人源小胶质样细胞：由诱导性多能干细胞分化而来及 体外 使用人突触体的活细胞吞噬作用检测

摘要

本方案描述了将人诱导性多能干细胞（iPSCs）分化为小胶质细胞样细胞的过程 体外 实验。我们还包含了一种详细的制备方法，用于从诱导多能干细胞衍生的下运动神经元中生成人突触体，该突触体可作为底物用于 体外 使用活细胞成像系统的吞噬作用检测

摘要

小胶质细胞是起源于髓系的常驻免疫细胞，负责维持脑内微环境的稳态，并在多种神经系统疾病中发挥关键作用。研究健康和疾病状态下的人类小胶质细胞面临巨大挑战，主要由于人类细胞来源极为有限。来源于个体的诱导性多能干细胞（iPSCs）可被用于突破这一限制。本文展示了如何将人类iPSCs分化为类小胶质细胞（iMGs），以用于 体外 实验。这些诱导型小胶质细胞（iMGs）表现出小胶质细胞预期的生理特性，包括典型的小胶质细胞样形态、特异性标志物的表达以及活跃的吞噬作用。此外，还提供了从人诱导多能干细胞（iPSC）来源的下运动神经元衍生的突触体底物的分离与标记的操作说明。³提供了一种运动神经元（LMNs）的培养方法。采用活细胞纵向成像检测技术，通过监测被pH敏感性染料标记的人源突触体的吞噬过程，以研究小胶质细胞（iMG）的吞噬能力。本文所述方案可广泛应用于研究人源小胶质细胞生物学及其在疾病中作用的多个领域。

引言

小胶质细胞是中枢神经系统（CNS）中的常驻免疫细胞，在CNS发育过程中发挥着关键作用。在成年大脑中，小胶质细胞对于维持内环境稳定以及积极应对创伤和疾病过程也至关重要。累积的证据表明，小胶质细胞在多种神经发育性和神经退行性疾病的发生机制中起着核心作用^1,2。尽管目前关于小胶质细胞生物学的知识主要来源于小鼠模型，但最近的研究揭示了小鼠与人类小胶质细胞之间存在重要差异，凸显了开发新技术以研究人类小胶质细胞遗传学和生物学功能的必要性^3,4。从小块原代组织中分离小胶质细胞可能会显著改变其特性⁵，从而可能干扰使用此类细胞所获得的实验结果。本方法的总体目标是将人诱导性多能干细胞（iPSCs）分化为诱导性小胶质样细胞（iMGs），从而建立一种细胞培养系统，用于在基础条件下研究人类小胶质细胞。此外，本文还包含一种基于完全人源化模型系统的吞噬功能检测方法，可用于评估iMGs的功能性，既作为质量控制手段，也可用于研究疾病背景下iMGs的功能障碍。

近年来，文献中出现了多种从诱导多能干细胞（iPSCs）分化为小胶质细胞的实验方案^6,

方案

注意：本方案中使用的所有试剂必须为无菌状态，所有步骤均须在生物安全柜中的无菌条件下进行。所有诱导多能干细胞（iPSC）系、维持培养基和分化培养基均在材料表中列出。下文所示的小胶质细胞分化方法基于先前已发表的方案^7,8,12，并包含了本文所述的新改进。

1. 小胶质细胞分化

注意：本方案的概述见图1。

1. 诱导多能干细胞（iPSC）培养
   注意：有关iPSC培养技术的更多详细信息可参见其他文献¹⁷.
   1. 解冻与培养维持
      1. 准备 iPSC 培养基分装培养基，于 -20 °C 保存，可保存长达 6 个月。将分装样品在 4 °C 过夜解冻，解冻后 1 周内使用。使用前于室温放置至少 1 小时。
      2. 用含有钙和镁的DPBS稀释的10 µg/mL层粘连蛋白521溶液，每孔加入1 mL，包被6孔板的孔壁¹⁸

结果

采用本方案生成iMG时，必须从具有紧凑集落形态且边界清晰的未分化iPSC开始（图2A）。如EB形成部分所述维持的解离后iPSC将形成球形聚集体，称为EB，并在分化第4天前持续增大（图2B）。一旦收集EB并接种于适合PMP生成的条件下，它们会贴附于Matrigel包被的培养板上，一层细胞将铺展并包围球形聚集体（图2C）。不健康的EB会从培养板脱落，应予以清除。在PMP生成的第14至21天期间，可能出现多种潜在的不同细胞类型并悬浮于培养基中；这些细胞应在换液时弃去¹²。到第28天，将出现悬浮的圆形细胞，其胞质与细胞核的比例较大（图2D），称为PMP。这些细胞可持续产生，并可在换液时每周收集一次，持续长达3个月。每周收获的PMP数量因iPSC细胞系及培养时间而异；通常产量随时间推移而下降。强烈建议将iPSC培养于层粘连蛋白521（laminin 521）包被的.......

讨论

本文所述的分化方案可在约6至8周内高效地获得高纯度、足够产量的诱导多能干细胞来源的类小胶质细胞，适用于进行免疫荧光实验及其他需要较大量细胞的检测。该方案在1周内最多可获得1 × 10⁶个iMGs，足以进行蛋白质和RNA提取以及相应的下游分析（如RNA测序、定量逆转录PCR、蛋白质印迹、质谱分析）。然而，该方案的一个局限性在于iMGs的产量可能限制某些应用。可通过额外改进方法，收集不同周数的PMPs，并在悬浮培养中维持均一细胞群体，直至积累足够数量的前体细胞后一次性进行后续分化过程¹⁸。或者，也可通过使用更大表面积的细胞培养板扩大类胚体（EBs）的培养规模，以增加PMPs的产量。

建议使用在层粘连蛋白521包被的培养板中培养的iPSCs来启动分化过程。其他包被试剂可能会减少后续过程中PMPs的产量¹⁸。同样，在PMP生成期间对培养板进行包被以促进EB黏附，可增强EB的贴附能力，从而延长培养物的存活时间。EB培养最长可维持达4个月，此时多个EB会脱落并死亡。然而，其他研.......

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
免疫荧光分析用抗体
兔抗IBA1抗体	和光纯药美国公司	NC9288364	1:350 稀释度
兔抗P2RY12抗体	Sigma-Aldrich	HPA014518	1:50 稀释度
兔抗TMEM119抗体	Sigma-Aldrich	HPA051870	1:100 稀释度
用于蛋白质印迹分析的抗体
抗-β-微管蛋白兔抗体	Abcam	ab6046	1:500 稀释度
抗突触素（SYP）兔抗体	Abclonal	A6344	1:1,000 稀释度
抗PSD95小鼠抗体	Millipore	MAB1596	1:500 稀释
硼酸盐缓冲液组分
硼酸（100 mM）	Sigma	B6768
碳酸氢钠（NaHCO₃）3生物Xtra	Sigma-Aldrich	S6297-250G
氯化钠（75 mM）	Sigma	S7653
四硼酸钠（25 mM）	Sigma	221732
细胞培养材料
6孔板	Greiner Bio-One	657160
40 μm 细胞滤筛	Falcon	352340
100 mm × 20 mm 组织培养处理皿	CELLTREAT	229620
细胞刮刀，双头，平刃 && 窄刃，无菌	CELLTREAT	229305
低吸附圆底96孔板	康宁	7007
Primaria 24孔平底表面修饰多孔细胞培养板	康宁	353847,
Primaria 6孔细胞培养板，平底，表面修饰	康宁	353846
Primaria 96孔透明平底微孔板	康宁	353872
细胞解离试剂
Accutase	康宁	25058CI	用于下运动神经元分化的解离试剂
TrypLE 试剂	Life Technologies	12-605-010	用于小胶质细胞分化的解离试剂
UltraPure 0.5 M EDTA，pH 8.0	Invitrogen	15575020
细胞培养用包被试剂
Matrigel GFR 基底膜基质	康宁™	354230	称为细胞外基质包被试剂
CellAdhere 层粘连蛋白-521	STEMCELL 技术	77004	称为层粘连蛋白521
聚-D-赖氨酸	Sigma	P7405	用硼酸盐缓冲液重悬至 0.1 mg/mL
聚-L-鸟氨酸	Sigma	P3655	用硼酸盐缓冲液重悬至 1 mg/mL
组成部分 iPSC 培养基
mTeSR Plus 试剂盒	STEMCELL 技术	100-0276	准备 iPSC 培养基 将各组分混合至1x
组成部分 EB培养基
BMP-4	Fisher Scientific	PHC9534	终浓度 50 ng/mL
iPSC 培养基			终浓度 1x
ROCK抑制剂Y27632	Fisher Scientific	BD 562822	终浓度 10 µM
SCF	PeproTech	300-07	终浓度 20 ng/mL
VEGF	PeproTech	100-20A	终浓度 50 ng/mL
组成部分 PMP 基础培养基
GlutaMAX	Gibco	35050061	终浓度 1x
青霉素-链霉素（10,000 U/mL）	Gibco	15140122	终浓度 100 U/mL
X-VIVO 15	Lonza	12001-988	终浓度 1x
组成部分 PMP 完全培养基
55 mM 2-巯基乙醇	Gibco	21985023	终浓度 55 µM
IL-3	PeproTech	200-03	终浓度 25 ng/mL
M-CSF	PeproTech	300-25	终浓度 100 ng/mL
PMP 基础培养基			终浓度 1x
组成部分 iMG 基础培养基
高级DMEM/F12	Gibco	12634010	终浓度 1x
GlutaMAX	Gibco	35050061	终浓度 1x
N2 补充剂，100 倍	Gibco	17502-048	终浓度 1x
青霉素-链霉素（10,000 U/mL）	Gibco	15140122	终浓度 100 U/mL
组成部分 iMG 完全培养基
55 mM 2-巯基乙醇	Gibco	21985023	终浓度 55 µM
IL-34	PeproTech 或 Biologend	200-34 或 577904	终浓度 100 ng/mL
iMG 基础培养基			终浓度 1x
M-CSF	PeproTech	300-25	终浓度 5 ng/mL
TGF-β	PeproTech	100-21	终浓度 50 ng/mL
诱导基础培养基的组分
含 HEPES 的 DMEM/F12 培养基	Gibco	11330032	终浓度 1x
GlutaMAX	Gibco	35050061	终浓度 1x
N2 补充剂，100 倍	Gibco	17502-048	终浓度 1x
非必需氨基酸（NEAA），100倍	Gibco	11140050	终浓度 1x
完全诱导培养基的组分
化合物 E	Calbiochem	565790	终浓度 0.2 μM，并用1:1的乙醇和DMSO将储备试剂重悬至2 mM
多西环素	Sigma	D9891	终浓度 2 μg/mL，并用DPBS将储备试剂重悬至2 mg/mL
诱导基础培养基			终浓度 1x
ROCK抑制剂Y27632	Fisher Scientific	BD 562822	终浓度 10 μM
神经元培养基的成分
B-27 Plus 神经元培养系统	Gibco	A3653401	培养基和添加剂的终浓度为1x
GlutaMAX	Gibco	35050061	终浓度 1x
N2 补充剂，100 倍	Gibco	17502-048	终浓度 1x
非必需氨基酸（NEAA），100 倍	Gibco	11140050	终浓度 1x
本研究中使用的人诱导多能干细胞系
KOLF2.1J：野生型克隆 B03	杰克逊实验室
WTC11 hNIL	美国国立卫生研究院
突触体分离试剂
BCA 蛋白检测试剂盒	Thermo Scientific Pierce	23227
二甲基亚砜（DMSO）	Sigma	D2650
Syn-PER 突触蛋白提取试剂	赛默飞世尔科技	87793	用于分离突触体的细胞裂解试剂
吞噬作用检测染料
NucBlue Live Ready 试剂	Invitrogen	R37605
pHrodo 红色，琥珀酰亚胺酯	赛默飞世尔科技	P36600	被称为pH敏感性染料
其他细胞培养试剂
0.4% 台盼蓝溶液	AMRESCO 公司	K940-100ML
牛血清白蛋白（BSA）	Sigma	22144-77-0
BrdU	Sigma	B9285	用无菌水重悬至 40 mM
细胞松弛素D	Sigma		终浓度 10 µM
含钙和镁的DPBS	康宁	21-030-CV
不含钙和镁的DPBS	康宁	21-031-CV	称为 DPBS
KnockOut  DMEM/F-12	Gibco	12660012	DMEM-F12，适用于人胚胎干细胞和诱导性多能干细胞生长的优化培养基
小鼠层粘连蛋白，天然	Gibco	23017015	称为层粘连蛋白
软件与设备
离心	Eppendorf	Model 5810R
Cytation 5 活细胞成像仪	Biotek
Gen5 微孔板读板仪与成像软件	Biotek	版本 3.03
多温加热振荡	基准测试		参照为试管振荡器
水浴超声仪	埃尔玛	Mode Transsonic 310