我们提供了从人源间充质干细胞生成四种组织的详细方法，这些组织用于模拟人类膝关节中的软骨、骨、脂肪垫和滑膜。这四种组织被整合到一个定制的生物反应器中，并通过微流控系统相互连接，从而构建出膝关节芯片。
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本文内容
摘要
摘要
骨关节炎（OA）等致残性关节疾病高发，带来了沉重的社会经济负担。目前针对关节疾病的可用药物大多仅为对症治疗。由于缺乏用于研究疾病机制和筛选潜在疾病修饰性骨关节炎药物（DMOADs）的合适模型，导致临床上对有效的DMOADs存在未被满足的需求。本文描述了一种微型滑膜关节模拟微生理系统（miniJoint）的建立，该系统包含由人源间充质干细胞（MSCs）衍生的脂肪、纤维和骨软骨组织组分。为获得三维（3D）微组织，MSCs在分化前或分化后被包埋于可光交联的甲基丙烯酰化明胶中。随后将含细胞的组织构建物集成至3D打印的生物反应器中，形成miniJoint。通过分别灌注成骨、成纤维和成脂培养基以维持各组织表型。同时，采用共用培养基流经软骨、滑膜和脂肪组织，实现组织间的相互作用。该灌注模式可对一个或多个组织组分施加干预，用于机制研究。此外，还可用于潜在DMOADs的测试。 通过 或者 "全身给药" 通过所有培养基流 "关节内给药" 通过仅将药物添加到共用部分 "滑膜液"-模拟流动。因此，miniJoint 可作为一种多功能装置 体外 用于高效研究疾病机制和在个性化医疗中进行药物测试的平台。
引言
骨关节炎（OA）等关节疾病具有很高的发病率和致残性，是全球范围内导致残疾的主要原因之一1。据估计，仅在美国，OA 就影响了 2700 万名患者，在 60 岁及以上成年人中的发病率达到 12.1%2。遗憾的是，目前用于治疗关节疾病的大多数药物仅为对症治疗，尚无有效的疾病修饰性骨关节炎药物（DMOADs）可用3。这一未满足的医疗需求主要源于缺乏可用于研究疾病机制并开发潜在 DMOADs 的有效模型。传统的二维（2D）细胞培养无法反映关节组织的三维结构，而组织外植体培养常因细胞大量死亡而受阻，且通常难以重现组织间的动态相互作用4。此外，遗传和解剖学上的差异显著降低了动物模型的生理相关性4。
器官芯片（OoCs），或称微生理系统，是工程学、生物学与医学交叉领域中一个极具前景的研究方向。这些 体外 平台是最小的功能单元，可复制其明确的健康或病理特征 体内 对应物5此外，这些微型化系统能够容纳多种细胞和基质，并模拟不同组织之间的生物物理和生化相互作用。因此，一种能够真实再现天然滑膜关节的微生理系统有望为关节疾病建模及潜在的疾病修饰性骨关节炎药物（DMOADs）的开发提供....
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方案
以下方案遵循匹兹堡大学及匹兹堡大学人类研究伦理委员会的伦理准则。本研究中所用材料的信息列于材料表中。
1. 制造3D打印生物反应器
- 使用计算机软件设计骨软骨（图 2A）和 miniJoint 生物反应器（图 2B），包括腔室、插件和盖子。各部件的尺寸信息见图 S1。
- 将设计传输至 3D 打印机，使用光聚合物墨水进行打印。
- 用 15 mL 95% 乙醇对 3D 打印的部件（图 2C–F）清洗三次，然后在手提式光固化装置中完全交联 200 秒。
- 在插件和盖子上安装 O 型圈（图 2C、D），并测试各部件是否匹配（图 2G、H）。
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结果
收集微型关节（miniJoint）中所有组织，以分析其在微型关节中培养28天后的表型（图4A）。相关内容已在我们之前的出版物中详细描述7。
通过RT-qPCR、免疫染色和组织学染色，证实了各微组织中组织特异性表型均得到了良好维持图4例如，骨软骨微组织中的骨性组分（OC-O），而非其他组织组分，高表达骨钙素（osteocalcin）OCN）。相比之下，在骨软骨组织的软骨部分（OC-C）中，II型胶原蛋白（COL2) 和聚集蛋白聚糖（aggrecan）ACAN) 的表达水平显著高于其他组织图4B）。脂联素表达水平（ADIPOQ）和瘦素（leptin）LEP），两个典型的脂肪生成基因，在脂肪组织（AT）中的表达远高于其他组织。钙盐的沉积（
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讨论
本文介绍了一种构建膝关节芯片系统的方案，该系统利用间充质干细胞（MSCs）在定制的生物反应器内形成骨、软骨、脂肪组织和类似滑膜的组织，并进行共培养。这种由多种人体细胞组成、具有即插即用特性的系统，为研究关节疾病的发病机制和药物开发提供了新工具。
鉴于不同组织倾向于特定的培养基，必须为每种组织提供相应的培养基，并防止各流路之间培养基的自由交换。特别是在构建双相骨软骨组织时，未分化间充质干细胞（MSCs）的分化命运取决于其所接触的培养基。在当前的设计中，我们采用明胶基水凝胶作为支架，该支架不仅为细胞生长提供模板，还可封闭组织与插入物壁之间可能存在的间隙。因此，至关重要的是 原位 在插入物内对凝胶进行光交联。此外，在成骨培养基和软骨诱导培养基中分别添加生长因子BMP7和TGFβ3。为了维持这些生长因子数天内的生物活性，新鲜培养基在加入芯片培养系统前必须置于培养箱外。因此，我们需要使用注射器从储液池中抽出培养基，而不是将培养基直接注入培养箱内的系统中。
操作生物反应器时另一个关键点是避免产生不必要的压力。组织依靠与.......
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披露
作者声明无竞争利益。
致谢
本研究主要由美国国立卫生研究院（National Institutes of Health）资助（项目编号：UG3/UH3TR002136，UG3/UH3TR003090）。此外，我们感谢华盛顿大学的Paul Manner博士提供人体组织样本，以及Jian Tan博士在分离间充质干细胞和建立细胞库过程中提供的帮助。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 3-异丁基-1-甲基黄嘌呤 | Sigma -Aldrich | I17018-1G | |
| 6 孔非组织培养板 | Corning Falcon® Plates | 351146 | |
| 24 孔非组织培养板 | Corning Falcon® Plates | 351147 | |
| 30 mL 注射器 | BD Syringe Luer Lock Cascade Health | 302832 | |
| 阿辛蓝染色液 | EK Industries | 1198 | 1% w/v，pH 1.0 |
| 高级 DMEM 培养基 | Gibco | 12491-015 | |
| αMEM | Gibco | 12571-063 | |
| 抗生素-抗真菌剂 | Gibco | 15240-062 | |
| 活检打孔器 | Integra Miltex | 12-460-407 | |
| BODIPY® 荧光染料 | Molecular Probes | ||
| 骨形态发生蛋白 7 (BMP7) | Peprotech | ||
| 弯头镊子 | Fisher Brand | 16100110 | |
| DMEM | Gibco | 11995-065 | 杜氏改良伊格尔培养基（Dulbecco’s Modified Eagle Medium） |
| 地塞米松 | Sigma -Aldrich | 02-05-2002 | |
| E-Shell 450 光敏聚合物 | EnvisionTec | RES-01-4022 | |
| 胎牛血清 | Gemini-Bio Products | 900-208 | |
| GlutaMAX | Gibco | 3505-061 | |
| 牛皮来源明胶 | Hyclone | 1003372809 | |
| Hank’s 平衡盐溶液 | Sigma -Aldrich | SH30588.02 | |
| 吲哚美辛 | Sigma -Aldrich | I7378-56 | |
| 胰岛素-转铁蛋白-硒-乙醇胺（ITS） | Gibco | 51500-056 | |
| 白细胞介素 1β | Peprotech | 200-01B | |
| 鲁尔锁接头 | Cole-Parmer Instruments | 45508-50 | |
| L-脯氨酸 | Sigma -Aldrich | 115388-93-7 | |
| β-甘油磷酸钠 | Sigma -Aldrich | 1003129352 | |
| 培养基袋 | KiYATEC | FC045 | |
| 甲基丙烯酸酐 | Sigma -Aldrich | 102378580 | |
| 磷酸盐缓冲液 | Corning | 21-040-CM | |
| 尖头镊子 | Fisher Brand | 12000122 | |
| 硅胶模具 | McMaster-Carr | RC00114P | |
| 硅胶 O 型圈 | McMaster-Carr | ZMCCs1X5 | 1 mm × 5 mm |
| SolidWorks | Dassault Systèmes SE, Vélizy-Villacoublay, France | ||
| 手术刀片 | Integra Miltex | 4-122 | |
| 注射泵 | Lagato210P, KD Scientific | Z569631 | 10 个注射器架 |
| T-182 组织培养瓶 | Fisher Brand | FB012939 | |
| 组织培养皿 150 mm | Fisher Brand | FB012925 | |
| 转化生长因子 β (TGF-β3) | Peprotech | 100-36E | |
| 胰蛋白酶 | Gibco | 25200-056 | |
| 紫外手电筒 | KBS | KB70109 | 395 nm |
| Vida 桌面 3D 打印机 | EnvisionTec | ||
| 维生素 D3 | Sigma -Aldrich | 32222-06-3 | 1,25-二羟基维生素 D3 |
参考文献
- Safiri, S., et al. Global, regional and national burden of osteoarthritis 1990-2017: A systematic analysis of the Global Burden of Disease Study 2017. Annals of the Rheumatic Diseases. 79 (6), 819-828 (2020).
- Lawrence, R. C., et al.
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重印与许可
