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利用农用塑料薄膜制备微纳米塑料用于基础科学研究

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DOI：

10.3791/64112

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2022年7月27日

 ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Biosystems Engineering and Soil Science, University of Tennessee, 2Neutron Scattering, Oak Ridge National Laboratory, 3Chemical Sciences Divisions, Oak Ridge National Laboratory, 4Center for Renewable Carbon, The University of Tennessee

本文内容

摘要

我们展示了微塑料和纳米塑料（分别为 MPs 和 NPs）的形成及其尺寸表征，该过程采用逐步的机械研磨、研磨和成像分析方法。

摘要

分散在农业生态系统中的微塑料（MPs）和纳米塑料（NPs）可能对土壤生物及附近水道生物构成严重威胁。此外，被NPs吸附的农药等化学物质可能对土壤生物造成伤害，并有可能进入食物链。在此背景下，农业中使用的塑料（如地膜）是农业生态系统中塑料污染的重要来源。然而，目前大多数关于其归趋和生态毒性的基础研究采用的是理想化且代表性较差的MP材料，例如聚苯乙烯微球。

因此，如本文所述，我们开发了一种实验室规模的多步骤方法，通过机械方式制备具有代表性的微塑料（MPs）和纳米塑料（NPs），用于此类研究。塑料材料来源于市售的聚己二酸/对苯二甲酸丁二醇酯（PBAT）地膜，通过低温处理（CRYO）或环境老化（W）使其脆化，同时也使用未经处理的PBAT颗粒作为原料。随后对这些塑料材料进行机械研磨，生成粒径为46–840 µm的微塑料，模拟风力和机械装置对塑料碎片的磨损过程。接着将微塑料过筛，分为多个粒径组分，以便进一步分析。最后，将106 µm筛分组分进行湿法研磨，生成粒径为20–900 nm的纳米塑料，该过程模拟了陆地环境中微塑料缓慢降解并减小粒径的过程。微塑料的尺寸和形态通过体视显微图像的图像分析确定，而纳米塑料的粒径则采用动态光散射（DLS）技术进行表征。通过该方法制备的微塑料和纳米塑料具有不规则形状，与从农田中回收的实际微塑料的几何特征一致。总体而言，该粒径减小方法在制备由可生物降解塑料（如聚己二酸/对苯二甲酸丁二醇酯，PBAT）组成的微塑料和纳米塑料方面表现出高效性，所用材料代表了农业特种作物生产中使用的地膜材料。

引言

近几十年来，全球塑料产量迅速增加，而塑料废弃物的处置不当及回收不足，已导致环境污染，影响了海洋和陆地生态系统1,2,3塑料材料在现代农业中至关重要，尤其用于蔬菜、小果类及其他特色作物的种植。作为地膜、高低隧道覆盖物、滴灌带及其他应用的材料，其使用旨在提高作物产量和品质，降低生产成本，并促进可持续农业的发展4,5然而，不断扩大的应用 "塑料栽培" 引发了人们对农业环境中塑料碎片的形成、分布和残留问题的担忧。在使用期间，由于环境降解导致材料脆化，经过持续的破碎过程，较大的塑料碎片会形成微塑料和纳米塑料（MNPs），这些颗粒可在土壤中长期残留，或迁移至邻近水体 通过 地表径流和风力6,7,8环境因素（如阳光中的紫外线辐射、水的机械作用力）以及生物因素会引发环境中分散塑料的脆化，导致较大的塑料碎片分解为大块或中等大小的塑料颗粒9,10进一步破碎会形成微塑料（MPs）和纳米塑料（NPs），指平均尺寸的颗粒（标称直径； dp分别为 1-5000 µm 和 1-1000 nm11。然而，上部 dp 纳米颗粒（NPs）的界限（即微米颗粒（MPs）的下限）尚未达成普遍共识 在多篇论文中，此值被列为 100 nm12.

来自塑料废物的微纳塑料颗粒（MNPs）对土壤健康和生态系统服务构成了日益严重的全球性威胁。微塑料（MPs）从淡水中吸附重金属，导致重金属浓度比周围环境高出800倍13。此外，水生生态系统中的微塑料通过改变光穿透性、引起缺氧，并黏附于各类生物体（包括在水生生物体内穿透和积累）而带来多重胁迫和污染14。

近期研究表明，微纳塑料（MNPs）可影响土壤地球化学过程及生物群，包括微生物群落和植物15,16,17。此外，纳米塑料（NPs）对食物网构成威胁17,18,19,20。由于MNPs在土壤中易于发生垂直和水平迁移，它们可携带吸附的污染物（如农药、增塑剂和微生物）通过土壤进入地下水或河流、溪流等水生生态系统21,22,23,24。传统的农用塑料（如地膜）由聚乙烯制成，使用后必须从田间移除并填埋处理。然而，移除不彻底会导致大量塑料残片在土壤中累积9,25,26。相比之下，土壤可生物降解塑料地膜（BDMs）设计为使用后可直接翻耕入土，在土壤中随时间逐渐降解。然而，BDMs在土壤中仍会暂时存留，并逐步降解和碎裂为微塑料（MPs）和纳米塑料（NPs）9,27。

目前许多环境生态毒理学和归趋研究采用的是理想化且不具代表性的微塑料（MPs）和纳米塑料（NPs）模型材料。最常用的替代性微纳塑料（MNPs）是单一分散的聚苯乙烯微球或纳米球，这类材料并不能反映环境中实际存在的MNPs特征12,28因此，选择不具代表性的微塑料（MPs）和纳米塑料（NPs）可能导致测量结果不准确。由于目前缺乏适用于陆地环境研究的合适模型微纳塑料（ΜNPs），作者受到启发，尝试利用农用塑料制备此类模型。我们此前已报道过通过机械研磨塑料颗粒和薄膜材料，从可生物降解地膜（BDMs）和聚乙烯颗粒中制备微纳塑料（MNPs）的方法，以及所获得MNPs的尺寸和分子特性。29本文提供了一种更为详细的制备磁性纳米颗粒（MNPs）的方案，该方案可更广泛地应用于所有农用塑料，例如地膜或其颗粒化原料。图1在此，作为示例，我们选择地膜和可生物降解聚合物聚己二酸/对苯二甲酸丁二酯（PBAT）的球形颗粒来代表农用塑料。

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方案

1. 通过低温预处理和研磨将塑料颗粒加工成微塑料

注意：本方法基于其他地方描述的程序，使用由本研究中所用相同材料制成的PBAT薄膜29。

  1. 称取约 1 g 的聚合物颗粒样品，转移至 50 mL 玻璃广口瓶中。
  2. 将带有 20 目（840 µm）筛网的“矩形出料管”插入旋转切割研磨机前方的插槽中，并向上提升出料管，直至其接触限位销钉。
  3. 将玻璃板置于研磨室正面并用可调节夹具固定；随后，在研磨机出料口下方放置一个 50 mL 玻璃广口瓶（图 2）。
  4. 将研磨机右侧上方的滑动侧臂支撑装置置于前部玻璃板的中部位置，并用滚花螺栓拧紧。确保研磨机的前部玻璃板牢固固定（图 2a）。
  5. 将漏斗插入研磨机顶部，对准上部研磨腔的开口。
  6. 将电源线插入电源插座，按下电源线开关以启动研磨机。
    注意：为防止堵塞，仅在研磨机通电并运转后才开始进料。整个研磨过程中需佩戴眼部和耳部防护装备。
  7. 缓慢将样品加入漏斗中（约 10 颗/分钟），以避免转速下降或堵塞。当听觉噪声降低后，再加入下一批颗粒（约 10 颗）。完成一批样品（1 g）处理后，按下电源线开关停止研磨机运行，冷却约 20 分钟。使用木质冲棒进料，以防止物料喷出及在进料漏斗内发生颗粒团聚。
    警告：最佳进料速率因加工材料类型而异。若因切割腔内颗粒摩擦导致处理速度下降，或在玻璃板上观察到聚合物熔融现象，应立即关闭研磨机，以防过热及聚合物颗粒进一步熔化。
  8. 完成第一批处理后，取下 20 目（840 µm）出料管，更换为 60 目（250 µm）出料管（图 2b）。
  9. 将收集的物料重新加入研磨机进料漏斗中。按照步骤 1.1 和 1.7 对 250 µm 研磨级分进行处理。
  10. 将收集的 250 µm 级分重复进料最多三次。
  11. 回收研磨腔内残留的颗粒，并将其并入收集的主级分中。

2. 塑料薄膜的低温预处理与研磨加工

  1. 从卷材上取下一片薄膜样品，使用切纸机将样品裁切成约 120 mm（横向）× 20 mm（纵向）的条状。
  2. 将碎片（约1 g）置于1000 mL玻璃烧杯中，用800 mL去离子水浸泡10 min。此步骤通过预先浸泡聚合物，提高后续低温冷却过程中的脆化效果。
    警告：操作液氮时须佩戴低温手套和护目镜等安全防护装备。
  3. 缓慢加入 200 mL 液氮（N2) 转移至冷冻容器。
  4. 用钢制镊子小心将预浸泡的薄膜颗粒转移至低温容器中。在液氮中预浸泡3 min2.
  5. 将冷冻的薄膜碎片转移至200 W、14档转速的搅拌机中。
  6. 以3级速度处理冷冻材料10秒，以破坏冷冻的玻璃薄膜结构。为促进进一步减小粒径，加入400 mL去离子水，并将薄膜-水浆液混合搅拌5分钟。
  7. 将浆液转移至带有滤纸的布氏漏斗中1 µm 网筛）并抽真空至少1小时。
  8. 真空干燥固体颗粒于 30 °C 在铝制培养皿中放置至少48小时。
  9. 用镊子将干燥颗粒送入研磨机中。研磨操作请遵循步骤 1.1–1.11。

3. 经环境风化和研磨预处理的塑料薄膜的加工

  1. 将从野外回收的塑料薄膜碎片平铺在光滑表面（实验台）上，用软毛刷小心去除吸附的土壤颗粒和植物残渣。
  2. 用剪刀将薄膜剪成约 4 cm2、质量约为 1.0 g 的样品。
  3. 将薄膜碎片加入盛有 500 mL 去离子水的 1000 mL 烧杯中，使用 20 mm 搅拌子以 300 min-1 的速度搅拌 1 小时。
  4. 通过倾析法去除溶解的土壤颗粒：在轻微振荡烧杯的条件下，将水倒入水槽或塑料桶中，随后重新加入去离子水。重复此步骤三次。持续的轻微搅动可使土壤颗粒保持在水中分散状态，便于倾析。
  5. 将样品从烧杯转移至铝皿中，先在空气中干燥 12 小时，然后转移至真空烘箱中，在 30 °C 下干燥 24 小时。如需研磨，请继续执行步骤 1.1–1.11。

4. 通过级联筛网的筛分程序

  1. 将直径为3英寸的筛子从底部开始堆叠，最底部为接料盘，接着放置最细的筛子（#325；45 µm），然后依次放置孔径逐渐增大的筛子（如#140；106 µm 和 #60；250 µm，其中#20；840 µm 的筛子为最粗筛），最后盖上顶盖。
  2. 通过将四根销钉插入筛分仪的孔中，将全部四个筛子固定在振动筛分仪上。
  3. 将步骤1、2或3中收集的各组分转移至这四个串联的筛子顶部，在300 min-1的频率下振动10分钟。
  4. 单独回收较粗的（顶部）组分，该组分将进行进一步研磨。
    注：根据需要调整筛分仪的振动速度。也可手动筛分，每次仅使用一个筛子，从#20筛网开始：用手牢固压住筛子底部和顶盖，轴向和水平方向振摇5分钟。
  5. 将粒径 dp > 106 µm 的筛上颗粒按步骤1.6–1.10所述重新引入旋转切割式研磨机中处理。
  6. 从接料盘中回收筛下细粉，并将其转移至下一个更细的筛子中继续筛分。重复该过程，直至106 µm粒径组分成为主要部分。
  7. 合并收集的106 µm组分，并将颗粒储存在干燥环境中（干燥器或密封塑料袋）。
    ​注：45 µm组分包含在106 µm组分之内；但由于其产率通常极低，未对其进行单独分离和分析。各筛分组分（#20筛至#325筛）相对于初始进料组分的回收产率及粒径分布可通过高精度微量天平进行重量法测定，以质量百分比（wt%）表示。

5. 湿法研磨用水性纳米颗粒浆料的制备

  1. 通过将800 mL去离子水加入1000 mL玻璃烧杯中，并放入搅拌子（直径 = 8 mm，长度 = 50.8 mm），制备MPs在去离子水中的悬浮液。
  2. 将步骤1、2、3或4中获得的106 µm塑料组分8 g加入去离子水中，制成1 wt%的悬浮液。
  3. 将玻璃烧杯置于搅拌器上，以400 min-1的转速磁力搅拌24小时，使颗粒充分吸水以促进软化。
  4. 将颗粒转移至一个1000 mL塑料容器中。
  5. 另准备两个1000 mL塑料容器，均装满去离子水，用于在研磨过程中冲洗研磨机料斗上附着的颗粒。

6. 纳米颗粒制备用湿法研磨机的准备

  1. 将粒径为46格令的磨石（研磨石粒度 = 297-420 µm）放入湿式摩擦研磨机中，并用17 mm扳手手动拧紧中心螺母。
  2. 将料斗安装在顶部，并用17 mm扳手拧紧三个螺母和螺栓。
  3. 在碰撞器出口下方放置一个1 L的塑料收集罐。在出口旁另放置一个空的1 L桶，用于处理过程中更换收集。
  4. 将量规间隙调节至+1.0，相当于从零位向正方向偏移0.10 µm。
  5. 打开电源，缓慢顺时针旋转调节轮，直至听到磨石接触的声音。然后将柔性测量环调至零位，并立即逆时针旋转调节轮。默认转速为1500 min-1。
    注意：避免磨石“干磨”，否则会在磨石上产生过多热量。
  6. 顺时针旋转调节轮，直至磨石接触，然后轻轻将水-纳米颗粒（NP）浆料倒入料斗中。在浆料加入后，持续减小间隙至量规读数为-2.0，相当于从零位向负方向偏移0.20 µm。两个磨石盘之间的塑料颗粒-水浆料有助于将微塑料（MPs）转化为纳米颗粒（NPs），并避免磨石之间的直接摩擦。
  7. 当收集桶中的液位超过0.5 L时，通过更换收集桶来收集浆料。
  8. 将颗粒收集后重新引入研磨机中30-60次；较高的通过次数（即更多次的重新引入）会导致更小的颗粒尺寸。
  9. 用准备好的去离子水瓶冲洗吸附在料斗上的颗粒，以确保在处理过程中实现充分的浆料混合。
    ​注意：在处理过程中，可通过将20 mL玻璃瓶插入出口流中来收集中间样品。各个步骤可用于评估随着处理强度（通过次数）增加时的颗粒破碎机制。回收浆料后，在25 °C下以400 min-1搅拌4小时以充分混合；随后静置48小时以使浆料稳定。

7. 从浆液中回收和干燥纳米颗粒

  1. 如果在浆液中观察到多层，通过缓慢将浆液倒入另一个1000 mL玻璃烧杯中，分离出底部组分（或纳米颗粒浓度最高的相）。
  2. 将各组分转移至离心管（50 mL）中，以相对离心力（RCF）= 20 × 102 g 的条件离心10分钟。RCF（也称为g力）是转子半径和转速函数所产生的径向力，可导致浆液中较重颗粒与水的分离。
  3. 通过倾析法将透明的上层液体倒入单独的铝盘中去除。
  4. 将剩余的底层（含有纳米颗粒浆液）转移至另一个铝皿中，并置于30 °C真空烘箱中干燥48小时。
  5. 在通风橱或手套箱内佩戴呼吸面罩，用刮刀回收干燥物料。将干燥物质转移至100 mL玻璃容器中，并用盖子密封。
  6. 将纳米颗粒装入容器中，储存于密闭、干燥且阴凉的地方（例如干燥器中）。
    注意：在制造过程中释放到环境中的磁性纳米颗粒（此处指湿法研磨过程中或作为干燥颗粒释放）可能对水生和陆地生态系统构成严重威胁。特别是，监管措施旨在尽量减少工程纳米材料在生产和使用过程中的风险30。因此，磁性纳米颗粒的处理需采取特定的预防措施，例如在通风橱或手套箱中操作材料。此外，在纳米颗粒分离过程中产生的含水废液（步骤6.7–6.9）将由环境健康与安全部门按照废弃物最终处置程序进行处理。

8. 多光子成像 通过 体视显微镜

  1. 将约 20 mg 颗粒（步骤 4 中收集）分散于面积约 4 cm² 的表面2将白色或半透明的微塑料平铺在深色表面上，或将黑色或深色微塑料平铺在白色背景（如纸张）上，以最大限度增强背景对比度。
  2. 将显微镜调整至最低放大倍数，以捕获尽可能大的区域（颗粒区域的中部）。随后，将外部光源对准焦点中心，以照亮目标区域。
  3. 应用能够实现检测的放大倍数 >视野中央有50个颗粒。建议采用此数量以获得可靠的统计评估结果。
  4. 重点关注无颗粒重叠或重叠较少且颜色对比度良好的区域。
  5. 通过聚焦外层颗粒形态，至少拍摄五张具有代表性的图像。用于成像的本地计算机将在软件中以位图格式保存高分辨率图像。
  6. 将体视显微镜记录的图像保存为 ImageJ 可识别的文件格式（如 bitmap、tiff 或 jpeg），用于后续定量数据分析。
    注意：使用尺子或图像中记录的其他参照物，在与主图像相同的放大倍数下拍摄一张参考图像。此步骤将有助于在使用 ImageJ 软件进行图像准备和分析时轻松完成图像校准。

9. 通过 ImageJ 进行图像分析

  1. 打开 ImageJ 软件31 并输入以准备文件导入（CTRL + L) 以打开 命令查找器。接下来输入 Bio-Formats 右下角。此功能可激活菜单路径 文件 > 导入 > 生物格式 (> 指软件内的导航步骤。搜索存储的图像文件目录。
    注意：如果 Bio-Formats 软件包未出现在 命令查找器，在线搜索 Bio-Formats ImageJ. 按照说明下载并安装 ImageJ。Bio-Formats 导入器可在 ImageJ 中简便地处理图像文件的导入/导出，并支持命令搜索。
  2. 单击以打开图像（也可按照第 9.1 步所述使用 Bio-Formats 导入） 文件 > 开放 > 选择粒子图像 在第4.7步中收集的文件位置以及第1.6步中描述的标尺参考图像处，建议通过单击创建副本图像 Shift + Command + D 在调整复制图像的阈值设置时，与原始图像进行比较。
    注意： 文件 > 开放 “文件”命令可直接打开 ImageJ 原生支持的各种格式，具体操作如步骤 8.7 所述。或者，也可在计算机中选择图像文件位置，将其拖放到 ImageJ 主窗口的状态栏上，图像文件将自动在单独的窗口中打开。
  3. 使用图像的缩放功能进行放大和缩小 CTRL + 和 CTRL -分别。
  4. 通过点击设置测量参数 分析 > 设置测量参数，然后选择 区域 和 形状描述符 作为默认值。
  5. 使用第8步中描述的标尺参考图像，用直线直接画过比例尺的长度来定义比例尺。按压 分析 > 设置比例尺，并在下方输入条形长度的数值 已知距离 及其对应长度的单位。
  6. 单击以在图像上显示比例尺 分析 > 工具 > 比例尺，调整设置，例如在图像上显示清晰的对比度。在图像上选择一个位置，用于放置比例尺以进行比例尺设置。选择 宽度 以校准单位调整横条 高度 以像素为单位的条形图长度，以及 字体大小 比例尺标签的选取。选择 背景 调整标签文本框的填充颜色。
    注意：对于微米，输入 µm 是足够的；该程序会进行调整 µm 在数据输出中自动完成。
  7. 将图像转换为8位图像，方法是选择 图像 > 类型 > 8位.
  8. 将复制的图像通过选择转换为8位 图像 > 类型 > 8位.
  9. 通过选择进行调整 图像 > 调节 > 阈值 > 设置 （与原始图像比较大小）。
  10. 确定要进行的测量项目，方法是选择 分析 > 设置测量参数.
  11. 选择分析颗粒 > 0至无穷大，点击显示结果，并原位展示。
  12. 将 ROI (.zip) 结果存储于 保存测量结果 和 选择文件夹.
  13. 保存结果 (*.csv) 至 文件 > 保存为 > 选择文件夹.

10. 在电子表格软件中计算颗粒直径（dp）和形状因子

注意：了解颗粒直径和形状因子对于颗粒在环境中的行为（归趋、迁移）以及表面积的测定至关重要。因此，在使用微塑料（MPs）进行环境研究时，几何特征是关键因素。例如，已观察到微塑料与土壤之间的不同相互作用机制取决于微塑料的尺寸和形状，如微塑料-微塑料（MP-MP）和微塑料-土壤团聚现象，这些都会影响颗粒在土壤中的移动15,32。因此，建议采用以下步骤来确定dp-颗粒的粒径分布和几何参数。

  1. 将从 ImageJ 分析（步骤 9.13）获得并保存的相应 *.csv 文件导入电子表格软件。
    注意：每列中每一行的数值代表根据公式 1和公式 2对每个颗粒进行的独立计算结果。
  2. 通过在每列底部输入 =average(x,y) 来计算平均形状参数值，例如圆形度（CIR）和长宽比（AR），其中 x 表示该列的第一行，y 表示最后一行，然后按Enter键。CIR 值描述了投影面积与具有相同周长的理想圆之间的关系，单个颗粒的 CIR = 1（公式 1）。AR 表示颗粒长度与宽度的比值，由公式 2描述。
  3. 判断平均 AR 是否小于 2.5，若 AR < 2.5，则使用公式 3在新列中计算dp值；若 AR ≥ 2.5，则根据公式 4计算反映颗粒尺寸的dp值。添加一个新列，基于 ImageJ 输出结果中的面积列来计算dp。
    注意：选择 AR 阈值 ≥ 2.5 表示颗粒形状更接近矩形，而 AR < 2.5 表示颗粒形状更接近圆形。该选择有助于最小化因显微镜测量并通过 ImageJ 确定面积时带来的dp计算误差。
    (1) 圆形度公式：圆形度 = 4π × [投影面积] / [周长]²；数学表达式。
    (2) 几何学中的长宽比公式，显示主轴与次轴长度的计算方程。
    (3) 颗粒尺寸公式，用于根据投影面积计算颗粒直径，供教学使用。
    (4) 颗粒直径公式 \(d_p\)：\(\sqrt{\frac{{\text{投影面积} \times \text{颗粒宽度}}}{{\text{颗粒长度}}}}\)

11. 微塑料和纳米塑料的统计分析

  1. 通过统计软件中的 文件 > 打开 > 选择文件位置 打开步骤 9.13 中生成的 *.csv 数据文件。
    注意：也可通过复制-粘贴功能将表格直接导入统计软件。请参见材料表中所列统计软件的品牌与版本，使用 编辑 > 粘贴 并保留列名称。
  2. 通过选择 分析 > 分布 对 dp 数据进行评估。
  3. 选择代表该列数据的 dp，将其拖入 Y 列区域，然后点击 确定 按钮。此操作将在新窗口中生成直方图，并输出包含统计摘要、均值和标准差的统计结果。
  4. 通过点击 dp > 连续拟合 旁边的三角形，选择最合适的拟合曲线，评估直方图是否符合正态分布（或 dp 的最佳拟合分布）。选择获得的最佳拟合曲线（例如，正态拟合）。此步骤将在直方图上叠加一条正态分布拟合曲线。
  5. 从圆形度（Cir）、长宽比（AR）、圆整度（Round）和实心度（Sol）等平均形状参数的统计摘要结果中，确定并报告其均值与标准差。
    注意：建议并采用 α = 0.05 作为统计显著性水平，所有评估均以此为准。显著性水平是指在比较数值结果时，当原假设为真时错误拒绝该假设的概率。

12. dp 粒径分布与颗粒形状因子的最佳拟合

  1. 将数据集载入统计软件，并使用步骤10中计算得到的 dp 分布的同一份 *.csv 数据集。
  2. 选择 分析 > 可靠性与生存分析 > 寿命分布。
  3. 将 dp 列 拖至 Y，事件时间 字段，然后选择 确定。此操作将生成一个以 dp 为函数的概率图输出。
  4. 在 分布比较 中，通过勾选 非参数、对数正态、威布尔、对数逻辑 和 正态 分布，确定最优分布。
  5. 通过图表下方的 模型比较统计表 中赤池信息准则（AIC）和贝叶斯信息准则（BIC）的最低数值，评估各模型拟合质量，以最低的 BIC 数值为最优。默认情况下，最佳拟合模型显示在表格第一行。分布比较 图表下方提供了每种分布评估的参数或非参数估计输出字段。
  6. 通过左上角红色下拉三角菜单选择 保存脚本 > 保存至数据表，将输出脚本保存至数据表。随后，通过选择 文件 > 另存为 > *.jmp，将原始 数据表 保存至指定文件位置。

13. 通过动态光散射对纳米颗粒进行尺寸表征

  1. 通过双击启动动态光散射（DLS）软件 桌面图标. 选择 文件 > 新 > 标准操作程序. 添加样本名称并选择 材料折射率设为1.33 用于蒸馏水和 1.59 用于聚合物33 在DLS软件中 样本设置. 选择 材料 在 下拉实验 菜单，然后单击 好的.
    注意：点击下拉菜单可打开 材料管理员，可添加新样本或通过更改现有样本来修改 折射率 和 吸收选择分散剂 水.
  2. 选择合适的细胞 细胞 > 细胞类型 并选择 报告 以确定每次测量后将呈现的输出结果。
  3. 关闭仪器盖子，若盖子处于打开状态，合上盖子后按下按钮以开启系统，启动仪器 开启 按钮。第一次蜂鸣后等待，再等待约30分钟，以使光束稳定。
  4. 等待初始化程序完成，并等待第二次蜂鸣声，表明预设温度（通常 25 °C）已达到。
  5. 在15 mL离心管中，将步骤7中获得的纳米颗粒（NPs）与去离子水配制成约0.1 wt%浓度的样品浆液，通过磁力搅拌约1小时，使其充分混合。
  6. 转移前将悬浮液充分振荡，取约1.0 mL加入4.5 mL石英比色皿中，并打开盖子。然后，小心将样品池插入动态光散射（DLS）仪器的样品支架中。
    注意：按照步骤13.5中所述方法，从同一批次的浆液中以相同浓度制备三个样品。
  7. 对每个样品进行三次测量（在DLS软件中选择）。每次测量之间，取出样品池，轻轻振荡样品5秒，以确保样品混合均匀。
  8. 通过DLS软件提取并导出数据，将数据集导入电子表格软件，并按照步骤11.1-11.5所述方法为微塑料（MPs）和纳米塑料（NPs）创建直方图图1）。从 记录查看选项卡 或一个 Table 或 图表 通过选择 编辑-复制，可粘贴到其他应用程序中，例如电子表格软件。

14. 使用傅里叶变换红外（FTIR）光谱-衰减全反射（ATR）对磁性纳米颗粒（MNPs）进行化学分析

注意：通过傅里叶变换红外光谱（FTIR）和核磁共振（NMR）对磁性纳米颗粒（MNPs）进行化学分析，是评估湿法研磨对化学键特性影响以及主要组分相对含量和聚合物单体组成的有效工具10。此外，差示扫描量热法（DSC）和热重分析（TGA）可分别用于评估MNPs中聚合物组分的热性能及其稳定性29。

  1. 使用乙醇和无绒布清洁检测系统（ATR晶体表面）。
  2. 启动软件，在命令栏中按下背景按钮，通过清除仪器光路在空气中进行背景扫描。背景光谱将在采集后 shortly 显示。
  3. 在仪器设置工具栏中输入样品编号和样品描述。
  4. 将光谱波数范围调整为4000 cm-1至600 cm-1，在吸光度模式下选择2.0 cm-1的分辨率。选择每光谱32次扫描并开始。
  5. 将微塑料（MPs，106 µm）和纳米塑料（NPs，~300 nm）的塑料样品（约20 mg或约1-3 mm3）置于内径约10 mm的钢制垫圈或等效装置中，并放置于晶体表面。
    注：垫圈可防止样品被样品座压紧时在晶体上扩散，从而避免因测量不一致导致的材料不均匀性和数据偏差。
  6. 将垫圈置于ATR晶体中心，并用刮勺将聚合物样品加入垫圈开口的中央。
  7. 将上方的样品杠杆旋至样品中心，顺时针旋转旋钮，同时监控力传感器读数在50-90之间。样品将显示初步光谱。再次按下扫描按钮以采集光谱。
  8. 通过点击扫描按钮采集8-10次光谱，每次测量后用刮勺小心混合样品，以获得具有代表性的结果。
  9. 在数据浏览器中点击样品视图文件夹，将所有采集的样品光谱叠加显示在视图区域。首先删除明显偏离的异常光谱。然后在工具栏中选择吸光度或透射率模式。
  10. 选择包含光谱的样品视图文件夹，从文件菜单中选择另存为以保存光谱。在对话窗口中可更改文件名、目标目录以及所有光谱的默认保存位置。
    注：也可通过选择某一光谱后右键点击，选择二进制选项，将光谱另存为*.sp文件。选择保存二进制并浏览最终的保存位置。
  11. 在数据浏览器中选择单个光谱，通过菜单选择处理 > 归一化，执行基线校正和均值归一化，可在软件中或下一步中完成。
    注：均值归一化可补偿因样品厚度或材料差异引起的光谱误差。
  12. 数据采集完成后，使用乙醇和无绒布清洁晶体区域。
  13. 根据先前发表的研究10中指定和评估的FTIR振动峰，解释MPs与NPs之间的差异。

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结果

为验证实验方法与分析流程，通过显微图像对由颗粒和薄膜材料制备的微塑料（MPs）和纳米塑料（NPs）的尺寸与形态进行比较。如图1所述方法，通过低温冷却、研磨及湿法研磨和表征，可高效地从可生物降解塑料颗粒和薄膜中制备出MPs和NPs；而对于经环境老化的薄膜，由于老化已导致材料脆化，因此无需进行前述低温预处理步骤（Astner等，未发表）。颗粒也可在未经低温预处理的情况下直接进行研磨。研磨后，通过筛分将颗粒分为四个粒径组分：840 µm、250 µm、106 µm 和 45 µm，具体操作见实验方案第4步。其中后三个组分仅包含微塑料（MPs）。随后，通过ImageJ软件分析体视显微镜图像，评估各组分颗粒的粒径分布(dp)及形态因子（即圆形度和长宽比），具体步骤见8.1–8.6。体视显微镜获取的图像示例如下：PBAT颗粒经106 µm筛分组分（图3a,c）和未经老化的PBAT薄膜经250 µm筛分组分（图3b

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讨论

本方法描述了一种此前文献中首次报道的有效流程29，用于制备来源于颗粒和地膜的微纳塑料（MNPs），以开展环境研究。尺寸减小过程包括低温冷却（仅针对薄膜）、干法研磨和湿法研磨阶段，以制备模型微纳塑料。我们已应用该方法从多种聚合物原料中制备微纳塑料，包括低密度聚乙烯（LDPE）、聚己二酸-对苯二甲酸丁二醇酯（PBAT）和聚乳酸（PLA）29（Astner 等人，待发表手稿）。然而，对于 LDPE，仅颗粒可作为原料；由于在挤出过程中地膜内嵌了增强网格，无法对其进行加工处理，这一点已在先前的文献中有所说明29。

该方案中的关键步骤包括：a）冷冻预处理，使通常具有柔韧性的薄膜发生脆化；b）研磨，以模拟农业生产（如犁地、耕作）过程中的机械冲击；c）湿法研磨，模拟微塑料与土壤颗粒碰撞时所经历的环境剪切作用。通过该方法生成的微纳塑料颗粒相较于聚苯乙烯微球和纳米球，更接近农业土壤中实际存在的颗粒形态。然而，后者常被用作人工设计的模型材料，广泛应用于研究微塑料...

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披露

作者无任何利益冲突需要披露。

致谢

本研究由田纳西大学诺克斯维尔分校农业科学学院、生物系统工程与土壤系以及科学联盟资助。此外，作者衷心感谢美国农业部（USDA）通过资助项目2020-67019-31167为本研究提供的经费支持。制备基于PBAT的可生物降解地膜微塑料（MNPs）所用的初始原料由BioBag Americas, Inc.（Dunevin, FL, USA）慷慨提供。 PBAT 颗粒，由 Mobius, LLC（Lenoir City, TN）提供。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
铝制培养皿，150 mL Fisher Scientific, Waltham, MA, USA08-732-103收集的纳米塑料（NPs）干燥
铝制培养皿，500 mLVWR International, Radnor, PA, USA25433-018湿法研磨后收集纳米塑料（NPs）
离心机Fisher Scientific, Waltham, MA, USACentrific 228用于离心的容器
导管，#20，840 µmThomas Scientific, Swedesboro, NJ, USA3383M30研磨过程中第一级分的筛分
导管，#60，250 µmThomas Scientific, Swedesboro, NJ, USA3383M45研磨过程中第二级分（3次） 的筛分
恒温混匀仪， 5350 混匀仪Eppendorf North America, Enfield, CT, USA05-400-200筛分实验的分析
傅里叶变换红外光谱仪 Two，配备衰减全反射（ATR）附件的光谱仪Perkin Elmer, Waltham, MA, USAL1050228 测量傅里叶变换红外（FTIR）光谱
玻璃烧杯，1000 mLDWK Life Sciences, Milville, NJ, USA02-555-113研磨前搅拌微塑料（MPs）-水浆液
玻璃前板Thomas Scientific, Swedesboro, NJ, USA3383N55 Wiley Mini Mill 的前盖板
玻璃瓶，50 mLUline, Pleasant Prairie, WI, USAS-15846P研磨后收集微塑料（MPs）
丁腈手套Bel-Art-SP Scienceware, Wayne, NJ, USABEL-H50029000022英寸，10号尺寸
Zetasizer Nano ZS 90 粒径分析仪Malvern Panalytical, Worcestershire, UK Zetasizer Nano ZS测量分散在去离子水中的纳米塑料
显微镜相机Nikon, Tokyo, 108-6290, JapanNikon Digital Sight 10与 Olympus 显微镜联用以获取数字图像
显微镜Olympus, Shinjuku, Tokyo, JapanModel SZ 61微塑料（MPs）成像
氮气罐，低型杜瓦瓶Cole-Palmer, Vernon Hills, IL, USAUX-03771-23低温冷却过程中液氮的储存
Accurate Blend 200，12速搅拌机Oster, Boca Raton, FL, USA6684启动经低温处理的塑料薄膜的尺寸减小
PBAT 薄膜，- BioAgri™（Mater-Bi®）BioBag Americas, Inc, Dunedin, FL, USA0.7 mm 厚用于制备微塑料（MPs）和纳米塑料（NPs）的原料，农业地膜
PBAT 颗粒Mobius, LLC, Lenoir City, TN, USA直径 3 mm通过研磨和研碎制备微塑料（MPs）和纳米塑料（NPs）的原料
塑料离心管，50 mLFisher Scientific, Waltham, MA, USA06-443-18湿法研磨后浆液的离心
塑料瓶，1000 mL，预清洗，直壁Fisher Scientific, Waltham, MA, USA05-719-733湿法研磨过程中及之后收集纳米塑料（NPs）
多边形搅拌子，直径ø=8 mm，长度=50.8 mm  Fisher Scientific, Waltham, MA, USA14-512-127湿法研磨前搅拌微塑料（MPs）浆液
钛合金涂层剪刀Westcott, Shelton, CT, USA13901切割初始 PBAT 薄膜原料
带方形开口和盖子的方形玻璃池，外径 12 mmMalvern Panalytical, Worcestershire, UK PCS1115测量纳米塑料（NPs）粒径
不锈钢底座，3 英寸，盘状Hogentogler & Co. Inc, Columbia, MD, USA8401Wiley 研磨后的筛分
不锈钢筛网，3 英寸，No. 140（106 µm）Hogentogler & Co. Inc, Columbia, MD, USA1308Wiley 研磨后的筛分
不锈钢筛网，3 英寸，No. 20（850 µm）Hogentogler & Co. Inc, Columbia, MD, USA1296Wiley 研磨后微塑料（MPs）的筛分
不锈钢筛网，3 英寸，No. 325（45 µm）Hogentogler & Co. Inc, Columbia, MD, USA1313Wiley 研磨后微塑料（MPs）的筛分
不锈钢筛网，3 英寸，No. 60（250 µm）Hogentogler & Co. Inc, Columbia, MD, USA1303Wiley 研磨后微塑料（MPs）的筛分
不锈钢顶盖，3 英寸Hogentogler & Co. Inc, Columbia, MD, USA8406Wiley 研磨后微塑料（MPs）的筛分
不锈钢镊子Global Industrial, Port Washington, NY, USAT9FB2264892将冷冻的薄膜颗粒从瓶中转移至搅拌机 
真空烘箱，型号 281AFisher Scientific, Waltham, MA, USA13-262-50湿法研磨后用于干燥纳米塑料（NPs）的真空烘箱
摩擦研磨机，Supermass ColloiderMasuko Sangyo, Tokyo, JapanMKCA6-2J将微塑料（MPs）研磨成纳米塑料（NPs）的研磨设备
湿法研磨石，粒径：297 μm -420 μmMasuko Sangyo, Tokyo, JapanMKE6-46DD将微塑料（MPs）研磨成纳米塑料（NPs）的研磨石
Wiley Mini Mill，旋转切割研磨机Thomas Scientific, Swedesboro, NJ, USANC1346618将颗粒和薄膜减小尺寸以制备微塑料（MPs）和纳米塑料（NPs）
软件
傅里叶变换红外光谱（FTIR）软件Perkin Elmer, Waltham, MA, USASpectrum 10 采集初始塑料、微塑料（MPs）和纳米塑料（NPs）的光谱
Image J，图像处理程序National Institutes of Health, Bethesda, MD, USA版本 1.53n分析显微镜获取的数字图像 
显微镜软件，ds-fi1 软件Malvern Panalytical , Malvern, UK固件 DS-U1 Ver3.10记录数字图像
Microsoft, Windows,  Excel 365，电子表格软件Microsoft, Redmond, WA, USAOffice 365计算平均粒径并生成傅里叶变换红外（FTIR）光谱图像
JMP 软件，统计分析软件SAS Institute Inc., Cary, NC, 1989-2021版本 15粒径的统计分析及数据集的最佳拟合
Unscrambler 软件Camo Analytics, Oslo, Norway版本 9.2将傅里叶变换红外（FTIR）光谱归一化并转换为 .csv 格式

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