创建用于模拟关节疾病与药物测试的膝关节芯片模型

摘要

我们提供了从人源间充质干细胞生成四种组织的详细方法，这些组织用于模拟人类膝关节中的软骨、骨、脂肪垫和滑膜。这四种组织被整合到一个定制的生物反应器中，并通过微流控系统相互连接，从而构建出膝关节芯片。

摘要

骨关节炎（OA）等致残性关节疾病高发，带来了沉重的社会经济负担。目前针对关节疾病的可用药物大多仅为对症治疗。由于缺乏用于研究疾病机制和筛选潜在疾病修饰性骨关节炎药物（DMOADs）的合适模型，导致临床上对有效的DMOADs存在未被满足的需求。本文描述了一种微型滑膜关节模拟微生理系统（miniJoint）的建立，该系统包含由人源间充质干细胞（MSCs）衍生的脂肪、纤维和骨软骨组织组分。为获得三维（3D）微组织，MSCs在分化前或分化后被包埋于可光交联的甲基丙烯酰化明胶中。随后将含细胞的组织构建物集成至3D打印的生物反应器中，形成miniJoint。通过分别灌注成骨、成纤维和成脂培养基以维持各组织表型。同时，采用共用培养基流经软骨、滑膜和脂肪组织，实现组织间的相互作用。该灌注模式可对一个或多个组织组分施加干预，用于机制研究。此外，还可用于潜在DMOADs的测试。 通过 或者 "全身给药" 通过所有培养基流 "关节内给药" 通过仅将药物添加到共用部分 "滑膜液"-模拟流动。因此，miniJoint 可作为一种多功能装置 体外 用于高效研究疾病机制和在个性化医疗中进行药物测试的平台。

引言

骨关节炎（OA）等关节疾病具有很高的流行率且致残性强，是全球范围内导致残疾的主要原因之一¹。据估计，仅在美国，OA 就影响着 2700 万名患者，在 60 岁及以上成年人中的发病率达到 12.1%²。遗憾的是，目前用于治疗关节疾病的大多数药物仅为对症缓解，尚无有效的疾病修饰性骨关节炎药物（DMOADs）问世³。这一未满足的医疗需求主要源于缺乏可用于研究疾病机制并开发潜在 DMOADs 的有效模型。传统的二维（2D）细胞培养无法反映关节组织的三维结构，而组织外植体培养常因细胞大量死亡而受阻，且通常难以重现组织间动态的相互连接关系⁴。此外，物种间的遗传和解剖学差异显著降低了动物模型的生理相关性⁴。

器官芯片（OoCs）或微生理系统，是工程学、生物学与医学交叉领域中一个极具前景的研究方向。这些体外平台是最小的功能单元，能够复制其体内对应器官特定的健康或病理特征⁵。此外，这些微型系统可容纳多种细胞和基质，并模拟不同组织之间的生物物理和生物化学相互作用。因此，一种能够真实模拟天然滑膜关节的微生理系统，有望为关节疾病建模及潜在的疾病修饰骨关节炎药物（DMOADs）的开发提供有效的平台。

人体间充质干细胞（MSCs）可从全身多种组织中分离获得，并可分化为成骨、软骨和脂肪谱系⁶。MSCs 已成功用于工程化构建多种组织，包括骨、软骨和脂肪组织⁶，因此表明其是构建膝关节组织组分的一种极具前景的细胞来源。我们近期开发了一种模拟关节功能的微型微生理系统，命名为 miniJoint，该系统包含由 MSCs 分化而来的骨、软骨、纤维和脂肪组织⁷。特别是，这一新型设计可通过微流控流动或渗透实现组织间的相互作用（图1）。本文中，我们展示了芯片组件的制备、组织组分的构建、工程化组织在芯片中的培养，以及组织样本的收集以用于后续分析的完整实验方案。

图1：miniJoint芯片示意图，显示不同组织组分及培养基流动路径的排列方式。 OC = 骨软骨组织。 请点击此处查看该图的放大版本。

方案

以下方案遵循匹兹堡大学及匹兹堡大学人类研究伦理委员会的伦理准则。本研究中所用材料的信息列于材料表中。

1. 制造3D打印生物反应器

1. 使用计算机软件设计骨软骨生物反应器（图 2A）和 miniJoint 生物反应器（图 2B），包括腔室、插件和盖子。各部件的尺寸信息见图 S1。
2. 将设计文件传输至3D打印机，使用光敏聚合物油墨进行打印。
3. 用15 mL 95%乙醇对3D打印的部件（图 2C-F）清洗三次，每次15 mL。随后，在手电筒式光聚合装置中对打印部件进行完全交联，持续200秒。
4. 在插件和盖子上安装O型圈（图 2C，D），并测试各部件是否匹配（图 2G，H）。

图2：构建miniJoint生物反应器所需各组件的制备。（A，B），用于制造（A）骨软骨和（B）miniJoint芯片的生物反应器3D模型。（C，D）3D打印的（C）盖子和（D）已安装O型圈的插入件。（E，F）用于（E）骨软骨和（F）miniJoint组织培养的3D打印腔室。（G，H）（G）骨软骨和（H）miniJoint芯片的组装示意图。请点击此处查看该图的放大版本。

2. 组织组分的构建

注意：锂苯基-2,4,6-三甲基苯甲酰基次膦酸盐（LAP）和甲基丙烯酰化明胶（GelMA）的制备过程已在先前的研究中描述^8,9。

1. 制备 GelMA，按以下步骤操作：
   1. 将 17 g B 型明胶加入 500 mL 蒸馏水中，于 37 °C 摇床上混合 30 分钟。
   2. 随后加入 13 mL 甲基丙烯酸酐，重新置于 37 °C 摇床上，持续振荡过夜。
   3. 次日，将 GelMA 分装至多个透析袋中，每袋约 60 mL。
   4. 将所有透析袋放入含磁力搅拌子的蒸馏水中，进行为期 7 天的透析。每日多次更换蒸馏水，并在过夜时将透析袋置于 4 °C。
   5. 第 7 天，将 GelMA 在 −80 °C 冷冻。完全冻结后，进行冻干处理。
   6. 将 GelMA 置于冻干机真空腔内的培养皿中，进行冷冻干燥。确保 GelMA 在从冻干机中取出前已完全干燥。
2. 将 GelMA 溶解于 Hank's 平衡盐溶液（含 Ca²⁺ 和 Mg²⁺ 的 HBSS）中，配制成 15% (w/v) 溶液。为确保 pH 值为 7.4，逐滴加入 NaOH 并调节至 pH 7.4。根据所得体积，向溶液中补充 1× 抗生素-抗真菌剂和 0.15% (w/v) LAP。将 15% GelMA 溶液于 −20 °C 保存至使用，避免光照。
3. 将 3D 打印的双流式生物反应器腔室、盖子和插件放入高压灭菌袋中，采用蒸汽在 121 °C 高压灭菌 20 分钟，随后干热处理 20 分钟。
4. 在生物安全柜内，将生物反应器腔室、盖子和插件浸泡于 15 mL 无菌磷酸盐缓冲液中过夜，之后使其自然干燥。
5. 在获得 IRB 批准（匹兹堡大学和华盛顿大学）的前提下，从全关节置换术的手术废弃组织中分离人骨髓来源的间充质干细胞（MSCs）。
   1. 具体操作：冲洗股骨颈和股骨头松质骨中的骨髓，并将其重悬于 Dulbecco 改良 Eagle 培养基（DMEM）中。
   2. 将悬液通过 40 µm 滤网过滤，并以 300 × g 离心 5 分钟。
   3. 弃去上清液，用生长培养基 [DMEM、10% 胎牛血清（FBS）和 1× 抗生素-抗真菌剂] 重悬细胞沉淀，接种至组织培养瓶中。
   4. 每 3 至 4 天更换一次培养基。确保细胞融合度达到 70% 至 80% 后再进行后续操作。
   5. 用胰蛋白酶-EDTA 孵育 2–3 分钟使细胞脱落，按每 T150 培养瓶接种 100 万个细胞的比例进行传代。
   6. 将细胞扩增至第 5 代（P5）。消化后重悬细胞，计数，并以 300 × g 离心 5 分钟收集细胞沉淀。
6. 使用 1,000 µL 移液器，将细胞以 20 × 10⁶ 个细胞/mL 的密度重悬于 15% GelMA 溶液中。
   注意：关闭生物安全柜的照明灯。
7. 佩戴无菌手套，将无菌干燥的硅胶模具压在培养皿上。然后用镊子将每个插件放入硅胶模具的孔中，确保插件的孔面朝下。
8. 使用 200 µL 移液器，向每个插件中加入细胞悬液（约每插件 50 µL）以填满插件。
9. 使用紫外手电筒（波长为 395 nm 的 LED 光源）照射凝胶/插件顶部 1.5 分钟，随后翻转照射另一面 30 秒。当 LAP 光引发剂暴露于紫外光时，发生交联反应。
   注意：此期间可将细胞悬液置于培养箱中或避光保存。
10. 用无菌镊子立即将插件转移至非组织培养 6 孔板中，每孔加入 8 mL 生长培养基（DMEM 补充 10% [v/v] FBS 和 1× 抗生素-抗真菌剂），使细胞过夜恢复。
11. 将细胞向四个谱系方向诱导分化。
    1. 为构建脂肪组织（AT），将插件转移至含 8 mL 成脂诱导培养基（AM；α-MEM、10% FBS、0.2 mM 吲哚美辛、1× 胰岛素-转铁蛋白-硒（ITS）、0.45 mM 3-异丁基-1-甲基黄嘌呤、0.1 μM 地塞米松和 1× 抗生素-抗真菌剂）的孔中以启动分化。理想情况下，将四个插件置于一个非组织培养 6 孔板的单个孔中，加入 8 mL 成脂诱导培养基。培养 28 天，每隔一天更换一次培养基。
    2. 为构建骨软骨单元（OC），将插件放入双流式生物反应器腔室中，盖上盖子，并分别以 5 µL/min 的流速向两个通道灌注 35 mL 成骨诱导培养基（OM；DMEM、10% FBS、1× 抗生素-抗真菌剂、0.1 μM 地塞米松、0.01 M β-甘油磷酸钠、100 ng/mL 骨形态发生蛋白 7（BMP7）、50 µg/mL 抗坏血酸和 10 nM 维生素 D3）和 35 mL 成软骨诱导培养基（CM；DMEM、1× 抗生素-抗真菌剂、1× ITS、0.1 μM 地塞米松、40 µg/mL 脯氨酸、50 µg/mL 抗坏血酸和 10 ng/mL 转化生长因子 β3）¹⁰。通过每两周更换一次培养基，维持细胞分化 28 天。
    3. 为获得成纤维细胞，将 MSCs 在 T150 cm² 组织培养瓶中以 20 mL 成纤维诱导培养基（FM；高级 DMEM、5% FBS、1× GlutaMAX、1× 抗生素-抗真菌剂和 50 µg/mL 抗坏血酸）进行 2D 培养，共 21 天。每周更换一次培养基。使用 4 mL 胰蛋白酶消化细胞，并按照上述方案将细胞包埋于插件内的 3D 凝胶中，以获得类似滑膜的纤维组织（SFT）。
       注意：所有诱导分化培养基的组成详见 表 1。

3. 建立 miniJoint 芯片

1. 对3D miniJoint生物反应器腔室、内径为0.062英寸、外径为0.125英寸的硅胶管以及F 1/16鲁尔锁接头进行高压灭菌。将硅胶管一端连接至miniJoint生物反应器的插管接头，另一端连接鲁尔锁接头。
2. 准备步骤2.11中提到的AM、OM（去除BMP7）和FMCM。此外，准备用于miniJoint培养的共用培养基（SM；无酚红DMEM，1×抗生素-抗真菌剂，1×丙酮酸钠，1×ITS，40 µg/mL脯氨酸，50 µg/mL抗坏血酸，以及0.5 ng/mL转化生长因子β3）。将每种培养基各35 mL加入培养基储液罐中。
3. 使用直镊将骨软骨单元从双流生物反应器转移至miniJoint生物反应器的右侧孔中。将脂肪组织插件和纤维组织插件分别转移至左侧和中间孔中。用灭菌盖子封闭所有孔。
4. 将miniJoint芯片的入口连接至培养基储液罐，出口连接至注射器（图3A-C）。
5. 将注射器安装到注射泵上（图3C），并将泵和芯片转移至培养箱中。培养基储液罐置于培养箱外的冰上保存。
6. 将泵设置为抽吸模式，将培养基从储液罐抽入miniJoint生物反应器腔室中。该miniJoint培养过程持续28天。
7. 为模拟关节炎症和软骨退变，在纤维化培养基流中加入白细胞介素1β（IL-1β），终浓度为10 ng/mL。在IL-1β处理的第三天更换注射器，并向纤维化培养基中补充新鲜的IL-1β。处理持续7天。
8. 在药物测试阶段，IL-1β处理3天后，将药物加入共用培养基中，模拟药物在膝关节局部使用的“关节腔内给药”（图3D）；或将药物加入所有类型的培养基中，模拟通过循环系统作用于膝关节的“全身性给药”（图3E）。
9. 无论样本是否接受了前4天的药物处理，在IL-1β处理7天后收集各组织用于分析。

图3：miniJoint的组装。（A，B）组织特异性培养基从入口1-3（I1-3）引入，并从出口1-3（O1-3）流出。共享培养基从I4灌注至O4。（C）miniJoint培养的完整设置。药物（绿色太阳状图形）可仅加入（D）共享培养基中，或加入（E）所有培养基中，以分别模拟“关节内给药”或“系统性给药”。请点击此处查看此图的放大版本。

4. 个体组织采集

1. 使用无菌弯镊取出插入物。
2. 用活检打孔器穿过插入物中心以取出凝胶，并将凝胶置于磷酸盐缓冲液（PBS）中。
3. 在检测基因表达时，将骨软骨凝胶切成两半。
   注意：由于骨软骨凝胶包含两种组织类型，因此必须分离成骨和成软骨细胞。
4. 收集条件培养基和组织用于不同实验。
   1. 从每种培养基来源收集约 1.5 mL。
   2. 将条件培养基在 14,000 × g 离心 10 分钟后弃去沉淀，再用液氮速冻。
   3. 对于组织学染色和免疫染色，首先将 OC 和 SFT 样本置于 10% 缓冲福尔马林中固定，随后用梯度浓度乙醇脱水，二甲苯透明，石蜡包埋，最后切成 6 µm 厚的切片。
   4. 对于 AT 微组织，将样本用 10% 缓冲福尔马林固定后，直接用油红 O 溶液或 BODIPY 染色。

结果

收集miniJoint中所有组织，以分析其在miniJoint中培养28天后的表型（图4A）。相关内容已在我们之前的出版物中详细描述⁷。

通过使用RT-qPCR、免疫染色和组织学染色，证实了各个微组织中的组织特异性表型均得到了良好维持图4）。例如，骨软骨微组织中的骨性成分（OC-O）表达高水平的骨钙素，而其他组织成分则不表达OCN）。相比之下，在骨软骨组织的软骨部分（OC-C）中，II型胶原蛋白（COL2) 和聚集蛋白聚糖（aggrecan）ACAN) 的表达水平显著高于其他组织图4B). 脂联素表达水平（ADIPOQ）和瘦素（leptin）LEP)，两个典型的脂肪生成基因，在脂肪组织（AT）中的表达水平远高于其他组织。钙盐的沉积（

讨论

本文介绍了一种构建膝关节芯片系统的方案，该系统利用间充质干细胞（MSCs）在定制的生物反应器内形成骨、软骨、脂肪组织和类似滑膜的组织，并进行共培养。这种由多种人体细胞组成、具有即插即用特性的系统，为研究关节疾病的发病机制和药物开发提供了新工具。

鉴于不同组织倾向于特定的培养基，必须为每种组织提供相应的培养基，并防止各流路之间培养基的自由交换。特别是在构建双相骨软骨组织时，未分化间充质干细胞（MSCs）的分化命运取决于其所接触的培养基。在当前的设计中，我们采用明胶基水凝胶作为支架，该支架不仅为细胞生长提供模板，还可封闭组织与插入物壁之间可能存在的间隙。因此，至关重要的是 原位 在插入物内对凝胶进行光交联。此外，在成骨培养基和软骨诱导培养基中分别添加生长因子BMP7和TGFβ3。为了维持这些生长因子数天内的生物活性，新鲜培养基在加入芯片培养系统前必须置于培养箱外。因此，我们需要使用注射器从储液池中抽出培养基，而不是将培养基直接注入培养箱内的系统中。

操作生物反应器时另一个关键点是避免产生不必要的压力。组织依靠与...

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
3-异丁基-1-甲基黄嘌呤	Sigma -Aldrich	I17018-1G
6 孔非组织培养板	Corning Falcon® Plates	351146
24 孔非组织培养板	Corning Falcon® Plates	351147
30 mL 注射器	BD Syringe Luer Lock Cascade Health	302832
阿辛蓝染色液	EK Industries	1198	1% w/v，pH 1.0
高级 DMEM 培养基	Gibco	12491-015
αMEM	Gibco	12571-063
抗生素-抗真菌剂	Gibco	15240-062
活检打孔器	Integra Miltex	12-460-407
BODIPY® 荧光染料	Molecular Probes
骨形态发生蛋白 7 (BMP7)	Peprotech
弯头镊子	Fisher Brand	16100110
DMEM	Gibco	11995-065	杜氏改良伊格尔培养基（Dulbecco’s Modified Eagle Medium）
地塞米松	Sigma -Aldrich	02-05-2002
E-Shell 450 光敏聚合物	EnvisionTec	RES-01-4022
胎牛血清	Gemini-Bio Products	900-208
GlutaMAX	Gibco	3505-061
牛皮来源明胶	Hyclone	1003372809
Hank’s 平衡盐溶液	Sigma -Aldrich	SH30588.02
吲哚美辛	Sigma -Aldrich	I7378-56
胰岛素-转铁蛋白-硒-乙醇胺（ITS）	Gibco	51500-056
白细胞介素 1β	Peprotech	200-01B
鲁尔锁接头	Cole-Parmer Instruments	45508-50
L-脯氨酸	Sigma -Aldrich	115388-93-7
β-甘油磷酸钠	Sigma -Aldrich	1003129352
培养基袋	KiYATEC	FC045
甲基丙烯酸酐	Sigma -Aldrich	102378580
磷酸盐缓冲液	Corning	21-040-CM
尖头镊子	Fisher Brand	12000122
硅胶模具	McMaster-Carr	RC00114P
硅胶 O 型圈	McMaster-Carr	ZMCCs1X5	1 mm × 5 mm
SolidWorks	Dassault Systèmes SE, Vélizy-Villacoublay, France
手术刀片	Integra Miltex	4-122
注射泵	Lagato210P, KD Scientific	Z569631	10 个注射器架
T-182 组织培养瓶	Fisher Brand	FB012939
组织培养皿 150 mm	Fisher Brand	FB012925
转化生长因子 β (TGF-β3)	Peprotech	100-36E
胰蛋白酶	Gibco	25200-056
紫外手电筒	KBS	KB70109	395 nm
Vida 桌面 3D 打印机	EnvisionTec
维生素 D3	Sigma -Aldrich	32222-06-3	1,25-二羟基维生素 D3