本文介绍了一种利用Leishmania major前鞭毛体来检测成孔毒素所诱导的结合、细胞毒性和信号转导的实验方案。文中以链球菌溶血素O作为概念验证示例，也可使用其他毒素，结合L. major中已有的遗传突变体，以揭示新的毒素抗性机制。
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摘要
摘要
了解孔形成毒素（PFTs）的功能与作用机制具有挑战性，因为细胞能够抵抗PFTs引起的膜损伤。尽管生物物理方法有助于理解孔的形成过程，但这些方法通常依赖于简化体系，缺乏完整的膜脂质和膜蛋白组成。培养的人源细胞提供了一种替代系统，但其修复机制的复杂性和冗余性使得特定机制的鉴定变得困难。相比之下，引起皮肤利什曼病的人类原生动物病原体， Leishmania major, 在复杂性与生理相关性之间提供了最佳平衡。 L. major 具有可遗传操作性，且可培养至高密度 体外，且可在已建立的小鼠模型中测量扰动对感染的影响。此外， L. major 合成的脂质与其哺乳动物对应物不同，可能改变膜动力学。这些膜动力学的改变可通过最明确的一类毒素——胆固醇依赖性溶细胞素（CDCs）中的PFTs进行探测。CDCs可结合麦角固醇 利什曼原虫 膜并可杀死 L. major 前鞭毛体，表明 L. major 是研究PFT功能的细胞和分子机制的合适模型系统。本文描述了在该系统中检测PFT功能的方法 L. major 前鞭毛体，包括寄生虫培养、评估脂质敏感性的遗传工具、膜结合实验和细胞死亡实验。这些实验将促进快速应用 L. major 作为研究多种进化上不同生物中PFT功能及脂质组织共性的强大模型系统。
引言
孔道形成毒素（pore-forming toxins, PFTs）是细菌毒素中最大的一类1，但其穿孔并破坏细胞的机制尚不明确。其中研究最为深入的是胆固醇依赖性溶细胞素（cholesterol-dependent cytolysins, CDCs）。CDCs 主要由革兰氏阳性菌合成，包括引起坏死性筋膜炎的致病菌Streptococcus pyogenes2。S. pyogenes 分泌 CDC 家族中的链球菌溶素 O（streptolysin O, SLO），该毒素以单体形式结合宿主细胞质膜中的固醇类物质，随后寡聚化，并在膜上插入约 20–30 nm 的孔道1。脂质在此过程中的作用仍不清楚。
研究脂质与胆固醇依赖性细胞溶解素（CDC）相互作用的一种方法是使用化学成分明确的脂质体。尽管成分明确的脂质体可提供关于维持毒素结合和成孔所需脂质阈值的信息3,4，但其无法完全重现细胞的生理功能。例如，重建的脂质体缺乏哺乳动物宿主细胞所具有的脂质不对称性，也无法模拟毒素刺激下发生的脂质修饰5。脂质体的一种替代方案是使用哺乳动物细胞系。虽然这些细胞系在生理相关性上更高，但其毒素感知和抗性机制存在大量冗余2。因此，用于抵抗CDC的膜修复通路至今仍不明确。值得注意的是，Ca2+内流是激活膜修复的主要信号1。在Ca2+内流之后，多个下游通路被激活，包括依赖神经酰胺的修复通路6,7和依赖MEK的修复通路6。这些通路会与其他蛋白效应分子相互作用，例如运输所需的内体分选复合物（ESCRT）8以及膜联蛋白（annexins）6,9,10。由于存在通路冗余，解析哺乳动物细胞中这些修复机制极具挑战性，这使得实验数据的解释变得复杂。
一种在解析修复通路时平衡复杂性与简洁性的方法是使用较为简单的生物体，例如原生动物病原体中的属 利什曼原虫. 利什曼原虫 sp. 可导致人类及其他动物感染利什曼病。利什曼病的临床表现因物种及其他因素而异，可从自限性皮肤利什曼病（皮肤损害）到致命性内脏利什曼病（肝脾肿大）。11. Leishmania major，皮肤利什曼病的致病原，可传播给人类 通过 一种沙蝇传播媒介，用于研究理解 利什曼原虫 功能与感染12此外， 利什曼原虫 sp. 为双基因遗传12它们以细胞内哺乳动物巨噬细胞寄生虫形式存在，称为无鞭毛体，同时也在沙蝇体内以自由游动、具鞭毛的前鞭毛体形式存在。12. L. major 前鞭毛体可在添加血清的培养基（如M199）中培养至高密度13前鞭毛体也具有可遗传操作性；已存在多种基因敲除株系，包括靶向脂质生物合成通路的基因敲除株系13这些基因敲除株可用于评估其生长情况、感染性差异以及病损形成的变化。 通过 Balb/c小鼠感染13.
除了相对容易的操作之外 利什曼原虫 培养条件及脂质生物合成敲除范围显示，该寄生虫的基因组比哺乳动物更简单。研究最深入的物种是 利什曼原虫 是 L. major，拥有多种现有的遗传工具，例如脂质代谢缺陷的突变体14值得注意的是，许多修复蛋白缺失。 L. major 迄今为止，尚未发现关键哺乳动物修复蛋白（如annexins）的同源物。这使得研究人员能够在排除哺乳动物系统复杂性的前提下，对进化上保守的修复通路进行表征。然而，修复通路在 利什曼原虫 迄今为止。同时，参与修复的关键信号通路，如 MEK 通路6， 在进化上是保守的 利什曼原虫 sp.15,16，尽管同源基因需要进一步验证。丝裂原活化蛋白激酶（MAPK）信号通路在 L. mexicana，其中它有助于哺乳动物细胞内的细胞内存活和热稳定性，并调控后循环型转化16在 利什曼原虫 sp. 中，15个MAPK中有10个已被表征17LmMAPK9 和 LmMAPK13 根据保守磷酸化唇序列的同源性被预测为与哺乳动物 ERK1/2 最为相似。哺乳动物 ERK1/2 与 LmMAPK9 及 LmMAPK13 的磷酸化唇序列均为 TEY。然而，其中八个的 利什曼原虫 MAPKs 具有 TDY 磷酸化基序15。已在至少两种MEK同源物中被鉴定出 利什曼原虫 sp., LmxMKK18 以及MEKK相关激酶（MRK1）19这表明在其中发现的见解 利什曼原虫 可转化为哺乳动物系统的研究成果。当其无法直接转化为哺乳动物系统时，则可作为治疗利什曼病的治疗靶点。
为了利用L. major前鞭毛体研究膜修复及其与毒素的相互作用，需要采用中等通量的技术。虽然高分辨率的活细胞成像能够实时观察标记的蛋白质和膜结构，但其通量较低，且无法有效检测细胞存活率。中等通量的活力检测方法包括通过流式细胞术检测染料摄取、线粒体活性测定，或细胞内蛋白（如乳酸脱氢酶（LDH））的释放。在哺乳动物细胞中，LDH检测并不能定量测量细胞死亡20。此外，基于群体的检测方法（如LDH释放或线粒体活性测定）无法实现可靠的单细胞或多参数分析20。相比之下，基于流式细胞术的检测方法可实现多参数单细胞分析20。然而，这些方法尚未被应用于研究L. major前鞭毛体对毒素的生物学反应或应答机制。
本研究中，SLO 被用作研究L. major糖鞘脂缺失突变体在两种不同缓冲液中质膜扰动的工具——即常用于培养L. major前鞭毛体的M199培养基和成分更简单的Tyrode's缓冲液。文中描述并使用了一种中等通量的流式细胞术检测方法，用于生成毒素的剂量-反应曲线。流式细胞术检测所得数据通过拟合逻辑斯蒂曲线以确定LC50 值。基于这些信息，可确定SLO的亚溶血剂量，从而利用蛋白质印迹法验证MAPK抗体。
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方案
在使用和操作2级风险病原体Leishmania major及重组DNA时，均遵循了所有相应的指南以及标准的微生物学、安全和细胞培养操作规范。所有涉及活体L. major的实验均在二级生物安全实验室的生物安全柜内进行。本工作由德克萨斯理工大学机构生物安全委员会监督实施。
注意：从安全角度来看，活的L. major前鞭毛体属于生物安全二级病原体。操作时应采用适当的生物安全防护措施，并接受机构生物安全委员会（IBC）的监管和指导。有毒物质和化学品的处理应遵循机构关于有毒物质的管理规程。若使用重组毒素，可能需要获得IBC对重组DNA实验的批准和监管。
1. 培养与制备 L. major 前鞭毛体
- 获取、制备并验证， L. major 使用同源重组或基于CRISPR的方法，如前所述构建遗传突变体13,21使用在质粒上回补基因的敲除菌株，以确保敲除的特异性。
- 培养野生型 L. major 和 spt2- 前鞭毛体在 27 °C 在完全M199培养基中培养附加体回补细胞（spt2-/+SPT2) 在完全M199培养基中 10 µg/mL G418（参见 表1 和 材料表).
注意：涉及实验的整个实验装置 L. major 细胞操作必须在经认证的生物安全二级（BSL2）生物安全柜中进行。 - 在完全M199培养基中培养前鞭毛体22 直到它们达到对数期（2-8 × 106 细胞/mL），由以下方法确定 L. major 先前完成的生长曲线测定23. 计划 1 × 105 每孔用于细胞毒性的细胞数，外加 5 x 105 用于染色对照的细胞。对于蛋白质印迹实验，计划使用 2 x 107 每孔细胞数
注意：以两个技术重复进行细胞毒性实验。 - 为验证细胞密度是否合适，取一份等量样品（10-40 µL) 将前鞭毛体与等体积固定液（3.7% 多聚甲醛溶于 1x PBS）混合。上样 10 µL 将固定后的样品分别加入血细胞计数板的两侧。
警告：甲醛是一种有毒化学物质。应根据机构对危险化学品的管理规定进行操作。 - 使用显微镜在20倍放大倍数下进行细胞计数。计数血细胞计数板中央25个中央小方格内的所有细胞。重复计数两侧方格内的细胞，并对计数结果取平均值。
注意：如果计数之间的差异是 >10，重复计数并取平均值。如果平均计数为 <10 或 >100，调整稀释倍数后重新计数，然后使用以下公式计算培养液密度：
(公式 1)
例如，如果平均有250个 利什曼原虫 在25个方格中，培养密度为5 x 106 cells/mL - 计数后，转移 5 x 106 将细胞转移至15 mL离心管中，以1,500 x g 室温下离心8分钟以收集细胞。
- 使用10 mL移液管弃去上清液，短暂涡旋振荡细胞沉淀。向同一离心管中加入5 mL 1×PBS，通过轻柔倒置3–6次洗涤细胞。在1,500 × g条件下离心 g 室温下离心8分钟以收集细胞。
- 使用10 mL移液管弃去上清液，并将5 x 106 用5 mL移液管将细胞沉淀重悬于5 mL实验所用培养基（例如M199或1×Tyrode缓冲液）中，使终浓度为1 × 106 cells/mL
2. 细胞毒性检测
- 实验准备
- 按照先前所述方法纯化毒素24，或从供应商处购买该毒素。分装成单次使用量，于−80 °C 最长可保存1年。避免反复冻融。
- 使用人红细胞测定每种毒素的溶血活性（参见 材料表)24.
注意：使用溶血活性是因为它可以控制因纯化、突变等因素导致的活性差异。所选用的红细胞物种可能影响溶血活性（例如，中介溶血素需要人红细胞）。 - 为每种条件设计两个技术重复，剂量反应曲线设置七个稀释梯度，并设无毒素对照组。
注意：使用野生型（WT）， spt2-, 和 spt2-/+SPT2 前鞭毛体可在同一块V型底96孔板中测试两种处理。例如，可比较其对培养基的敏感性（图1）。与V型底板不同，使用1.2 mL微量离心管（参见 材料表可使用上述方法。由于流式细胞仪的采集时间较长，不建议同时运行多个孔板。 - 根据实验所需的测试条件和实验目的，确定使用哪种测定缓冲液。
注意：本示例中比较了两种检测缓冲液：M199 和添加了活率染料碘化丙啶（PI）的 Tyrode's 缓冲液。血清中的胆固醇会干扰 CDC 活性24. - 根据处理的条件和基因型数量计算所需的毒素量。确保在稀释曲线的中点处发生50%的特异性裂解。
注意：对于CDCs，进行两倍倍比稀释可为后续的逻辑建模提供良好的浓度范围。对于spt2- 前鞭毛体，建议起始稀释度为 4,000 HU/mL SLO。若使用失活毒素，可改用与最高剂量等质量的量。 - 方案 200 µL 每孔终体积，并额外加入少量体积（50-100 µL以校正移液器误差。
注意：三个基因型样本各设两个重复，共需进行六份样品的梯度稀释。 - 使用以下公式计算所需毒素的总量：
(公式 2)
其中，ActivityMax 为所用最高浓度（HU/mL）；TotalFinalVolume 为总体积（六个样本时，200 × 6 + 100 = 1,300 µL）；ActivityStock 为毒素原液的活性（HU/mL）；VolStockToxin 为所需毒素原液的体积。 - 准备实验所需的足量测定缓冲液。在基础培养基中添加活性染料和任何 Ca2+ 或需要EGTA来控制Ca2+ 水平。涡旋混匀。
注意：例如，每10 mL 台氏缓冲液，加入 50 µL 2 mg/mL PI 200 µL 100 mM CaCl2，得到终浓度为 10 µg/mL 分别为 2 mM。 - 确保PI活力染料与其他探针（如使用Cy5或AlexaFluor647标记的毒素进行的荧光结合实验）之间无冲突20,25.
- 规划毒素稀释方案，制备2倍浓度的毒素溶液。将检测缓冲液加入1.5 mL离心管中，并置于冰上预冷。毒素应在开始检测前立即加入。
注意：在此示例中，最高浓度稀释液需加入 1.3 mL 检测缓冲液， 650 µL 将加入进行连续稀释，以制备2倍浓度的毒素溶液。
- 实验
- 从步骤1.8中保留0.5 mL已处理的前鞭毛体于另一管中，作为“未染色对照”。
注意：此样本将用于设置流式细胞仪的门控。 - 加入PI至终浓度为2 mg/mL 10 µg/mL 对剩余的前鞭毛体进行涡旋振荡3秒。
注意：向处理后的前鞭毛体加入PI后，这些细胞仅可在2.5小时内使用。超过2.5小时，细胞开始死亡，导致结果出现误差。 - 加入 1 × 105 在 100 µL/well) 将处理后的前鞭毛体加入至V型底96孔板的每个孔中，或1.2 mL微量离心管中（图1）。将培养皿或试管架放在冰上，呈大约 45° 从观察角度进行操作。处理时应在生物安全柜中进行工作。 利什曼原虫 前鞭毛体
- 添加 100 µL 加入含PI的检测缓冲液至无毒素对照组（最后一行）。通过目视确认总体积正确的试管，以验证对照品已正确添加 200 µL 颜色较深的
- 从 −80 °C 冰箱中取出毒素分装样品80°C，置于冰上解冻，根据需要合并。将步骤 2.1.5 中计算出的毒素体积加入最高稀释度样品中（步骤 2.1.10 制备）。随后，对毒素进行连续稀释（图1用移液器上下吹打至少8次，确保混匀。
注意：操作需在冰上进行，因为CDCs在室温下会迅速失活。 - 从最低毒素浓度开始，迅速加入 100 µL 将毒素加入正确的孔中（图1 和 图2）并持续操作直至所有毒素均加入细胞中。
- 用封板膜密封培养板。在指定条件下孵育 37 °C 孵育30分钟。孵育结束后，将培养板包装并运送至流式细胞仪。
- 从步骤1.8中保留0.5 mL已处理的前鞭毛体于另一管中，作为“未染色对照”。
- 数据采集
- 设置流式细胞仪（参见 材料表）并根据制造商说明及机构规定操作仪器和采集软件。未经流式细胞仪操作培训，不得进行流式细胞术实验。
注意：本示例使用了4激光Attune NxT流式细胞仪。PI信号采集于YL-1通道（由561 nm激光激发，经577 LP滤光片，由600 DLP反射，并通过585/16带通滤光片），但由于PI光谱范围较宽，也可在其他通道进行信号采集。 - 使用未染色的 L. major 前鞭毛体样品，根据所选染料设定前向散射和侧向散射的门控以及初始荧光参数。
- 如需检查自发荧光，可在点图中增加一个额外参数（例如，“未染色”）图3).
注意：本示例中，BL-1 通道（由 488 nm 激光激发，经 495 DLP 和 503 LP 滤光片，被 555 DLP 反射，并通过滤光片） 通过 530/30 带通）被使用。 - 使用单染对照设置活力染料（本研究中为 PI）及任何荧光标记毒素的门控。通过前向散射对时间监测微堵塞情况。
注意：PI 会微弱染色所有细胞，相对于未染色对照组。死细胞将易于区分，而短暂性通透化的细胞则位于两群之间。 - 获取 >每份样本在流式细胞仪上采集10,000个门控事件。
注意：建议按照从最敏感到最不敏感的顺序进行读取，但也可逆转读取顺序，以确定读取顺序对样本结果可能产生的影响。 - 保存数据，并根据需要导出以进行分析。
- 设置流式细胞仪（参见 材料表）并根据制造商说明及机构规定操作仪器和采集软件。未经流式细胞仪操作培训，不得进行流式细胞术实验。
- 数据分析
注意：本研究中使用带有求解器插件的 Excel（参见 材料表) 用于数据分析（参见 补充文件 1).- 门控总数，单细胞 L. major 通过前向散射、侧向散射及必要的时间参数设门圈选前鞭毛体（promastigotes）图3）。建议根据流式细胞仪的要求使用高度或面积。
注意：对于此处使用的流式细胞仪，建议使用高度参数而非面积参数。 - 鉴定并圈选死细胞为“PI高”。将中间态细胞圈选为“PI低”。PI高细胞为死细胞，而PI低细胞为暂时性通透化细胞26.
注意：PI 高表达细胞通常较阴性细胞出现 2-3 个数量级的偏移。 - 将数据导出至 Excel。获取样品名称/编号及高 PI 比例以确定杀伤率。
注意：如果使用了荧光标记的毒素，则需要测定活细胞、瞬时通透化细胞以及阴性群体的中位荧光强度（MFI）。瞬时通透化的%PI低值可导出用于分析。 - 确定每种条件下两个技术重复之间的平均 %PI 高值。
注意：如需计算荧光毒素的平均 MFI，也应一并计算。 - 使用以下公式根据 %PI 高值计算 %特异性裂解24,25:
(公式 3)
其中，PIhighxpt 为实验条件下 PI 高染细胞的百分比；PIhighctl 为无毒素对照条件下 PI 高染细胞的百分比。 - 绘制特异性裂解百分比相对于毒素浓度的剂量-反应曲线（图4).
- 在 Excel 中整理剂量-反应曲线以进行逻辑建模。包括毒素浓度和平均 % 特异性裂解，以及实验细节和/或原始 %PI 高值计算表2).
- 确认已启用“规划求解”加载项。
注意：要在 Excel 桌面版中启用求解器，请转到 文件 > 选项 > 加载项，并检查 求解器 框。重新启动 Excel。 - 将另外四列分别标记为“模拟值”、“残差”、“参数”和“参数值”。确认前几列对应实验参数、毒素浓度和特异性裂解百分比。表 2).
- 在“参数”列中添加以下参数：L、k、c、SUM 和 LC50。在“参数值”列中输入以下数值，对参数 L、k 和 c 进行初始化：100、0.05、1,000。
- 在“建模”列中，使用以下公式创建逻辑回归模型：
(公式 4)
将 L、k 和 c 设置为“参数值”列中包含这些参数的单元格。
将 x 设为含有毒素浓度的细胞。
注意：对于 表2，单元格 G4 中的公式如下：=$J$3/(1+EXP(-$J$4*(D4-$J$5))) - 将该方程应用于所有 %特异性裂解值，但不含无毒素对照组。
- 在“残差”列中，使用以下公式计算模型数值与实际特异性裂解率之间差异的平方：
(公式 5)
其中，y 为实验测得的特异性裂解百分比；m 为在步骤 2.4.10–2.4.11 中计算得到的“模拟”列中的相应数值。 - 在“SUM”旁边的“参数值”列中，对残差列中的所有数值求和。
- 在“LC50”旁边的“参数值”列中，初始化方程以计算LC50 由测定值计算得出。此为求解方程 4 x 当 m = 50 时。
(公式 6)
对于 表 2，Excel 公式如下：=J5-(LN(J3/(50)-1))/J4 - 打开 求解器 从 数据标签页. 选择 设定目标 用于存放计算所得残差之和的单元格。将其设置为 分钟.
- 更改参数 L、k 和 c 的变量单元格。
注意：如果保留勾选“使无约束变量为非负数”，求解器的性能可能会更优。 - 对于负的 k 值，通过从 k 中提取 −1 将 k 变为正值，从而修改公式 4 和公式 6。使用 GRG 非线性求解方法。点击 解决.
- 检查曲线以及液相色谱（LC）50 使用公式6自动计算（表 2). 通过将特异性裂解百分比和模型拟合结果对毒素浓度进行图形化绘图，验证拟合效果。
注意：也可通过计算 R 来验证2 曲线。
- 门控总数，单细胞 L. major 通过前向散射、侧向散射及必要的时间参数设门圈选前鞭毛体（promastigotes）图3）。建议根据流式细胞仪的要求使用高度或面积。
3. 毒素处理的L. major前鞭毛体蛋白质分析
- 按照第1节所述方法制备L. major前鞭毛体。
- 使用5 mL移液管将2 × 107个野生型（WT）、spt2-和spt2-/+SPT2 L. major前鞭毛体重悬于2 mL所需检测缓冲液中（例如无血清M199培养基）。加入毒素至终浓度为亚溶血剂量，并在37 °C孵育30分钟。
注：例如，spt2-前鞭毛体的亚溶血剂量SLO为500 HU/mL。 - 包括其他基因型样本及无毒素对照组。
- 将前鞭毛体在1,500 × g离心10分钟以收集细胞沉淀。使用10 mL移液管弃去上清液。将含有细胞沉淀的离心管快速在不规则表面（如生物安全柜的格栅）上摩擦三次，以打散细胞沉淀。
注：细胞沉淀肉眼几乎不可见。 - 在使用前立即配制含2-巯基乙醇的1× SDS-PAGE上样缓冲液，并加热至95 °C 10分钟后再加入细胞沉淀中。将细胞沉淀重悬于热的1× SDS-PAGE上样缓冲液中，通过反复吹打充分混匀。将重悬后的细胞沉淀在95 °C加热10分钟。
注：样品在上样缓冲液中溶解后，如需长期保存，可置于−20 °C储存。 - 配制分离胶。除过硫酸铵（APS）和TEMED外，其余组分均需脱气15分钟。
- 在灌胶前立即加入APS和TEMED。小心地在分离胶上层覆盖一层水。让分离胶聚合约30–45分钟。
- 倒掉上层水，配制浓缩胶。加入浓缩胶时注意避免产生气泡。插入具有相应孔数的梳子，聚合5分钟。使用剩余的浓缩胶监测聚合情况。
- 组装SDS-PAGE电泳凝胶装置，并向电泳槽中加入电泳缓冲液。
- 每孔上样10 µL样品，或8 µL蛋白ladder。以180 V电压电泳至样品进入分离胶后，将电压降至约160 V，继续电泳直至染料前沿距离凝胶底部边缘约0.5 cm。
注：样品到达凝胶底部所需时间可能在1–1.5小时之间，降低电压可延长电泳时间。切勿将电压降至零。较高电压可能导致凝胶“微笑”现象或使玻璃板破裂。 - 将凝胶转移至考马斯亮蓝染色液（用于蛋白染色）或1×转膜缓冲液（用于Western blotting）。若进行考马斯亮蓝染色，则过夜染色后脱色、成像并干燥。
- 进行Western blot时，按照制造商说明书准备转膜系统。
- 湿法转膜时使用预冷的1×转膜缓冲液，并预先润湿海绵垫、滤纸和硝酸纤维素膜。对于本实验所用的Bio-rad Protean III系统（见材料表），滤纸可裁剪为10 cm × 7.5 cm，硝酸纤维素膜裁剪为9 cm × 6.75 cm。
注：硝酸纤维素膜高度易燃，请避免明火及其他可能的点火源。 - 在转膜夹中依次放置海绵垫、滤纸和硝酸纤维素膜，用滚轮排除气泡，然后小心加入凝胶。
- 覆盖滤纸并用滚轮排除气泡，再放上海绵垫，关闭夹子，并按正确方向插入电泳槽（确保硝酸纤维素膜朝向红色电极）。在槽内加入搅拌子和冰袋，并用预冷的1×转膜缓冲液充满电泳槽。以110 V转膜90分钟。
注：转膜过程中产生的热量可能影响转膜效果。为确保良好的转膜效率，务必使用预冷的1×转膜缓冲液。 - 取出硝酸纤维素膜，用Ponceau染色液染色约5分钟，然后用超纯水冲洗。用铅笔标记蛋白ladder位置，并根据需要修剪膜。使用剩余的转膜缓冲液进行脱色。
注：Ponceau染色液可多次重复使用。 - 将硝酸纤维素膜置于含5% BSA的25 mL 1× TBST中，在4 °C摇床上封闭过夜。弃去封闭液，加入用含1% BSA的1× TBST稀释的一抗（1:1,000），4 °C摇床孵育过夜。
注：一抗可保存于−20 °C，多次重复使用。 - 用1× TBST在摇床上洗涤硝酸纤维素膜3次，每次10分钟。弃去洗涤液，加入用含1% BSA的1× TBST稀释的HRP标记二抗（1:10,000），室温摇床孵育1小时。再次用1× TBST在摇床上洗涤3次，每次10分钟。
- 在成像前立即配制ECL显色试剂。成像前迅速倒掉TBST，将ECL试剂加至硝酸纤维素膜上，摇动1分钟，然后进行成像。
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结果
利什曼原虫前鞭毛体在Tyrode缓冲液中对SLO的敏感性高于M199培养基
比较了不同检测缓冲液中L. major前鞭毛体对SLO的敏感性。野生型、spt2-突变体及spt2-/+SPT2互补株前鞭毛体分别在无血清M199或含2 mM CaCl2的Tyrode缓冲液中与SLO作用30分钟，随后通过流式细胞仪进行分析。用于分析的合适寄生虫为通过前向散射/侧向散射图谱识别的单细胞（图3A、B）。数据采集使用BL1通道（488 nm激发，530/30 nm发射滤光片）作为自发荧光对照，YL1通道（561 nm激发，585/16 nm发射滤光片）检测碘化丙啶（PI）信号。BL1通道用于识别潜在的自发荧光或补偿问题（图3C–E的x轴）。使用561 nm激光可减少PI信号在BL1通道中的串色干扰。针对每种...
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讨论
本研究以人类病原体Leishmania major为模型系统，描述了研究孔形成毒素（PFTs）分子机制和功能的方法。建立了一种基于流式细胞术的中通量细胞毒性检测方法，用于测定单细胞存活率。由于可通过逻辑建模从剂量-反应曲线计算LC50值，因此该方法可在群体水平上实现存活率的定量分析。作为原理验证，采用流式细胞术检测证明了培养基的选择可影响野生型和鞘脂缺乏型L. major对SLO的敏感性，并确定了每种培养基中的亚溶血毒素剂量。在后续实验的原理验证中，检测了毒素攻击过程中L. major前鞭毛体内的磷酸化MAPK和磷酸化ERK抗体反应。总体而言，L. major前鞭毛体是一种具有病理相关性且遗传操作可行的模型系统，可用于深入理解毒素介导的细胞损伤机制与功能。
流式细胞术检测具有高度灵活性。如有需要，可使用其他活力染料替代碘化丙啶（PI）。在哺乳动物细胞中，多种活力染料的报告能力未见差异。20. 毒素的选择， L. major ...
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披露
本研究工作获得了美国国立卫生研究院下属的国家过敏与传染病研究所的资助，项目编号为R21AI156225（PI：PAK，合作研究者：KZ）和R01AI139198（PI：KZ，合作研究者）。CH感谢生物科学系在本研究期间提供的助教奖学金支持。
资助机构在研究设计、数据收集、分析或解释、稿件撰写以及决定发表结果等方面均未发挥作用。本文内容完全由作者负责，不一定代表资助机构的官方观点。作者声明不存在任何竞争性利益冲突。
致谢
作者感谢Keyel实验室和Zhang实验室成员对本文手稿的审阅。作者感谢文理学院显微技术中心提供设施支持。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 1.2 mL 微量离心管（Marsh） | Fisher | 02-681-376 | 细胞毒性检测 |
| 1.5 mL 微量离心管 | Fisher | 05-408-129 | 毒素稀释液 |
| 15 mL 离心管 | Avantor VWR（宾夕法尼亚州拉德诺） | 89039-666 | 用于盛放细胞和培养基 |
| 1×磷酸盐缓冲液（PBS） | Fisher | BP399 | 用于细胞处理 |
| 3% H2O2 | 沃尔玛 （费耶特维尔，AR） | N/A | 用于ECL |
| 5x M199 | Cell-gro | 11150067 | L. major 前鞭毛体的基础培养基 |
| 生物安全柜 | 贝克 | 在无菌条件下培养细胞 | |
| 牛血清白蛋白（BSA） | Fisher | BP1605-100 | V型级，可接受纯度 |
| CaCl2 | Fisher | BP510-100 | 储存浓度 100 mM |
| 离心 | Thermo Fisher | Heraeus Megafuge 40R | 离心收集培养物中的细胞 |
| Cy5 单反应性染料套装 | Cytiva（马萨诸塞州马尔伯勒） | PA25031 | 毒素的荧光标记 |
| 数字干浴器 | 基准 | BSH1002 | 使蛋白质样品变性 |
| EGTA | Amresco | 0732-100G | 储备浓度 0.5 M |
| Excel | Microsoft (Redmond, VA) | 数据分析软件 | |
| 流式细胞仪（4 激光 Attune NxT） | Fisher | 用于数据采集的流式细胞仪 | |
| FlowJo | BD（美国阿什兰） | 软件 | |
| 甲醛 | Fisher | BP531-500 | 用于细胞计数的固定剂 |
| G418 | Fisher | BP673-1 | 细胞筛选剂 |
| 海尔曼毒素III | Sigma | Z805939 | 按1:4比例稀释以清洁流式细胞仪 |
| 血细胞计数板 | Fisher | 0267151B | 用于细胞计数 |
| 人类红细胞 | Zen-bio（美国北卡罗来纳州达勒姆） | SER-10MLRBC | 验证毒素活性 |
| 冰桶 | |||
| 光学显微镜 | Nikon | Eclipse 55i | 观察细胞 |
| 硝酸纤维素 | Fisher | 88018 | 通过抗体检测蛋白质 |
| 移液器和吸头 | Avantor VWR | 用于分配试剂 | |
| 电源供应器 | Bio-Rad | 进行 SDS-PAGE 及转膜 | |
| 碘化丙啶 | Biotium | 40016 | 储存浓度：2 mg/mL，溶于水 |
| 蛋白分子量标准 | Bio-Rad | 161-0373 | 测定蛋白质的分子量 |
| SDS-PAGE电泳装置（Mini Protean III） | Bio-Rad | 165-3302 | 根据蛋白质的大小进行分离 |
| 封口膜 | R&研发 | DY992 | 用封板膜密封含细胞的培养板 |
| 链球溶血素 O C530A 质粒插入片段 | 克隆至 pBAD-gIII 载体（参考文献：7） | ||
| 链球溶血素 O C530A 毒素 | 实验室纯化 | 特异性活性 4.34 × 105 HU/mg | |
| 水平转子 | Thermo Fisher | 75003607 | 离心细胞 |
| V 型底板 | Greiner Bio-one | 651206 | 用于细胞毒性检测 |
| 涡旋震荡 | 基准 | BV1000 | 混合细胞 |
| Western blot成像系统（Chemi-doc） | Bio-Rad | 通过蛋白质印迹法检测蛋白质 | |
| Western Blot 转膜装置（Mini Protean III） | Bio-Rad | 170-3930 | 将蛋白质转移至硝酸纤维素膜 |
| Whatman 滤纸 | GE Healthcare Life Sciences | 3030-700 | 用于将蛋白质转移至硝酸纤维素膜 |
| 抗体 | |||
| 抗ERK抗体 | 细胞信号技术公司 | 货号 9102S | 兔源抗体（1:1000 稀释） |
| 抗脂磷糖苷（LPG）抗体 | CreativeBioLabs | 货号 WIC79.3 | 小鼠（1:1000） |
| 抗MEK抗体 | 细胞信号技术 | 货号 9122L | 兔抗（1:1000） |
| 抗小鼠 IgG，HRP 缀合物 | Jackson Immunoresearch | 货号 715-035-151 | 驴抗（1:10000） |
| 抗磷酸化ERK抗体 | 细胞信号技术公司 | 货号 9101S | 兔抗（1:1000） |
| 抗pMEK抗体 | 细胞信号转导技术 | 货号 9121S | 兔抗（1:1000） |
| 抗兔 IgG，HRP 偶联物 | Jackson Immunoresearch | Cat#711-035-152 | 驴抗（1:10000） |
| 抗微管蛋白抗体 | Sigma | 货号 T5168 | 小鼠（1:2000） |
| Leishmania major 基因型 | 参考文献：13 | ||
| 附加型回补（Episomal addback）spt2-/+SPT2) | Δspt2::HYG/Δspt2:PAC/+pXG-SPT2 | ||
| 丝氨酸棕榈酰转移酶亚基2基因敲除（spt2-) | Δspt2::HYG/Δspt2::PAC | ||
| 野生型（野生型) | LV39 克隆 5 (Rho/SU/59/P) |
参考文献
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