本方案描述了将人诱导性多能干细胞（iPSCs）分化为小胶质细胞样细胞的过程 体外 实验。我们还包含了一种详细的制备方法，用于从诱导多能干细胞衍生的下运动神经元中生成人突触体，该突触体可作为底物用于 体外 使用活细胞成像系统的吞噬作用检测
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摘要
摘要
小胶质细胞是起源于髓系的常驻免疫细胞，负责维持脑内微环境的稳态，并在多种神经系统疾病中发挥关键作用。研究健康和疾病状态下的人类小胶质细胞面临巨大挑战，主要由于人类细胞来源极为有限。来源于个体的诱导性多能干细胞（iPSCs）可被用于突破这一限制。本文展示了如何将人类iPSCs分化为类小胶质细胞（iMGs），以用于 体外 实验。这些诱导型小胶质细胞（iMGs）表现出小胶质细胞预期的生理特性，包括典型的小胶质细胞样形态、特异性标志物的表达以及活跃的吞噬作用。此外，还提供了从人诱导多能干细胞（iPSC）来源的下运动神经元衍生的突触体底物的分离与标记的操作说明。3提供了一种运动神经元（LMNs）的培养方法。采用活细胞纵向成像检测技术，通过监测被pH敏感性染料标记的人源突触体的吞噬过程，以研究小胶质细胞（iMG）的吞噬能力。本文所述方案可广泛应用于研究人源小胶质细胞生物学及其在疾病中作用的多个领域。
引言
小胶质细胞是中枢神经系统（CNS）中的常驻免疫细胞，在CNS发育过程中发挥着关键作用。在成年大脑中，小胶质细胞对于维持内环境稳定以及积极应对创伤和疾病过程也至关重要。累积的证据表明，小胶质细胞在多种神经发育性和神经退行性疾病的发生机制中起着核心作用1,2。尽管目前关于小胶质细胞生物学的知识主要来源于小鼠模型，但最近的研究揭示了小鼠与人类小胶质细胞之间存在重要差异，凸显了开发新技术以研究人类小胶质细胞遗传学和生物学功能的必要性3,4。从小块原代组织中分离小胶质细胞可能会显著改变其特性5，从而可能干扰使用此类细胞所获得的实验结果。本方法的总体目标是将人诱导性多能干细胞（iPSCs）分化为诱导性小胶质样细胞（iMGs），从而建立一种细胞培养系统，用于在基础条件下研究人类小胶质细胞。此外，本文还包含一种基于完全人源化模型系统的吞噬功能检测方法，可用于评估iMGs的功能性，既作为质量控制手段，也可用于研究疾病背景下iMGs的功能障碍。
近年来，文献中出现了多种从诱导多能干细胞（iPSCs）分化为小胶质细胞的实验方案6,7,8,9,10。部分方案可能存在的缺点包括分化周期较长、需要添加多种生长因子和/或实验步骤复杂6,9,10。本文展示了一种“用户友好型”分化方法，该方法通过将iPSCs分化为称为原始巨噬细胞前体细胞（PMPs）的前体细胞，模拟了小胶质细胞发育过程中的某些特征7,11。PMPs的生成方法基于先前报道的方案，并进行了部分优化12。PMPs模拟了不依赖MYB的卵黄囊来源巨噬细胞，这类巨噬细胞在胚胎发育过程中于血脑屏障闭合前侵入大脑，进而发育为小胶质细胞13。为了将PMPs终末分化为诱导小胶质细胞（iMGs），我们采用了一种快速且简化的单细胞培养方法，该方法基于Haenseler等和Brownjohn等的方案，并进行了若干改进，从而建立了一种高效的小胶质细胞分化方法，使iMGs能够稳定表达小胶质细胞富集标志物7,8。该分化方法可在具备iPSC培养经验、并致力于利用人类模型系统研究小胶质细胞生物学的实验室中重复实现。
由诱导多能干细胞分化而来的小胶质细胞是研究人类小胶质细胞的一种具有生物学相关性的来源 体外 实验是研究小胶质细胞经典功能（包括吞噬作用）的重要工具。小胶质细胞是大脑和中枢神经系统中的专职吞噬细胞，负责清除细胞碎片、聚集的蛋白质以及降解的髓鞘14小胶质细胞还通过吞噬突触参与突触重塑，并通过吞噬病原体在抵御外来感染中发挥防御作用。15,16在此方案中，使用人源突触体作为iMG吞噬的材料，以评估iMG的吞噬功能。为此，本文描述了从人源i3LMNs 的描述如下。i3由LMN提取的人类突触体经pH敏感性染料标记，可用于定量分析在吞噬体加工与降解过程中定位于酸性区室的突触体 体外采用活细胞显微镜进行吞噬作用检测，以实时监测小胶质细胞吞噬过程的动态变化。该功能检测方法为在完整的人源系统中研究健康与疾病状态下小胶质细胞吞噬功能可能存在的缺陷奠定了基础。
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方案
注意：本方案中使用的所有试剂必须为无菌状态，所有步骤均须在生物安全柜中的无菌条件下进行。所有诱导多能干细胞系以及维持和分化培养基均在材料表中列出。下文所示的小胶质细胞分化方法基于先前已发表的方案7,8,12，并包含了本文所述的新改进。
1. 小胶质细胞分化
注意：本方案的概述见图1。
- 诱导多能干细胞（iPSC）培养
注意：有关iPSC培养技术的更多详细信息可参见其他文献17.- 解冻与培养维持
- 准备 iPSC 培养基，分装培养基，于 -20 °C 长达6个月。将分装样品在 4 °C 可使用长达1周。使用前于室温放置至少1小时。
- 在6孔板的各孔中加入1 mL包被液进行包被 10 µg/mL 含钙和镁的DPBS稀释的层粘连蛋白52118. 将培养板置于培养箱中，在 37 °C 和5% CO2 至少 2 小时，或最好过夜。稀释后，将层粘连蛋白置于 4 °C 3个月。
- 通过无菌水稀释配制10 mM Rho激酶抑制剂Y27632（ROCK抑制剂）储备液。将ROCK抑制剂溶液分装成单次使用量，于-20°C保存。20 °C 长达1年。
- 通过将0.5 M EDTA储存液用DPBS稀释，配制0.5 mM EDTA。
- 解冻一管冷冻的iPSC时，将冻存管置于水浴中 37 °C 直到大部分解冻。立即将冻存管中的内容物转移至含有 4 mL 的 15 mL 圆锥管中 iPSC 培养基. 500 × g 离心 g 1 分钟。
- 吸弃上清液，并通过加入 1 mL 的溶液重悬细胞 iPSC 培养基 含有 10 µM ROCK抑制剂沿管壁缓慢加入，以避免干扰细胞集落。
- 加入1.5 mL的 iPSC 培养基 含有 10 µM 将ROCK抑制剂加入各包被孔中，并将重悬的克隆逐滴转移至含有培养基的孔中。
注意：使用步骤 1.1.1.6 中的 5–7 滴进行培养物维持，但需针对每种 iPSC 系优化接种密度。 - 通过手动将培养板左右及前后轻轻摇晃，使细胞均匀分布于各孔中。将细胞置于培养箱中，于 37 °C 和5% CO₂2第二天，通过添加新鲜培养基完全更换原有培养基 iPSC 培养基 不含ROCK抑制剂。
- 为维持细胞生长，每天更换培养基，直至细胞汇合度达到80%。
注意：若细胞密度适宜，可在不更换培养基的情况下维持培养2天。 iPSC 培养基 使用该方法可实现灵活的换液时间安排。建议每次传代仅使用一次，且仅在细胞融合度低于50%时进行。
- 分离
- 吸弃培养基，用 1 mL DPBS（不含钙和镁）洗涤细胞。
- 为使细胞脱落，加入1 mL 0.5 mM EDTA，室温孵育2–3分钟，直至细胞集落边缘从孔板表面翘起。用DPBS再次洗涤细胞，然后加入1 mL iPSC 培养基.
- 使用细胞刮轻轻刮取细胞克隆集落使其解离。每个孔内的区域仅刮取一次，以避免扰动克隆集落。
注意：有关从孔中移除菌落的其他方法可参见其他文献17. - 使用1 mL移液器吸头收集细胞，并以1:6的比例（细胞与培养基比例）逐滴加入预先包被的孔中（如步骤1.1.1.2所述），每孔含1.5 mL培养基 iPSC 培养基.
- 解冻与培养维持
- iPSC向小胶质样细胞（iMGs）的分化
注意：小分子和生长因子溶解于经无菌过滤的含0.1%牛血清白蛋白的DPBS中，其储备液浓度比最终浓度高1,000倍。建议在iPSC的早期传代阶段将其分化为iMG。建议对iPSC细胞系进行常规核型分析。- 制备标准包被溶液
- 在冰上解冻细胞外基质包被试剂的储存液 4 °C 过夜。
- 预冷微量离心管和滤芯吸头于 4 °C.
- 等分试样 250 µL 将浓缩的细胞外基质包被试剂加入每根试管中，并立即置于冰上。将分装的试剂在 -20 °C.
- 为制备包被溶液，将一份细胞外基质包被试剂在冰上解冻 4 °C 过夜。
- 向预冷的锥形管中加入 50 mL 冰冷的 DMEM-F12 培养基（该培养基适用于人胚胎干细胞和诱导性多能干细胞的生长，以下简称 DMEM-F12），并置于冰上保存。
- 将1 mL枪头通过反复吸取冰冻的DMEM-F12进行预冷，然后立即用该枪头转移 250 µL 将细胞外基质包被试剂加入含有DMEM-F12培养基的锥形管中。
注意：标准包被液可在 4 °C.
- 拟胚体（EB）形成
- 准备 EB 培养基 可维持在 4 °C 长达 4 天。
- 当诱导多能干细胞（iPSCs）达到80%融合度时，用1 mL DPBS洗涤细胞，并加入1 mL解离试剂，在37°C下孵育2分钟 37 °C用细胞刮刀反复刮取，使菌落脱落，形成单细胞悬液。收集细胞并全部转移至含有9 mL DPBS的15 mL锥形管中。
- 将细胞在 500 × g 1分钟，去除上清液，将细胞重悬于1 mL EB 培养基. 取 10 µL 细胞，与台盼蓝按1:1稀释。使用血细胞计数板对细胞进行计数，并根据细胞浓度将细胞悬液稀释至终浓度为每微升10,000个细胞 100 µL接种细胞时，加入 100 µL 每孔加入稀释后的细胞，置于低吸附性圆底96孔板中。
注意：通常，每个80%融合度的iPSC孔可获得96孔板中的48个孔。 - 将培养板在 125 × g 条件下离心 g 3 分钟，然后孵育于 37 °C 和5% CO2 培养4天。在第2天使用多通道移液器轻轻吸取一半培养基进行换液。 50 µL 旧培养基，并重新加入 50 µL 新鲜的 EB 培养基.
注意：第4天时，iPSCs将形成球形的细胞结构，即结果部分所述的EBs。如有必要，EB分化过程可延长至7天。
- 原始巨噬细胞前体（PMPs）的生成
- 准备 PMP基础培养基，经无菌过滤后，于 4 °C 长达1个月。
- 在6孔板的孔中加入1 mL冰冷的Matrigel包被溶液，进行包被，并于 37 °C 和5% CO2 至少 2 小时，或最好过夜。
- 在EB分化第4天，使用1 mL枪头（移液器）收集EB，将其转移至Matrigel包被的孔中。轻轻吹打1至2次，使EB从孔壁脱离。将6孔板倾斜放置，使EB沉降至孔的边缘。
注意：每个包被孔可接种9或10个EB。 - 待所有EB沉降后，使用1 mL移液器吸头轻柔吹吸并移除旧培养基，同时将EB保持在孔板边缘。加入3 mL新鲜配制的 PMP 完全培养基 向每个孔中加入。通过手动将培养板左右、前后轻轻摇晃，使细胞均匀分布。将培养板放入培养箱中，于 37 °C 和5% CO₂2.
- 7天内不要移动培养板，以使胚胎小体（EBs）贴附到孔底。此后，使用半量换液法更换培养基 PMP 完全培养基.
注意：此时大多数EB应已贴壁于培养板上，可移除任何未贴壁的漂浮EB。 - 5-7天后，在4倍物镜下用明场显微镜观察拟胚体是否已贴壁至孔板底部。按照步骤1.2.3.5所述更换培养基。第21天时，加入3 mL培养基进行完全换液。 PMP 完全培养基.
注意：此时培养基中可能存在悬浮的髓系祖细胞，换液时应弃去这些细胞。 - 第28天，在上清液中观察呈圆形的细胞，即PMPs，使用10 mL移液管和自动移液器收集含有PMPs的培养基。注意不要扰动拟胚体（EBs）。将PMPs及培养基转移至15 mL锥形离心管中，并按步骤1.2.4所述进行后续操作。
注意：通常可从6孔板的五个孔中收集同一iPSC系的PMPs，并将它们汇集至一个15 mL锥形管中。 - 加入 3 mL 新鲜的 PMP 完全培养基 用于EB的进一步培养。由于PMPs会从EB中持续释放超过3个月，应每隔4-7天收集一次（避免培养基颜色变为黄色），具体操作如步骤1.2.3.7和1.2.3.8所述。
注意：尽管PMPs可收集数月，但其表型可能随时间发生变化。
- 诱导型小胶质细胞的分化
- 准备 iMG基础培养基 (材料表），经无菌滤膜过滤后，于 4 °C 长达3周。
- 将PMPs收集至15 mL锥形管后，在200 × g 4分钟。吸除上清液，并用1-2 mL的PMP重悬沉淀。 iMG 基础培养基使用血细胞计数板计数细胞，取少量细胞样品与台盼蓝按1:1比例稀释后进行计数。
注意：0.5–1.5 × 106 PMPs 的获取通常每周进行一次，具体频率取决于 iPSC 细胞系和 EB 培养的天数。 - 再次以 200 × g 离心剩余细胞 g 4 分钟。将 PMPs 稀释至所需浓度，使细胞接种密度约为 ~105/cm2 使用新鲜配制的细胞培养处理板 iMG完全培养基进行半量换液，使用新配制的培养基 iMG完全培养基 每3-4天更换一次培养基，持续10-12天，以促进终末分化。
注意：此时细胞应获得类似小胶质细胞的形态。为确认肺泡巨噬细胞前体（PMPs）向小胶质细胞命运的定向分化，需进行免疫荧光分析，以验证小胶质细胞富集标志物的表达，例如嘌呤能受体P2RY12和跨膜蛋白119（TMEM119）。9. - 为保持细胞健康和活力，应在iMG分化的第10至12天内进行所有实验。
- 制备标准包被溶液
2. 利用运动神经元来源的人类突触体进行吞噬作用检测
- 转录因子介导的诱导多能干细胞来源的下运动神经元分化（i3下运动神经元 (LMNs)
注意：分化过程采用了一种WTC11细胞系，该细胞系在CLYBL安全港位点稳定插入了包含神经源性分化因子2（NGN2）、胰岛素瘤-1（ISL1）和LIM同源盒3（LHX3）转录因子的hNIL可诱导表达盒，具体方法如前所述17iPSC 细胞系的维持培养按照步骤 1.1.1 所述进行，但采用步骤 1.2.1 中描述的包被条件。由于神经元分化无需使用层粘连蛋白 521，因此可用于培养将用于神经元分化的 iPSC 的任何细胞外基质包被试剂均可使用。所有培养基在使用前均需在室温下平衡至少 1 小时。- 用5 mL标准包被液按照1.2.1步骤所述方法包被10 cm培养皿。
注意：此处每次分化使用 3-4 个 10 cm 培养皿。 - 准备 诱导基础培养基，经无菌过滤后，于 4 °C 长达3周。
- 准备 神经元培养基，经无菌过滤后，于 4 °C 长达2周。
- 将100 mM硼酸、25 mM四硼酸钠和75 mM氯化钠溶于无菌水中配制硼酸盐缓冲液。调节pH至8.5，经无菌滤器过滤。
- 当诱导多能干细胞（iPSCs）达到80%融合度时，用DPBS洗涤细胞，并加入0.5 mM EDTA使细胞集落脱落。
注意：每个10 cm培养皿通常需要两个孔。 - 将细胞在室温下孵育4-5分钟。移除EDTA，并向每孔加入3 mL含HEPES的DMEM/F12培养基。
- 使用细胞刮轻轻刮取细胞，并用10 mL移液器轻柔吹打2-3次，将细胞从孔底收集起来。
- 将细胞收集至15 mL锥形管中，于300 × g 3 分钟。
- 将细胞重悬于 3 mL 的 iPSC 培养基 含有 10 µM 使用血细胞计数板计数ROCK抑制剂。
- 接种 1.5 × 106 预包被的10 cm培养皿中的iPSCs，加入12 mL iPSC 培养基 含有 10 µM ROCK抑制剂
- 第二天，移除培养基，并用 DPBS 洗涤细胞。加入 12 mL 新鲜配制的 完全诱导培养基 以诱导转录因子的表达。
- 第2天，用5 mL神经元包被液对10 cm培养皿进行包被，该包被液由等体积的0.1 mg/mL多聚-D-赖氨酸和1 mg/mL多聚-L-鸟氨酸用硼酸盐缓冲液稀释制备而成。置于37°C培养箱中孵育过夜 37 °C 和5% CO2.
- 第3天，用无菌水清洗包被的培养皿3次，彻底吸干水分，然后将培养皿倾斜放置，在生物安全柜中部分敞盖，于室温下干燥至少1小时。
- 待培养皿完全干燥后，加入6 mL的 完全诱导培养基 添加了 15 µg/mL 层粘连蛋白和 40 µM BrdU 至少 1 小时 37 °C 和5% CO2.
注意：建议使用 BrdU 处理以消除有丝分裂活跃的细胞，从而提高神经元培养的纯度。BrdU 对神经元健康的影响极小。 - 向每个10 cm培养皿中的分化细胞加入3 mL消化试剂，在室温下孵育3-4分钟。
- 向培养板中加入 6 mL DPBS，无需去除解离试剂，使用 10 mL 移液器将细胞悬液上下吹打 4–5 次以解离细胞。
- 收集细胞悬液并使其通过一个 40 µm 细胞滤筛转移至50 mL锥形管中。加入1 mL 诱导基础培养基 冲洗滤网。
- 以 300 × g 5分钟。吸去培养基，将细胞重悬于3 mL培养基中 完全诱导培养基 含有 40 µM BrdU
- 使用血细胞计数板对细胞进行计数。将约 2.5 × 106 每10 cm培养皿接种细胞，将细胞用6 mL培养基稀释后加入预先包被的培养皿中 完全诱导培养基 含有 40 µM BrdU，无需去除在步骤2.1.14中加入的包被溶液。
- 第4天，吸除培养基，用DPBS洗涤细胞1次，然后加入新鲜培养基 完全诱导培养基 含有 40 µM BrdU
- 第6天，吸除培养基，用DPBS洗涤细胞1次，然后加入 神经元培养基 添加了 1 µg/mL 层粘连蛋白。
- 第9天，更换1/3rd 通过更换为新鲜培养基 神经元培养基 添加了 1 µg/mL 层粘连蛋白
- 维持 i3LMNs 再培养 25 天，期间进行半量换液 神经元培养基 添加新鲜的 1 µg/mL 每3-4天更换一次层粘连蛋白。
注意：在此时间点，i3下运动神经元应呈现具有长突起的神经元形态。神经元还倾向于形成细胞团或细胞簇。有关如何验证i分化的更详细描述3下运动神经元可存在于其他部位17.
- 用5 mL标准包被液按照1.2.1步骤所述方法包被10 cm培养皿。
- 突触体纯化与标记
注意：保持无菌条件，所有步骤均须在生物安全柜内进行。- 洗涤 i3 用DPBS将LMNs洗涤两次。
- 加入2 mL预冷的突触体分离用细胞裂解试剂，冰上孵育2分钟，并用力刮取神经元。
- 将裂解液转移至多个2 mL微量离心管中（每管约1.5 mL裂解液），在1,200 × g 10 min 4 °C.
注意：整个操作过程中，始终将试管置于冰上。 - 收集上清液（弃去沉淀），在15,000 × g 20 分钟 4 °C将含有突触体的沉淀物用与原始裂解液体积相似的含5% DMSO的DPBS重悬并保存。
注意：突触体可立即用荧光染料标记，或在 -80 °C 以备将来使用。 - 对所有试管进行二辛可宁酸（BCA）蛋白测定，以评估突触体分离物中的总蛋白得率。
注意：也可使用其他方法测定蛋白质浓度。不同制备样品所得的总蛋白产量已包含在内 表1 作为参考，建议对突触体样本进行蛋白质印迹分析，以确认突触前和突触后蛋白的存在。此处选择突触前标志物突触素（SYP）和突触后标志物突触后密度蛋白95（PSD95）进行蛋白质印迹分析，具体步骤如前所述。19. - 配制100 mM碳酸氢钠水溶液，调节pH至8.5，经无菌滤器过滤。
- 将1 mg所用的pH敏感性染料冻干粉溶解于 150 µL DMSO。分装成单次使用量，于 -80 °C.
- 以 15,000 × g 离心突触体 g 5 分钟 4 °C.
- 将突触体稀释至最多 1 mg 100 µL 100 mM 碳酸氢钠溶液
- 为了标记突触体，加入 1 µL 每1 mg突触体加入重悬的pH敏感性染料，用铝箔包裹反应管以避免光照。使用试管振荡器在室温下振荡2 h。
- 向离心管中加入 1 mL DPBS，将标记的突触体在 15,000 × g 5 分钟 4 °C.
- 移除上清液，并按照步骤 2.2.11 中所述进行四次额外洗涤。
- 最后一次洗涤并离心后，尽可能吸除上清液，避免扰动沉淀物，并用含5% DMSO的DPBS重悬标记的突触体，调整体积至所需浓度（0.7 µg/µL 此处使用）。制备单次使用分装液，于 -80 °C务必避免标记的突触体暴露于光照下。
- 活细胞吞噬作用检测
- 接种20-30 × 10的细胞4 将PMPs加入96孔板中 100 µL 的 iMG完全培养基 并按照步骤1.2.4中所述，进行为期10天的分化过程。
- 在检测当天，将1滴活细胞核染色剂加入2 mL中，配制核染色溶液 iMG基础培养基.
- 移除 40 µL 每孔加入96孔板中适量培养基，并添加 10 µL 使用多通道移液器加入核染色溶液。将培养板置于 37 °C 和5% CO2 2小时。
- 将标记的突触体在冰上解冻，并使用水浴超声仪轻轻超声处理1分钟。立即将突触体放回冰上。用适当缓冲液稀释标记的突触体 iMG完全培养基 以比例 1 µL 每 synaptosome 的 50 µL 培养基的量。
注意：突触体的浓度取决于具体实验，可能需要优化。为保持培养基中二甲基亚砜（DMSO）的浓度相对较低（即0.1%或更低），建议添加量不要超过 2 µL 每孔突触体数量。 - 作为阴性对照，用细胞松弛素D预处理部分孔，以抑制肌动蛋白聚合，从而抑制吞噬作用。制备细胞松弛素D溶液 60 µM 细胞松弛素D iMG完全培养基添加 10 µL 将该溶液加入每孔，终浓度为 10 µM 并在指定条件下孵育 37 °C 和5% CO₂2 30分钟。
- 从培养箱中取出培养板，并在 10 °C 10分钟。将培养板置于冰上，并加入 50 µL 含按2.3.4步骤所述制备的突触体的培养基
- 将培养板在 270 × g 3 分钟 10 °C 并将培养板置于冰上直至进行成像采集。
- 成像采集与分析
- 将培养板放入活细胞成像仪中，并选择需要分析的孔。
- 选择一个 20x 物镜
- 调节 焦点，发光二极管（LED) 强度，积分时间，以及 增益 的 明场 和 蓝色 （4',6-二脒基-2-苯基吲哚 [DAPI]）通道。在初始时间点，突触体的荧光信号应可忽略不计。聚焦于 红色 （RFP）通道，以明场通道作为参考。不同实验间的积分时间和增益可能有所差异；红光通道的初始设置建议如下： LED：4，积分时间：250，以及 增益：5.
- 选择每个孔中马赛克成像所需获取的单个图像块数量（采集 16 个图块 在 孔的中心，从而成像约5%的总孔面积）。设置 温度 到 37 °C 以及 期望的时间间隔 用于成像。
注意：本研究中图像每1-2小时采集一次，持续长达16小时。 - 打开分析软件。
- 打开包含图像的实验。点击 数据缩减 图标.
- 在菜单中选择 图像拼接 在……下方 图像处理 根据所述参数，将拼接图中的 4 × 4 个单独图像块合成为一幅完整图像 表2.
- 一旦拼接图像生成后，定义一个 强度阈值 使用DAPI和RFP通道获取这些图像。打开图像并点击 分析；在……之下 分析，选择 细胞分析, 以及在……之下 检测通道，选择 DAPI 或 RFP 通道中的拼接图像。前往 初级掩膜与计数 标签并建立一个 阈值 和 物体大小 在DAPI通道中准确选择细胞核，或在RFP通道中准确选择突触体信号的参数值。使用不同图像重复此过程，直至优化出适用于整个实验的参数。
注：建议值可在 表2. - 要统计细胞核数量，请前往 数据缩减 菜单，以及在 图像分析，选择 细胞分析. 前往 初级掩膜与计数 标签和下方 通道, 选择 DAPI 拼接 图像，并使用文中所述参数 表 2.
- 前往 计算指标 标签并选择 细胞计数. 要获得突触体信号的面积，请前往 数据缩减 菜单和下方 分析，选择 细胞分析.
- 前往 初级掩膜与计数 标签和下方 通道，选择 RFP 拼接 图像，并使用下述详细参数 表2.
- 前往 计算指标 标签并选择 物体总面积. 在 数据降维 标签，点击 好的 并允许软件分析所有获取的图像。
- 导出 物体总面积 和 细胞计数 每个时间点的值。将 物体总面积 由 细胞计数 计算每个时间点的归一化面积。若比较多种处理或基因型，请使用公式（1):
(1) - 保存结果并整合数据。
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结果
采用本方案生成诱导性小胶质细胞（iMGs）时，必须从具有紧凑集落形态且边界清晰的未分化iPSCs开始（图2A）。如拟胚体（EB）形成部分所述方式维持的解离后iPSCs将形成球形聚集体，即拟胚体（EBs），其体积将持续增大至分化第4天（图2B）。一旦收集EBs并接种于生成原髓系前体细胞（PMP）的适当条件下，它们将贴附于基质胶（Matrigel）包被的培养板上，并有一层细胞延展并包裹球形聚集体（图2C）。不健康的EBs会从培养板上脱落，应予以清除。在PMP生成的第14至21天期间，可能出现多种潜在的不同细胞类型，它们将悬浮于培养基中；这些细胞应在换液过程中丢弃12。至第28天，将出现悬浮的圆形细胞，其胞质与细胞核比例较大（图2D），称为PMPs。这些细胞可持续产生，并可在换液时每周收集一次，持续长达3个月。每周收获的PMP数量因iPSC细胞系及培养时间而异...
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讨论
本文所述的分化方案可在约6至8周内高效地获得高纯度、足够产量的诱导多能干细胞来源的类小胶质细胞，适用于进行免疫荧光实验及其他需要较大量细胞的检测。该方案在1周内最多可获得1 × 106个iMGs，足以进行蛋白质和RNA提取以及相应的下游分析（如RNA测序、定量逆转录PCR、蛋白质印迹、质谱分析）。然而，该方案的一个局限性在于iMGs的产量可能限制某些应用。可通过额外改进方法，收集不同周数的PMPs，并在悬浮培养中维持均一细胞群体，直至积累足够数量的前体细胞后一次性进行后续分化过程18。或者，也可通过使用更大表面积的细胞培养板扩大类胚体（EBs）的培养规模，以增加PMPs的产量。
建议使用在层粘连蛋白521包被的培养板中培养的iPSCs来启动分化过程。其他包被试剂可能会减少后续过程中PMPs的产量18。同样，在PMP生成期间对培养板进行包被以促进EB黏附，可增强EB的贴附能力，从而延长培养物的存活时间。EB培养最长可维持达4个月，此时多个EB会脱落并死亡。然而，其他研...
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披露
作者声明无利益冲突。
致谢
作者感谢 Michael Ward 提供用于运动神经元分化的 WTC11 hNIL 诱导多能干细胞系，以及 Jackson 实验室提供用于小胶质细胞分化的 KOLF2.1J WT 克隆 B03 诱导多能干细胞系。我们还感谢 Dorothy Schafer 在方案实施过程中给予的支持，Anthony Giampetruzzi 和 John Landers 在活细胞成像系统方面提供的帮助，Hayden Gadd 在修订期间的技术贡献，以及 Jonathan Jung 在本研究中的合作。本工作由马萨诸塞大学陈医学院的 Dan 和 Diane Riccio 神经科学基金以及 Angel 基金会资助。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 免疫荧光分析用抗体 | |||
| 兔抗IBA1抗体 | 和光纯药美国公司 | NC9288364 | 1:350 稀释度 |
| 兔抗P2RY12抗体 | Sigma-Aldrich | HPA014518 | 1:50 稀释度 |
| 兔抗TMEM119抗体 | Sigma-Aldrich | HPA051870 | 1:100 稀释度 |
| 用于蛋白质印迹分析的抗体 | |||
| 抗-β-微管蛋白兔抗体 | Abcam | ab6046 | 1:500 稀释度 |
| 抗突触素（SYP）兔抗体 | Abclonal | A6344 | 1:1,000 稀释度 |
| 抗PSD95小鼠抗体 | Millipore | MAB1596 | 1:500 稀释 |
| 硼酸盐缓冲液组分 | |||
| 硼酸（100 mM） | Sigma | B6768 | |
| 碳酸氢钠（NaHCO₃）3生物Xtra | Sigma-Aldrich | S6297-250G | |
| 氯化钠（75 mM） | Sigma | S7653 | |
| 四硼酸钠（25 mM） | Sigma | 221732 | |
| 细胞培养材料 | |||
| 6孔板 | Greiner Bio-One | 657160 | |
| 40 μm 细胞滤筛 | Falcon | 352340 | |
| 100 mm × 20 mm 组织培养处理皿 | CELLTREAT | 229620 | |
| 细胞刮刀，双头，平刃 && 窄刃，无菌 | CELLTREAT | 229305 | |
| 低吸附圆底96孔板 | 康宁 | 7007 | |
| Primaria 24孔平底表面修饰多孔细胞培养板 | 康宁 | 353847, | |
| Primaria 6孔细胞培养板，平底，表面修饰 | 康宁 | 353846 | |
| Primaria 96孔透明平底微孔板 | 康宁 | 353872 | |
| 细胞解离试剂 | |||
| Accutase | 康宁 | 25058CI | 用于下运动神经元分化的解离试剂 |
| TrypLE 试剂 | Life Technologies | 12-605-010 | 用于小胶质细胞分化的解离试剂 |
| UltraPure 0.5 M EDTA，pH 8.0 | Invitrogen | 15575020 | |
| 细胞培养用包被试剂 | |||
| Matrigel GFR 基底膜基质 | 康宁™ | 354230 | 称为细胞外基质包被试剂 |
| CellAdhere 层粘连蛋白-521 | STEMCELL 技术 | 77004 | 称为层粘连蛋白521 |
| 聚-D-赖氨酸 | Sigma | P7405 | 用硼酸盐缓冲液重悬至 0.1 mg/mL |
| 聚-L-鸟氨酸 | Sigma | P3655 | 用硼酸盐缓冲液重悬至 1 mg/mL |
| 组成部分 iPSC 培养基 | |||
| mTeSR Plus 试剂盒 | STEMCELL 技术 | 100-0276 | 准备 iPSC 培养基 将各组分混合至1x |
| 组成部分 EB培养基 | |||
| BMP-4 | Fisher Scientific | PHC9534 | 终浓度 50 ng/mL |
| iPSC 培养基 | 终浓度 1x | ||
| ROCK抑制剂Y27632 | Fisher Scientific | BD 562822 | 终浓度 10 µM |
| SCF | PeproTech | 300-07 | 终浓度 20 ng/mL |
| VEGF | PeproTech | 100-20A | 终浓度 50 ng/mL |
| 组成部分 PMP 基础培养基 | |||
| GlutaMAX | Gibco | 35050061 | 终浓度 1x |
| 青霉素-链霉素（10,000 U/mL） | Gibco | 15140122 | 终浓度 100 U/mL |
| X-VIVO 15 | Lonza | 12001-988 | 终浓度 1x |
| 组成部分 PMP 完全培养基 | |||
| 55 mM 2-巯基乙醇 | Gibco | 21985023 | 终浓度 55 µM |
| IL-3 | PeproTech | 200-03 | 终浓度 25 ng/mL |
| M-CSF | PeproTech | 300-25 | 终浓度 100 ng/mL |
| PMP 基础培养基 | 终浓度 1x | ||
| 组成部分 iMG 基础培养基 | |||
| 高级DMEM/F12 | Gibco | 12634010 | 终浓度 1x |
| GlutaMAX | Gibco | 35050061 | 终浓度 1x |
| N2 补充剂，100 倍 | Gibco | 17502-048 | 终浓度 1x |
| 青霉素-链霉素（10,000 U/mL） | Gibco | 15140122 | 终浓度 100 U/mL |
| 组成部分 iMG 完全培养基 | |||
| 55 mM 2-巯基乙醇 | Gibco | 21985023 | 终浓度 55 µM |
| IL-34 | PeproTech 或 Biologend | 200-34 或 577904 | 终浓度 100 ng/mL |
| iMG 基础培养基 | 终浓度 1x | ||
| M-CSF | PeproTech | 300-25 | 终浓度 5 ng/mL |
| TGF-β | PeproTech | 100-21 | 终浓度 50 ng/mL |
| 诱导基础培养基的组分 | |||
| 含 HEPES 的 DMEM/F12 培养基 | Gibco | 11330032 | 终浓度 1x |
| GlutaMAX | Gibco | 35050061 | 终浓度 1x |
| N2 补充剂，100 倍 | Gibco | 17502-048 | 终浓度 1x |
| 非必需氨基酸（NEAA），100倍 | Gibco | 11140050 | 终浓度 1x |
| 完全诱导培养基的组分 | |||
| 化合物 E | Calbiochem | 565790 | 终浓度 0.2 μM，并用1:1的乙醇和DMSO将储备试剂重悬至2 mM |
| 多西环素 | Sigma | D9891 | 终浓度 2 μg/mL，并用DPBS将储备试剂重悬至2 mg/mL |
| 诱导基础培养基 | 终浓度 1x | ||
| ROCK抑制剂Y27632 | Fisher Scientific | BD 562822 | 终浓度 10 μM |
| 神经元培养基的成分 | |||
| B-27 Plus 神经元培养系统 | Gibco | A3653401 | 培养基和添加剂的终浓度为1x |
| GlutaMAX | Gibco | 35050061 | 终浓度 1x |
| N2 补充剂，100 倍 | Gibco | 17502-048 | 终浓度 1x |
| 非必需氨基酸（NEAA），100 倍 | Gibco | 11140050 | 终浓度 1x |
| 本研究中使用的人诱导多能干细胞系 | |||
| KOLF2.1J：野生型克隆 B03 | 杰克逊实验室 | ||
| WTC11 hNIL | 美国国立卫生研究院 | ||
| 突触体分离试剂 | |||
| BCA 蛋白检测试剂盒 | Thermo Scientific Pierce | 23227 | |
| 二甲基亚砜（DMSO） | Sigma | D2650 | |
| Syn-PER 突触蛋白提取试剂 | 赛默飞世尔科技 | 87793 | 用于分离突触体的细胞裂解试剂 |
| 吞噬作用检测染料 | |||
| NucBlue Live Ready 试剂 | Invitrogen | R37605 | |
| pHrodo 红色，琥珀酰亚胺酯 | 赛默飞世尔科技 | P36600 | 被称为pH敏感性染料 |
| 其他细胞培养试剂 | |||
| 0.4% 台盼蓝溶液 | AMRESCO 公司 | K940-100ML | |
| 牛血清白蛋白（BSA） | Sigma | 22144-77-0 | |
| BrdU | Sigma | B9285 | 用无菌水重悬至 40 mM |
| 细胞松弛素D | Sigma | 终浓度 10 µM | |
| 含钙和镁的DPBS | 康宁 | 21-030-CV | |
| 不含钙和镁的DPBS | 康宁 | 21-031-CV | 称为 DPBS |
| KnockOut DMEM/F-12 | Gibco | 12660012 | DMEM-F12，适用于人胚胎干细胞和诱导性多能干细胞生长的优化培养基 |
| 小鼠层粘连蛋白，天然 | Gibco | 23017015 | 称为层粘连蛋白 |
| 软件与设备 | |||
| 离心 | Eppendorf | Model 5810R | |
| Cytation 5 活细胞成像仪 | Biotek | ||
| Gen5 微孔板读板仪与成像软件 | Biotek | 版本 3.03 | |
| 多温加热振荡 | 基准测试 | 参照为试管振荡器 | |
| 水浴超声仪 | 埃尔玛 | Mode Transsonic 310 |
参考文献
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- Muzio, L., Viotti, A., Martino, G. Microglia in neuroinflammation and neurodegeneration: from understanding to therapy. Frontiers in Neuroscience. 15, 742065(2021).
- Galatro, T. F., et al. Transcriptomic analysis of purified human cortical microglia reveals age-associated changes. Nature Neuroscience. 20 (8), 1162-1171 (2017).
- Gosselin, D., et al. An environment-dependent transcriptional network specifies human microglia identity. Science. 356 (6344), (2017).
- Haimon, Z., et al. Re-evaluating microglia expression profiles using RiboTag and cell isolation strategies. Nature Immunology. 19 (6), 636-644 (2018).
- Abud, E. M., et al. iPSC-derived human microglia-like cells to study neurological diseases. Neuron. 94 (2), 278-293 (2017).
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- McQuade, A., et al. Development and validation of a simplified method to generate human microglia from pluripotent stem cells. Molecular Neurodegeneration. 13 (1), 1-13 (2018).
- Muffat, J., et al. Efficient derivation of microglia-like cells from human pluripotent stem cells. Nature Medicine. 22 (11), 1358-1367 (2016).
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- Janda, E., Boi, L., Carta, A. R. Microglial phagocytosis and its regulation: a therapeutic target in Parkinson's disease. Frontiers in Molecular Neuroscience. 11, 144(2018).
- Schafer, D. P., Stevens, B. Microglia function in central nervous system development and plasticity. Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. 7 (10), 020545(2015).
- Nau, R., Ribes, S., Djukic, M., Eiffert, H. Strategies to increase the activity of microglia as efficient protectors of the brain against infections. Frontiers in Cellular Neuroscience. 8, 138(2014).
- Fernandopulle, M. S., et al. Transcription factor-mediated differentiation of human iPSCs into neurons. Current Protocols in Cell Biology. 79 (1), 51(2018).
- Gutbier, S., et al. Large-scale production of human IPSC-derived macrophages for drug screening. International Journal of Molecular Sciences. 21 (13), 4808(2020).
- Sellgren, C., et al. Patient-specific models of microglia-mediated engulfment of synapses and neural progenitors. Molecular Psychiatry. 22 (2), 170-177 (2017).
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