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视网膜组织中免疫染色Caspase-9的定量分析

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DOI：

10.3791/64237

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2022年7月25日

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1Department of Pathology & Cell Biology, Vagelos College of Physicians and Surgeons, Columbia University, 2Department of Molecular Pharmacology and Therapeutics, Vagelos College of Physicians and Surgeons, Columbia University, 3NCI-designated Cancer Center, Sanford Burnham Prebys Medical Discovery Institute, 4Department of Neurology, Vagelos College of Physicians and Surgeons, Columbia University, 5The Taub Institute for Research on Alzheimer’s Disease and the Aging Brain, Vagelos College of Physicians and Surgeons, Columbia University

* These authors contributed equally

本文内容

摘要

本文介绍了一种详细的免疫组织化学实验方案，用于在复杂组织中识别、验证和靶向具有功能相关性的半胱天冬酶（caspases）。

摘要

半胱天冬酶（caspase）家族已知可介导多种超出细胞死亡范围的细胞通路，包括细胞分化、轴突导向以及增殖。自从发现细胞死亡蛋白酶家族以来，人们一直在寻找可用于识别并拓展该家族特定成员在发育、健康及疾病状态下功能的研究工具。然而，目前许多广泛使用的商业化caspase工具对靶向的caspase并不具有特异性。在本报告中，我们阐述了采用一种新型抑制剂结合遗传学方法及免疫组织化学检测手段，在神经系统中识别、验证并靶向caspase-9的研究策略。具体而言，我们以视网膜神经元组织作为模型，用于识别和验证caspase的存在及其功能。该方法能够探究特定细胞类型中caspase-9的凋亡性与非凋亡性功能，并可推广应用于其他复杂组织及感兴趣的caspase分子。深入理解caspase的功能有助于拓展当前细胞生物学的知识体系，同时因其在疾病中的参与作用，也有助于发现潜在的治疗靶点。

引言

半胱天冬酶（caspase）是一类蛋白酶家族，参与调控发育过程中的细胞死亡、免疫反应以及疾病中的异常细胞死亡1,2。尽管已知在多种神经退行性疾病中半胱天冬酶家族成员会被激活，但明确具体是哪种半胱天冬酶驱动疾病病理过程仍具挑战性3。此类研究需要借助工具来识别、表征并验证各个半胱天冬酶家族成员的功能。从机制和治疗角度而言，区分出相关的特定半胱天冬酶至关重要，因为已有大量文献表明半胱天冬酶具有多种不同的生物学作用4,5。因此，若目标是通过靶向某种半胱天冬酶以获得治疗效益，则必须实现对相关家族成员的特异性靶向。传统检测组织中半胱天冬酶水平的技术包括蛋白质印迹法（western blotting）、酶活性检测以及荧光测定方法3,6。然而，这些方法均无法实现细胞特异性的半胱天冬酶水平检测，在某些情况下，裂解后的半胱天冬酶往往也无法通过传统的蛋白质分析方法被检测到。已知半胱天冬酶在同一组织中可发挥凋亡性和非凋亡性等多种功能7，因此，准确理解发育和疾病相关通路，需要对细胞特异性的半胱天冬酶水平进行细致的表征。

本研究展示了在神经血管缺氧-缺血模型——视网膜静脉阻塞（RVO）中caspase的激活及其功能7,8。在视网膜等复杂组织中，RVO所诱导的缺氧-缺血可影响多种细胞类型，包括胶质细胞、神经元和血管系统7。在成年小鼠视网膜中，通过免疫组织化学（IHC）检测发现健康组织中caspase的表达极低7，但在发育过程中9或视网膜疾病模型中则并非如此10,11。免疫组织化学是一种在生物医学研究中广泛应用的技术，可用于验证疾病及病理靶点、通过空间定位发现新功能，并实现蛋白质的定量分析。当裂解型caspase产物无法通过Western印迹或荧光定量分析检测，或需明确特定caspase在细胞中的具体定位，或需通过定位手段研究caspase信号通路时，应采用免疫组织化学方法。

为了确定在视网膜静脉阻塞（RVO）中具有功能相关性的半胱天冬酶（caspase），本研究使用经过验证的半胱天冬酶抗体和细胞标志物抗体进行免疫组化（IHC）分析。实验室先前的研究表明，在缺血性脑卒中模型中，caspase-9 可迅速被激活，使用高特异性抑制剂抑制 caspase-9 可保护神经元免于功能障碍和死亡12。由于视网膜属于中枢神经系统（CNS），因此可作为研究 caspase-9 在神经血管损伤中作用的理想模型系统13。为此，采用小鼠 RVO 模型来研究 caspase-9 的细胞特异性定位与分布，及其在神经血管损伤中的意义。RVO 是工作年龄成年人失明的常见原因，由血管损伤引发14。研究发现，caspase-9 在内皮细胞中以非凋亡方式表达，而在神经元中则无表达。

作为一种组织，视网膜可被观察为平铺标本，便于观察血管网络，也可观察为横切面，以突出显示视网膜的神经元层结构。通过横切面中caspase蛋白表达的定量分析，可确定特定caspase在视网膜神经元连接及视觉功能中的潜在关键作用，从而明确caspase(s)在视网膜中的定位。在完成鉴定与验证后，可通过诱导型细胞特异性敲除所鉴定的caspase，实现对该caspase的靶向研究。针对潜在治疗性研究，可利用特异性工具抑制活化的caspase，以检验目标caspase的相关性。对于caspase-9，使用了一种细胞通透性高、高度选择性的抑制剂7,15 Pen1-XBIR3。本研究中采用了2月龄雄性C57BL/6J品系小鼠，以及以C57BL/6J为背景的他莫昔芬诱导型内皮细胞caspase-9敲除（iEC Casp9KO）品系小鼠。这些动物接受了视网膜静脉阻塞（RVO）小鼠模型处理，其中C57BL/6J小鼠接受了caspase-9选择性抑制剂Pen1-XBir3治疗。所述方法可推广应用于中枢和外周系统其他疾病模型的研究7,15。

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方案

本方案遵循视力与眼科学研究协会（ARVO）关于在眼科和视觉研究中使用动物的声明。啮齿类动物实验已获得哥伦比亚大学机构动物护理和使用委员会（IACUC）的批准并接受其监督。

1. 视网膜组织的制备与冷冻切片

  1. 通过腹腔注射麻醉剂（氯胺酮（80–100 mg/kg）和赛拉嗪（5–10 mg/kg））处死动物，并使用蠕动泵对接受视网膜静脉阻塞（RVO）处理的小鼠进行4%多聚甲醛（PFA）灌注固定。
    注意：在实施安乐死和灌注前，应通过夹趾反应确认动物麻醉深度。有关灌注的详细信息，请参见8。更多灌注操作细节可参考16。
  2. 使用镊子小心摘除眼球，并将眼球置于1 mL 4% PFA中，于4 °C条件下过夜固定。随后用1 mL 1×PBS洗涤三次，每次10分钟，并将样本置于摇床上振荡洗涤。
  3. 将眼球浸入1 mL 30%蔗糖溶液中，持续3天，直至眼球沉降至管底，表明蔗糖已充分渗透。
  4. 使用30 G注射器向眼球内注入最佳切割温度包埋剂（OCT），直至眼球呈现圆形（约注入50 µL）。
  5. 将眼球置于冷冻模具中，用OCT包埋至完全覆盖，并于-80 °C冷冻，待进行冷冻切片时取出。
  6. 使用恒冷切片机将包埋的眼球组织以20 µm厚度切片并贴附于载玻片上。
    1. 从冷冻模具中取出OCT包埋块。
    2. 在恒冷切片机的样品头（chuck）上添加少量OCT，将包埋块固定其上，并置于恒冷切片机内直至冻结牢固。
    3. 以20 µm厚度连续切片，直至观察到视网膜组织。
      注意：可通过30倍放大倍数（3倍物镜，10倍目镜）的光学显微镜确认。视网膜组织可通过颜色和形态与OCT介质区分开来。
    4. 将视网膜组织按每张载玻片四片连续切片的方式收集。
      注意：视网膜切片的推荐排布方式见图1A。
  7. 使用可去识别处理组和基因型信息的编号标记载玻片。
  8. 将载玻片储存于-20 °C，待染色时取出。

2. 免疫组织化学

注意：进行免疫组织化学染色时应使用固定的冷冻保存组织，以维持细胞形态。选择与活体光学相干断层扫描（OCT）图像相对应层面的切片in vivo7。使用从恒冷箱切片机收集的前两组切片，或从视网膜组织深入150 µm处的切片。

  1. 将载玻片置于黑暗且湿润的载片盒中。
  2. 通透与封闭：用 300 µL 的 1× PBS 洗涤视网膜横切面 5 分钟，以去除 OCT 包埋剂，随后弃去 PBS。
  3. 通过加入 300 µL 含 0.1% Triton X-100 的 1× PBS，在室温（RT）下处理 2 小时以通透组织，随后弃去溶液。
  4. 加入 300 µL 封闭液（含 10% 正常山羊血清（NGS）、1% 牛血清白蛋白（BSA）的 1× PBS，过滤后使用），于 4 °C 过夜孵育以封闭非特异性结合位点。
  5. 一抗孵育：将一抗用封闭液稀释。所用一抗包括 anti-cl-caspase-9（1:800）、anti-CD31（1:50）以及直接标记的一抗 anti-caspase-7-488（1:150）。
    注意：请根据生产商推荐的条件选择合适的一抗稀释比例。
    1. 倾去切片上的封闭液，向视网膜载片上加入 100 µL 一抗混合液。
    2. 于 4 °C 过夜孵育切片。
  6. 用 300 µL 的 1× PBS 洗涤切片 4 次，每次 5 分钟。
    注意：若组织切片非常脆弱，建议通过毛细作用去除洗涤液，即用吸水纸接触载玻片一角，避免移位视网膜切片。
  7. 为避免同一宿主来源的一抗之间发生交叉标记，应在使用直接标记抗体前先完成二抗染色步骤。
  8. 二抗孵育：将二抗以 0.1% 的浓度溶于封闭液中。例如，检测兔源的 anti-cl-caspase-9 时，使用山羊抗兔 IgG-568 作为二抗。
    1. 向视网膜组织上加入 200 µL 二抗混合液。
    2. 于室温孵育 2 小时。
    3. 用 300 µL 的 1× PBS 洗涤 4 次，每次 5 分钟。
    4. 用 0.02% 稀释度的 DAPI 溶液 300 µL 对细胞核染色 5 分钟。
  9. 用 300 µL 的 1× PBS 洗涤一次，每次 5 分钟。
  10. 在视网膜切片上滴加 500 µL Fluoromount-G 封片介质以保存荧光信号，小心盖上盖玻片，避免产生气泡。

3. 共聚焦成像

  1. 使用共聚焦显微镜获取染色切片的图像。
    1. 打开共聚焦显微镜。
    2. 将玻片放置在载物台上。
    3. 调节焦距，清晰观察视网膜切片。
      注意：每个切片至少采集四幅图像，每只视网膜采集四个切片。参见视网膜成像示意图以了解建议的成像区域（图1B，C）。
  2. 使用具备Z轴层扫功能的共聚焦显微镜，结合20x或40x物镜，对caspase、血管及细胞核染色进行成像。
    注意：实验中所有成像的参数和软件设置应保持一致。20x物镜可提供由细胞核染色清晰界定的视网膜各层的整体概览，而40x物镜可提供更详细的细胞结构信息。
    1. 通过点击采集设置，为每个通道设置合适的曝光时间和激光强度。
    2. 通过点击Z轴序列设置Z轴层扫，调整上下参数以覆盖组织的完整厚度。
  3. 按照冰冻切片过程中分配的掩码编号保存图像。

4. 半胱天冬酶水平的定量分析

  1. 将 405、470、555 和 640 通道的图像文件拖动到 FIJI 的控制台。
  2. 点击 图像 > 颜色 > 合并通道。
  3. 按如下方式为文件分配颜色：555 通道设为红色，470 通道设为绿色，405 通道设为灰色，640 通道设为青色。
  4. 通过点击 图像 > 堆栈 > Z 投影 来压缩 Z 堆栈。
  5. 点击 投影类型：最大强度。
  6. 点击 图像 > 颜色通道工具 打开通道界面。
  7. 打开 亮度与对比度 界面。
  8. 选择 按通道设置参数。
    1. 进入 通道 并选择一个通道。
    2. 将光标置于表达半胱天冬酶（caspase）的细胞上方，并记录像素值。
    3. 将光标置于背景区域上方，并记录像素值。
  9. 测试参数
    1. 进入 亮度与对比度 界面。
    2. 点击 选择。
    3. 输入最小显示值（即表达半胱天冬酶细胞的标注像素值）。
    4. 输入最大显示值（即背景区域的标注像素值）。
    5. 点击 确定。
  10. 对所有通道重复步骤 4.8–4.9。
  11. 从盲法处理的组织中随机选取图像测试参数。
    注：仅当其他图像的背景值不适宜时，才调整亮度和对比度参数。
  12. 参数确定后，打开图像文件并压缩 Z 堆栈。
  13. 为半胱天冬酶通道以及等凝集素（isolectin）血管标记通道设置亮度和对比度参数。
  14. 使用点工具，通过血管标记物与半胱天冬酶表达的共定位情况来定量血管阳性区域的数量。
  15. 重复步骤 4.14，但使用 Hoechst 作为神经元阳性区域的标记物。
  16. 在电子表格中按图像记录各项数值。
  17. 按组织切片对数值取平均值。
  18. 对各切片的平均值再取平均值，该结果即为每只眼的读数。

5. 内皮细胞caspase-9相关性的遗传学验证

  1. 使用经RVO处理的Casp9FL/FL-VECad-CreERT2小鼠获取的视网膜组织7。
  2. 按照上述第2节所述方法，对视网膜进行caspase-9（被敲除的caspase）、caspase-7（下游效应caspase）、血管标志物以及DAPI的免疫染色。
  3. 按照上述第3和第4节所述方法进行成像与定量分析。

6. 靶向视网膜静脉阻塞中的caspase-9

  1. 获取经视网膜静脉阻塞（RVO）处理后的小鼠眼球，并按照文献7所述方法将caspase-9抑制剂Pen1-XBir3局部应用于眼球。
  2. 按照上述第2节所述方法，对视网膜进行caspase-7（一种下游效应caspase）、血管标志物和DAPI的免疫染色。
  3. 按照上述第3和第4节所述方法进行成像和定量分析。

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结果

本方案可使用户分析并定量视网膜组织中的caspase-9水平。此外，该方案还提供了进一步识别、验证及特异性靶向caspase-9及其下游底物的工具。所总结的步骤可对荧光显微图像中的caspase水平及细胞特异性进行可量化的分析。所有图示均展示了未损伤及损伤后1天P-RVO视网膜横切面中总视网膜、内皮细胞和神经元内指定caspase水平的代表性荧光显微图像及其定量结果。当使用Hoechst染色时，视网膜横切面可清晰显示视网膜节细胞层（RGL）、内核层（INL）和外核层（ONL）中的视网膜细胞核。此外，视网膜血管可见于视网膜网状层，或位于RGL与INL之间以及INL与ONL之间。由于血管的组织学特性，当视网膜被切片时，血管呈现为不连续且分离的结构，分布于网状层并为其供血。图2显示caspase-9在损伤后1天的P-RVO中受到高度调控。图3通过使用可诱导的内皮细胞敲除小鼠验证了内皮细胞中caspase-9的功能相关性。图4表明，通过药物手段靶向活化的caspase...

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讨论

Caspase 是一个由多个成员组成的蛋白酶家族，其在细胞死亡和炎症中的作用已被广泛研究；然而，最近发现该家族中的一些成员还具有多种非死亡相关功能4,5。目前对 Caspase 功能的大部分认识主要来源于细胞培养实验以及人类疾病中的推断性数据。尽管已知在疾病状态下存在 Caspase 的异常诱导、激活或失活，但要从功能上明确 Caspase 是否驱动疾病病理过程仍具挑战性。许多用于检测特定 Caspase 的工具会同时识别多个家族成员，从而削弱了使用这些试剂所获得数据的功能相关性17。本文提供了一种在复杂组织中研究 Caspase 的实验方案，并以视网膜为例进行说明。在神经系统中，Caspase 的表达在出生前和出生后均呈下调状态，这使得可利用特异性抗体检测疾病模型中 Caspase 水平的变化。

尽管本实验方案的重点在于图像处理与分析，但该技术的成功还依赖于细致的组织制备、免疫组织化学（IHC）以及显微成像，以确保数...

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披露

作者声明存在以下竞争利益：C.M.T. 拥有以下专利申请：US20200164026、US20190142915 和 US20150165061。C.M.T. 与 S.S. 共同拥有一项专利申请 US 20140024597。C.M.T.、A.M.P. 和 M.I.A. 共同拥有一项专利申请 US2020058683。C.M.T. 与 Y.Y.J. 共同拥有一项专利申请 WO2018013519。M.I.A. 和 C.M.T. 被列为纽约市哥伦比亚大学受托人提交的专利申请 WO/2020/223212 的发明人。其余作者声明不存在竞争利益。

致谢

本工作获得了美国国家科学基金会研究生研究奖学金计划（NSF-GRFP）资助号 DGE - 1644869，以及美国国立卫生研究院（NIH）下属国家神经疾病与卒中研究所（NINDS）的资助，资助编号为 F99NS124180 NIH NINDS 多样性专项 F99（授予 CKCO），国家眼科研究所（NEI）5T32EY013933（授予 AMP），国家神经疾病与卒中研究所（RO1 NS081333、R03 NS099920，授予 CMT），以及美国国防部陆军/空军（DURIP，授予 CMT）的支持。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
抗 Caspase-7 488Novus BiologicalsNB-56529AF488使用比例为 1:150
抗裂解型 Caspase-9Cell Signaling9505-S使用比例为 1:800
抗 CD31BD Pharmingen553370使用比例为 1:50
共聚焦转盘显微镜Biovision
FIJI 2.3.0开源软件
Fluormount GFisher50-187-88
镊子RobozRS-5015
iCasp9FL/FL × VECad-CreERT2 小鼠实验室构建参见 Avrutsky 2020
异凝集素（594, 649）VectorDL-1207使用比例为 1:200
盐酸氯胺酮Henry ScheinNDC: 11695-0702-1
灌注泵 Masterflex
Pen1-XBir3实验室构建参见 Avrutsky 2020
Prism 9.1GraphPad
Tissue-Tek O.C.T.Fisher14-373-65
Vis-a-View 4.0Visitron Systems
赛拉嗪AkornNDCL 59399-110-20

参考文献

  1. Van Opdenbosch, N., Lamkanfi, M. Caspases in cell death, inflammation, and disease. Immunity. 50 (6), 1352-1364 (2019).
  2. Ramirez, M. L. G., Salvesen, G. S. A primer on caspase mechanisms. Seminars in Cell & Developmental Biology. 82, Academic Press. 79-85 (2018).
  3. Troy, C. M., Jean, Y. Y. Caspases: therapeutic targets in neurologic disease. Neurotherapeutics. 12 (1), 42-48 (2015).
  4. Avrutsky, M. I., Troy, C. M. Caspase-9: a multimodal therapeutic target with diverse cellular expression in human disease. Frontiers in Pharmacology. 12, 1728(2021).
  5. Fuchs, Y., Steller, H. Programmed cell death in animal development and disease. Cell. 147 (4), 742-758 (2011).
  6. Troy, C. M., Akpan, N., Jean, Y. Y. Regulation of caspases in the nervous system: implications for functions in health and disease. Progress in Molecular Biology and Translational Science. 99, 265-305 (2011).
  7. Avrutsky, M. I., et al. Endothelial activation of caspase-9 promotes neurovascular injury in retinal vein occlusion. Nature Communications. 11 (1), 3173(2020).
  8. Colon Ortiz, C., Potenski, A., Lawson, J. M., Smart, J., Troy, C. M. Optimization of the retinal vein occlusion mouse model to limit variability. Journal of Visualized Experiments. (174), e62980(2021).
  9. Tisch, N., et al. Caspase-8 modulates physiological and pathological angiogenesis during retina development. The Journal of Clinical Investigation. 129 (12), 5092-5107 (2019).
  10. Chi, W., et al. HMGB1 promotes the activation of NLRP3 and caspase-8 inflammasomes via NF-kappaB pathway in acute glaucoma. Journal of Neuroinflammation. 12, 137(2015).
  11. Thomas, C. N., et al. Caspase-2 mediates site-specific retinal ganglion cell death after blunt ocular injury. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 59 (11), 4453-4462 (2018).
  12. Akpan, N., et al. Intranasal delivery of caspase-9 inhibitor reduces caspase-6-dependent axon/neuron loss and improves neurological function after stroke. Journal of Neuroscience. 31 (24), 8894-8904 (2011).
  13. London, A., Benhar, I., Schwartz, M. The retina as a window to the brain-from eye research to CNS disorders. Nature Reviews Neurology. 9 (1), 44-53 (2013).
  14. Song, P., Xu, Y., Zha, M., Zhang, Y., Rudan, I. Global epidemiology of retinal vein occlusion: a systematic review and meta-analysis of prevalence, incidence, and risk factors. Journal of Global Health. 9 (1), 010427(2019).
  15. Akpan, N., et al. Intranasal delivery of caspase-9 inhibitor reduces caspase-6-dependent axon/neuron loss and improves neurological function after stroke. The Journal of neuroscience. 31 (24), 8894-8904 (2011).
  16. Gage, G. J., Kipke, D. R., Shain, W. Whole animal perfusion fixation for rodents. Journal of Visualized Experiments. (65), e3564(2012).
  17. McStay, G. P., Salvesen, G. S., Green, D. R. Overlapping cleavage motif selectivity of caspases: implications for analysis of apoptotic pathways. Cell Death & Differentiation. 15 (2), 322-331 (2007).
  18. Kuida, K., et al. Reduced apoptosis and cytochrome c-mediated caspase activation in mice lacking caspase 9. Cell. 94 (3), 325-337 (1998).
  19. Troy, C. M., et al. Death in the balance: alternative participation of the caspase-2 and -9 pathways in neuronal death induced by nerve growth factor deprivation. Journal of Neuroscience. 21 (14), 5007-5016 (2001).

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Caspase 9 Caspase

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