利用利什曼原虫破译毛孔形成毒素的分子机制和功能

Summary

这里介绍的是使用 利什曼原虫主要 前鞭毛体来确定孔形成毒素诱导的结合、细胞毒性和信号传导的方案。提供了链球菌溶血素O的概念验证。其他毒素也可用于利用 杆菌 中可用的遗传突变体来确定毒素抗性的新机制。

Abstract

了解造孔毒素（PFT）的功能和机制具有挑战性，因为细胞可以抵抗PFT引起的膜损伤。虽然生物物理方法有助于理解孔的形成，但它们通常依赖于缺乏膜脂质和蛋白质全部补充的还原论方法。培养的人类细胞提供了一种替代系统，但它们的复杂性和修复机制的冗余使得识别特定机制变得困难。相比之下，导致皮肤利什曼病的人类原生动物病原体，即大利什曼原虫，在复杂性和生理相关性之间提供了最佳平衡。杆菌在遗传上是可处理的，可以在体外培养到高密度，并且可以在已建立的小鼠模型中测量扰动对感染的任何影响。此外，L. major合成的脂质与哺乳动物不同，这可能会改变膜动力学。膜动力学的这些改变可以用来自最佳特征毒素家族胆固醇依赖性溶细胞素（CDC）的PFT进行探测。CDC与利什曼原虫膜中的麦角甾醇结合，可杀死大鞭毛乳杆菌，表明杆菌是确定PFT功能的细胞和分子机制的合适模型系统。这项工作描述了在L. majorpromagotes中测试PFT功能的方法，包括寄生虫培养，用于评估脂质敏感性的遗传工具，膜结合测定和细胞死亡测定。这些测定将能够快速使用L. major作为强大的模型系统，用于了解一系列进化上多样化的生物体的PFT功能和脂质组织的共性。

Introduction

孔形成毒素（PFTs）是细菌毒素中最大的家族¹，但它们穿孔和破坏细胞的机制知之甚少。研究得最好的毛孔形成毒素家族是胆固醇依赖性溶细胞素（CDCs）。CDC主要由革兰氏阳性菌合成，包括坏死性筋膜炎的病原体化 脓性链球菌²。 化脓性 链球菌分泌CDC链球菌溶血素O（SLO），其作为单体与宿主细胞质膜中的甾醇结合，低聚化并将~20-30nm孔插入膜¹。脂质在这一过程中所起的作用仍然不确定。

研究脂质-CDC相互作用的一种方法是使用化学定义的脂质体。虽然定义的脂质体提供了维持毒素结合和^{孔形成所需的}脂质阈值的信息3，4^，但它们并不能完全概括细胞功能。例如，重组脂质体缺乏哺乳动物宿主的脂质不对称性和响应毒素的脂质修饰⁵。脂质体的一种替代方案是使用哺乳动物细胞系。虽然这些细胞系在生理上更具相关性，但在毒素传感和抗^{性机制方面}存在很大程度的冗余2。因此，用于抵抗CDC的修复途径仍然确定得很差。值得注意的是，Ca²⁺的流入是膜修复¹的主要激....

Protocol

所有适当的指南和标准的微生物学、安全性和细胞培养实践都用于使用和处理RG2病原体 利什曼原虫主要 和重组DNA。所有活的 L. major 实验均在BSL-2认证实验室的生物安全柜中进行。这项工作由德克萨斯理工大学机构生物安全委员会监督。

注意:从安全角度来看， 活的L. majorpromaputetes是风险组2病原体。使用机构生物安全委员会（IBC）的适当遏制，预防措施和监督进行处理。按照有毒物质的机构程序处理有毒物质和化学品。如果使用重组毒素，重组DNA工作可能需要IBC批准和监督。

1. 大鞭毛乳杆菌 的培养与制备

1. 获取或制造和验证L .主要 遗传突变体，如前所述，使用同源重组或基于CRISPR的方法^13，21。使用敲除与重新添加到质粒上的基因互补的基因，以确保敲除的特异性。
2. 在完全M199培养基中培养野生型 L.主要L. 和 spt2^- 前鞭毛体，在27°C。在完整的M199加199加10μg/ mL G418中培养游离加法细胞（spt2^-

Results

与M199相比，Tyrode缓冲液中促乳腺对SLO的敏感性增加
比较不同测定缓冲液之间主要鞭毛乳杆菌的SLO敏感性。在流式细胞仪上分析之前，在无血清M199或补充有2mM CaCl₂的Tyrode缓冲液中用SLO攻击野生型，spt2^-和spt2-/+ SPT2前鞭毛体30分钟。适合分析的寄生虫是通过前向/侧面散射图鉴定的单细胞（图3A，B）。使用通道BL1（488激发，530/30发射滤光片）作为自发荧光对照和YL1（561 nm激发，585/16发射滤光片）作为PI收集数据。BL1用于识别潜在的自发荧光或补偿问题（图3C-E中的x轴）。使用 561 nm 线减少了从 PI 到 BL1 通道的渗漏。测定每种条件下的死细胞比例，并确定%特异性裂解。野生型和.......

Discussion

本研究以人类病原虫大利 什曼原虫 为模型系统，描述了肺功能转移疗法分子机制和功能的研究方法。开发了一种基于中通量流式细胞术的细胞毒性测定法来测量单细胞活力。活力在人群水平上是定量的，因为LC₅₀ 值可以使用逻辑建模从剂量-反应曲线计算出来。作为原理验证，使用流式细胞术测定来说明培养基的选择可以改变野生型和鞘脂缺陷的 L.major 对SLO的敏感性，并确定每种培养基中的亚解毒素剂量。作为下游测定的原理证明，在毒素激发期间，在主要前鞭 毛乳杆菌 中测试了磷酸化-MAPK和磷酸化ERK抗体。总体而言， L. majorpromapugotes是一种致病相关且遗传可处理的模型系统，可用于更好地了解毒素介导的细胞损伤的机制和功能。

流式细胞术测定具有很高的灵活性。如果需要，其他活性染料可以替代PI。在哺乳动物细胞中，未观察到一系列活性染料的报告能力存在差异²⁰。毒素、主要基因型乳杆菌的选择、任何处理的添加以及测定缓冲液的选择可根据需.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
1.2 mL 微量滴定（Marsh）管	Fisher	02-681-376	细胞毒性测定
1.5 mL 微量离心管	Fisher	05-408-129	毒素稀释液
15 mL 离心管	Avantor VWR （Radnor， PA）	89039-666	用于保存细胞和培养基
1x 磷酸盐缓冲盐水 （PBS）Fisher		BP399	用于细胞处理
3% H2O2	沃尔玛 （阿肯色州费耶特维尔）	不适用	ECL
5x M199	细胞总	11150067	大鞭毛前鞭
生物安全柜	贝克		在无菌条件下培养细胞
牛血清白蛋白 （BSA）	Fisher	BP1605-100	馏分 V 可接受纯度
CaCl2	Fisher	BP510-100	储备浓度 100 mM
Thermo Fisher 离心		贺利氏 Megafuge 40R	从培养物中沉淀
Cy5 单反应染料包	Cytiva（马萨诸塞州马尔堡）	PA25031	毒素荧光团标记
数字干浴	基准	BSH1002	使蛋白质样品变性
EGTA	Amresco	0732-100G	原液浓度 0.5 M
Excel	Microsoft（弗吉尼亚州雷德蒙德）		数据分析软件
流式细胞仪 （4-激光器 Attune NxT）	用于数据采集的	Fisher
FlowJo	BD （俄勒冈州阿什兰）		软件
甲醛	Fisher	BP531-500	细胞计数固定剂
G418	Fisher	BP673-1	细胞选择剂
Hellmanex III	Sigma	Z805939	稀释 1：4用于清洁 细胞仪
血细胞计数器	Fisher	0267151B	用于细胞计数
人红细胞	Zen-bio （Durham， NC）	SER-10MLRBC	验证毒素活性
冰桶
光学显微镜	Nikon	Eclipse 55i	可视化细胞
硝酸纤维素	Fisher	88018	用于探测通过抗体的蛋白质
移液器和吸头	Avantor VWR		分配试剂
电源	Bio-Rad		运行 SDS-PAGE 并转移
化丙啶	Biotium	40016	储备液浓度 2 mg/mL 水溶液
分子量	Bio-Rad	161-0373	测定蛋白质的分子量
SDS-PAGE 运行仪器 （Mini Protean III）	Bio-Rad	165-3302	根据蛋白质大小分离蛋白质
密封胶带	R&D	DY992	用细胞密封板
链球菌溶血素 O C530A 质粒插入片段			克隆到 pBAD-gIII 载体中 （参考：7）
链球菌溶血素 O C530A 毒素	实验室纯化		比活性  4.34 x 105 胡/mg
水平转子	Thermo Fisher	75003607	离心细胞
V型底板	Greiner Bio-one	651206	用于细胞毒性测定
Vortex	Benchmark	BV1000	混合细胞
蛋白质免疫印迹成像系统 （Chemi-doc）	Bio-Rad		通过蛋白质免疫印迹观察蛋白质
蛋白质印迹转移仪 （Mini Protean III）	Bio-Rad	170-3930	转移蛋白质制硝酸纤维素
Whatman 滤纸	GE Healthcare Life Sciences	3030-700	用于将蛋白质转移到硝酸纤维素
Antibody
Anti-ERK 抗体	Cell Signaling Technologies	Cat# 9102S	兔子（1：1000 稀释）
抗脂磷酸聚糖 （LPG） 抗体	CreativeBioLabs	Cat# WIC79.3	小鼠 （1： 1000）
抗 MEK 抗体	Cell Signaling Technologies	Cat# 9122L	兔子 （1：1000）
抗小鼠 IgG、HRP 偶联物	Jackson 免疫研究	Cat#715-035-151	驴 （1：10000）
抗磷酸化 ERK 抗体	Cell Signaling Technologies	货号# 9101S	兔 （1：1000）
抗 pMEK 抗体	Cell Signaling Technologies	Cat# 9121S	兔 （1：1000）
抗兔 IgG、HRP 偶联物	Jackson 免疫研究	Cat#711-035-152	驴 （1：10000）
抗微管蛋白抗体	Sigma	Cat# T5168	小鼠 （1： 2000）
主要利什曼原虫 基因型			Reference： 13
Episomal addback （spt2-/+SPT2）&			Delta;spt2：：HYG/Δspt2：PAC/+pXG-SPT2
丝氨酸棕榈酰转移酶亚基 2 敲除 （spt2-）			Δspt2：：HYG/Δspt2：:P AC
野生型 （WT）			LV39 克隆 5 （Rho/SU/59/P）