方法文章

创建用于模拟关节疾病与药物测试的膝关节芯片模型

DOI：

10.3791/64186

⸱

2023年1月27日

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1Department of Orthopaedic Surgery, University of Pittsburgh School of Medicine, 2Department of Bioengineering, University of Pittsburgh Swanson School of Engineering, 3Department of Neurobiology, University of Pittsburgh School of Medicine, 4Department of Orthopaedic Surgery, Stanford University, 5Department of Microbiology, Immunology, and Genetics, University of North Texas Health Science Center, 6Department of Bioengineering, Stanford University, 7McGowan Institute for Regenerative Medicine, University of Pittsburgh School of Medicine, 8The Chinese University of Hong Kong

本文内容

摘要

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我们提供了从人源间充质干细胞生成四种组织的详细方法，这些组织用于模拟人类膝关节中的软骨、骨、脂肪垫和滑膜。这四种组织被整合到一个定制的生物反应器中，并通过微流控系统相互连接，从而构建出膝关节芯片。

摘要

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骨关节炎（OA）等致残性关节疾病高发，带来了沉重的社会经济负担。目前针对关节疾病的可用药物大多仅为对症治疗。由于缺乏用于研究疾病机制和筛选潜在疾病修饰性骨关节炎药物（DMOADs）的合适模型，导致临床上对有效的DMOADs存在未被满足的需求。本文描述了一种微型滑膜关节模拟微生理系统（miniJoint）的建立，该系统包含由人源间充质干细胞（MSCs）衍生的脂肪、纤维和骨软骨组织组分。为获得三维（3D）微组织，MSCs在分化前或分化后被包埋于可光交联的甲基丙烯酰化明胶中。随后将含细胞的组织构建物集成至3D打印的生物反应器中，形成miniJoint。通过分别灌注成骨、成纤维和成脂培养基以维持各组织表型。同时，采用共用培养基流经软骨、滑膜和脂肪组织，实现组织间的相互作用。该灌注模式可对一个或多个组织组分施加干预，用于机制研究。此外，还可用于潜在DMOADs的测试。 通过 或者 "全身给药" 通过所有培养基流 "关节内给药" 通过仅将药物添加到共用部分 "滑膜液"-模拟流动。因此，miniJoint 可作为一种多功能装置 体外 用于高效研究疾病机制和在个性化医疗中进行药物测试的平台。

引言

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骨关节炎（OA）等关节疾病具有很高的流行率且致残性强，是全球范围内导致残疾的主要原因之一1。据估计，仅在美国，OA 就影响着 2700 万名患者，在 60 岁及以上成年人中的发病率达到 12.1%2。遗憾的是，目前用于治疗关节疾病的大多数药物仅为对症缓解，尚无有效的疾病修饰性骨关节炎药物（DMOADs）问世3。这一未满足的医疗需求主要源于缺乏可用于研究疾病机制并开发潜在 DMOADs 的有效模型。传统的二维（2D）细胞培养无法反映关节组织的三维结构，而组织外植体培养常因细胞大量死亡而受阻，且通常难以重现组织间动态的相互连接关系4。此外，物种间的遗传和解剖学差异显著降低了动物模型的生理相关性4。

器官芯片（OoCs）或微生理系统，是工程学、生物学与医学交叉领域中一个极具前景的研究方向。这些体外平台是最小的功能单元，能够复制其体内对应器官特定的健康或病理特征5。此外，这些微型系统可容纳多种细胞和基质，并模拟不同组织之间的生物物理和生物化学相互作用。因此，一种能够真实模拟天然滑膜关节的微生理系统，有望为关节疾病建模及潜在的疾病修饰骨关节炎药物（DMOADs）的开发....

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方案

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以下方案遵循匹兹堡大学及匹兹堡大学人类研究伦理委员会的伦理准则。本研究中所用材料的信息列于材料表中。

1. 制造3D打印生物反应器

  1. 使用计算机软件设计骨软骨生物反应器（图 2A）和 miniJoint 生物反应器（图 2B），包括腔室、插件和盖子。各部件的尺寸信息见图 S1。
  2. 将设计文件传输至3D打印机，使用光敏聚合物油墨进行打印。
  3. 用15 mL 95%乙醇对3D打印的部件（图 2C-F）清洗三次，每次15 mL。随后，在手电筒式光聚合装置中对打印部件进行完全交联，持续200秒。
  4. 在插件和盖子上安装O型圈（图 2C，D），并测试各部件是否匹配（图 2G，H）。

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结果

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收集miniJoint中所有组织，以分析其在miniJoint中培养28天后的表型（图4A）。相关内容已在我们之前的出版物中详细描述7。

通过使用RT-qPCR、免疫染色和组织学染色，证实了各个微组织中的组织特异性表型均得到了良好维持图4）。例如，骨软骨微组织中的骨性成分（OC-O）表达高水平的骨钙素，而其他组织成分则不表达OCN）。相比之下，在骨软骨组织的软骨部分（OC-C）中，II型胶原蛋白（COL2) 和聚集蛋白聚糖（aggrecan）ACAN) 的表达水平显著高于其他组织图4B). 脂联素表达水平（ADIPOQ）和瘦素（leptin）LEP)，两个典型的脂肪生成基因，在脂肪组织（AT）中的表达水平远高于其他组织。钙盐的沉积（

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讨论

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本文介绍了一种构建膝关节芯片系统的方案，该系统利用间充质干细胞（MSCs）在定制的生物反应器内形成骨、软骨、脂肪组织和类似滑膜的组织，并进行共培养。这种由多种人体细胞组成、具有即插即用特性的系统，为研究关节疾病的发病机制和药物开发提供了新工具。

鉴于不同组织倾向于特定的培养基，必须为每种组织提供相应的培养基，并防止各流路之间培养基的自由交换。特别是在构建双相骨软骨组织时，未分化间充质干细胞（MSCs）的分化命运取决于其所接触的培养基。在当前的设计中，我们采用明胶基水凝胶作为支架，该支架不仅为细胞生长提供模板，还可封闭组织与插入物壁之间可能存在的间隙。因此，至关重要的是 原位 在插入物内对凝胶进行光交联。此外，在成骨培养基和软骨诱导培养基中分别添加生长因子BMP7和TGFβ3。为了维持这些生长因子数天内的生物活性，新鲜培养基在加入芯片培养系统前必须置于培养箱外。因此，我们需要使用注射器从储液池中抽出培养基，而不是将培养基直接注入培养箱内的系统中。

操作生物反应器时另一个关键点是避免产生不必要的压力。组织依靠与.......

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披露

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作者声明无竞争利益。

致谢

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本研究主要由美国国立卫生研究院（National Institutes of Health）资助（项目编号：UG3/UH3TR002136，UG3/UH3TR003090）。此外，我们感谢华盛顿大学的Paul Manner博士提供人体组织样本，以及Jian Tan博士在分离间充质干细胞和建立细胞库过程中提供的帮助。

....

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
3-异丁基-1-甲基黄嘌呤Sigma -AldrichI17018-1G
6 孔非组织培养板Corning Falcon® Plates351146
24 孔非组织培养板Corning Falcon® Plates351147
30 mL 注射器BD Syringe Luer Lock Cascade Health302832
阿辛蓝染色液EK Industries11981% w/v，pH 1.0
高级 DMEM 培养基Gibco12491-015
αMEMGibco12571-063
抗生素-抗真菌剂Gibco15240-062
活检打孔器Integra Miltex12-460-407
BODIPY® 荧光染料Molecular Probes
骨形态发生蛋白 7 (BMP7)Peprotech
弯头镊子Fisher Brand16100110
DMEMGibco11995-065杜氏改良伊格尔培养基（Dulbecco’s Modified Eagle Medium）
地塞米松Sigma -Aldrich02-05-2002
E-Shell 450 光敏聚合物EnvisionTecRES-01-4022
胎牛血清Gemini-Bio Products900-208
GlutaMAXGibco3505-061
牛皮来源明胶Hyclone1003372809
Hank’s 平衡盐溶液Sigma -AldrichSH30588.02
吲哚美辛Sigma -AldrichI7378-56
胰岛素-转铁蛋白-硒-乙醇胺（ITS）Gibco51500-056
白细胞介素 1βPeprotech200-01B
鲁尔锁接头Cole-Parmer Instruments45508-50
L-脯氨酸Sigma -Aldrich115388-93-7
β-甘油磷酸钠Sigma -Aldrich1003129352
培养基袋KiYATECFC045
甲基丙烯酸酐Sigma -Aldrich102378580
磷酸盐缓冲液Corning21-040-CM
尖头镊子Fisher Brand12000122
硅胶模具McMaster-CarrRC00114P
硅胶 O 型圈McMaster-CarrZMCCs1X51 mm × 5 mm
SolidWorksDassault Systèmes SE, Vélizy-Villacoublay, France
手术刀片Integra Miltex4-122
注射泵Lagato210P, KD ScientificZ56963110 个注射器架
T-182 组织培养瓶Fisher BrandFB012939
组织培养皿 150 mmFisher BrandFB012925
转化生长因子 β (TGF-β3)Peprotech100-36E
胰蛋白酶Gibco25200-056
紫外手电筒KBSKB70109395 nm
Vida 桌面 3D 打印机EnvisionTec
维生素 D3Sigma -Aldrich32222-06-31,25-二羟基维生素 D3

参考文献

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  1. Safiri, S., et al. Global, regional and national burden of osteoarthritis 1990-2017: A systematic analysis of the Global Burden of Disease Study 2017. Annals of the Rheumatic Diseases. 79 (6), 819-828 (2020).
  2. Lawrence, R. C., et al.

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