斑马鱼幼鱼作为评估潜在放射增敏剂或保护剂的模型

摘要

斑马鱼最近被用作模型来验证潜在的辐射修饰因子。本实验方案详细描述了利用斑马鱼胚胎进行基于辐射的筛选实验的步骤，以及一些用于评估不同处理和辐射效应的观察方法。

摘要

斑马鱼因其易于维护，且具备独特而便捷的模型系统特征，被广泛应用于多种研究领域。由于高增殖性细胞对辐射诱导的DNA损伤更为敏感，斑马鱼胚胎已成为辐射研究中首选的活体（in vivo）模型。此外，该模型可在短时间内呈现辐射及不同药物的作用效果，同时反映主要的生物学事件及相关应答反应。许多癌症研究已采用斑马鱼模型，本实验方案即基于放射治疗与癌症背景下辐射调节剂的应用。该方法可便捷地用于验证不同药物对经辐射处理和对照（未辐射）胚胎的影响，从而鉴定出具有放射增敏或放射保护作用的药物。尽管该方法已在大多数药物筛选实验中被使用，但有关实验细节以及在X射线辐射暴露背景下的毒性评估仍较为有限或仅被简要提及，导致实际操作存在困难。本方案旨在解决这一问题，详细阐述实验流程及毒性评估方法，并配以详尽图示说明。该操作流程提供了一种简便、可靠且可重复的方法，用于斑马鱼胚胎在辐射研究及基于辐射的药物筛选中的应用。

引言

斑马鱼（Danio rerio斑马鱼是一种在近30多年研究中被广泛使用的知名动物模型。它是一种小型淡水鱼，在实验室条件下易于饲养和繁殖。斑马鱼已被广泛应用于多种发育学和毒理学研究。^{1,2,3,4,5,6,7,8}斑马鱼具有繁殖力强、胚胎发育周期短的特点；其胚胎适合追踪不同的发育阶段，具有良好的光学透明性，且易于进行多种遗传操作和高通量筛选平台应用。^{9,10,11,12,13,14}此外，斑马鱼提供了 整体上 利用体视显微镜或荧光显微镜可方便地研究其发育过程以及在不同有毒物质或因素作用下产生的各种畸形^7,15,16.

放射治疗是用于治疗癌症的主要治疗方式之一^{17,18,19,20,21,22,23,24}然而，癌症放射治疗需要潜在的辐射防护剂，以在杀伤恶性细胞的同时保护正常健康细胞免于死亡，或在涉及高能辐射的治疗过程中保障人类健康^{25,26,27,28,29}相反，研究人员也在探索强效的放射增敏剂，以提高放射治疗杀伤恶性细胞的效率，尤其是在靶向治疗和精准治疗中。^30,31,32,33因此，为了验证有效的辐射防护剂和增敏剂，亟需一种适用于半高通量药物筛选且能明确表现出辐射效应的模型。目前已有多种模型被用于辐射研究并参与药物筛选实验。然而，高等脊椎动物甚至是最常用的 体内 模型小鼠不适合大规模药物筛选，因为使用这些模型耗时长、成本高，且难以设计相应的筛选实验。同样，细胞培养模型则适用于多种高通量药物筛选实验。^34,35然而，涉及细胞培养的实验并不总是具有实用性、高度可重复性或可靠性，因为培养中的细胞行为可能因生长条件和动力学而发生显著变化。此外，不同类型的细胞对辐射的敏感性也存在差异。值得注意的是，二维（2D）和三维（3D）细胞培养系统并不能完全模拟整个生物体的情况，因此所获得的结果可能无法真实反映实际的放射毒性水平^36,37在这方面，斑马鱼在筛选新型放射增敏剂和放射防护剂方面具有多项优势。其易于操作、产卵量大、寿命短、胚胎发育迅速、胚胎透明以及体型小等特点，使其成为大规模药物筛选的合适模型。由于上述优点，实验可在短时间内重复进行，并可在体视显微镜下直接于多孔板中观察处理效果。因此，斑马鱼在涉及辐射研究的药物筛选领域正日益受到关注。^38,39.

斑马鱼作为筛选辐射修饰剂的可靠模型的潜力已在多项研究中得到证实^{40,41,42,43,44,45}。已有报道显示，在斑马鱼模型中，潜在的辐射防护剂（如纳米颗粒DF1、氨磷汀（WR-2721）、DNA修复蛋白KU80和ATM以及移植的造血干细胞）具有放射保护作用，而辐射增敏剂（如黄酮吡啶醇和AG1478）也表现出相应效应^{19,41,42,43,44,45,46}。利用相同的系统，已对DF-1（富勒烯纳米颗粒）在整体水平和器官特异性水平上的辐射防护效果进行了评估，并进一步探索了使用斑马鱼胚胎进行辐射防护剂筛选的应用价值⁴⁷。最近，Kelulut蜂蜜被报道在斑马鱼胚胎中具有辐射防护作用，可提高胚胎存活率，并防止器官特异性损伤、细胞DNA损伤及细胞凋亡⁴⁸。

类似地，所生成聚合物的辐射防护作用 通过 通过高通量筛选检测了Hantzsch反应在斑马鱼胚胎中的作用，其保护效应主要源于对细胞DNA损伤的防护⁴⁹在之前的一项研究中，采用斑马鱼模型结合该方法，发现亲脂性他汀类药物氟伐他汀可能具有放射增敏作用⁵⁰同样，金纳米颗粒被认为是一种理想的放射增敏剂，已在多项研究中得到应用。^51,52.

斑马鱼的胚胎发育在最初的3小时内经历卵裂阶段，此时单细胞合子分裂形成2细胞、4细胞、8细胞、16细胞、32细胞和64细胞阶段，这些阶段可通过体视显微镜轻松识别。随后，胚胎在受精后2.25小时（hpf）达到囊胚期，此时细胞数量为128个，此后细胞每15分钟翻倍，依次经历256细胞（2.5 hpf）、512细胞（2.75 hpf），并在短短3小时内达到1,000多个细胞（图1）。在4小时时，卵子进入球形期，随后胚胎团形成穹顶状结构^7,53,54。斑马鱼的原肠作用始于5.25 hpf⁵⁴，此时达到盾形期。盾形结构清晰地指示了细胞向胚环一侧快速汇聚的运动（图1），是原肠期胚胎中一个显著且明确的阶段，易于识别^53,54。尽管对胚胎的辐射暴露可在其发育的任何阶段进行，但在原肠作用期间进行辐射暴露可能引起更明显的形态学变化，从而更有利于评估辐射诱导的毒性效应⁵⁵；类似地，对胚胎给药可早在2 hpf即开始⁵⁴。

方案

本研究在获得生命科学研究所（布巴内斯瓦尔）机构动物伦理委员会事先批准并遵循其指南的情况下进行。所有斑马鱼的饲养和繁殖均在28.5 °C的常温养殖设施中进行，胚胎则置于生化需氧量（BOD）培养箱中，于28.5 °C条件下培养。实验中使用斑马鱼AB品系，胚胎发育阶段的鉴定依据Kimmel等人的方法⁵⁴。在受精后6小时（盾牌期）进行X射线照射，并持续观察至受精后120小时，记录不同表型变化。

1. 繁殖设置与胚胎收集

1. 设置繁殖用鱼缸（由聚碳酸酯制成，容量1 L，参见材料表）。将系统用水（pH值为6.8–7.5，电导率为500 µS，温度为28.5 °C）注入繁殖鱼缸，水量约为鱼缸体积的40%。将分隔板放入鱼缸中，形成两个独立腔室，分别用于放置雌鱼和雄鱼。
2. 从亲鱼饲养缸中，使用网小心捕获两条健康雌鱼和一条健康雄鱼，分别放入鱼缸的对应腔室中，并在28.5 °C黑暗条件下过夜（至少10小时）。
3. 次日早晨，移除分隔板，让鱼类自由交配，过程中避免扰动繁殖鱼缸。
   注意：雌鱼将开始产卵，鱼类交配后10–15分钟内即可在鱼缸底部观察到卵粒^56,57,58。
4. 产卵结束后将亲鱼放回原饲养缸，使用滤网从繁殖鱼缸中收集胚胎，用系统用水充分清洗，然后将收集的卵置于含E-3培养基（4.94 mM NaCl、0.17 mM KCl、0.43 mM CaCl₂、0.85 mM MgCl₂ 盐类，1% w/v 亚甲蓝，参见材料表）的培养皿中。
5. 在体视显微镜下观察卵，使用巴斯德移液管移除未受精或已死亡的胚胎，并将含有受精卵的培养皿置于28.5 °C的培养箱中，在E-3培养基中进行正常发育与维持。
   注意：未受精卵表现为乳白色外观，卵膜凝固或卵膜内细胞破裂。除未受精卵外，还应剔除未发生卵裂、卵裂过程中出现异常（如不对称、囊泡形成）、卵膜损伤或发育停滞的卵，以确保所收集胚胎的健康状态并保持培养基清洁^7,56。

2. 胚胎监测及辐射实验的筛选

1. 在解剖显微镜下观察发育中的胚胎，确定正确的发育阶段^7,54，并移除任何死亡或不健康的胚胎。确保胚胎发育阶段准确，因为辐射和药物处理将在特定的原肠胚形成阶段进行。
   注意：每天检查培养皿中培养基的量和质量。每24小时更换一次培养基，并同时移除死亡的胚胎。建议使用巴斯德移液管进行挑选胚胎或更换培养基的操作。
2. 实验开始前，使用巴斯德移液管小心地将健康胚胎分配至实验用培养板中。每个实验组取15–20个胚胎。
   ​注意：仅将处于目标发育阶段的健康胚胎放入实验培养板中。若需在6 hpf（受精后6小时）对胚胎进行药物处理，则应至少提前30–60分钟开始将胚胎接种至实验板中。

3. 药物处理

1. 将所需浓度的药物加入斑马鱼胚胎中。提前准备好含药物的 E-3 培养基。在配制用于处理斑马鱼胚胎的工作液之前，确保药物的储备液中无未溶解的药物残留。
2. 在将任何药物加入用于辐射筛选的培养基之前，应使用不同梯度浓度的药物检测其细胞毒性效应。遵循 OECD 指南评估待测药物的 LC 50^59,60,61。
   ​注意：在进行照射或观察期间移动培养板和培养皿时需格外小心。操作过程中培养板极易受到扰动，可能导致培养基从孔中泄漏，或胚胎从原孔中溢出，进而污染邻近孔位，破坏实验结果。

4. X射线照射

1. 在设置辐射实验时，应包括对照组（非辐照组）和仅辐射组。同样，在进行药物筛选时，还需增设一组，在该组中给予与筛选实验相同浓度的药物，并联合辐射处理。
   注意：对孔板或培养皿的盖子和底部均进行标记，以防止盖子错放。
2. 若辐射屏蔽装置能够覆盖并保护部分孔免受辐射，而其他孔可暴露于特定辐射剂量下，则可将胚胎分配至同一块孔板的不同孔中；否则，应使用单独的培养板或培养皿，按不同辐射剂量分别接种胚胎。
3. 打开X射线辐照仪（见材料表），启动仪器初始化和预热程序。
   注意：源到受试物距离（SSD）必须为50 cm；虽然可使用其他SSD值，但需重新进行标准化校准。
4. 将实验用培养板置于仪器内辐照装置正下方中央位置，确保培养板位于X射线源正下方，然后设定所需剂量（例如5 Gy），并启动X射线辐照。
   注意：使用石蜡膜密封培养板，以避免在从培养箱转运至辐照仪及返回过程中发生意外泄漏或污染。
5. 完成辐照后，取出培养板，关闭仪器程序并切断电源，立即在显微镜下检查培养板中的胚胎状态。移除死亡胚胎，并将培养板放回28.5 °C的培养箱中继续培养。在体视显微镜下评估后，记录死亡胚胎数量。
   注意：对不同组别的胚胎进行指定剂量辐照时，各组之间应尽量减少时间延迟，因为胚胎发育阶段的差异可能显著影响辐射效应。
   ​警告：操作X射线仪器时，须采取适当的防护措施。

5. 数据采集、成像与分析

1. 在预定的时间间隔（例如照射辐射后每24小时）收集数据。记录所有可能的观察指标，如存活率、孵化效率、发育阶段、心跳次数、身体和尾部弯曲程度、心包水肿、卵黄囊延伸情况、小头畸形、 swim bladder（鳔）发育情况、总体运动能力或活动性等^62,63,64。
2. 为获取图像，选择具有代表性的胚胎置于洁净的载玻片上，在显微镜下检查胚胎，并将其调整至特定方向，然后点击 images 进行拍摄。根据实验分组和时间点对图像文件重新命名。
   注意：在不同时间点拍摄图像时，必须使用相同的放大倍数和光照条件。

结果

该实验方案的整体布局如 图2所示。通过以下分析，评估了辐射效应及其剂量依赖性特征。

X射线诱导毒性的评估
使用体视显微镜，在药物处理和/或辐射后对以下异常情况进行评估和表征。根据经济合作与发展组织（OECD）指南⁶¹中关于鱼类毒性评价的要求，包含四个主要的终点指标用于分析总体毒性⁶¹，分别为胚胎凝固、体节形成异常、尾部未能脱离卵黄囊以及心跳减缓或缺失。急性毒性根据上述任一异常情况的出现来判定。除这四个主要终点外，还进行了其他形态学观察，包括脊柱或尾部弯曲、头部畸形和小头症、发育缺陷、心包水肿、卵黄囊畸形、 swim bladder 畸形以及眼部结构变化（图3C 和 图4）。放射毒性评分可依据存活率和/或不同形态学异常的评分进行。

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讨论

斑马鱼在包括多种癌症研究在内的许多研究中被用作重要的模型。该模型为大规模药物筛选提供了有用的平台^67,68。与其他任何毒性评估方法一样，辐射和/或药物处理后主要生物学变化的定量评估是本实验方案中最关键的部分。在这一类研究中，存活率不应是观察毒性的唯一标准；还必须通过适当的评分系统对身体或发育缺陷进行评估以提供支持。例如，在胚胎暴露于5 Gy、10 Gy和20 Gy X射线辐射剂量的各组之间，至72小时（hpf）时胚胎的存活率差异并不显著；然而，当在这些特定剂量下检查胚胎的整体形态和表型时，明显可见X射线的毒性比存活曲线所显示的更为严重。在这些剂量下，胚胎的形态畸形程度非常高，表现为整体体型改变、发育缺陷、重要器官畸形以及整体活动能力的变化。甚至在15 Gy和20 Gy组中，胚胎完全无法从卵膜中孵化，并且表现出明显的剂量依赖性畸形。因此，在评估有毒物质（包括高致死性的X射线辐射）的影响时，必须尽可能全面地纳入对形态学、发育性和生理学缺陷的评分，并应利用这些指标来评估斑马鱼胚胎对实验过程中施用的不同药物的整体反应。

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材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
6 孔板	Corning	CLS3335	聚苯乙烯
B.O.D 培养箱	Oswald	JRIC-10
氯化钙	菲舍尔科技	10101-41-4
解剖显微镜	蔡司	Stemi 2000
1.0 L 繁殖罐外罐	Tecniplast	ZB10BTE	聚碳酸酯
玻璃培养皿	Borosil	3165A75	玻璃
GraphPad Prism	GraphPad Software, Inc.		版本 5.01
Kline 凹面载玻片	Himedia	GW092-1PK	玻璃
氯化镁	Sigma-Aldrich	M8266
亚甲蓝水合物	Sigma-Aldrich	66720-100G
Parafilm 封口膜	Tarsons	380020	石蜡膜
巴斯德吸管	Himedia	PW1212-1X500NO	聚乙烯塑料
1.0 L 繁殖罐带孔内罐	Tecniplast	ZB10BTI	聚碳酸酯
1.0 L 繁殖罐聚碳酸酯分隔板	Tecniplast	ZB10BTD	聚碳酸酯
1.0 L 繁殖罐聚碳酸酯盖	Tecniplast	ZB10BTL	聚碳酸酯
氯化钾	Sigma-Aldrich	P5655
氯化钠	Sigma-Aldrich	S7653-5KG
氢氧化钠颗粒	SRL	1949181
Leica M205FA 体视显微镜	Leica	型号/PN MDG35/10 450 125
X-Rad 225 精密X射线辐照仪	Precision X-Ray	X-RAD 225XL