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方法文章

制备心肌梗死后成年小鼠心脏的非心肌细胞悬液用于单细胞RNA测序

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DOI：

10.3791/64290

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2023年2月3日

 ,  ,  ,  , 
1Key Laboratory of Cardiovascular Intervention and Regenerative Medicine of Zhejiang Province, 2Department of Cardiology, Sir Run Run Shaw Hospital, School of Medicine, Zhejiang University Hangzhou

* These authors contributed equally

本文内容

摘要

本文介绍了一种从心肌梗死（MI）后小鼠心脏中分离出足量且高活性的非心肌细胞的实验方案。该方法可用于后续的单细胞测序、流式细胞术分析以及原代细胞培养。

摘要

心肌梗死（MI）是最常见的心血管疾病之一，其全球死亡率呈上升趋势。非心肌细胞占心脏细胞总数的一半以上，在心肌损伤后参与适应性代偿过程，包括炎症反应、组织修复和瘢痕形成。为了研究心肌梗死后心脏的微环境，单细胞RNA测序（scRNA-seq）被广泛用于鉴定不同类型的心脏细胞及细胞间的相互作用。在scRNA-seq样本制备的各个步骤中，细胞悬液的制备是最关键的步骤之一，因为细胞活力会直接影响scRNA-seq结果的质量。因此，我们设计了一种从心肌梗死后小鼠心脏中制备非心肌细胞悬液的实验方案，特别关注通过选用温和的消化酶、控制消化时间以及应用荧光激活细胞分选（FACS）来提高细胞活力。最后，我们从通过该方案获得的非心肌细胞悬液中分离出CD45+细胞，并进行了单细胞RNA测序。

引言

心肌梗死（MI）是最常见的心血管疾病之一，其全球死亡率持续上升1。MI 是由于流向周围心肌的血液供应不足所致，通常由动脉粥样硬化斑块破裂引起的冠状动脉阻塞所导致。尽管经皮冠状动脉介入治疗（PCI）已显著降低了急性 MI 患者的死亡率，但 MI 后心力衰竭的高发病率仍然是一个严峻问题2。MI 后心力衰竭的关键病理生理机制是机体对心脏损伤产生的代偿性反应，该过程会以无收缩功能的纤维化瘢痕替代坏死的心肌组织。这些适应性反应在很大程度上依赖于多种细胞类型与心脏组织细胞相互作用所介导的局部炎症反应，目前这种炎症过程被视为潜在的治疗靶点，旨在减少纤维化瘢痕的形成，从而预防 MI 后心力衰竭3,4。有趣的是，梗死部位的微环境在 MI 不同阶段会随时间推移发生浸润细胞类型及其功能的动态转变1,5。大量研究表明，非心肌细胞（如免疫细胞、成纤维细胞和内皮细胞）在 MI 后的炎症反应及组织修复过程中发挥核心作用5,6。近年来，单细胞测序技术已被广泛用作解析非心肌细胞在 MI 后微环境中参与机制与功能的强大工具7,8。 这些研究为深入理解 MI 后损伤与修复的病理生理过程，以及开发针对 MI 后心力衰竭的潜在治疗策略提供了重要见解。

高通量RNA测序（RNA-Seq）是一种利用下一代测序技术（NGS）对整个转录组进行精细研究的技术7,8,9。近年来，单细胞RNA测序（scRNA-Seq）的发展彻底改变了生物医学研究领域。与传统的群体测序相比，scRNA-Seq能够在单细胞水平上分析基因表达谱和转录异质性7,8。该技术通过鉴定心肌梗死（MI）后微环境中的不同循环细胞类型，并揭示心肌细胞与非心肌细胞之间的相互作用，显著推动了MI细胞病理生理学的研究9,10。这些发现进一步有助于揭示MI后心力衰竭的新型治疗靶点。通常，基于scRNA-Seq的MI后研究实验包括三个主要部分：（1）建立MI后动物模型；（2）制备单细胞悬液；（3）样本测序与数据分析。值得注意的是，单细胞悬液的制备是scRNA-Seq实验准备过程中最关键的一步，因为细胞悬液的质量直接决定了实验结果的准确性。

本方案旨在从心肌梗死后的心脏组织中提取非心肌细胞的单细胞悬液；尤其重要的是，方案中包含了维持细胞活力和细胞解离效果的具体细节。同时，本方案所使用的设备，如小鼠手术器械、啮齿类动物呼吸机和离心机等，在大多数动物实验中心和生物医学实验室中均可获得，因此该实验的成本相对较低。此外，若将梗死的时间点和部位作为变量考虑，本方案可应用于模拟多种临床场景，尤其适用于研究心肌梗死后并发症。

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方案

所有实验均按照浙江大学实验动物护理和使用指南进行，并经浙江大学动物咨询委员会批准。

1. 左前降支冠状动脉结扎术（LAD 结扎术）

注意：采用八周龄雄性 C57BL/6J 小鼠作为模型。心肌梗死（MI）后两周收集心脏。左前降支冠状动脉结扎手术按照先前所述并展示的方法进行11。

  1. 手术前用70%乙醇对手术器械进行消毒。
  2. 称量小鼠体重，然后通过腹腔注射1%戊巴比妥钠（50 mg/kg）对小鼠进行麻醉。观察趾夹反射，并测量呼吸频率以评估手术过程中麻醉的深度。
  3. 将小鼠置于带有37 °C加热垫的手术台上。使用眼用软膏以防止眼睛脱水。
  4. 用脱毛膏去除其左侧心前区胸部和颈部的毛发，并用棉签清除毛发。先用碘伏对皮肤进行消毒，再用70%酒精清洁该区域三次。
  5. 在显微镜下做颈部正中切口（0.8–1.0 cm）。分离皮肤、肌肉及气管周围组织，然后将20 G套管插入气管。
    注意：在显微镜下观察将套管插入气管的过程，确保导管未插入食管。
  6. 将小鼠连接至呼吸机，设置潮气量为0.2 mL，呼吸频率为每分钟150次。
  7. 沿锁骨中线用无菌剪刀斜向切开小鼠胸腔。分离皮下组织以暴露肋骨。
  8. 使用无菌剪刀沿左侧锁骨中线以斜角剪开皮肤（0.8–1.0 cm）。行左侧开胸术，分离第三和第四肋骨以暴露心脏。使用肋骨牵开器以获得清晰视野。
  9. 用弯头镊子打开心包膜，随后使用7-0丝线结扎左前降支动脉（位于左心耳下方）。左心室前壁出现苍白区域表明心肌灌注已成功阻断。
  10. 松开肋骨牵开器，用5-0丝线逐层缝合胸腔切口，同时排出胸腔内空气。用5-0丝线缝合颈部切口。
  11. 小鼠自主呼吸恢复后，移除气管插管。腹腔注射0.5 mL预热的无菌生理盐水。每12小时皮下注射一次布托啡诺（0.1 mg/kg），以减轻疼痛。
  12. 最后，将小鼠置于加热垫上等待复苏。密切监测小鼠，确保其未出现严重呼吸困难或出血情况。 通过 目视观察。
  13. 小鼠苏醒后放回笼中。术后第一周内，每天观察小鼠的活动能力、理毛行为和进食情况，确保其状态正常。根据实验需求，在心肌梗死（MI）后的不同时间点处死小鼠并取心脏组织。
    ​注意：在本方案中，单细胞悬液是在心肌梗死（MI）后2周用心脏组织制备的。

2. 心脏单细胞悬液的制备

  1. 溶液和培养基的制备
    1. 心脏组织解离缓冲液：将 10 mg 胶原酶 IV（600 U/mL）、5 mg 分散酶 II（0.5 U/mL）和 50 µL DNase I（100 µg/mL）溶于 5 mL RPMI 1640 培养基中。使用前在 37 °C 水浴中预热该溶液。
    2. 细胞洗涤缓冲液：用磷酸盐缓冲液（PBS，pH 7.4）配制 1% BSA 或 10% FBS，置于 4 °C 或冰上保存。
    3. 灌注液：将 PBS（pH 7.4）预冷作为灌注液。
    4. 红细胞（RBC）裂解缓冲液：按照生产商说明使用红细胞裂解缓冲液。
      注：有关本研究中所用试剂和设备的列表，请参见材料表。
  2. 通过腹腔注射戊巴比妥钠（150 mg/kg）处死小鼠。
  3. 心脏解剖
    1. 用胶带固定小鼠后肢，使其仰卧。
    2. 用 70% 乙醇喷洒小鼠体表，然后垂直切开腹部皮肤和肌肉，注意避免刺穿肝脏。小心打开胸腔，避免穿刺心脏。
    3. 用预冷的 PBS（pH 7.4）灌注左心室，直至流出液变为无色（约需 15 mL PBS [pH 7.4]）。
    4. 用镊子轻轻将心脏从胸腔中取出，用眼科剪刀剪除附着在心脏外表面的多余组织。将心脏放入含有 1 mL 预冷 PBS（pH 7.4）的 1.5 mL 微离心管中。
  4. 心脏组织的酶解解离
    1. 将小鼠心脏转移至 24 孔板的一个孔中，孔内预先加入 150 µL 冰上放置的心脏组织解离缓冲液，并用剪刀将心脏剪成小块（约 1 mm）。
    2. 将剪碎的心脏组织转移至含有 5 mL 组织解离缓冲液的 15 mL 离心管中。
      注：推荐的心脏组织解离缓冲液体积为每心脏 5 mL。
    3. 将离心管置于电动恒温往复摇床中，在 37 °C、125 rpm 条件下振荡 1 小时。每隔 20 分钟用移液器将组织悬液上下吹打 10 次。
    4. 将细胞悬液通过 70 µm 细胞筛过滤，以去除未消化的组织和细胞团块。加入 25 mL 细胞洗涤缓冲液冲洗原离心管，然后将冲洗液转移至细胞筛进行冲洗。接着将细胞悬液通过 40 µm 细胞筛进一步去除细胞团块。
    5. 在 4 °C 条件下，以 300 × g 离心 5 分钟，收集过滤后的细胞悬液。弃去上清液，将细胞沉淀重悬于 1× 红细胞裂解缓冲液中，在室温（RT）下孵育 5 分钟。
    6. 加入四倍体积的细胞洗涤缓冲液，于 4 °C 以 300 × g 离心 5 分钟。
    7. 弃去上清液，将细胞重悬于 10 mL 细胞洗涤缓冲液中，于 4 °C 以 300 × g 离心 5 分钟。
    8. 弃去上清液，将细胞重悬于 1 mL 细胞洗涤缓冲液中。
    9. 取 18 µL 细胞悬液与 2 µL 吖啶橙（AO）/碘化丙啶（PI）染色液（9:1）混合，取 10 µL 混合液加入细胞计数板。使用自动细胞计数仪评估细胞数量和活力。

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结果

通过实施本方案的第2节，获得了高活力的单细胞悬液。然而，仍可观察到细胞碎片（图1A）；因此，采用荧光激活细胞分选（FACS）进一步提高细胞悬液质量16。FACS分选后，细胞平均大小从9.6 µm减小至9.1 µm （表1），表明FACS可有效降低细胞悬液中细胞碎片的比例 （图1B）。FACS所用的设门策略见图1C。

除了图1中的图像外，还通过细胞计数仪测量了细胞浓度、平均细胞大小和细胞活力（Table 1）。细胞浓度的差异源于细胞悬液体积的不同。值得注意的是，FACS 分选后平均细胞大小减小（Table 1），表明 FACS 能有效减少细胞聚集体并去除细胞碎片。

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讨论

本文旨在描述一种从心肌梗死（MI）后小鼠心脏中分离单个非心肌细胞的实验方案。该方案可用于高质量地分离心肌梗死后微环境中多种类型的细胞，包括免疫细胞、内皮细胞和成纤维细胞。获得适用于单细胞测序的高质量细胞悬液有三个关键因素。第一个因素是酶消化条件的设置。控制消化时间以及消化酶的体积和浓度至关重要，以确保细胞活力与分离效率之间的平衡。在本方案中，我们适当提高了酶的浓度并延长了消化时间。建议消化时间为45分钟至1小时。时间过短虽可能提高细胞活力，但会导致心脏组织消化不充分，并增加细胞团块的形成。此外，我们使用DNase I以防止细胞聚集，因为裂解的细胞会释放游离DNA，包裹周围细胞从而形成细胞团块13。 第二个关键因素是使用含有BSA或FBS的细胞洗涤液。BSA或FBS不仅能保护消化酶的活性，还能提高细胞的存活率。最后一个关键因素是通过流式细胞分选（FACS）去除细胞碎片和死亡细胞。细胞碎片会导致细胞计数和活力评估不准确。上述各因素共同作用，可显著提高细胞悬液的活力和纯度，使其更适用于单细胞测序。

本方案首先描述了用于单细胞测序的...

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披露

作者声明不存在任何竞争利益。

致谢

本工作得到浙江省自然科学基金（LQ22H020010）的资助。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
吖啶橙/碘化丙啶染色Logos生物系统F23001
自动化 细胞 计数器Logos生物系统L20001
牛血清白蛋白ServicebioG5001细胞保护作用
细胞计数板Logos生物系统L12001
IV型胶原酶Gibco17104019消化酶
Dispase IISigmaD4693消化酶
Dnase I罗氏11284932001防止细胞聚团
Falcon 40μm细胞筛Falcon352340去除细胞团块
Falcon 70μm细胞滤筛Falcon352350去除未消化的组织和团块
流式细胞分选仪贝克曼库尔特B25982
碘伏欧庆思10054963976859
持针器FST12061-01
眼科镊真实世界数据F14012-10
眼科剪真实世界数据S11036-08
磷酸盐缓冲液 ServicebioG4202-500ML
红细胞裂解缓冲液BeyotimeC3702-120ml去除红细胞
肋骨牵开器FST17005-04
啮齿类动物呼吸机哈佛大学730043
RPMI 1640培养基Gibco11875093溶剂 酶溶液
无菌剪刀真实世界数据S14014-10

参考文献

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