斑马鱼最近被用作模型来验证潜在的辐射修饰因子。本实验方案详细描述了利用斑马鱼胚胎进行基于辐射的筛选实验的步骤，以及一些用于评估不同处理和辐射效应的观察方法。
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本文内容
摘要
摘要
斑马鱼因其易于维护，且具备独特而便捷的模型系统特征，被广泛应用于多种研究领域。由于高增殖性细胞对辐射诱导的DNA损伤更为敏感，斑马鱼胚胎已成为辐射研究中首选的活体（in vivo）模型。此外，该模型可在短时间内呈现辐射及不同药物的作用效果，同时反映主要的生物学事件及相关应答反应。许多癌症研究已采用斑马鱼模型，本实验方案即基于放射治疗与癌症背景下辐射调节剂的应用。该方法可便捷地用于验证不同药物对经辐射处理和对照（未辐射）胚胎的影响，从而鉴定出具有放射增敏或放射保护作用的药物。尽管该方法已在大多数药物筛选实验中被使用，但有关实验细节以及在X射线辐射暴露背景下的毒性评估仍较为有限或仅被简要提及，导致实际操作存在困难。本方案旨在解决这一问题，详细阐述实验流程及毒性评估方法，并配以详尽图示说明。该操作流程提供了一种简便、可靠且可重复的方法，用于斑马鱼胚胎在辐射研究及基于辐射的药物筛选中的应用。
引言
斑马鱼（Danio rerio斑马鱼是一种在近30多年研究中被广泛使用的知名动物模型。它是一种小型淡水鱼，在实验室条件下易于饲养和繁殖。斑马鱼已被广泛应用于多种发育学和毒理学研究。1,2,3,4,5,6,7,8斑马鱼具有繁殖力强、胚胎发育周期短的特点；其胚胎适合追踪不同的发育阶段，具有良好的光学透明性，且易于进行多种遗传操作和高通量筛选平台应用。9,10,11,12,13,14此外，斑马鱼提供了....
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方案
本研究在获得生命科学研究所（布巴内斯瓦尔）机构动物伦理委员会事先批准并遵循其指南的情况下进行。所有斑马鱼的饲养和繁殖均在28.5 °C的常温养殖设施中进行，胚胎则置于生化需氧量（BOD）培养箱中，于28.5 °C条件下培养。实验中使用斑马鱼AB品系，胚胎发育阶段的鉴定依据Kimmel等人的方法54。在受精后6小时（盾牌期）进行X射线照射，并持续观察至受精后120小时，记录不同表型变化。
1. 繁殖设置与胚胎收集
- 设置繁殖用鱼缸（由聚碳酸酯制成，容量1 L，参见材料表）。将系统用水（pH值为6.8–7.5，电导率为500 µS，温度为28.5 °C）注入繁殖鱼缸，水量约为鱼缸体积的40%。将分隔板放入鱼缸中，形成两个独立腔室，分别用于放置雌鱼和雄鱼。
- 从亲鱼饲养缸中，使用网小心捕获两条健康雌鱼和一条健康雄鱼，分别放入鱼缸的对应腔室中，并在28.5 °C黑暗条件下过夜（至少10小时）。
- 次日早晨，移除分隔板，让鱼类自由交配，过程中避免扰动繁殖鱼缸。
注意：雌鱼将开始产卵，鱼类交配后10–15分钟内即可在鱼缸底部观察到卵粒56,57,
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结果
该实验方案的整体布局如 图2所示。通过以下分析，评估了辐射效应及其剂量依赖性特征。
X射线诱导毒性的评估
使用体视显微镜，在药物处理和/或辐射后对以下异常情况进行评估和表征。根据经济合作与发展组织（OECD）指南61中关于鱼类毒性评价的要求，包含四个主要的终点指标用于分析总体毒性61，分别为胚胎凝固、体节形成异常、尾部未能脱离卵黄囊以及心跳减缓或缺失。急性毒性根据上述任一异常情况的出现来判定。除这四个主要终点外，还进行了其他形态学观察，包括脊柱或尾部弯曲、头部畸形和小头症、发育缺陷、心包水肿、卵黄囊畸形、 swim bladder 畸形以及眼部结构变化（图3C 和 图4）。放射毒性评分可依据存活率和/或不同形态学异常的评分进行。
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讨论
斑马鱼在包括多种癌症研究在内的许多研究中被用作重要的模型。该模型为大规模药物筛选提供了有用的平台67,68。与其他任何毒性评估方法一样，辐射和/或药物处理后主要生物学变化的定量评估是本实验方案中最关键的部分。在这一类研究中，存活率不应是观察毒性的唯一标准；还必须通过适当的评分系统对身体或发育缺陷进行评估以提供支持。例如，在胚胎暴露于5 Gy、10 Gy和20 Gy X射线辐射剂量的各组之间，至72小时（hpf）时胚胎的存活率差异并不显著；然而，当在这些特定剂量下检查胚胎的整体形态和表型时，明显可见X射线的毒性比存活曲线所显示的更为严重。在这些剂量下，胚胎的形态畸形程度非常高，表现为整体体型改变、发育缺陷、重要器官畸形以及整体活动能力的变化。甚至在15 Gy和20 Gy组中，胚胎完全无法从卵膜中孵化，并且表现出明显的剂量依赖性畸形。因此，在评估有毒物质（包括高致死性的X射线辐射）的影响时，必须尽可能全面地纳入对形态学、发育性和生理学缺陷的评分，并应利用这些指标来评估斑马鱼胚胎对实验过程中施用的不同药物的整体反应。
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披露
作者声明无竞争利益。
致谢
SS 的实验室和 RKS 的实验室获得了印度生物技术部（DBT）和科学与工程研究委员会（SERB）的资助。APM 获得了印度政府印度医学研究理事会（ICMR）的奖学金。DP 获得了印度政府科学与工业研究理事会（CSIR）的奖学金。UN 获得了印度政府科技部（DST）-Inspire 奖学金。图 2 使用 Biorender（https://biorender.com）生成。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 6 孔板 | Corning | CLS3335 | 聚苯乙烯 |
| B.O.D 培养箱 | Oswald | JRIC-10 | |
| 氯化钙 | 菲舍尔科技 | 10101-41-4 | |
| 解剖显微镜 | 蔡司 | Stemi 2000 | |
| 1.0 L 繁殖罐外罐 | Tecniplast | ZB10BTE | 聚碳酸酯 |
| 玻璃培养皿 | Borosil | 3165A75 | 玻璃 |
| GraphPad Prism | GraphPad Software, Inc. | 版本 5.01 | |
| Kline 凹面载玻片 | Himedia | GW092-1PK | 玻璃 |
| 氯化镁 | Sigma-Aldrich | M8266 | |
| 亚甲蓝水合物 | Sigma-Aldrich | 66720-100G | |
| Parafilm 封口膜 | Tarsons | 380020 | 石蜡膜 |
| 巴斯德吸管 | Himedia | PW1212-1X500NO | 聚乙烯塑料 |
| 1.0 L 繁殖罐带孔内罐 | Tecniplast | ZB10BTI | 聚碳酸酯 |
| 1.0 L 繁殖罐聚碳酸酯分隔板 | Tecniplast | ZB10BTD | 聚碳酸酯 |
| 1.0 L 繁殖罐聚碳酸酯盖 | Tecniplast | ZB10BTL | 聚碳酸酯 |
| 氯化钾 | Sigma-Aldrich | P5655 | |
| 氯化钠 | Sigma-Aldrich | S7653-5KG | |
| 氢氧化钠颗粒 | SRL | 1949181 | |
| Leica M205FA 体视显微镜 | Leica | 型号/PN MDG35/10 450 125 | |
| X-Rad 225 精密X射线辐照仪 | Precision X-Ray | X-RAD 225XL |
参考文献
- Teame, T., et al. The use of zebrafish (Danio rerio) as biomedical models. Animal Frontiers. 9 (3), 68-77 (2019).
- Ye, M., Chen, Y. Zebrafish as an emerging model to study gonad development. Computational and Structural Biotechnology Journal
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