本实验方案开发了一种利用蓝光LED照射技术估测薄层色谱板上化合物产率的方法。该方法具有安全、高效、成本低廉的优点，并可使研究人员同时测量多个样品。
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摘要
摘要
薄层色谱法（TLC）是一种易于实施的分析技术，已广泛应用于有机化学研究中，用于定量未知样品的产率。本研究建立了一种利用蓝光LED照明器估算TLC板上样品产率的有效、廉价且安全的方法。实验以从Aspergillus terreus中提取的洛伐他汀作为示例化合物。基于洛伐他汀标准品建立的回归模型用于评估洛伐他汀的产率。比较了三种方法：生物测定法、紫外检测法和蓝光LED照射法。结果表明，蓝光LED照射法在时间效率上显著优于紫外检测法和生物测定法。此外，由于生物测定法存在生物危害风险（如微生物感染），紫外检测法存在紫外线暴露风险，蓝光LED照射法相对更为安全。与需要专用仪器且独立操作前需长期培训的昂贵方法（如气相色谱法GC、高效液相色谱法HPLC和高效薄层色谱法HPTLC）相比，使用蓝光LED照明器是一种经济可行的TLC板样品产率估算方案。
引言
薄层色谱法（TLC）在有机化学领域被广泛用作一种定性和定量分析技术1,2,3。TLC 的主要优点在于其检测速度快、样品需求灵活，且无需专用设备4。迄今为止，尽管已建立多种先进方法，薄层色谱法仍是鉴定混合物中未知样品的主要手段。然而，该方法面临的挑战在于缺乏安全且低成本的设备来量化样品产率，尤其是在预算有限的发展中实验室中。因此，本研究旨在开发一种高效、安全且低成本的方法，与薄层色谱法结合使用，以估算样品的产率。
与高效薄层色谱（HPTLC）、高效液相色谱（HPLC）和气相色谱（GC）相比，这些方法对样品要求严格、耗时较长且样品前处理步骤繁琐1,5，而薄层色谱（TLC）具有多项优势。首先，在样品前处理方面，HPLC 和 GC 无法检测粗提物，因为粗提物可能堵塞 HPLC 和 GC 的色谱柱。其次，当样品不适合紫外检测（HPLC 分析的关键要求）或挥发性较低（GC 分析的关键要求）时，TLC 仍可用于此类样品，且通过使用显色试剂，可使分离出的样品在薄层板上清晰可见6,
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方案
本方案以洛伐他汀为例进行描述。 洛伐他汀从培养一周的土曲霉中提取。
1. 化合物提取
注意：有关化合物提取的详细信息，请参见图1。
- 在马铃薯葡萄糖琼脂（PDA，参见材料表）培养基上，于30 °C培养Aspergillus terreus。
- 于40 °C干燥培养物24 h。使用灭菌镊子将干燥的培养物转移至50 mL离心管中，并加入15 mL乙酸乙酯。
- 涡旋振荡混合物1 min，使其充分混匀，随后在40 °C、200 rpm振荡条件下孵育1 h。
- 使用40 kHz超声波清洗仪（参见材料表），在40 °C条件下对混合物进行1 h超声处理。
- 在室温下以5,000 x g离心1 min，随后通过11 µm滤纸过滤。
- 在分液漏斗中用等体积的无菌水萃取滤液。
- 相分离后，收集有机相，然后在旋转蒸发仪（参见材料表）中蒸发溶剂。将残留物溶解于2 mL乙酸乙酯中。
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结果
本研究提出了利用蓝光LED照射法来估算化合物的产量，并对该方法进行了验证，同时与生物测定法和紫外检测法进行了比较（表1）。针对这三种方法，分别基于条带尺寸与标准品浓度建立了回归模型，用于预测样品的产量。首先，在生物测定法的结果中，抑菌圈尺寸与洛伐他汀标准品之间的决定系数（R²）为0.99，回归模型预测的样品产量为0.56 mg（图2）。其次，在紫外检测法中，洛伐他汀标准品与薄层色谱板上条带尺寸之间的R²为0.97，回归模型预测的样品产量为0.53 mg（图3）。值得注意的是，条带边缘模糊，且观察到信号强度相对较低的条带（图3A）。第三，在蓝光LED照射法中，洛伐他汀标准品与薄层色谱板上条带尺寸之间的R²为0.98，回归模型预测的样品产量为0.54 mg（图4）。使用蓝光LED照射仪预测的产量更接近以生物测定法作为对照的结果。条带尺寸与洛伐他汀的含量成正比，且蓝光LED.......
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讨论
本研究介绍了一种新方法——蓝光LED照明仪，用于在无需使用高效薄层色谱（HPTLC）、高效液相色谱（HPLC）和气相色谱（GC）等昂贵且专用设备的情况下定量化合物，并将该方法与生物测定法和紫外检测法进行了比较，以评估其定量性能。结果表明，蓝光LED照射法是一种相对安全、有效的协议，可用于定量薄层色谱板上目标化合物的产率。
既往研究已报道了多种无需使用专用定量设备的定量方法，所有这些研究均表明，其定量准确性接近使用专用设备的水平2,9,10,11,12（表2）。例如，El-Gindy 等人10比较了基于高效液相色谱法（HPLC）和薄层色谱-光密度法（TLC-densitometri.......
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披露
所有作者均声明不存在利益冲突。
致谢
本研究由中国台湾科技部资助（MOST 108-2320-B-110-007-MY3）。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 美国细菌学琼脂 | Condalab | 1802.00 | |
| Aspergillus terreus | ATCC 20542 | ||
| 蓝光LED照明器 | MICROTEK | Bio-1000F | |
| 离心机 | Thermo Scientific | HERAEUS Megafuge 8 | |
| 小型紫外灯 | UVP | UVGL-25 | |
| 乙酸乙酯 | MACRON | MA-H078-10 | |
| 滤纸 125mm | ADVANTEC | 60311102 | |
| ImageJ | NIH | 免费软件 | https://imagej.nih.gov/ij/download.html |
| 洛伐他汀标准品 | ACROS | A0404262 | |
| MiBio Fluo | MICROTEK | V1.04 | |
| 正己烷 | C-ECHO | HH3102-000000-72EC | |
| OriginPro | OriginLab | 9.1 | https://www.originlab.com/origin |
| 马铃薯葡萄糖肉汤 H | STBIO MEDIA | 110533 | |
| 旋转蒸发仪 | EYELA | SB-1000 | |
| 硫酸 | Fluka | 30743-2.5L-GL | |
| 薄层色谱硅胶板 60 F254 | MERCK | 1.05554.0001 | |
| 三氟乙酸 | Alfa Aesar | 10229873 | |
| 超声波振荡仪 | DELTA | DC600 |
参考文献
- Pyka, A. Detection progress of selected drugs in TLC. BioMed Research International. 2014, 732078(2014).
- Hess, A. V. I. Digitally enhanced thin-layer chromatography: An inexpensive, new technique for qualitative and qua....
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