP定量结果的变异系数（CV）为25%。
为了确认ADEV制备物中囊泡标志物的存在，检测了两种标志物：Alix，一种经典的胞质囊泡标志物42以及跨膜蛋白CD81.......
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讨论
细胞外囊泡（EVs）因其在诊断和治疗方面的潜力而在生物医学研究中受到广泛关注。目前，EV分离方法面临的主要障碍之一是缺乏方法学共识和标准化的操作流程。本研究提供了一种从人血浆中富集星形胶质细胞来源EV的详细实验方案。 通过 基于聚合物的沉淀法和GLAST免疫捕获
从体液中分离细胞外囊泡（EVs）存在多种方法，每种方法都有其自身的优缺点。本研究选择基于聚合物的方法，因其操作简单、易于使用、耗时短、无需特殊仪器、EV得率高，且该方法在神经学领域的EV生物标志物研究中被广泛应用12,18,19,20，有利于结果的比较。然而，也可尝试其他方法，例如尺寸排阻色谱法。基于聚合物的方法常受到的一个批评是脂蛋白会与EV共同沉淀。但通过使用ACSA-1抗体进行额外的免疫捕获步骤以及后续的洗涤，可以选择性地结合星形胶质细胞来源的E.......
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披露
Belbin 博士报告在提交的工作之外，从 ADx NeuroSciences 获得个人费用。Alcolea 博士报告在提交的工作之外，因担任 Fujirebio-Europe、Roche、Nutricia、Krka Farmacéutica、Zambon S.A.U. 和 Esteve 的顾问委员会成员和/或演讲酬金而获得个人费用。Lleó 博士在提交的工作之外，曾担任 Fujirebio-Europe、Roche、Biogen、Grifols 和 Nutricia 的顾问或顾问委员会成员。Fortea 博士报告在提交的工作之外，因在 AC Immune、Novartis、Lundbeck、Roche、Fujirebio 和 Biogen 的顾问委员会、裁决委员会任职或获得演讲酬金而收取个人费用。Alcolea、Belbin、Lleó 和 Fortea 博士报告持有神经退行性疾病突触病变标志物的专利（已授权给 ADx，专利号 EPI8382175.0）。未报告其他利益冲突。其余所有作者均无其他事项需要披露。
致谢
作者谨此感谢Soraya Torres、Shaimaa El Bounasri El Bennadi和Oriol Sanchez Lopez在样品处理与制备方面的协助。同时感谢来自ICTS的José Amable Bernabé的合作。 "NANBIOSIS"，第6单元（生物工程、生物材料领域CIBER单元） & 纳米医学）的 Marti de Cabo Jaume（巴塞罗那自治大学电子显微镜中心），Sant Pau 生物医学研究所（IIB-Sant Pau）流式细胞术平台的 Marta Soler Castany 博士和 Lia Ros Blanco，以及 IIB-Sant Pau 脂质相关疾病病理生理学研究组的 Joan Carles Escolà-Gil 博士，分别在纳米颗粒追踪分析（NTA）、冷冻电镜（cryo-EM）、Luminex 和载脂蛋白 B（ApoB）检测方面提供的帮助。
作者感谢以下机构提供的经费支持：Jérôme Lejeune 基金会（项目 #1941 和 #1913 资助 MFI 和 MCI）、Carlos III 健康研究所（PI20/01473 资助 JF，PI20/01330 资助 AL，PI18/00435 资助 DA，INT19/00016 资助 DA）、美国国立卫生研究院（1R01AG056850-01A1、R21AG056974 和 R01AG061566 资助 JF）、阿尔茨海默病协会与全球脑健康研究所（GBH....
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 用于 Western blotting 的抗 Alix 一抗 | EMD Millipore | ABC40 | |
| µMACS 分离器 | Miltenyi Biotec | 130-042-602 | 的 µMACS 分离器需与以下组件联合使用 µ 柱和 MACS MicroBeads。 |
| 用于 Western 印迹法的抗钙联蛋白一抗 | Genetex | GTX109669 | |
| 用于 Western blot 的抗 CD9 一抗 | 细胞信号传导 | 13174 | |
| 10% BSA 封闭液 200 mL | 赛默飞世尔科技 | 37525 | |
| Bransonic 1510E-MT 超声波清洗仪 | 布拉森 | ||
| COBAS 6000 全自动分析仪 | 罗氏诊断 | 用于载脂蛋白B免疫比浊测定的分析仪；商用全自动分析仪 | |
| cOmplete蛋白酶抑制剂混合物（无EDTA） | 罗氏 | 11873580001 | |
| Digital Micrograph 1.8 | 显微图像软件 | ||
| 杜氏磷酸盐缓冲液（不含 Mg++ 和 Ca++），500 mL | 赛默飞世尔科技 | 14190144 | |
| EveryBlot 封闭缓冲液 | BioRad | 12010020 | |
| Exoquick（外泌体沉淀溶液 5 mL）+ 凝血酶 | System Bioscience | EXOQ5TM-1 | ExoQuick 20 mL 也可单独购买（EXOQ20A-1） |
| Gatan 895 USC 4000 | 相机 | ||
| GeneGnome XRQ 化学发光成像系统 | Syngene | ||
| 人CD81抗原（CD81）ELISA试剂盒 | Cusabio | CSB-EL004960HU | |
| 人程序性细胞死亡6相互作用蛋白（PDCD6IP）ELISA试剂盒 | Cusabio | CSB-EL017673HU | |
| 免疫印迹PVDF膜 | BioRad | 1620177 | |
| JEOL 2011 透射电子显微镜 | 日本电子株式会社 | 配备有 Gatan 895 USC 4000 CCD 相机 （Gatan 626，Gatan，Pleasanton，USA） | |
| Lavender EDTA BD Vacutainer K2E 管 | Becton Dickinson | 367525 | |
| Leica EM GP | 徕卡显微系统 | 商用浸入式冷冻仪 | |
| 低吸附微量离心管 1.5 mL | Deltalab | 4092.3NS | |
| MACS µ 带有活塞的柱子 | Miltenyi Biotec | 130-110-905 | µ 带有活塞的柱子专为从体液中分离外泌体而设计 |
| MACS 多通道支架 | Miltenyi Biotec | 130-042-303 | |
| MAGPIX 酶标仪 | Luminex Corporation | 80-073 | Luminex xMAP 多重分析仪（Luminex xPonent v 4.3 软件） |
| MicroBead 试剂盒100 μL 抗GLAST（ACSA-1）-生物素，人源，小鼠，大鼠 – 小尺寸；100 μL 抗生物素微珠 | Miltenyi Biotec | 130-095- 825 | |
| MILLIPLEX MAP 试剂盒 人类细胞因子/趋化因子/生长因子磁珠检测面板A | EMD Millipore | HCYTA-60K-25 | |
| M-PER 哺乳动物蛋白提取试剂 25 mL | 赛默飞世尔科技 | 78503 | 对于某些应用，如蛋白质印迹，可使用更强效的裂解缓冲液（例如 RIPA） |
| MultiSkan SkyHigh 微孔板分光光度计 | 赛默飞世尔科技 | A51119500C | |
| NanoSight NS300 | 马尔文帕纳科 | NTA；3.4 版本 | |
| Pierce Halt 蛋白酶和磷酸酶抑制剂混合液 | 赛默飞世尔科技 | 78441 | |
| 聚丙烯注射器（G29） | PeroxFarma | 1 mL 注射器；0.33×12 mm-G29×1/2" | |
| 二抗（抗兔） | 赛默飞世尔科技 | 10794347 | |
| Simoa GFAP 发现试剂盒 | Quanterix | 102336 | |
| Simoa SR-X 仪器 | Quanterix | SR-X 超灵敏生物标志物检测系统；商用生物标志物检测技术 | |
| 载脂蛋白B特异性蛋白检测 - APOB（100次检测）COBAS C/CI | 罗氏诊断 | 3032574122 | |
| SuperSignal West Femto | 赛默飞世尔科技 | 34095 | 超灵敏增强型化学发光（ECL）HRP底物 |
| Trans-Blot Turbo 转膜系统 | BioRad | 1704150 |
参考文献
- Pathan, M., et al. Vesiclepedia 2019: a compendium of RNA, proteins, lipids and metabolites in extracellular vesicles. Nucleic Acids Research. 47, 516-519 (2019).
- Raposo, G., Stoorvogel, W. Extracellular vesicles: Exo....
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