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方法文章

从人血浆中富集星形胶质细胞来源的细胞外囊泡

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DOI：

10.3791/64107

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2022年8月3日

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1Sant Pau Memory Unit, Department of Neurology, Hospital de la Santa Creu i Sant Pau, Biomedical Research Institute Sant Pau, Universitat Autònoma de Barcelona, 2Center of Biomedical Investigation Network for Neurodegenerative Diseases (CIBERNED), 3Movement Disorders Unit, Department of Neurology, Hospital de la Santa Creu i Sant Pau, 4Department of Endocrinology and Nutrition, Hospital Clínic de Barcelona, August Pi i Sunyer Biomedical Research Institute - IDIBAPS, 5Spanish Biomedical Research Network in Physiopathology of Obesity and Nutrition (CIBEROBN)

本文内容

摘要

本方案描述了从人血浆中富集星形胶质细胞来源的细胞外囊泡（ADEVs）的方法。该方法基于通过聚合物沉淀分离细胞外囊泡，随后利用ACSA-1进行ADEVs的免疫捕获。对ADEVs的分析可能为研究活体患者炎症通路的变化提供线索，并可通过液体活检实现无创检测。

摘要

细胞外囊泡（EVs）是由所有细胞分泌的生物纳米颗粒，参与细胞间通讯和废物清除。在生理和病理条件下，EVs通过将其携带的分子 cargo 传递给其他细胞，介导多种生物学功能。由于EVs存在于各种生物体液中，因此是研究疾病过程的宝贵资源，可被视为用于生物标志物发现的液体活检。EV分析的一个显著优势在于，可根据其来源细胞的特异性标记物对EVs进行筛选，从而使其携带的内容物反映特定组织的微环境状态。然而，目前EV分离技术面临的主要挑战之一是缺乏统一的方法学共识和标准化操作流程。星形胶质细胞是一类在大脑中发挥关键作用的胶质细胞。在神经退行性疾病中，星形胶质细胞的反应性改变可能导致EV cargo 异常以及细胞间通讯紊乱，进而促进或加剧疾病进展。因此，对星形胶质细胞来源的EVs（ADEVs）进行分析，有助于发现潜在的生物标志物和治疗靶点。本实验方案描述了一种从人血浆中富集星形胶质细胞来源EVs（ADEVs）的两步法。首先，从去纤维蛋白原血浆中富集EVs 通过 基于聚合物的沉淀法。随后通过基于ACSA-1的免疫捕获结合磁性微珠对星形胶质细胞来源的细胞外囊泡（ADEVs）进行富集，即将重悬的细胞外囊泡（EVs）加载至置于磁场中的层析柱中。磁性标记的ACSA-1阳性EVs被截留在柱内，而其他EVs则流穿。当将层析柱移出磁场后，ADEVs被洗脱，即可用于储存和分析。为验证星形胶质细胞标志物的富集效果，可在洗脱液和流穿液中检测胶质纤维酸性蛋白（GFAP）或其他来源于细胞内的特异性星形胶质细胞标志物，并进行比较。本方案提出了一种简便、省时的方法，用于从血浆中富集ADEVs，可作为检测与星形胶质细胞相关标志物的研究平台。

引言

细胞外囊泡（EVs）是一类由所有类型细胞分泌的、具有异质性的膜性纳米颗粒，携带蛋白质、脂质和核酸1。根据其来源位置的不同，主要EV类型包括微囊泡（100–1000 nm）、外泌体（30–100 nm）和凋亡小体（1000–5000 nm）2,3。EVs调控多种重要的生理过程，例如抗原呈递和免疫应答4、受体再循环、代谢物清除5以及细胞间通讯6。这些过程的调控可通过EV细胞膜中富集的蛋白质与靶细胞中的目标分子直接结合实现，和/或通过将内容物内化并释放到受体细胞的细胞质中来完成7。尽管EVs执行重要的细胞功能，但在癌症和神经科学等病理学领域，它们正受到越来越多的关注。事实上，多项研究表明，EVs可促进肿瘤细胞迁移8,9，或在阿尔茨海默病等神经退行性疾病中播毒性蛋白聚集体10,11。

可以根据与EVs起源细胞相关的细胞表面标志物，从生物体液中选择并富集EVs，从而使其携带的内含物反映特定组织的微环境12,13,14,15,16,17,18,19,20。此外，由于EVs存在于血液、脑脊液（CSF）、唾液、尿液和乳汁中，因此它们是一种极佳的非侵入性诊断工具，可用于生物标志物的发现，可被视为一种液体活检。这一点在神经科学领域尤为重要，因为除脑脊液外，其他易获取体液中难以检测到脑源性分析物。

星形胶质细胞因其处于神经-血管通讯的关键位置而日益受到关注21。在生理条件下，星形胶质细胞负责维持血脑屏障、神经递质的回收、向神经元及其他胶质细胞提供营养物质和生长因子22,23,24，以及参与神经免疫防御，这得益于其在促炎状态与抗炎状态之间相互转换的代谢可塑性25,26,27。星形胶质细胞实现其调控功能的重要机制之一是通过细胞外囊泡（EVs）进行通讯28,29。反应性星形胶质增生是多种神经退行性疾病的关键特征，例如阿尔茨海默病30、多系统萎缩（MSA）、进行性核上性麻痹（PSP）31和肌萎缩侧索硬化症（ALS）32。星形胶质细胞的活化可能导致EV内容物的改变、炎性介质的释放以及细胞间通讯异常，从而促进病理过程的扩散并导致神经元退行性变10,11。因此，研究星形胶质细胞来源的细胞外囊泡（ADEVs）及其内容物的变化，为以非侵入性方式探究神经退行性过程提供了有价值的途径。

目前，存在多种用于分离细胞外囊泡（EVs）的方法，每种方法都有其相应的优缺点33。必须根据特定研究的最终应用目的，评估哪种方法更为合适。在神经科学领域，尤其是星形胶质细胞研究中，基于聚合物的沉淀法结合免疫捕获是目前主要采用的方法12,18,19,20,34。然而，即使采用相同的方法，不同研究在EV分离的具体操作步骤上仍存在异质性。因此，亟需一种清晰、逐步标准化的操作流程，以促进星形胶质细胞EV的研究并提高研究的可重复性。基于聚合物的沉淀法因其操作快速、简便，无需复杂设备，且能获得较高产量的EVs而不影响其生物学活性，因而有利于生物标志物的筛选35。

本方案介绍了一种从人血浆中富集星形胶质细胞来源的细胞外囊泡（ADEVs）的详细、简便的两步法。该方法首先通过聚合物沉淀法富集总的细胞外囊泡（EV）组分，随后利用免疫捕获技术分离星形胶质细胞来源的EV。鉴于星形胶质细胞在中枢神经系统中的重要功能，对ADEVs的分析可能有助于发现可通过无创方式研究的生物标志物及脑内炎症相关通路。

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方案

本方案所述研究使用了来自西班牙巴塞罗那圣保罗神经退行性疾病倡议队列（SPIN队列）的健康成年男女捐赠者的血浆样本（年龄范围65.9–81.3岁，女性占45.5%）36参与者均签署了知情同意书。本研究遵循《赫尔辛基宣言》中规定的国际医学研究伦理准则及西班牙法律。圣保罗研究伦理委员会（CEIC）已审查并批准了来自SPIN队列的人体血浆样本采集与储存方案（#16/2013）。

1. 从人血浆中富集星形胶质细胞EVs

注意：本方案涉及人源血浆样本的使用。本方案中所用试剂和实验材料的所有详细信息均包含在材料表中。本实验无需特殊设备，但请参照各生产商提供的说明，仔细查阅每种试剂的安全使用注意事项。

  1. 样本采集与保存
    1. 使用紫色EDTA真空采血管，按照血浆采集的标准操作规程采集血液36,37. 以 2000 x g 10 min 4 °C 采集后30-120分钟内进行血浆分离。分离上层澄清的液体部分，即血浆，作为上清液置于 500 µL 等分试样
    2. 为去除细胞碎片，将等分试样在3000 x g下离心 g 室温下静置15分钟。收集上清液。将血浆储存在-80 °C 直至分析前均应妥善保存。与生物流体分析的常规做法一致，样品在储存前应分装成等份，并避免经历超过三次的冻融循环。
  2. 总细胞外囊泡富集
    注意：所有使用的试剂必须通过过滤处理 0.22 µm 滤膜
    1. 解冻 500 µL 血浆样本。以1:100的比例加入凝血酶以去除凝固因子。轻轻倒置混匀三次，室温静置5分钟。
    2. 用Dulbecco's磷酸盐缓冲液（DPBS）工作液（DPBS + 3倍浓缩蛋白酶抑制剂混合液，由10倍浓缩原液稀释而成）定容至1 mL，颠倒混匀。
    3. 将样品在6000 x g 20 分钟 4 °C收集上清液，用DBPS工作液定容至1 mL。
    4. 添加 252 µL 加入EV沉淀溶液，颠倒混匀三次。4°C孵育 4 °C 60 分钟。
    5. 将样品在1500 x g条件下离心 g 20 分钟 4 °C 沉淀总EV组分（沉淀物）。收集1 mL上清液，将该组分标记为EV耗竭血浆，用作EV富集标志物的阴性对照（无EVs），并储存于-80 °C.
    6. 将剩余沉淀物在1500 x g下离心 g 5 分钟 4 °C弃去剩余上清液。将沉淀重悬于 500 µL 含蛋白酶和磷酸酶抑制剂的超纯水（终浓度为3倍稀释，由100倍母液稀释而来，参见 材料表).
    7. 用力吹打混匀以松动沉淀，避免产生泡沫；涡旋振荡，并在室温下于旋转摇床中振荡30分钟，直至完全重悬。确保沉淀完全重悬，此步骤对后续免疫捕获至关重要。
  3. ADEVs的免疫捕获
    注意：ADEVs 携带星形胶质细胞标志物。用于 ADEV 富集的选定标志物 通过 免疫捕获靶标为GLAST。GLAST即谷氨酸-天冬氨酸转运蛋白（UniProtKB-P43003），是小脑和大脑新皮层中星形胶质细胞主要表达的最丰富的谷氨酸转运蛋白。38抗GLAST抗体（ACSA-1，星形胶质细胞表面抗原-1）特异性识别GLAST的胞外表位，可用于星形胶质细胞的鉴定。该抗体是目前从人血浆中免疫捕获星形胶质细胞来源的细胞外囊泡（ADEVs）最常用的靶点。12,20,34.
    1. 添加 10 µL 向每份含有总EV制备物的样品中加入抗GLAST（ACSA-1）生物素化抗体。充分轻柔混匀，于室温孵育1小时 4 °C 在旋转管式摇床上。
    2. 添加 10 µL 磁珠与单克隆抗生物素抗体（小鼠IgG1）偶联。充分轻柔混匀，于4℃孵育1小时 4 °C 在旋转管式摇床上。
    3. 将微型柱置于MACS分离器的磁场中。用以下溶液冲洗微型柱以进行预处理 500 µL PBS-0.5% 牛血清白蛋白（BSA）溶液的滤过液弃去。
    4. 将EV/ACSA-1/微珠悬浮液上样至柱中。此步骤中切勿用推杆推动。收集穿流液，标记为非星形胶质细胞EVs（No ADEVs），必要时作为对照保存。
    5. 用洗涤缓冲液洗涤柱子两次 500 µL 加入 PBS-0.5% BSA 溶液，弃去穿流液。
    6. 从磁力架上取下色谱柱，放入低吸附性的1.5 mL收集管中。用移液器吸取 500 µL 加入 PBS-0.5% BSA 溶液至柱中，用推杆用力推动，收集洗脱液。
    7. 标记为 ACSA-1+ EVs（ADEVs）。将未裂解的EVs储存于 -20 °C 短时间或在 -80 °C 更长时间>6个月）。
      注意：抗ACSA-1抗体会与GLAST-1/EAAT-1表位结合。磁性微珠可特异性结合抗ACSA-1-细胞外囊泡复合物。MACS微型柱含有优化的基质，当置于磁场中时可产生强磁场，用于截留标记的ADEVs。
      有关ADEV富集步骤的示意图，请参见 图1.
  4. 细胞外囊泡的裂解
    注意：为了检测囊泡内标志物，必须彻底裂解细胞外囊泡（EVs）。建议采用两种连续的裂解方法，例如先化学裂解再机械裂解。
    1. 通过加入蛋白提取试剂对细胞外囊泡（EVs）进行化学裂解（参见 材料表比例中的） 100 µL 每样本 150 µL 提取试剂。加入100倍浓度的蛋白酶和磷酸酶抑制剂，使其终浓度为1倍。剧烈涡旋振荡，室温静置15分钟。
    2. 通过两步法进行机械裂解：将化学裂解后的EV溶液用G29针头抽吸两次。随后，将样品置于超声波冷水浴中处理45秒。将裂解后的EVs于-80℃冻存80 °C.
    3. 在室温下解冻样品 37 °C 5 分钟。再次在 -80 °C 用于储存裂解的EVs。在室温下再次解冻5分钟 37 °C 分析前

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图1星形胶质细胞来源的细胞外囊泡（EVs）富集的两步法示意图。 第一步， 通过基于聚合物的沉淀和离心步骤，从去纤维蛋白人血浆中富集细胞外囊泡（EVs）。在将全部EV重悬后，使用生物素标记的抗GLAST（ACSA-1）抗体及抗生物素磁性微珠通过免疫捕获法选择星形胶质细胞来源的EVs。缩写：ACSA-1 = 星形胶质细胞表面抗原-1；ADEVs = 星形胶质细胞来源的细胞外囊泡；DPBS = 达尔伯克氏磷酸盐缓冲液；EVs = 细胞外囊泡；GLAST = 谷氨酸-天冬氨酸转运体；No ADEVs = 非星形胶质细胞来源的细胞外囊泡；No EVs = 无细胞外囊泡（去EV血浆）；PIC = 蛋白酶抑制剂混合物；RT = 室温。图示由BioRender制作。 请点击此处以查看此图的放大版本。

2. 方案验证

  1. 免疫捕获前对总EV组分的表征
    1. 使用裂解后的总EV（聚合物沉淀后重悬的沉淀物）和稀释的血浆样品进行Western blot分析。向样品中加入4倍浓度的Laemmli上样缓冲液（每15 µL样品加5 µL），在90 °C下煮沸10分钟，然后上样至10%无染料丙烯酰胺凝胶中。
    2. 在Tris/甘氨酸/SDS缓冲液中进行SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE），先以80 V电泳30分钟，再以200 V电泳40分钟。电泳结束后，将凝胶从玻璃板中取出，并在紫外光激发1分钟后观察总蛋白含量。
    3. 通过半干转印系统将蛋白从凝胶转移至甲醇活化的0.2 µm PVDF膜上，条件为25 V、2.5 A，持续10分钟（设备详情见材料表）。转印完成后，室温下用封闭缓冲液封闭膜5分钟，随后在4 °C下与一抗Alix（1:1000）、CD9（1:1000）或Calnexin（1:1000）孵育过夜；具体信息见材料表。
    4. 用含0.1% Tween 20的Tris缓冲盐水（TBST）洗涤膜三次，每次10分钟，然后在室温下用封闭缓冲液按1:7500稀释的辣根过氧化物酶（HRP）标记的二抗孵育1小时。再用TBST洗涤四次，每次10分钟。所有洗涤和孵育步骤均在摇床上轻柔振荡进行。
    5. 将化学发光溶液与过氧化物缓冲液按1:1比例混合，室温孵育膜5分钟。使用化学发光成像系统曝光并获取条带信号（详见材料表）。
  2. ADEV组分中星形胶质细胞特异性标志物富集的验证
    ​注意：胶质纤维酸性蛋白（GFAP）是星形胶质细胞中的主要中间丝蛋白，也是其发育过程中细胞骨架的重要组成部分。GFAP可在脑组织和生物体液中被检测到，是公认的星形胶质细胞标志物39。因此，本研究采用商业化的生物标志物检测技术定量该标志物，以证明ADEV组分中星形胶质细胞来源标志物的富集。该生物标志物技术是一种超灵敏检测方法，可单分子水平检测蛋白质，其灵敏度可达传统免疫测定法的1000倍。该技术基于使用与抗体偶联的顺磁性微粒，这些抗体可特异性结合目标分子40,41（详见材料表）。
    1. 使用裂解后的EV样品进行生物标志物分析。为检测星形胶质细胞标志物的富集情况，采用商业化的超灵敏免疫测定法比较洗脱液（ADEVs）与流穿液（No ADEVs）中的GFAP水平。
    2. 将样品按1:4比例稀释（25 µL EV + 75 µL检测缓冲液），制备校准品，并按照制造商说明书在生物标志物检测设备上进行检测（详见材料表）。样品可直接在板上稀释。
    3. 样品和校准品均设复孔检测。GFAP检测的定量范围为1.37–1000 pg/mL。使用制造商提供的软件分析平台根据标准曲线计算GFAP浓度。
    4. 为评估星形胶质细胞标志物富集方案的变异系数（CV），检测来自相同重复的人混合血浆样品所制备的ADEV中GFAP水平，并按标准差/均值×100计算CV值。 本方案中，CV值基于N = 10份相同的血浆样品计算得出。 
  3. ADEV组分中EV标志物富集的验证
    1. 为验证EV标志物的富集情况，按照制造商推荐方法，使用ELISA法（详见材料表）检测未稀释裂解EV样品中的Alix和CD81水平。样品和校准品均设复孔检测。
    2. 使用酶标仪在450 nm和570 nm波长下读取吸光度值。采用线性标准曲线计算Alix和CD81浓度。Alix检测的定量范围为47–3000 pg/mL，CD81检测的定量范围为0.156–10 ng/mL。
  4. ADEV的大小和形态表征
    1. 纳米颗粒追踪分析
      1. 采用纳米颗粒追踪分析（NTA）测定新鲜未裂解EV制剂的颗粒浓度和粒径分布。
      2. 根据仪器检测范围（每帧20–100个颗粒），使用过滤后的PBS稀释新鲜未裂解的ADEV悬液（10 µL），在配套软件控制下记录三段60秒视频，设置如下：注射器流速为30 a.u.，相机等级为13，检测阈值为5。根据上样体积、EV重悬体积及NTA检测所需稀释倍数对颗粒浓度进行校正。
        注意：建议预先观察含有EV载体溶液的样品，以验证基质效应及EV重悬介质的纯度。
    2. 冷冻电子显微镜
      1. 采用冷冻电子显微镜（Cryo-EM）确认新鲜未裂解ADEV悬液（4 µL）中EV的存在及其形态。使用商用 plunge 冷冻仪在载有孔碳膜的载网上进行玻璃化处理，参数如下：加样量3.9 µL，等待时间10秒，滤纸吸附时间2秒。
      2. 迅速浸入液态乙烷-氮气混合物中，在低温工作站中将载网转移至维持在-179 °C的低温样品 holder 中，用于透射电子显微镜分析。使用加速电压为200 kV、配备CCD相机的透射电子显微镜观察EV，并通过软件采集显微图像。
  5. 脂蛋白共沉淀分析
    1. 使用经商业自动分析仪适配的免疫比浊法试剂盒（详见材料表），测定未稀释血浆、裂解后的总EV样品及裂解后的ADEV样品中人载脂蛋白B（ApoB）的水平。
  6. ADEV中炎症标志物的分析
    1. 采用基于微球的检测方法（详见材料表）定量25种炎症标志物的浓度：嗜酸性粒细胞趋化蛋白（eotaxin）、IFN Alpha2、IFN Gamma、IL-1 Alpha、IL-1 Beta、IL-3、IL-6、IL-8、IL-10、IL-12 (p40)、IL-12 (p70)、IL-15、IL-17A、IL-17E/IL-25、IL-17F、IL-18、IP-10、MCP-1、MCP-3、MDC、MIP-1 Alpha、MIP-1 Beta、TGF Alpha、TNF Alpha、TNF Beta。
    2. 使用25 µL未稀释裂解EV样品，按照制造商说明书与微球在4°C下孵育过夜。洗涤反应板后，加入25 µL检测抗体，在室温下振荡孵育1小时。
    3. 每孔加入25 µL链霉亲和素-PE，室温孵育30分钟。加入150 µL鞘液，振荡孵育5分钟。使用与系统连接的酶标仪读取结果。
      ​注意：该技术基于免疫测定法，利用抗体结合荧光包被的磁性微球表面。该技术通过不同染料对微球进行内部编码，每种微球包被特异性捕获抗体，从而多种偶联微球可同时捕获样品中的分析物，实现数十种分析物的定量多重检测。系统采用基于微球的多重免疫测定平台进行信号检测43。

3. 数据分析

  1. 使用商业软件进行统计分析。采用Shapiro-Wilk检验评估数据正态性。两组间比较采用Mann-Whitney U检验，三组及以上比较采用Kruskal-Wallis检验并结合Dunn's事后校正。显著性水平设定为p < 0.05。

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结果

从健康供体采集的血浆中成功分离出ADEVs。采用基于聚合物的沉淀法获得总EV组分，随后使用磁性微珠进行免疫捕获以获得ADEVs。

在免疫捕获步骤之前，对总EV组分进行的蛋白质印迹分析表明，EV制备物中不存在钙联蛋白（细胞污染标志物），但含有Alix和跨膜蛋白CD9（图2A）。

免疫捕获后，对ADEV组分中囊泡和星形胶质细胞标志物的存在及富集情况进行验证。与无ADEV组分（流穿组分）相比，ADEV中GFAP浓度显著升高，富集达六倍（p = 0.008），证实ADEV组分中的细胞外囊泡主要来源于星形胶质细胞（图2B）。对10个相同样本制备的ADEV中GFAP定量结果的变异系数（CV）为25%。

为了确认ADEV制备物中囊泡标志物的存在，检测了两种标志物：Alix，一种经典的胞质囊泡标志物42以及跨膜蛋白CD81...

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讨论

细胞外囊泡（EVs）因其在诊断和治疗方面的潜力而在生物医学研究中受到广泛关注。目前，EV分离方法面临的主要障碍之一是缺乏方法学共识和标准化的操作流程。本研究提供了一种从人血浆中富集星形胶质细胞来源EV的详细实验方案。 通过 基于聚合物的沉淀法和GLAST免疫捕获

从体液中分离细胞外囊泡（EVs）存在多种方法，每种方法都有其自身的优缺点。本研究选择基于聚合物的方法，因其操作简单、易于使用、耗时短、无需特殊仪器、EV得率高，且该方法在神经学领域的EV生物标志物研究中被广泛应用12,18,19,20，有利于结果的比较。然而，也可尝试其他方法，例如尺寸排阻色谱法。基于聚合物的方法常受到的一个批评是脂蛋白会与EV共同沉淀。但通过使用ACSA-1抗体进行额外的免疫捕获步骤以及后续的洗涤，可以选择性地结合星形胶质细胞来源的E...

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披露

Belbin 博士报告在提交的工作之外，从 ADx NeuroSciences 获得个人费用。Alcolea 博士报告在提交的工作之外，因担任 Fujirebio-Europe、Roche、Nutricia、Krka Farmacéutica、Zambon S.A.U. 和 Esteve 的顾问委员会成员和/或演讲酬金而获得个人费用。Lleó 博士在提交的工作之外，曾担任 Fujirebio-Europe、Roche、Biogen、Grifols 和 Nutricia 的顾问或顾问委员会成员。Fortea 博士报告在提交的工作之外，因在 AC Immune、Novartis、Lundbeck、Roche、Fujirebio 和 Biogen 的顾问委员会、裁决委员会任职或获得演讲酬金而收取个人费用。Alcolea、Belbin、Lleó 和 Fortea 博士报告持有神经退行性疾病突触病变标志物的专利（已授权给 ADx，专利号 EPI8382175.0）。未报告其他利益冲突。其余所有作者均无其他事项需要披露。

致谢

作者谨此感谢Soraya Torres、Shaimaa El Bounasri El Bennadi和Oriol Sanchez Lopez在样品处理与制备方面的协助。同时感谢来自ICTS的José Amable Bernabé的合作。 "NANBIOSIS"，第6单元（生物工程、生物材料领域CIBER单元） & 纳米医学）的 Marti de Cabo Jaume（巴塞罗那自治大学电子显微镜中心），Sant Pau 生物医学研究所（IIB-Sant Pau）流式细胞术平台的 Marta Soler Castany 博士和 Lia Ros Blanco，以及 IIB-Sant Pau 脂质相关疾病病理生理学研究组的 Joan Carles Escolà-Gil 博士，分别在纳米颗粒追踪分析（NTA）、冷冻电镜（cryo-EM）、Luminex 和载脂蛋白 B（ApoB）检测方面提供的帮助。

作者感谢以下机构提供的经费支持：Jérôme Lejeune 基金会（项目 #1941 和 #1913 资助 MFI 和 MCI）、Carlos III 健康研究所（PI20/01473 资助 JF，PI20/01330 资助 AL，PI18/00435 资助 DA，INT19/00016 资助 DA）、美国国立卫生研究院（1R01AG056850-01A1、R21AG056974 和 R01AG061566 资助 JF）、阿尔茨海默病协会与全球脑健康研究所（GBHI_ALZ-18-543740 资助 MCI）以及 The Association for  额颞叶变性（临床研究博士后奖学金，  AFTD 2019–2021）资助予ODI，以及加泰罗尼亚神经病学学会（Societat Catalana de Neurologia，SCN基金会2020年度奖学金授予MCI）。本研究还获得了CIBERNED项目（项目1，阿尔茨海默病研究，资助予AL及SIGNAL研究）的支持。 SS 获得了西班牙科学与创新部（西班牙政府）国家研究局颁发的“胡安·德·拉谢尔瓦-并入”博士后资助（IJC2019-038962-I）。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
用于 Western blotting 的抗 Alix 一抗EMD MilliporeABC40
µMACS 分离器Miltenyi Biotec130-042-602的 µMACS 分离器需与以下组件联合使用 µ 柱和 MACS MicroBeads。
用于 Western 印迹法的抗钙联蛋白一抗GenetexGTX109669
用于 Western blot 的抗 CD9 一抗细胞信号传导13174
10% BSA 封闭液 200 mL赛默飞世尔科技37525
Bransonic 1510E-MT 超声波清洗仪布拉森
COBAS 6000 全自动分析仪罗氏诊断用于载脂蛋白B免疫比浊测定的分析仪；商用全自动分析仪
cOmplete蛋白酶抑制剂混合物（无EDTA）罗氏11873580001
Digital Micrograph 1.8 显微图像软件
杜氏磷酸盐缓冲液（不含 Mg++ 和 Ca++），500 mL赛默飞世尔科技14190144
EveryBlot 封闭缓冲液BioRad12010020
Exoquick（外泌体沉淀溶液 5 mL）+ 凝血酶 System BioscienceEXOQ5TM-1ExoQuick 20 mL 也可单独购买（EXOQ20A-1）
Gatan 895 USC 4000 相机
GeneGnome XRQ 化学发光成像系统Syngene
人CD81抗原（CD81）ELISA试剂盒CusabioCSB-EL004960HU
人程序性细胞死亡6相互作用蛋白（PDCD6IP）ELISA试剂盒CusabioCSB-EL017673HU
免疫印迹PVDF膜BioRad1620177
JEOL 2011 透射电子显微镜 日本电子株式会社配备有 Gatan 895 USC 4000 CCD 相机 （Gatan 626，Gatan，Pleasanton，USA）
Lavender EDTA BD Vacutainer K2E 管Becton Dickinson367525
Leica EM GP 徕卡显微系统商用浸入式冷冻仪
低吸附微量离心管 1.5 mLDeltalab4092.3NS
MACS µ 带有活塞的柱子 Miltenyi Biotec130-110-905µ 带有活塞的柱子专为从体液中分离外泌体而设计
MACS 多通道支架Miltenyi Biotec130-042-303
MAGPIX 酶标仪Luminex Corporation80-073Luminex xMAP 多重分析仪（Luminex xPonent v 4.3 软件）
MicroBead 试剂盒100 μL 抗GLAST（ACSA-1）-生物素，人源，小鼠，大鼠 – 小尺寸；100 μL 抗生物素微珠Miltenyi Biotec130-095- 825
MILLIPLEX MAP 试剂盒 人类细胞因子/趋化因子/生长因子磁珠检测面板AEMD MilliporeHCYTA-60K-25
M-PER 哺乳动物蛋白提取试剂 25 mL赛默飞世尔科技78503对于某些应用，如蛋白质印迹，可使用更强效的裂解缓冲液（例如 RIPA）
MultiSkan SkyHigh 微孔板分光光度计赛默飞世尔科技A51119500C
NanoSight NS300马尔文帕纳科NTA；3.4 版本
Pierce Halt 蛋白酶和磷酸酶抑制剂混合液赛默飞世尔科技78441
聚丙烯注射器（G29）PeroxFarma1 mL 注射器；0.33×12 mm-G29×1/2"
二抗（抗兔）赛默飞世尔科技10794347
Simoa GFAP 发现试剂盒Quanterix102336
Simoa SR-X 仪器QuanterixSR-X 超灵敏生物标志物检测系统；商用生物标志物检测技术
载脂蛋白B特异性蛋白检测 - APOB（100次检测）COBAS C/CI罗氏诊断3032574122
SuperSignal West Femto赛默飞世尔科技34095超灵敏增强型化学发光（ECL）HRP底物 
Trans-Blot Turbo 转膜系统BioRad1704150

参考文献

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