利用荧光素黄在顶膜外翻肠类器官模型中测定肠道通透性

摘要

本实验方案介绍了一种利用顶端朝外的肠类器官模型中荧光黄染料测定肠道通透性的方法。该方法可用于评估模拟坏死性小肠结肠炎等炎症性肠病的肠类器官的细胞旁通透性。

摘要

类器官是研究坏死性小肠结肠炎（necrotizing enterocolitis, NEC）等炎症性肠病的新兴研究工具。传统上，肠类器官以基底外侧朝外（basolateral-out, BO）构型培养，其中上皮细胞的顶膜面向类器官内部腔隙。在此模型中，对类器官腔面进行处理和实验操作较为困难，限制了宿主与病原体相互作用的研究。为克服这一局限，已建立一种用于坏死性小肠结肠炎研究的新生儿顶膜朝外（apical-out, AO）类器官模型。由于肠上皮细胞通透性的改变是NEC的特征性病理表现，本实验方案采用荧光黄（lucifer yellow, LY）作为细胞旁路通透性的标记物。LY可穿过肠上皮屏障 通过 三种主要的细胞旁通路：孔道通路、渗漏通路和非限制性通路。在AO模型中使用LY可对NEC中的通透性进行更广泛的研究。在获得机构审查委员会批准及家长知情同意后，采集早产新生儿的人体肠道组织手术样本，并分离肠道干细胞。 通过 隐窝分离并用于培养肠类器官。肠类器官培养至成熟后，转化为AO构型或保持在BO构型。随后，这些类器官未接受处理（对照组）或经脂多糖（LPS）处理并置于低氧条件下以诱导 体外 NEC。采用LY评估通透性。顶端蛋白闭合蛋白-1（zonula occludens-1）和基底外侧蛋白β-catenin的免疫荧光染色证实了AO的构象。与对照组相比，经LPS和缺氧处理的AO和BO类肠体均表现出显著增加的旁细胞通透性。与对照组相比，AO和BO类肠体在处理后均显示出更多的LY进入类肠体腔内。在AO类肠体模型中使用LY可研究旁细胞通透性的全部三种主要途径。此外，该模型还可用于研究宿主-病原体相互作用及其对通透性的影响，相较于BO类肠体模型具有优势。

引言

类肠体是由局限于器官的人肠干细胞衍生而来的三维（3D）结构^1,2。它们完全由上皮细胞谱系构成，并包含所有分化类型的肠上皮细胞²。类肠体还维持细胞极性，其结构包括形成内部腔室的顶侧管腔面以及朝向周围培养基的基底外侧表面。类肠体是一种独特的模型，因其保留了来源宿主的特征³。因此，来源于早产人类婴儿的类肠体可作为研究主要影响该人群疾病（如坏死性小肠结肠炎，NEC）的有用模型。

传统的肠类器官模型以基底侧朝外（BO）构型培养，其中肠类器官被包裹在基底膜基质（BMM）形成的穹顶状结构中。BMM诱导肠类器官维持三维结构，使基底侧表面朝向外侧。BO肠类器官是一种适用于坏死性小肠结肠炎（NEC）研究的模型，可填补二维（2D）原代人源细胞系与体内动物模型之间的空白^2,4。在该模型中，通过将病原体（如LPS或细菌）加入肠类器官周围的培养基中，再暴露于缺氧环境，从而诱导NEC的发生^2,3。BO肠类器官NEC模型的局限性在于，其无法有效研究在体内发生于顶膜表面的宿主-病原体相互作用。肠道通透性的改变正是由这些宿主-病原体相互作用所引起。为了更深入理解通透性如何影响疾病的病理生理基础，必须建立一种能够对顶膜表面进行处理的模型。

Co 等人. 首次证明了通过去除BMM穹顶并将成熟的BO类器官重悬于培养基中，可诱导其形成顶膜外翻（AO）构型⁵本文表明，AO类器官维持了正确的上皮极性，包含所有类型的肠细胞，保持了肠上皮屏障的完整性，并可接触其顶膜表面。⁵使用AO类器官作为坏死性小肠结肠炎模型可实现对该疾病过程的生理学再现，并可用于研究宿主与病原体之间的相互作用。

坏死性小肠结肠炎病理生理学的一个主要因素是肠道通透性增加⁶已有多种分子被提议用于检测肠道通透性 体外⁷其中，荧光黄（lucifer yellow, LY）是一种亲水性染料，其激发峰和发射峰分别为428 nm和540 nm。⁸由于它能够穿过所有主要的旁细胞通路，因此已被用于评估多种应用场景中的旁细胞通透性，包括血脑屏障和肠上皮屏障^8,9传统的LY应用使用在半透性表面上生长的单层细胞¹⁰荧光素黄（LY）被施加于上皮细胞的顶膜表面，通过细胞旁路的紧密连接蛋白穿过细胞层，聚集于基底外侧。基底外侧腔室中较高的LY浓度表明紧密连接蛋白减少，继而导致肠道上皮细胞屏障破坏及通透性增加。¹⁰在3D BO类肠体模型中也有相关描述，其中将LY加入培养基，并对单个类肠体进行成像，以观察LY进入腔内的摄取情况¹¹尽管这允许进行定性分析 通过 LY摄取的可视化，其定量分析仍受限。本方案概述了一种独特技术，利用LY评估细胞旁通透性，采用一种 体外 在保持三维结构取向的同时，于AO类肠体中建立NEC类肠体模型。该方法可用于通透性的定性与定量分析。

方案

本研究在获得俄克拉荷马大学机构审查委员会（IRB，编号 #11610、11611）批准后进行。根据机构审查委员会的规定，在采集人类手术标本前需取得家长知情同意。在获得机构审查委员会批准及家长知情同意后，从接受坏死性小肠结肠炎（NEC）或其他肠道切除手术（如造口闭合术或闭锁修复术）的婴儿体内获取了人小肠组织。这些婴儿在样本采集时的校正胎龄（GA）为 36–41 周，均有早产史（估计胎龄为 25–34 周），性别比为 2:1（男:女）。类器官由取自空肠或回肠的组织建立。

1. 来自人类婴儿的肠类器官培养：从完整组织中分离和接种隐窝

1. 按照先前报道的方法制备培养基、螯合缓冲液#1和螯合缓冲液#2（表1）⁴。将螯合缓冲液储存于4 °C，并在48小时内使用。
2. 制备人源类肠道培养基（表1）。将储备液保存于−20 °C，使用前在37 °C水浴中预热。
3. 制备50% L-WRN条件培养基（CM）（表1）。储备液可于4 °C保存最多1周。
   注：条件培养基所用的100% L-WRN基础培养基详见Miyoshi等人的实验方案¹²。
4. 根据先前报道的方法，从小肠组织样本（来自手术标本）中建立肠类器官（enteroids）⁴。取0.75–2.5 g肠组织，接种至24孔板中的四个孔。
   ​注：肠类器官可成功从在4 °C下、50 mL锥形管中含30 mL Roswell Park Memorial Institute（RPMI）1640培养基中保存最多48小时的组织中获得。
5. 将24孔板倒置于37 °C、5% CO₂ 培养箱中15–20分钟，以促进基底膜基质（BMM） dome的聚合⁴。
6. 向每孔加入500 µL 50% L-WRN CM（如步骤1.3所述）和0.5 µL Y-27632（ROCK抑制剂，RI；见材料表）。2–3天后，更换为不含RI的50% L-WRN CM。

2. AO 类器官的生成

1. 在含有50% L-WRN CM⁴的BMM中培养类肠体，持续7-10天。
2. 移除培养基，向一个孔中加入500 µL细胞回收溶液（CRS，参见材料表）。刮取类器官穹顶结构，用移液器反复吹打数次，然后将CRS/类肠体/BMM混合液转移至下一个孔中。
3. 再次刮取穹顶结构，反复吹打，将溶液转移至微量离心管中。向第二个孔中加入500 µL CRS，吹打混匀后转移至第一个孔中。将该混合液一并转移至同一支1.5 mL微量离心管中。
4. 重复步骤2.3，将两个孔的样品汇集至同一支微量离心管中，直至所有孔的内容物均被收集至CRS中。
   注意：若需制备大量AO类肠体，可将两个以上孔的样品汇集至一个较大的15 mL锥形离心管中。保持每孔500 µL CRS的比例至关重要，以确保BMM完全溶解。
5. 将含有汇集后CRS/类肠体/BMM混合液的微量离心管（步骤2.3）置于旋转仪上，在4 °C下旋转孵育1小时，以溶解BMM。
6. 在4 °C下以200 x g离心3分钟，随后用移液器小心去除上清液，保留沉淀。
7. 每支微量离心管中加入1 mL步骤1.3配制的50% L-WRN CM重悬类肠体沉淀。轻柔吹打混匀后，取500 µL重悬的类肠体/培养基混合液加入超低吸附24孔细胞培养板的每个孔中（参见材料表）。
8. 实验前于37 °C、5% CO₂条件下孵育3天。

3. AO类器官构象的验证 通过 整体免疫荧光染色

1. 将类肠器官在培养基悬浮液中孵育3天后，用移液器将一个孔中的类肠器官/培养基悬浮液转移至微量离心管中。
2. 在4 °C条件下，以200 × g 离心5分钟，离心类肠器官/培养基悬浮液。用微量移液器弃去上清液。
3. 将类肠器官重悬于20 µL基质胶（BMM）中。取10 µL类肠器官悬浮液滴加到显微镜载玻片上，并将其铺展成约1 cm × 1 cm的薄层。在载玻片的另一区域重复操作，使用剩余的10 µL类肠器官悬浮液，使载玻片上形成两个类肠器官/BMM悬浮液涂片。
4. 让类肠器官/BMM涂片在室温（RT）下固化15分钟。
5. 在通风橱内操作，将载玻片放入染色缸中，并加入4%多聚甲醛至完全覆盖类肠器官/BMM涂片（若使用可容纳10张载玻片的玻璃染色缸，则每张载玻片约需30 mL）。在室温下静置30分钟，以完成固定。
   注意：4%多聚甲醛具有危害性，可能导致眼部损伤/刺激、皮肤刺激以及致癌。使用时务必在通风橱内操作，佩戴防护手套和个人防护装备。废弃时应放入经批准的废液容器中。
6. 将4%多聚甲醛倒入适当的废液容器中。向染色缸中加入30 mL磷酸盐缓冲液（PBS），或加至完全覆盖类肠器官/BMM涂片。室温下静置3分钟，然后将PBS倒入多聚甲醛废液瓶中。重复此步骤两次，共进行三次洗涤。
7. 在新的染色缸中加入30 mL用PBS稀释的0.5% Triton X-100溶液。将带有类肠器官/BMM涂片的载玻片放入Triton溶液中，在室温下透化处理20分钟。
8. 弃去用PBS稀释的0.5% Triton X-100溶液。向染色缸中加入30 mL PBS，静置3分钟，然后倾倒弃去PBS。
9. 轻轻擦拭载玻片上类肠器官/BMM涂片周围的区域，注意不要破坏涂片。使用疏水屏障笔（PAP屏障笔，参见材料表）在每个类肠器官/BMM涂片周围画一个圆圈。配制20%血清溶液，该血清应与二抗来源动物相匹配（参见材料表）。
10. 将显微镜载玻片平放在实验台上。用移液器将步骤3.9中配制的100 µL 20%血清分别加至由疏水屏障笔圈定的每个类肠器官/BMM涂片上，在4 °C条件下封闭1小时。
11. 用PBS分别按1:100和1:200的比例稀释β-catenin和ZO-1一抗，配制100 µL混合溶液。
    注：两种一抗必须来源于不同动物，以确保成像时具有不同的免疫荧光通道。本研究使用小鼠来源的β-catenin抗体和兔来源的ZO-1抗体（参见材料表）。
12. 轻敲载玻片以去除20%血清，并轻轻擦干，注意不要破坏类肠器官/BMM涂片。向其中一个类肠器官/BMM涂片上加100 µL β-catenin/ZO-1一抗混合溶液。向另一个涂片上加100 µL不含一抗的PBS作为阴性对照。
13. 在塑料容器底部铺上湿润的纸巾，以形成一个加湿环境。将载玻片放入容器中，注意不要扰动覆盖在类肠器官/BMM涂片上的溶液。盖上盖子密封，并在4 °C条件下平放过夜。
    注：切勿让载玻片干燥。确保容器密闭，以防脱水。
14. 准备继续操作时，轻敲载玻片以去除类肠器官/BMM涂片上的一抗和PBS。
15. 将载玻片放入染色缸中，加入30 mL PBS或加至完全覆盖类肠器官/BMM涂片，进行洗涤步骤。室温下静置3分钟。弃去PBS，并重复该步骤两次，共进行三次洗涤。
16. 为两个不同的免疫荧光通道分别配制200 µL二抗溶液，每种二抗在PBS中的稀释比例为1:1000（参见材料表）。避光保存该溶液。
17. 向每个类肠器官/BMM涂片上加100 µL二抗溶液。避光静置1小时，室温孵育。
18. 轻敲载玻片以去除二抗。重复步骤3.15所述的洗涤步骤，所有洗涤过程均需在避光条件下进行。
19. 向每个类肠器官/BMM涂片上滴加一滴4′,6-二脒基-2-苯基吲哚（含DAPI的Fluoroshield封片剂，参见材料表），盖上盖玻片，确保两个涂片均被充分覆盖。避免在盖玻片下产生气泡。将载玻片避光保存，直至准备在显微镜下观察。
    ​注：立即成像可获得最佳结果；然而，载玻片可在4 °C的加湿容器中平放保存，并在加入DAPI后一周内完成成像。

4. 实验性坏死性小肠结肠炎的诱导

1. 确保AO类器官在使用前已悬浮培养至少72小时。
2. 将每个孔中的所有类肠体/培养基悬浮液轻柔地用移液器转移至微量离心管中。
   注意：若处理的孔数量较多，可将多个孔的液体合并至一个15 mL离心管中。本方案建议每个处理组至少设置三个复孔。
3. 以 300 x g 离心 g 室温下离心3分钟，弃上清液。
4. 加入10 µL浓度为5 mg/mL的脂多糖（LPS，参见 材料表) 加入500 µL 50% LWRN条件培养基至每孔（LPS终浓度为100 µg/mL）。
5. 将指定为处理组的AO类器官重悬于50% LWRN + LPS中，并将500 µL悬液分装至24孔超低吸附培养板中。将指定为未处理对照组的AO类器官以每孔500 µL的50% LWRN CM重悬，取500 µL该悬液分装至另一块24孔超低吸附培养板中。
6. 在LPS处理的AO类器官中诱导缺氧 通过 模块化培养箱（MIC），含1% O₂₂，5% CO₂₂，以及94% N₂ 按照制造商的说明（参见 材料表用低氧和LPS处理类肠体24 h。
7. 将未经处理和经LPS+缺氧处理的培养物（仍置于MIC腔室中）放入37 °C、5% CO₂培养箱中₂ 孵育箱中孵育24小时。

利用LY测定细胞旁通透性

1. 将每个孔中的类肠体/培养基悬浮液轻轻吹打转移至微量离心管中。将DPBS和50% LRWN CM置于37 °C水浴中预热。
2. 在室温下以300 × g 离心3分钟，使类肠体/培养基悬浮液沉淀。
3. 移除上清液。用500 µL预热的DPBS洗涤类肠体。
4. 在室温下以300 × g 离心3分钟，然后用移液器小心吸除上清液。
5. 重复步骤5.3–5.4一次，共洗涤两次。
6. 洗涤完成后，向每个样本中加入450 µL预热的50% LWRN CM（按步骤1.3配制）。
7. 向每孔中加入50 µL浓度为2.5 mg/mL的LY（终浓度为0.25 µg/µL，参见材料表），轻轻摇晃混匀。将培养板置于37 °C、5% CO₂培养箱中孵育2小时。
8. 将每个孔中的类肠体/培养基悬浮液轻轻吹打转移至微量离心管中。
9. 在室温下以300 × g 离心3分钟，然后移除上清液，保留类肠体沉淀。
10. 用500 µL预热的DPBS洗涤类肠体。
11. 在室温下以300 × g 离心3分钟，然后移除上清液，保留类肠体沉淀。
12. 重复步骤5.10–5.11三次，共完成四次洗涤。
13. 将每份沉淀用1,000 µL冷DPBS重悬，并剧烈吹打上下混合，以充分解离类肠体。
14. 用DPBS配制LY标准品系列（100 ng/mL；50 ng/mL；25 ng/mL；12.5 ng/mL；6.25 ng/mL；3.13 ng/mL；1.57 ng/mL；0 ng/mL），用于绘制标准曲线。
15. 在96孔板中，每份样本取150 µL加入每孔，每个样本设三个复孔。
16. 使用具备荧光检测功能的酶标仪（参见材料表），在激发波长428 nm、发射波长536 nm处测定荧光值。利用统计分析软件（参见材料表），通过四参数曲线拟合方法对标准曲线进行插值计算，得出各样本的浓度。

结果

AO构象
在50% LWRN培养基中悬浮培养72小时的肠类器官呈现AO构型（图1）。这一点得到了证实 通过 利用类器官全 mount 标本对顶端蛋白闭合蛋白-1（ZO-1）和基底外侧蛋白β-catenin 进行免疫荧光染色图1）。AO类器官显示ZO-1（绿色）位于类器官的外侧顶端表面，而β-catenin（红色）位于内侧基底外侧表面（图1A）。小肠类器官显示相反情况，β-catenin（红色）位于外表面，ZO-1（绿色）位于内侧的管腔表面（图1B这些结果显示出预期的极性反转，以确认在实验前类肠体具有顶侧朝外（AO）的构型。

LY 检测结果
肠组织类器官腔内LY染料摄取增加表明通透性升高，这在坏死性小肠结肠炎（NEC）中预期会出现

讨论

肠道通透性复杂，可反映上皮屏障功能。肠道屏障由单层上皮细胞构成，介导跨细胞和旁细胞转运¹⁴。旁细胞通透性依赖于紧密连接蛋白，这些蛋白封闭上皮细胞之间的间隙¹⁴。在旁细胞转运中，分子可通过三种不同的途径穿越屏障：孔道途径、渗漏途径和非限制性途径¹⁵。孔道途径允许小的带电离子通过，而渗漏途径则允许较大的非带电分子通过¹⁵。第三种非限制性途径反映了因上皮损伤或死亡所导致的通透性增加¹⁶。尽管有多种分子可用于评估旁细胞通透性，但所用分子的类型和大小会影响所研究的通透性途径。

作为一种小分子亲水性物质，LY 可穿过所有三种细胞旁路途径，因此是研究细胞旁路通透性的理想工具。相比之下，作为细胞旁路通透性标志物的 4 kDa FITC-葡聚糖（一种糖分子），只能通过渗漏途径和非限制性途径。而分子量更大的 70 kDa FITC-葡聚糖则仅限于非限制性途径。另一种...

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
[leu] 15-胃泌素 1	Millipore Sigma	G9145-.1MG
100 µm 无菌细胞滤筛	Corning	431752
100% LWRN 条件培养基	按 Miyoshi 等人方法自行制备12
24 孔组织培养板	Corning	3526
96 孔黑色、透明底板	Greiner Bio-One	655090
A-83-01	R&D Systems	2939/10
Alexa Fluor 488 山羊抗兔二抗，1:1000	Invitrogen	A-11034
Alexa Fluor 594 山羊抗鼠二抗，1:1000	Invitrogen	A-11032
两性霉素 B	Thermo Fisher Scientific	15290026
抗紧密连接蛋白-1（zonula occludens-1）兔单克隆一抗，1:200	Cell Signaling	#D6L1E
抗β-连环蛋白（β-catenin）鼠单克隆一抗，1:100	Cell Signaling	#14-2567-82
B-27 添加剂（不含维生素 A）	Thermo Fisher Scientific	17504-044
屏障式 PAP 笔	Scientific Device Laboratory	9804-02
BMM（Matrigel）	Corning	CB-40230C
细胞回收溶液	Corning	354270
解剖剪
DMEM	Thermo Fisher Scientific	11-965-118
DMEM/F-12	Thermo Fisher Scientific	11320-082
DPBS	Thermo Fisher Scientific	14-190-144
表皮生长因子（EGF）	Millipore Sigma	GF144
乙二胺四乙酸（EDTA）	Millipore Sigma	EDS-500G
EVOS m7000 成像系统	Invitrogen	AMF7000
胎牛血清（FBS）	Gemini Bio-Products	100-525
含 DAPI 的 Fluoroshield 封片剂	Millipore Sigma	F6057-20mL
镊子
庆大霉素	Thermo Fisher Scientific	15-750-060
玻璃盖玻片
GlutaMAX	Thermo Fisher Scientific	35050-061
GraphPad Prism 9	Dotmatics
胰岛素	Thermo Fisher Scientific	12585014
脂多糖（LPS）	Millipore Sigma	L2630-25MG
荧光黄 CH 锂盐（Lucifer Yellow CH, Lithium Salt）	Invitrogen	L453
模块化培养箱	Billups Rothenberg Inc.	MIC101
N-2 添加剂	Thermo Fisher Scientific	17502-048
N-2-羟乙基哌嗪-N-2-乙磺酸（HEPES）	Thermo Fisher Scientific	15630-080
N-乙酰半胱氨酸	Millipore Sigma	A9165-5G
烟酰胺	Millipore Sigma	N0636-100G
青霉素-链霉素	Thermo Fisher Scientific	15140-148
带制冷功能的摆桶式离心机
带制冷功能的台式微量离心机
RPMI 1640 培养基	Thermo Fisher Scientific	11875093
SB202190	Millipore Sigma	S7067-5MG
SpectraMax iD3 微孔板读板仪	Molecular devices
Tube Revolver 旋转混合仪	ThermoFisher Scientific	88881001
超低吸附 24 孔组织培养板	Corning	3473
Y-27632，ROCK 抑制剂（RI）	Tocris	1254