通过蓝光LED照明技术 估算 TLC板上化合物的产量

薄层色谱（TLC）被广泛用作有机化学领域的定性和定量技术¹，^2，3。TLC的主要优点是检测速度快，样品要求灵活，不需要专用设备⁴.迄今为止，尽管已经建立了许多先进的方法，但TLC仍然是识别混合物中未知样品的主要方法。然而，这种方法的挑战是缺乏安全且廉价的设备来量化样品产量，特别是对于开发预算有限的实验室。因此，本研究旨在开发一种高效、安全且廉价的方法，结合TLC来估计样品的产量。

与高效TLC（HPTLC）、高效液相色谱（HPLC）和气相色谱（GC）不同，TLC具有严格的样品要求，耗时长，并且涉及样品制备^的多步骤1，^5，TLC表现出几个优点。首先，对于样品制备，HPLC和GC无法检测到粗提取物，因为粗提取物可能会堵塞HPLC和GC的色谱柱。其次，当样品不适合紫外线（对HPLC分析很重要）或挥发性低（对GC分析很重要）时，可以将TLC应用于这些样品，并且使用可视化试剂使分离的样品在薄层⁶，^7，8上可见。第三，对于一般用户来说，与TLC相比，HPLC和GC在独立工作之前通常需要相对较长的预训练时间。此外，定量TLC分析，称为高性能TLC（HPTLC），可以使用高灵敏度扫描仪将TLC板上的信息数字化。然而，HPTLC系统的成本相对昂贵。因此，开发一种经济高效且快速的方法来定量TLC板上的样品是一个重要的主题。

已经开发了类似的TLC产量定量方法;例如，Johnson⁹ 报告了一种技术，该技术允许使用连接到计算机的平板扫描仪对TLC板上的样品进行定量。2001年，El-Gindy等人¹⁰ 开发了TLC-密度测定法，该方法用于检测具有光密度的化合物，该技术也被Elkady等人¹¹应用。2007年，Hess² 提出了数字增强TLC（DE-TLC）方法，该方法用于使用结合紫外光的数码相机检测TLC板上化合物的产量。Hess还比较了HPTLC和DE-TLC方法之间的成本差异，并得出结论，DE-TLC方法^{由于其可承受}的成本2而可用于高中和大学实验室。然而，TLC密度法的成本仍然昂贵，并且紫外线的操作需要足够的预培训，以防用户可能暴露于紫外线辐射。因此，与TLC兼容，开发一种高效，安全且廉价的方法来定量样品产量是可取的。

本研究描述了一种使用蓝光LED照明器检测TLC板上样品的协议，并开发了一种具有高可靠性（高R平方值）的回归模型来测量条带的尺寸，然后确定化合物产量。最后，发现蓝光LED照明方法相对安全（与紫外线检测方法），便宜（与GC、HPLC 和 HPTLC）以及用于产量定量的有效（与生物测定方法相比）。

使用洛伐他汀作为示例描述本协议。洛伐他汀是从一周大的 土曲霉中提取的。

1. 化合物萃取

注:有关化合物提取的详细信息，请参见 图1。

1. 在30°C的马铃薯葡萄糖琼脂（PDA，见材料表）培养基上培养土曲霉。
2. 将培养物在40°C干燥24小时。使用灭菌的镊子将干燥的培养物转移到50 mL管中，并加入15 mL乙酸乙酯。
3. 通过涡旋1分钟剧烈摇动混合物，并在40°C下以200rpm振荡孵育1小时。
4. 使用40kHz超声波浴（见 材料表）在40°C下超声处理混合物1小时。
5. 在室温下以5，000× g 离心混合物1分钟，并通过11μm滤纸过滤。
6. 在分离漏斗中用等体积的无菌水提取滤液。
7. 相分离后，收集有机层，然后在旋转蒸发器中蒸发（见 材料表）。将残留物溶解在 2 mL 乙酸乙酯中。

2. 通过正相（NP）吸附柱分离粗提物

1. 以NP硅胶为固定相填料柱，以正己烷:乙酸乙酯:三氟乙酸（H:E:T;80:20:0.1，v/v/v）为流动相。
2. 将2 mL提取物（步骤1）上样到色谱柱上，并以1 mL/min的流速加入流动相溶剂以洗脱提取物。
   注意:流量是使用旋塞阀手动控制的。
3. 通过TLC验证流出物以确认洛伐他汀的存在，然后在45°C的旋转蒸发器中蒸发，直到溶剂被除去。此步骤大约需要 20-25 分钟。
4. 将残留物溶解在1mL乙酸乙酯中，然后与等体积的1%三氟乙酸混合。
5. 在室温下以5，000× g 离心混合物1分钟，并将有机层收集在新玻璃管中。

3. 薄层色谱（TLC）板的制备和上样

1. 使用毛细管移液管将5μL样品和洛伐他汀标准品（参见 材料表）点到TLC板的基线上，在TLC板的侧面留下1cm的边界。
2. 在室温下将TLC板在通风橱中干燥5分钟。
3. 用镊子将板轻轻放入含有流动相溶剂的饱和玻璃室中。用玻璃盖盖住腔室，让板充分展开。
4. 当溶剂管线距离板顶部 1 厘米时，将板从腔室中取出。

4. 蓝光LED照明器分析

1. 用铅笔标记溶剂线。在室温下将板在通风橱中干燥10分钟。
2. 干燥后，立即将板浸泡在10%H₂SO₄ 溶剂中，然后在室温下在通风橱中干燥10分钟。
3. 将板放在加热板上，直到出现棕色斑点。确保板没有过热，因为这可能会使洛伐他汀的可视化变得困难。
4. 将印版转移到蓝色LED照明器，并使用兼容的免费软件（MiBio Fluo）进行扫描（参见 材料表）。

5. 通过回归模型估算产量

1. 使用 ImageJ 软件测量条带的尺寸（参见 材料表）。
2. 使用数据分析和绘图软件（参见 材料表）建立回归模型，基于洛伐他汀标准品的降序浓度，包括1 mg/mL、0.75 mg/mL、0.5 mg/mL和0.25 mg/mL。
3. 应用回归模型来估计样本的产量。

本研究介绍了用于估计化合物产量的蓝光LED照明方法，该方法得到了验证，并与生物测定和紫外线检测方法进行了比较（表1）。基于3种方法的条带维数和标准品浓度分别建立了回归模型，以预测样品的产量。首先，在生物测定方法的结果中，抑制区尺寸与洛伐他汀标准品尺寸之间的R平方为0.99，回归模型预测的样品产率为0.56mg（图2）。其次，在UV检测方法中，洛伐他汀标准品与TLC板上条带尺寸之间的R平方为0.97，回归模型预测的样品产率为0.53 mg（图3）。值得注意的是，波段的边缘模糊，观察到相对较低的信号强度波段（图3A）。第三，在蓝光LED照明方法中，洛伐他汀标准品与TLC板上条带尺寸之间的R平方为0.98，回归模型预测的样品产率为0.54 mg（图4）。使用蓝色LED照明器的预测产量更接近生物测定方法（设置为对照）。条带的尺寸与洛伐他汀的量成正比，采用blue-LED照明法获得清晰的条带。此外，生物测定、紫外检测和蓝光LED照明方法的工作时间分别约为24 h、2 h和1 h;（注:工作时间是指洛伐他汀产量检查所花费的总时间）。

图 1:协议的工作流程。 请单击此处查看此图的大图。

图2:生物测定方法。 （A）洛伐他汀对 神经孢子虫 的生物测定（在30°C下孵育24小时）。在试验结束时，在可见光下拍摄90毫米琼脂平板。（B）六种洛伐他汀标准品的浓度为:1号（1毫克/毫升）、2号（0.75毫克/毫升）、3号（0.5毫克/毫升）和4号（0.25毫克/毫升）。将5号样品稀释至0.25×（1:4）。将6号样品稀释至0.5×（1:2）。抑制区尺寸（mm2）由成像软件测量。（C）使用基于标准抑制区维度的数据分析和绘图软件开发了回归模型。 请点击此处查看此图的大图。

图 3:暴露于紫外光下的薄层色谱图 （TLC） 板。 （A）在TLC分析中以正己烷:乙酸乙酯（2:3 v/v）为流动相，在显影剂中浸泡后将TLC板暴露在紫外光（365 nm）（10% H2SO4）下。（B）六种洛伐他汀标准品的浓度为:1号（1毫克/毫升）、2号（0.75毫克/毫升）、3号（0.5毫克/毫升）和4号（0.25毫克/毫升）。将5号样品稀释至0.25×（1:4）。将6号样品稀释至0.5×（1:2）。抑制区尺寸（mm2）由成像软件测量。（C）使用基于TLC板上洛伐他汀标准条带尺寸的数据分析和绘图软件开发了回归模型。请点击此处查看此图的大图。

图 4:蓝色 LED 照明器扫描的薄层色谱图 （TLC） 板。 （A）在TLC分析中以正己烷:乙酸乙酯（2:3 v/v）作为流动相，用蓝光LED照明器扫描TLC板。（B）六种洛伐他汀标准品的浓度为:1号（1毫克/毫升）、2号（0.75毫克/毫升）、3号（0.5毫克/毫升）和4号（0.25毫克/毫升）。将5号样品稀释至0.25×（1:4）。将6号样品稀释至0.5×（1:2）。抑制区尺寸（mm2）由成像软件测量。（C）使用基于TLC板上洛伐他汀标准条带尺寸的数据分析和绘图软件开发了回归模型。请点击此处查看此图的大图。

表1:本研究中使用的三种检测方法的比较。

表2:以前方法和当前研究的比较。

补充图1:采用蓝光LED照明法扫描含有氨苄青霉素的薄层色谱（TLC）板。 （A）乙酸乙酯:甲醇（9:13 v/v）作为TLC分析中的流动相，用蓝光LED照明器扫描TLC板。（B）四种氨苄西林标准的浓度为:1号（100毫克/毫升）、2号（75毫克/毫升）、3号（50毫克/毫升）和4号（25毫克/毫升）。条带的尺寸由成像软件测量。（C）使用数据分析和绘图软件基于TLC板上氨苄青霉素标准条带的尺寸开发了回归模型。 请点击此处下载此文件。

补充图2:薄层色谱图（TLC）板，通过蓝光LED照明方法扫描阿布拉霉素。 （A）甲醇:在TLC分析中使用水（6:5 v/v）作为流动相，用蓝光LED照明器扫描TLC板。（B）四种阿布拉霉素标准品的浓度为:1号（50 mg/mL）、2号（40 mg/mL）、3号（30 mg/mL）和4号（20 mg/mL）。条带的尺寸由成像软件测量。（C）使用数据分析和绘图软件基于TLC板上阿布拉霉素标准条带的尺寸开发了回归模型。 请点击此处下载此文件。

所有作者都声明他们没有利益冲突。