人源小胶质样细胞：由诱导性多能干细胞分化而来及 体外 使用人突触体的活细胞吞噬作用检测

摘要

本方案描述了将人诱导性多能干细胞（iPSCs）分化为小胶质细胞样细胞的过程 体外 实验。我们还包含了一种详细的制备方法，用于从诱导多能干细胞衍生的下运动神经元中生成人突触体，该突触体可作为底物用于 体外 使用活细胞成像系统的吞噬作用检测

摘要

小胶质细胞是起源于髓系的常驻免疫细胞，负责维持脑内微环境的稳态，并在多种神经系统疾病中发挥关键作用。研究健康和疾病状态下的人类小胶质细胞面临巨大挑战，主要由于人类细胞来源极为有限。来源于个体的诱导性多能干细胞（iPSCs）可被用于突破这一限制。本文展示了如何将人类iPSCs分化为类小胶质细胞（iMGs），以用于 体外 实验。这些诱导型小胶质细胞（iMGs）表现出小胶质细胞预期的生理特性，包括典型的小胶质细胞样形态、特异性标志物的表达以及活跃的吞噬作用。此外，还提供了从人诱导多能干细胞（iPSC）来源的下运动神经元衍生的突触体底物的分离与标记的操作说明。³提供了一种运动神经元（LMNs）的培养方法。采用活细胞纵向成像检测技术，通过监测被pH敏感性染料标记的人源突触体的吞噬过程，以研究小胶质细胞（iMG）的吞噬能力。本文所述方案可广泛应用于研究人源小胶质细胞生物学及其在疾病中作用的多个领域。

引言

小胶质细胞是中枢神经系统（CNS）中的常驻免疫细胞，在CNS发育过程中发挥着关键作用。在成年大脑中，小胶质细胞对于维持内环境稳定以及积极应对创伤和疾病过程也至关重要。累积的证据表明，小胶质细胞在多种神经发育性和神经退行性疾病的发生机制中起着核心作用^1,2。尽管目前关于小胶质细胞生物学的知识主要来源于小鼠模型，但最近的研究揭示了小鼠与人类小胶质细胞之间存在重要差异，凸显了开发新技术以研究人类小胶质细胞遗传学和生物学功能的必要性^3,4。从小块原代组织中分离小胶质细胞可能会显著改变其特性⁵，从而可能干扰使用此类细胞所获得的实验结果。本方法的总体目标是将人诱导性多能干细胞（iPSCs）分化为诱导性小胶质样细胞（iMGs），从而建立一种细胞培养系统，用于在基础条件下研究人类小胶质细胞。此外，本文还包含一种基于完全人源化模型系统的吞噬功能检测方法，可用于评估iMGs的功能性，既作为质量控制手段，也可用于研究疾病背景下iMGs的功能障碍。

近年来，文献中出现了多种从诱导多能干细胞（iPSCs）分化为小胶质细胞的实验方案^6,7,8,9,10。部分方案可能存在的缺点包括分化周期较长、需要添加多种生长因子和/或实验步骤复杂^6,9,10。本文展示了一种“用户友好型”分化方法，该方法通过将iPSCs分化为称为原始巨噬细胞前体细胞（PMPs）的前体细胞，模拟了小胶质细胞发育过程中的某些特征^7,11。PMPs的生成方法基于先前报道的方案，并进行了部分优化¹²。PMPs模拟了不依赖MYB的卵黄囊来源巨噬细胞，这类巨噬细胞在胚胎发育过程中于血脑屏障闭合前侵入大脑，进而发育为小胶质细胞¹³。为了将PMPs终末分化为诱导小胶质细胞（iMGs），我们采用了一种快速且简化的单细胞培养方法，该方法基于Haenseler等和Brownjohn等的方案，并进行了若干改进，从而建立了一种高效的小胶质细胞分化方法，使iMGs能够稳定表达小胶质细胞富集标志物^7,8。该分化方法可在具备iPSC培养经验、并致力于利用人类模型系统研究小胶质细胞生物学的实验室中重复实现。

由诱导多能干细胞分化而来的小胶质细胞是研究人类小胶质细胞的一种具有生物学相关性的来源 体外 实验是研究小胶质细胞经典功能（包括吞噬作用）的重要工具。小胶质细胞是大脑和中枢神经系统中的专职吞噬细胞，负责清除细胞碎片、聚集的蛋白质以及降解的髓鞘¹⁴小胶质细胞还通过吞噬突触参与突触重塑，并通过吞噬病原体在抵御外来感染中发挥防御作用。^15,16在此方案中，使用人源突触体作为iMG吞噬的材料，以评估iMG的吞噬功能。为此，本文描述了从人源i³LMNs 的描述如下。i³由LMN提取的人类突触体经pH敏感性染料标记，可用于定量分析在吞噬体加工与降解过程中定位于酸性区室的突触体 体外采用活细胞显微镜进行吞噬作用检测，以实时监测小胶质细胞吞噬过程的动态变化。该功能检测方法为在完整的人源系统中研究健康与疾病状态下小胶质细胞吞噬功能可能存在的缺陷奠定了基础。

方案

注意：本方案中使用的所有试剂必须为无菌状态，所有步骤均须在生物安全柜中的无菌条件下进行。所有诱导多能干细胞（iPSC）系、维持培养基和分化培养基均在材料表中列出。下文所示的小胶质细胞分化方法基于先前已发表的方案^7,8,12，并包含了本文所述的新改进。

1. 小胶质细胞分化

注意：本方案的概述见图1。

1. 诱导多能干细胞（iPSC）培养
   注意：有关iPSC培养技术的更多详细信息可参见其他文献¹⁷.
   1. 解冻与培养维持
      1. 准备 iPSC 培养基分装培养基，于 -20 °C 保存，可保存长达 6 个月。将分装样品在 4 °C 过夜解冻，解冻后 1 周内使用。使用前于室温放置至少 1 小时。
      2. 用含有钙和镁的DPBS稀释的10 µg/mL层粘连蛋白521溶液，每孔加入1 mL，包被6孔板的孔壁¹⁸将培养板置于37 °C、5% CO₂的培养箱中孵育。₂ 至少2小时，或最好过夜。稀释后，将层粘连蛋白于4 °C保存，可存放3个月。
      3. 通过无菌水稀释配制10 mM Rho激酶抑制剂Y27632（ROCK抑制剂）储备液。将ROCK抑制剂溶液分装成单次使用量，于-20 °C保存，可使用长达1年。
      4. 通过将0.5 M EDTA储存液用DPBS稀释，制备0.5 mM EDTA溶液。
      5. 解冻一管冷冻的iPSCs时，将冻存管置于37 °C水浴中，直至大部分融化。立即将管内液体转移至含有4 mL培养基的15 mL锥形管中 iPSC 培养基. 在500 × g条件下离心 g 1 分钟。
      6. 吸弃上清液，并加入 1 mL 悬浮液重悬细胞 iPSC 培养基 加入10 µM ROCK抑制剂，沿管壁缓慢加入，以避免干扰细胞集落。
      7. 加入1.5 mL的 iPSC 培养基 向每个包被孔中加入含有10 µM ROCK抑制剂的培养基，并将重悬的细胞集落逐滴转移至含培养基的孔中。
         注意：使用步骤 1.1.1.6 中的 5–7 滴进行培养物维持，但需针对每种 iPSC 系优化接种密度。
      8. 通过手动将培养板左右及前后轻轻摇晃，使细胞均匀分布于各孔中。将细胞置于37 °C、5% CO₂的培养箱中培养。₂第二天，通过添加新鲜培养基完全更换原有培养基 iPSC 培养基 不含ROCK抑制剂。
      9. 为维持细胞生长，每天更换培养基，直至细胞汇合度达到80%。
         注意：若细胞密度适宜，可在不更换培养基的情况下维持培养2天。 iPSC 培养基 使用该方法可实现灵活的换液时间安排。建议每次传代仅使用一次，且仅在细胞融合度低于50%时进行。
   2. 分离
      1. 吸弃培养基，并用 1 mL DPBS（不含钙和镁）洗涤细胞。
      2. 为使细胞脱落，加入 1 mL 0.5 mM EDTA，室温孵育 2–3 分钟，直至细胞集落边缘从孔壁表面翘起。用 DPBS 再次洗涤细胞，然后加入 1 mL iPSC 培养基.
      3. 用细胞刮轻轻刮取细胞克隆以进行解离。每个孔中的区域仅刮取一次，避免扰动克隆。
         注意：有关从孔中移除菌落的其他方法可参见其他文献¹⁷.
      4. 使用1 mL移液器吸头收集细胞，并以1:6的比例（细胞与培养基比例）逐滴加入预先包被的孔中（如步骤1.1.1.2所述），每孔含1.5 mL培养基 iPSC 培养基.
2. iPSC向小胶质样细胞（iMGs）的分化
   注意：小分子和生长因子溶解于经无菌过滤的含0.1%牛血清白蛋白的DPBS中，配制成比最终浓度高1,000倍的储存液。建议在iPSCs的早期传代阶段将其分化为iMGs。建议对iPSC细胞系进行常规核型分析。
   1. 制备标准包被溶液
      1. 将细胞外基质包被试剂的储存液在4 °C冰上过夜解冻。
      2. 将微量离心管和带滤芯吸头在4 °C预冷。
      3. 将250 µL浓缩的细胞外基质包被试剂分装至各管中，立即置于冰上。将分装的试剂储存于-20 °C。
      4. 为制备包被溶液，将一份细胞外基质包被试剂在冰上于 4 °C 过夜解冻。
      5. 向预冷的锥形管中加入 50 mL 冰冷的 DMEM-F12 培养基（专为人类胚胎干细胞和诱导性多能干细胞生长优化，以下简称 DMEM-F12），并置于冰上保存。
      6. 用1 mL枪头反复吸取冰冻的DMEM-F12培养基数次以预冷枪头，随后立即使用该枪头将250 µL细胞外基质包被试剂转移至含有DMEM-F12培养基的锥形管中。
         注意：标准包被液可在 4 °C 下保存 2 周。
   2. 拟胚体（EB）形成
      1. 准备 EB 培养基 可在4 °C下保存长达4天。
      2. 当诱导多能干细胞（iPSCs）达到80%融合度时，用1 mL DPBS洗涤细胞，然后加入1 mL解离试剂，在37 °C孵育2分钟以解离细胞集落。使用细胞刮刀反复刮擦，使集落脱落，形成单细胞悬液。收集细胞，并将全部内容转移至含有9 mL DPBS的15 mL离心管中。
      3. 以 500 × g 1 分钟后，弃去上清液，将细胞重悬于 1 mL 的 EB 培养基取10 µL细胞悬液，与台盼蓝按1:1比例稀释。使用血细胞计数板计数细胞，并根据计数结果将细胞储备液稀释至每100 µL含10,000个细胞。接种细胞时，每孔加入100 µL稀释后的细胞悬液至低吸附圆底96孔板中。
         注意：通常，每个80%融合度的iPSC孔可获得96孔板中的48个孔。
      4. 将培养板在 125 × g 条件下离心 g 3 分钟，然后在 37 °C、5% CO₂ 条件下孵育₂ 培养4天。在第2天使用多通道移液器轻轻吸取50 µL旧培养基，进行半量换液，然后加入50 µL新鲜培养基 EB 培养基.
         注意：第4天时，iPSCs将形成球形的细胞结构，即结果部分所述的EB。如有必要，EB分化过程可延长至7天。
   3. 原始巨噬细胞前体（PMPs）的生成
      1. 准备 PMP基础培养基，经无菌过滤后，于4 °C保存，可存放长达1个月。
      2. 在6孔板的各孔中加入1 mL冰冷的Matrigel包被溶液进行包被，并在37 °C、5% CO₂条件下孵育₂ 至少 2 小时，或最好过夜。
      3. 在EB分化第4天，使用1 mL枪头（移液器）收集EB，将其转移至Matrigel包被的孔中。轻轻吹打1至2次，使EB从孔壁脱离。将6孔板倾斜放置，使EB沉降到孔的边缘。
         注意：每个包被孔可接种9至10个EB。
      4. 待所有拟胚体沉降后，用1 mL枪头轻轻吹打并移除旧培养基，同时将拟胚体保留在孔的边缘处。加入3 mL新鲜配制的 PMP 完全培养基 向每个孔中加入。通过手动将培养板左右、前后轻轻摇晃，使细胞均匀分布。将培养板置于37 °C、5% CO₂的培养箱中孵育。₂.
      5. 7天内不要移动培养板，以使胚胎体（EBs）贴附到孔底。此后，使用半量换液法更换培养基 PMP 完全培养基.
         注意：此时大多数拟胚体应已贴壁于培养板上。任何未贴壁的悬浮拟胚体可予以去除。
      6. 5-7天后，在4倍物镜下用明场显微镜观察拟胚体，确保其已贴壁至孔板底部。按照步骤1.2.3.5所述更换培养基。第21天时，加入3 mL培养基进行完全换液 PMP 完全培养基.
         注意：此时培养基中可能存在悬浮的髓系祖细胞。换液时应弃去这些细胞。
      7. 第28天，在上清液中观察呈圆形的细胞，即PMPs，使用10 mL移液管和自动移液器收集含有PMPs的培养基。注意不要扰动拟胚体（EBs）。将PMPs及培养基转移至15 mL锥形管中，并按步骤1.2.4所述进行后续操作。
         注意：通常可从6孔板的五个孔中收集同一iPSC系的PMP，并将它们汇集至一个15 mL圆底离心管中。
      8. 加入3 mL新鲜的 PMP 完全培养基 用于EB的进一步培养。由于PMPs会持续从EB中释放超过3个月，按照步骤1.2.3.7和1.2.3.8所述，每4-7天收集一次（避免培养基颜色变为黄色）。
         注意：尽管PMPs可收集数月，但其表型可能随时间发生变化。
   4. 诱导型小胶质细胞（iMGs）的分化
      1. 准备 iMG基础培养基 (材料表），经无菌过滤后，于4 °C保存，可保存长达3周。
      2. 将PMP收集至15 mL锥形管后，在200 × g 孵育4分钟。吸除上清液，并用1-2 mL的PMP重悬液重新悬浮PMPs。 iMG基础培养基使用血细胞计数板，取少量细胞悬液与台盼蓝按1:1比例稀释后进行细胞计数。
         注意：0.5–1.5 × 10⁶ PMPs 的获取通常每周进行一次，具体频率取决于 iPSC 细胞系和 EB 培养的天数。
      3. 再次以 200 × g 离心剩余细胞 g 4 分钟。将 PMPs 稀释至所需浓度，使细胞接种密度约为 ~10⁵/cm² 使用新鲜配制的细胞培养处理板 iMG完全培养基进行半量换液，使用新配制的培养基 iMG完全培养基 每3-4天更换一次，持续10-12天，以促进终末分化。
         注意：此时细胞应呈现小胶质细胞样形态。为确认肺泡巨噬细胞前体（PMPs）向小胶质细胞命运的定向分化，需进行免疫荧光分析，以验证小胶质细胞富集标志物的表达，如嘌呤能受体P2RY12和跨膜蛋白119（TMEM119）。⁹.
      4. 为保持细胞的健康与活性，所有实验应在iMG分化第10至12天之间进行。

2. 利用运动神经元来源的人类突触体进行吞噬作用检测

1. 转录因子介导的iPSC来源的下运动神经元（i³LMNs）分化
   注意：使用WTC11细胞系，该细胞系在CLYBL安全港位点稳定插入了包含神经源性因子-2（NGN2）、胰岛素基因增强子蛋白-1（ISL1）和LIM同源框3（LHX3）转录因子的hNIL可诱导转录因子表达盒，用于如前所述的分化过程¹⁷。iPSC细胞系的维持方法见步骤1.1.1，但采用步骤1.2.1中所述的包被条件。由于不需要层粘连蛋白521，因此可用于神经元分化的iPSC培养可使用任何细胞外基质包被试剂。所有培养基在使用前需在室温下平衡至少1小时。
   1. 按照步骤1.2.1所述方法，用5 mL标准包被液对10 cm培养皿进行包被。
      注意：此处每次分化使用3-4个10 cm培养皿。
   2. 配制诱导基础培养基，经无菌过滤后，于4 °C保存，最长可保存3周。
   3. 配制神经元培养基，经无菌过滤后，于4 °C保存，最长可保存2周。
   4. 通过将100 mM硼酸、25 mM四硼酸钠和75 mM氯化钠溶于无菌水中配制硼酸盐缓冲液。调节pH至8.5，并进行无菌过滤。
   5. 当iPSC达到80%融合度时，用DPBS洗涤细胞，并加入0.5 mM EDTA使细胞集落脱落。
      注意：通常每个10 cm培养皿使用两个孔即足够。
   6. 在室温下孵育细胞4-5分钟。去除EDTA，向每孔加入3 mL含HEPES的DMEM/F12培养基。
   7. 使用细胞刮刀刮取细胞，并用10 mL移液器轻柔吹打2-3次，将细胞从孔底移出。
   8. 将细胞收集至15 mL锥形管中，在300 × g下离心3分钟。
   9. 用含10 µM ROCK抑制剂的3 mL iPSC培养基重悬细胞，并使用血细胞计数板进行计数。
   10. 将1.5 × 10⁶个iPSC接种至已预包被的10 cm培养皿中，加入含10 µM ROCK抑制剂的12 mL iPSC培养基。
   11. 次日，弃去培养基，用DPBS洗涤细胞，然后加入12 mL新鲜配制的完全诱导培养基以诱导转录因子表达。
   12. 第2天，用等体积的0.1 mg/mL多聚-D-赖氨酸和1 mg/mL多聚-L-鸟氨酸溶于硼酸盐缓冲液中配制神经元包被液，取5 mL包被10 cm培养皿。在37 °C和5% CO₂条件下过夜孵育。
   13. 第3天，用无菌水清洗包被后的培养皿3次，彻底吸除水分，并将培养皿倾斜放置于生物安全柜中部分敞口，在室温下干燥至少1小时。
   14. 待培养皿完全干燥后，加入6 mL含15 µg/mL层粘连蛋白和40 µM BrdU的完全诱导培养基，在37 °C和5% CO₂条件下孵育至少1小时。
       注意：建议使用BrdU处理以消除有丝分裂活跃的细胞，从而提高神经元培养的纯度。BrdU对神经元健康的影响极小。
   15. 每10 cm培养皿加入3 mL消化试剂处理正在分化的细胞，在室温下孵育3-4分钟。
   16. 不移除消化试剂，向培养板中加入6 mL DPBS，并用10 mL移液器在溶液中上下吹打4-5次以充分解离细胞。
   17. 收集细胞悬液，经40 µm细胞筛过滤至50 mL锥形管中。加入1 mL 诱导基础培养基冲洗滤网。
   18. 在300 × g下离心5分钟。吸除上清液，用含40 µM BrdU的3 mL 完全诱导培养基重悬细胞。
   19. 使用血细胞计数板计数细胞。将约2.5 × 10⁶个细胞稀释于6 mL含40 µM BrdU的完全诱导培养基中，接种至预包被的培养皿（每10 cm培养皿接种约2.5 × 10⁶个细胞），无需移除步骤2.1.14中添加的包被液。
   20. 第4天，吸除培养基，用DPBS洗涤细胞一次，然后加入新鲜的含40 µM BrdU的完全诱导培养基。
   21. 第6天，吸除培养基，用DPBS洗涤细胞一次，然后加入补充了1 µg/mL层粘连蛋白的神经元培养基。
   22. 第9天，更换1/3体积的培养基，用新鲜的补充了1 µg/mL层粘连蛋白的神经元培养基替换。
   23. 此后继续维持i³LMNs培养25天，每隔3-4天用补充了新鲜1 µg/mL层粘连蛋白的神经元培养基进行半量换液。
       注意：此时i³LMNs应呈现具有长突起的神经元形态，且细胞倾向于形成团块或簇状结构。有关i³LMNs分化验证的更详细描述可参见其他文献¹⁷。
2. 突触体纯化与标记
   注意：保持无菌条件，所有操作均在生物安全柜内进行。
   1. 用DPBS洗涤i³LMNs两次。
   2. 加入2 mL冰浴的突触体分离用细胞裂解试剂，在冰上孵育2分钟，并用力刮取神经元。
   3. 将裂解液转移至多个2 mL微量离心管中（每管约1.5 mL裂解液），在4 °C下以1,200 × g离心10分钟。
      注意：整个操作过程中保持离心管置于冰上。
   4. 收集上清液（弃去沉淀），在4 °C下以15,000 × g离心20分钟。保留沉淀（含突触体），并用与原始裂解液体积相当的含5% DMSO的DPBS重悬。
      注意：突触体可立即用荧光染料标记，或于-80 °C保存以备后续使用。
   5. 对所有管进行二辛可宁酸（BCA）蛋白定量分析，以评估突触体制备物中的总蛋白产量。
      注意：也可使用其他蛋白浓度测定方法。不同制备批次所得总蛋白产量已列于表1作为参考。建议对突触体制备物进行Western blot分析，以确认突触前和突触后蛋白的存在。本研究中选择突触前标志物突触素（SYP）和突触后标志物突触后密度蛋白95（PSD95）进行Western blot分析，方法如前所述¹⁹。
   6. 将100 mM碳酸氢钠溶于水中，调节pH至8.5，并进行无菌过滤。
   7. 将1 mg冻干的pH敏感性染料溶于150 µL DMSO中。分装成单次使用量，于-80 °C保存。
   8. 在4 °C下以15,000 × g离心突触体5分钟。
   9. 将最多1 mg突触体溶于100 µL 100 mM碳酸氢钠溶液中。
   10. 为标记突触体，每1 mg突触体加入1 µL复溶的pH敏感性染料，用铝箔包裹反应管以避光。使用管式振荡器在室温下震荡反应2小时。
   11. 向管中加入1 mL DPBS，并在4 °C下以15,000 × g离心5分钟，收集标记后的突触体。
   12. 去除上清液，并按照步骤2.2.11所述方法再进行四次洗涤。
   13. 最后一次洗涤并离心后，尽可能彻底去除上清液（不扰动沉淀），用含5% DMSO的DPBS重悬标记后的突触体至所需浓度（本实验使用0.7 µg/µL）。分装成单次使用量，于-80 °C保存。务必避免标记后的突触体暴露于光照下。
3. 活细胞吞噬实验
   1. 将20-30 × 10⁴个PMPs接种至96孔板中，每孔加入100 µL iMG完全培养基，并按照步骤1.2.4所述进行为期10天的分化。
   2. 实验当天，向2 mL iMG基础培养基中加入一滴活细胞核染色试剂，配制核染色溶液。
   3. 从96孔板每孔中移除40 µL培养基，使用多通道移液器每孔加入10 µL核染色溶液。在37 °C和5% CO₂条件下孵育2小时。
   4. 将标记的突触体置于冰上解冻，并使用水浴超声仪轻柔超声处理1分钟。立即放回冰上。将标记的突触体按每50 µL培养基加入1 µL突触体的比例稀释于iMG完全培养基中。
      注意：突触体浓度取决于具体实验，可能需要优化。为保持培养基中DMSO比例相对较低（即0.1%或更低），建议每孔加入的突触体体积不超过2 µL。
   5. 作为阴性对照，部分孔预先用细胞松弛素D处理以抑制肌动蛋白聚合，从而阻断吞噬作用。将60 µM细胞松弛素D溶于iMG完全培养基中配制成溶液。每孔加入10 µL该溶液（终浓度为10 µM），在37 °C和5% CO₂条件下孵育30分钟。
   6. 将培养板从培养箱中取出，在10 °C下孵育10分钟。保持培养板置于冰上，每孔加入50 µL按步骤2.3.4所述配制的含突触体的培养基。
   7. 在10 °C下以270 × g离心3分钟，并在成像采集前保持培养板置于冰上。
4. 成像采集与分析
   1. 将培养板插入活细胞成像仪中，选择待分析的孔。
   2. 选择20倍物镜。
   3. 调节聚焦、发光二极管（LED）强度、积分时间和增益参数，分别针对明场和蓝色（4',6-二脒基-2-苯基吲哚[DAPI]）通道进行设置。在初始时间点，突触体荧光信号应可忽略不计。为聚焦红色（RFP）通道，可参考明场图像。积分时间和增益参数可能因实验而异；红色通道的初始设置建议为：LED: 4，积分时间: 250，增益: 5。
   4. 设置每孔采集的拼接图像中单个图块的数量（在孔中心采集16个图块，覆盖约5%的总孔面积）。将温度设为37 °C，并设定所需的成像时间间隔。
      注意：本研究中图像采集间隔为每1-2小时一次，持续最多16小时。
   5. 打开分析软件。
      1. 打开包含图像的实验文件。点击数据缩减图标。
      2. 在菜单中选择图像拼接功能，位于图像处理下，使用表2中所述参数将4×4的单个图块拼接成完整图像。
      3. 拼接图像生成后，使用DAPI和RFP通道为这些图像设定强度阈值。打开一张图像，点击分析；在分析下选择细胞分析，在检测通道下选择DAPI或RFP通道的拼接图像。进入主掩膜与计数选项卡，设定合适的阈值和对象大小参数，以准确识别DAPI通道中的细胞核或RFP通道中的突触体信号。重复此过程，直至优化出适用于整个实验的一组参数。
         注意：建议参数值见表2。
      4. 为统计细胞核数量，进入数据缩减菜单，在图像分析下选择细胞分析。进入主掩膜与计数选项卡，在通道下选择DAPI拼接图像，并使用表2中所述参数。
      5. 进入计算指标选项卡，选择细胞计数。为获取突触体信号面积，进入数据缩减菜单，在分析下选择细胞分析。
      6. 进入主掩膜与计数选项卡，在通道下选择RFP拼接图像，并使用表2中详细列出的参数。
      7. 进入计算指标选项卡，选择对象总和面积。在数据缩减选项卡中点击确定，允许软件分析所有采集的图像。
      8. 导出每个时间点的对象总和面积和细胞计数值。将对象总和面积除以细胞计数，计算每个时间点的归一化面积。若比较多种处理或基因型，使用公式（1）计算吞噬指数：
         （1）
      9. 保存结果并整合数据。

结果

采用本方案生成iMG时，必须从具有紧凑集落形态且边界清晰的未分化iPSC开始（图2A）。如EB形成部分所述维持的解离后iPSC将形成球形聚集体，称为EB，并在分化第4天前持续增大（图2B）。一旦收集EB并接种于适合PMP生成的条件下，它们会贴附于Matrigel包被的培养板上，一层细胞将铺展并包围球形聚集体（图2C）。不健康的EB会从培养板脱落，应予以清除。在PMP生成的第14至21天期间，可能出现多种潜在的不同细胞类型并悬浮于培养基中；这些细胞应在换液时弃去¹²。到第28天，将出现悬浮的圆形细胞，其胞质与细胞核的比例较大（图2D），称为PMP。这些细胞可持续产生，并可在换液时每周收集一次，持续长达3个月。每周收获的PMP数量因iPSC细胞系及培养时间而异；通常产量随时间推移而下降。强烈建议将iPSC培养于层粘连蛋白521（laminin 521）包被的...

讨论

本文所述的分化方案可在约6至8周内高效地获得高纯度、足够产量的诱导多能干细胞来源的类小胶质细胞，适用于进行免疫荧光实验及其他需要较大量细胞的检测。该方案在1周内最多可获得1 × 10⁶个iMGs，足以进行蛋白质和RNA提取以及相应的下游分析（如RNA测序、定量逆转录PCR、蛋白质印迹、质谱分析）。然而，该方案的一个局限性在于iMGs的产量可能限制某些应用。可通过额外改进方法，收集不同周数的PMPs，并在悬浮培养中维持均一细胞群体，直至积累足够数量的前体细胞后一次性进行后续分化过程¹⁸。或者，也可通过使用更大表面积的细胞培养板扩大类胚体（EBs）的培养规模，以增加PMPs的产量。

建议使用在层粘连蛋白521包被的培养板中培养的iPSCs来启动分化过程。其他包被试剂可能会减少后续过程中PMPs的产量¹⁸。同样，在PMP生成期间对培养板进行包被以促进EB黏附，可增强EB的贴附能力，从而延长培养物的存活时间。EB培养最长可维持达4个月，此时多个EB会脱落并死亡。然而，其他研...

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
免疫荧光分析用抗体
兔抗IBA1抗体	和光纯药美国公司	NC9288364	1:350 稀释度
兔抗P2RY12抗体	Sigma-Aldrich	HPA014518	1:50 稀释度
兔抗TMEM119抗体	Sigma-Aldrich	HPA051870	1:100 稀释度
用于蛋白质印迹分析的抗体
抗-β-微管蛋白兔抗体	Abcam	ab6046	1:500 稀释度
抗突触素（SYP）兔抗体	Abclonal	A6344	1:1,000 稀释度
抗PSD95小鼠抗体	Millipore	MAB1596	1:500 稀释
硼酸盐缓冲液组分
硼酸（100 mM）	Sigma	B6768
碳酸氢钠（NaHCO₃）3生物Xtra	Sigma-Aldrich	S6297-250G
氯化钠（75 mM）	Sigma	S7653
四硼酸钠（25 mM）	Sigma	221732
细胞培养材料
6孔板	Greiner Bio-One	657160
40 μm 细胞滤筛	Falcon	352340
100 mm × 20 mm 组织培养处理皿	CELLTREAT	229620
细胞刮刀，双头，平刃 && 窄刃，无菌	CELLTREAT	229305
低吸附圆底96孔板	康宁	7007
Primaria 24孔平底表面修饰多孔细胞培养板	康宁	353847,
Primaria 6孔细胞培养板，平底，表面修饰	康宁	353846
Primaria 96孔透明平底微孔板	康宁	353872
细胞解离试剂
Accutase	康宁	25058CI	用于下运动神经元分化的解离试剂
TrypLE 试剂	Life Technologies	12-605-010	用于小胶质细胞分化的解离试剂
UltraPure 0.5 M EDTA，pH 8.0	Invitrogen	15575020
细胞培养用包被试剂
Matrigel GFR 基底膜基质	康宁™	354230	称为细胞外基质包被试剂
CellAdhere 层粘连蛋白-521	STEMCELL 技术	77004	称为层粘连蛋白521
聚-D-赖氨酸	Sigma	P7405	用硼酸盐缓冲液重悬至 0.1 mg/mL
聚-L-鸟氨酸	Sigma	P3655	用硼酸盐缓冲液重悬至 1 mg/mL
组成部分 iPSC 培养基
mTeSR Plus 试剂盒	STEMCELL 技术	100-0276	准备 iPSC 培养基 将各组分混合至1x
组成部分 EB培养基
BMP-4	Fisher Scientific	PHC9534	终浓度 50 ng/mL
iPSC 培养基			终浓度 1x
ROCK抑制剂Y27632	Fisher Scientific	BD 562822	终浓度 10 µM
SCF	PeproTech	300-07	终浓度 20 ng/mL
VEGF	PeproTech	100-20A	终浓度 50 ng/mL
组成部分 PMP 基础培养基
GlutaMAX	Gibco	35050061	终浓度 1x
青霉素-链霉素（10,000 U/mL）	Gibco	15140122	终浓度 100 U/mL
X-VIVO 15	Lonza	12001-988	终浓度 1x
组成部分 PMP 完全培养基
55 mM 2-巯基乙醇	Gibco	21985023	终浓度 55 µM
IL-3	PeproTech	200-03	终浓度 25 ng/mL
M-CSF	PeproTech	300-25	终浓度 100 ng/mL
PMP 基础培养基			终浓度 1x
组成部分 iMG 基础培养基
高级DMEM/F12	Gibco	12634010	终浓度 1x
GlutaMAX	Gibco	35050061	终浓度 1x
N2 补充剂，100 倍	Gibco	17502-048	终浓度 1x
青霉素-链霉素（10,000 U/mL）	Gibco	15140122	终浓度 100 U/mL
组成部分 iMG 完全培养基
55 mM 2-巯基乙醇	Gibco	21985023	终浓度 55 µM
IL-34	PeproTech 或 Biologend	200-34 或 577904	终浓度 100 ng/mL
iMG 基础培养基			终浓度 1x
M-CSF	PeproTech	300-25	终浓度 5 ng/mL
TGF-β	PeproTech	100-21	终浓度 50 ng/mL
诱导基础培养基的组分
含 HEPES 的 DMEM/F12 培养基	Gibco	11330032	终浓度 1x
GlutaMAX	Gibco	35050061	终浓度 1x
N2 补充剂，100 倍	Gibco	17502-048	终浓度 1x
非必需氨基酸（NEAA），100倍	Gibco	11140050	终浓度 1x
完全诱导培养基的组分
化合物 E	Calbiochem	565790	终浓度 0.2 μM，并用1:1的乙醇和DMSO将储备试剂重悬至2 mM
多西环素	Sigma	D9891	终浓度 2 μg/mL，并用DPBS将储备试剂重悬至2 mg/mL
诱导基础培养基			终浓度 1x
ROCK抑制剂Y27632	Fisher Scientific	BD 562822	终浓度 10 μM
神经元培养基的成分
B-27 Plus 神经元培养系统	Gibco	A3653401	培养基和添加剂的终浓度为1x
GlutaMAX	Gibco	35050061	终浓度 1x
N2 补充剂，100 倍	Gibco	17502-048	终浓度 1x
非必需氨基酸（NEAA），100 倍	Gibco	11140050	终浓度 1x
本研究中使用的人诱导多能干细胞系
KOLF2.1J：野生型克隆 B03	杰克逊实验室
WTC11 hNIL	美国国立卫生研究院
突触体分离试剂
BCA 蛋白检测试剂盒	Thermo Scientific Pierce	23227
二甲基亚砜（DMSO）	Sigma	D2650
Syn-PER 突触蛋白提取试剂	赛默飞世尔科技	87793	用于分离突触体的细胞裂解试剂
吞噬作用检测染料
NucBlue Live Ready 试剂	Invitrogen	R37605
pHrodo 红色，琥珀酰亚胺酯	赛默飞世尔科技	P36600	被称为pH敏感性染料
其他细胞培养试剂
0.4% 台盼蓝溶液	AMRESCO 公司	K940-100ML
牛血清白蛋白（BSA）	Sigma	22144-77-0
BrdU	Sigma	B9285	用无菌水重悬至 40 mM
细胞松弛素D	Sigma		终浓度 10 µM
含钙和镁的DPBS	康宁	21-030-CV
不含钙和镁的DPBS	康宁	21-031-CV	称为 DPBS
KnockOut  DMEM/F-12	Gibco	12660012	DMEM-F12，适用于人胚胎干细胞和诱导性多能干细胞生长的优化培养基
小鼠层粘连蛋白，天然	Gibco	23017015	称为层粘连蛋白
软件与设备
离心	Eppendorf	Model 5810R
Cytation 5 活细胞成像仪	Biotek
Gen5 微孔板读板仪与成像软件	Biotek	版本 3.03
多温加热振荡	基准测试		参照为试管振荡器
水浴超声仪	埃尔玛	Mode Transsonic 310