本实验方案开发了一种利用蓝光LED照射技术估测薄层色谱板上化合物产率的方法。该方法具有安全、高效、成本低廉的优点，并可使研究人员同时测量多个样品。
需要JoVE订阅才能观看此内容。 请登录或开始免费试用
本文内容
摘要
摘要
薄层色谱法（TLC）是一种易于实施的分析技术，已广泛应用于有机化学研究中，用于定量未知样品的产率。本研究建立了一种利用蓝光LED照明器估算TLC板上样品产率的有效、廉价且安全的方法。实验以从Aspergillus terreus中提取的洛伐他汀作为示例化合物。基于洛伐他汀标准品建立的回归模型用于评估洛伐他汀的产率。比较了三种方法：生物测定法、紫外检测法和蓝光LED照射法。结果表明，蓝光LED照射法在时间效率上显著优于紫外检测法和生物测定法。此外，由于生物测定法存在生物危害风险（如微生物感染），紫外检测法存在紫外线暴露风险，蓝光LED照射法相对更为安全。与需要专用仪器且独立操作前需长期培训的昂贵方法（如气相色谱法GC、高效液相色谱法HPLC和高效薄层色谱法HPTLC）相比，使用蓝光LED照明器是一种经济可行的TLC板样品产率估算方案。
引言
薄层色谱法（TLC）在有机化学领域被广泛用作一种定性和定量分析技术1,2,3。TLC 的主要优点在于其检测速度快、样品需求灵活，且无需专用设备4。迄今为止，尽管已建立多种先进方法，薄层色谱法仍是鉴定混合物中未知样品的主要手段。然而，该方法面临的挑战在于缺乏安全且低成本的设备来量化样品产率，尤其是在预算有限的发展中实验室中。因此，本研究旨在开发一种高效、安全且低成本的方法，与薄层色谱法结合使用，以估算样品的产率。
与高效薄层色谱（HPTLC）、高效液相色谱（HPLC）和气相色谱（GC）相比，这些方法对样品要求严格、耗时较长且样品前处理步骤繁琐1,5，而薄层色谱（TLC）具有多项优势。首先，在样品前处理方面，HPLC 和 GC 无法检测粗提物，因为粗提物可能堵塞 HPLC 和 GC 的色谱柱。其次，当样品不适合紫外检测（HPLC 分析的关键要求）或挥发性较低（GC 分析的关键要求）时，TLC 仍可用于此类样品，且通过使用显色试剂，可使分离出的样品在薄层板上清晰可见6,7,8。第三，对于普通用户而言，与 TLC 相比，HPLC 和 GC 通常需要较长时间的独立操作前培训。此外，定量 TLC 分析，即高效薄层色谱（HPTLC），可通过高灵敏度扫描仪将 TLC 板上的信息数字化。然而，HPTLC 系统的成本相对较高。因此，开发一种经济高效且快速的 TLC 板样品定量方法是一个重要课题。
已有类似方法用于薄层色谱（TLC）产率的定量分析；例如，Johnson9 报道了一种通过将平板扫描仪连接至计算机来定量分析TLC板上样品的技术。2001年，El-Gindy 等人10 开发了TLC-光密度法（TLC-densitometric method），该方法利用光密度检测化合物，此后 Elkady 等人11 也应用了该技术。2007年，Hess2 提出了数字增强型薄层色谱法（digitally enhanced-TLC, DE-TLC），该方法结合数码相机与紫外光用于检测TLC板上化合物的产率。Hess 还比较了高效薄层色谱法（HPTLC）与DE-TLC方法的成本差异，并得出结论：由于DE-TLC成本低廉，适用于高中和大学实验室2。然而，TLC-光密度法的成本仍然较高，且紫外光源的操作需要经过充分培训，以避免使用者暴露于紫外辐射。因此，开发一种与TLC兼容、高效、安全且低成本的样品产率定量方法具有重要意义。
本研究描述了一种使用蓝光LED照明仪在薄层色谱板上检测样品的方案，建立了一个具有高可靠性的回归模型（高R平方值），用于测量条带的尺寸，进而确定化合物的产率。最后发现，蓝光LED照明法是一种相对安全的与. 紫外检测法），价格低廉（与. 气相色谱（GC）、高效液相色谱（HPLC）和高效薄层色谱（HPTLC），以及高效与生物测定法用于产量定量。
访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。
方案
本方案以洛伐他汀为例进行描述。 洛伐他汀从培养一周的土曲霉中提取。
1. 化合物提取
注意：有关化合物提取的详细信息，请参见图1。
- 在马铃薯葡萄糖琼脂（PDA，参见材料表）培养基上，于30 °C培养Aspergillus terreus。
- 于40 °C干燥培养物24 h。使用灭菌镊子将干燥的培养物转移至50 mL离心管中，并加入15 mL乙酸乙酯。
- 涡旋振荡混合物1 min，使其充分混匀，随后在40 °C、200 rpm振荡条件下孵育1 h。
- 使用40 kHz超声波清洗仪（参见材料表），在40 °C条件下对混合物进行1 h超声处理。
- 在室温下以5,000 x g离心1 min，随后通过11 µm滤纸过滤。
- 在分液漏斗中用等体积的无菌水萃取滤液。
- 相分离后，收集有机相，然后在旋转蒸发仪（参见材料表）中蒸发溶剂。将残留物溶解于2 mL乙酸乙酯中。
2. 通过正相吸附柱分离粗提物
- 使用非极性硅胶作为固定相装填色谱柱，并以正己烷:乙酸乙酯:三氟乙酸（H:E:T；80:20:0.1，v/v/v）作为流动相。
- 将2 mL提取物（步骤1）上样至色谱柱，以1 mL/min的流速加入流动相进行洗脱。
注意：流速通过旋塞手动控制。 - 采用薄层色谱法（TLC）检测流出液，确认洛伐他汀的存在，随后在45 °C下使用旋转蒸发仪蒸发至溶剂完全除去。此步骤约需20–25分钟。
- 将残留物溶于1 mL乙酸乙酯中，再加入等体积的1%三氟乙酸溶液并混合。
- 将混合液在室温下以5,000 × g 离心1分钟，收集有机层至新的玻璃试管中。
3. 薄层色谱（TLC）板的制备与点样
- 使用毛细管移液器将5 µL样品和洛伐他汀标准品（见材料表）点样至薄层色谱板的起始线上，薄层色谱板两侧各留出1 cm边缘。
- 将薄层色谱板在通风橱中室温下干燥5分钟。
- 用镊子轻轻将薄层板放入含有流动相溶剂的饱和玻璃展开槽中，用玻璃盖盖上展开槽，使薄层板充分展开。
- 当溶剂前沿上升至距薄层板顶端1 cm时，将薄层板从展开槽中取出。
4. 蓝光LED照射器分析
- 用铅笔标记溶剂线。在通风橱中于室温下干燥10分钟。
- 干燥后，立即将薄层板浸入10% H2SO4溶剂中，随后在通风橱中于室温下再干燥10分钟。
- 将薄层板置于加热板上，直至出现棕色斑点。注意避免过热，否则可能影响洛伐他汀的显色观察。
- 将薄层板转移至蓝光LED照明仪中，使用兼容的免费软件（MiBio Fluo）进行扫描（参见材料表）。
5. 利用回归模型进行产量估算
- 使用 ImageJ 软件（参见材料表）测量条带的尺寸。
- 基于洛伐他汀标准品的递减浓度（包括 1 mg/mL、0.75 mg/mL、0.5 mg/mL 和 0.25 mg/mL），利用数据分析与绘图软件（参见材料表）建立回归模型。
- 应用该回归模型估算样品的产量。
访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。
结果
本研究提出了利用蓝光LED照射法来估算化合物的产量，并对该方法进行了验证，同时与生物测定法和紫外检测法进行了比较（表1）。针对这三种方法，分别基于条带尺寸与标准品浓度建立了回归模型，用于预测样品的产量。首先，在生物测定法的结果中，抑菌圈尺寸与洛伐他汀标准品之间的决定系数（R²）为0.99，回归模型预测的样品产量为0.56 mg（图2）。其次，在紫外检测法中，洛伐他汀标准品与薄层色谱板上条带尺寸之间的R²为0.97，回归模型预测的样品产量为0.53 mg（图3）。值得注意的是，条带边缘模糊，且观察到信号强度相对较低的条带（图3A）。第三，在蓝光LED照射法中，洛伐他汀标准品与薄层色谱板上条带尺寸之间的R²为0.98，回归模型预测的样品产量为0.54 mg（图4）。使用蓝光LED照射仪预测的产量更接近以生物测定法作为对照的结果。条带尺寸与洛伐他汀的含量成正比，且蓝光LED...
访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。
讨论
本研究介绍了一种新方法——蓝光LED照明仪，用于在无需使用高效薄层色谱（HPTLC）、高效液相色谱（HPLC）和气相色谱（GC）等昂贵且专用设备的情况下定量化合物，并将该方法与生物测定法和紫外检测法进行了比较，以评估其定量性能。结果表明，蓝光LED照射法是一种相对安全、有效的协议，可用于定量薄层色谱板上目标化合物的产率。
既往研究已报道了多种无需使用专用定量设备的定量方法，所有这些研究均表明，其定量准确性接近使用专用设备的水平2,9,10,11,12（表2）。例如，El-Gindy 等人10比较了基于高效液相色谱法（HPLC）和薄层色谱-光密度法（TLC-densitometri...
访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。
披露
所有作者均声明不存在利益冲突。
致谢
本研究由中国台湾科技部资助（MOST 108-2320-B-110-007-MY3）。
访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。
材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 美国细菌学琼脂 | Condalab | 1802.00 | |
| Aspergillus terreus | ATCC 20542 | ||
| 蓝光LED照明器 | MICROTEK | Bio-1000F | |
| 离心机 | Thermo Scientific | HERAEUS Megafuge 8 | |
| 小型紫外灯 | UVP | UVGL-25 | |
| 乙酸乙酯 | MACRON | MA-H078-10 | |
| 滤纸 125mm | ADVANTEC | 60311102 | |
| ImageJ | NIH | 免费软件 | https://imagej.nih.gov/ij/download.html |
| 洛伐他汀标准品 | ACROS | A0404262 | |
| MiBio Fluo | MICROTEK | V1.04 | |
| 正己烷 | C-ECHO | HH3102-000000-72EC | |
| OriginPro | OriginLab | 9.1 | https://www.originlab.com/origin |
| 马铃薯葡萄糖肉汤 H | STBIO MEDIA | 110533 | |
| 旋转蒸发仪 | EYELA | SB-1000 | |
| 硫酸 | Fluka | 30743-2.5L-GL | |
| 薄层色谱硅胶板 60 F254 | MERCK | 1.05554.0001 | |
| 三氟乙酸 | Alfa Aesar | 10229873 | |
| 超声波振荡仪 | DELTA | DC600 |
参考文献
- Pyka, A. Detection progress of selected drugs in TLC. BioMed Research International. 2014, 732078(2014).
- Hess, A. V. I. Digitally enhanced thin-layer chromatography: An inexpensive, new technique for qualitative and quantitative analysis. Journal of Chemical Education. 84 (5), 842-847 (2007).
- Ullah, Q., Mohammad, A. Vitamins determination by TLC/HPTLC-a mini-review. Journal of Planar Chromatography - Modern TLC. 33 (5), 429-437 (2020).
- Chen, Z., Tao, H., Liao, L., Zhang, Z., Wang, Z. Quick identification of xanthine oxidase inhibitor and antioxidant from Erycibe obtusifolia by a drug discovery platform composed of multiple mass spectrometric platforms and thin-layer chromatography bioautography. Journal of Separation Science. 37 (16), 2253-2259 (2014).
- Duncan, J. D. Chiral separations: A comparison of HPLC and TLC. Journal of Liquid Chromatography. 13 (14), 2737-2755 (1990).
- Sherma, J. Thin-layer chromatography in food and agricultural analysis. Journal of Chromatography A. 880 (1-2), 129-147 (2000).
- Bocheńska, P., Pyka, A., Bocheńska, P., Bocheńska, B. Determination of acetylsalicylic acid in pharmaceutical drugs by TLC with densitometric detection in UV. Journal of Liquid Chromatography. 35 (10), 1346-1363 (2012).
- Poole, C. F. Planar chromatography at the turn of the century. Journal of Chromatography A. 856 (1-2), 399-427 (1999).
- Rapid Johnson, M. E. simple quantitation in thin-layer chromatography using a flatbed scanner. Journal of Chemical Education. 77 (3), 368-372 (2000).
- El-Gindy, A., Ashour, A., Abdel-Fattah, L., Shabana, M. M. First derivative spectrophotometric, TLC-densitometric, and HPLC determination of acebutolol HCL in presence of its acid-induced degradation product. Journal of Pharmaceutical and Biomedical Analysis. 24 (4), 527-534 (2001).
- Elkady, E. F., Mahrouse, M. A. Reversed-phase ion-pair HPLC and TLC-densitometric methods for the simultaneous determination of ciprofloxacin hydrochloride and metronidazole in tablets. Chromatographia. 73 (3-4), 297-305 (2011).
- Musharraf, S. G., Ul Arfeen,, Shoaib, Q., M, Development and validation of TLC-densitometric method for the quantification of a steroidal drug, danazol in its pharmaceutical formulations. Journal of Planar Chromatography - Modern TLC. 25 (4), 331-337 (2012).
访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。
重印与许可
标签
