人诱导多能干细胞来源的心脏球体的生成、高通量筛选和生物样本库

人类诱导多能干细胞（hiPSCs）的发现为在细胞水平上研究人类发育和疾病提供了前所未有的机会。在过去的十年中，利用发育经验，已经建立了各种方案，以确保hiPSCs有效分化为心肌细胞（CMs）¹，²，^3，4。hiPSC 来源的心肌细胞 （hiPSC-CM） 可以作为模拟遗传性心血管疾病 （CVD）、测试新药心脏安全性和心脏再生策略的资源⁵，⁶，^7，8。尽管hiPSCs具有定向心脏分化，但不确定的CM数量在心脏领域仍然是一个挑战，因为成熟的hiPSC-CMs通常是非增殖性的，并且原代人细胞的数量不高。

最近，我们描述了伴随的Wnt信号激活与低细胞密度培养导致hiPSC-CMs^9，10的大规模增殖反应（高达250倍）。这种通过培养瓶形式的连续传代 大规模 扩增hiPSC-CMs的经济高效的策略有助于大量功能性hiPSC-CMs的标准化和质量控制。此外，为了跟上各种供体对大批量hiPSC-CMs的需求，已经描述了hiPSC-CMs的生物样本库¹⁰。然而，接种在这些标准培养皿中的心肌细胞单层不能代表心脏中存在的复杂3D结构。此外，hiPSC-CMs的不成熟仍然是一个障碍，因此在模拟 体内 心血管环境的生物学和生理表型方面存在不足。

已经开发了新颖的3D体外模型，其中hiPSC-CMs表现出更紧密的生理行为，例如自组织11，12，细胞外基质（ECM）重塑13，增强成熟¹⁴，15，16和同步收缩¹⁷，^18，19.3D模型已被用于药物发现，药物心脏毒性测试，疾病建模，再生疗法，甚至首次临床试验^20，21，²²，^23，24。最常用的模型之一是基于纤维蛋白的工程心脏组织（EHT），其表现出组织样排列和心脏收缩力¹³，^17，25。之前，我们发现由扩增的hiPSC-CMs产生的EHT表现出与未扩增的hiPSC-CMs相当的收缩性，显示出扩增⁹后细胞功能不受损害。然而，尽管从hiPSC-CMs生成EHT已经建立，但预计在建立HT评估平台方面会有进一步发展。在这里，快速生成大量96孔格式的自聚集心脏球体（CS）可以改善用于高通量筛选（HTS）目的的3D条件。

总体而言，CS作为3D细胞培养的优势在于其高可重复性和可扩展性。特别是，CS与机器人样品处理相结合，可以使CS培养、药物治疗和高内涵分析标准化和自动化²⁰。在这里，我们描述了优化的方案以产生高纯度和高质量的CS，通过使用光学钙采集和分析系统进行Ca^{2 +} 瞬态测量，可以有效地冷冻保存和筛选心脏功能。该模型提供了一个简单而强大的工具，可以在数百到数千个球体^17，18上执行高通量筛选。

注意:本研究中使用的hiPSC-CM是根据先前描述的hiPSC培养和CM分化方案^26，27生成的。或者，hiPSC-CM可以在开始CS方案之前扩增和冷冻保存（第4节）¹⁰。

1. 细胞培养基、溶液和等分试样的制备

1. 准备基础培养基
   1. 将青霉素-链霉素和培养基 （RPMI 1640） 平衡至室温 （RT） 并确保其完全解冻。混合 500 mL 培养基和 5 mL 笔/链球菌。在4°C下储存长达8周;使用前平衡至37°C。
2. 准备 RPMI + B27
   1. 将 B27 补充剂和基础培养基平衡至 RT。 确保完全解冻补充剂。混合 490 mL 基础培养基和 10 mL 50x B27 补充剂。在4°C下储存长达2周;使用前平衡至37°C。
3. 制备 hiPSC-CM 重镀介质
   1. 将含有蛋白激酶 （ROCK） 抑制剂（2 μM 终浓度）和 10% 敲除血清替代 （KSR） 的 Rho 相关线圈添加到 RPMI + B27 培养基中。根据需要将 ROCK 抑制剂直接添加到 RM 培养基中。补充后不要储存培养基。
4. 准备CM解冻培养基
   1. 向RPMI + B27培养基中加入1:100浓度的细胞存活补充剂（例如Revitacell）和20%KSR，并在使用前平衡至37°C。
5. 准备成熟补充剂
   1. 前面描述的成熟培养基式²⁸ 包括:3mM葡萄糖，10mM L-乳酸，5mg / mL维生素B12，0.82mM生物素，5mM肌酸一水合物，2mM牛磺酸，2mM左旋肉碱，0.5mM抗坏血酸，1x NEAA，0.5%（w / v）相蛋白，1x B27和1%KOSR。要准备一整瓶（500毫升）的成熟补充剂，请从一瓶不含葡萄糖的DMEM中取出65毫升，并补充2.7克葡萄糖，5.6克L-乳酸，0.025毫克维生素B12，1毫克生物素，3.73克一水肌酸，1.25克牛磺酸，1.975克左旋肉碱，0.7125克抗坏血酸， 50 mL NEAA、12.5 g 白蛋白和 5 mL 青霉素-链霉素。
   2. 通过带有0.22μm孔聚醚砜（PES）膜的无菌一次性过滤装置进行过滤。
   3. 分装到 45 mL（制备 500 mL 成熟培养基）或 4.5 mL（制备 50 mL 成熟培养基）中。在20°C下储存长达6个月。
6. 准备成熟培养基
   1. 在室温下平衡 B27 补充剂、敲除 SR、青霉素-链霉素、成熟补充剂²⁸ 和 DMEM 无葡萄糖培养基。 确保完全解冻补充剂。将 435 mL DMEM 无葡萄糖培养基与 10 mL 50x B27 补充剂、5 mL 青霉素-链霉素、5 mL 敲除 SR 和 45 mL 成熟补充剂混合。在4°C下储存长达2周;使用前在37°C下平衡。
7. 制备荧光光亮培养基
   1. 在室温下平衡青霉素 - 链霉素和DMEM氟布里特培养基。 确保补充剂完全解冻。将 500 mL DMEM 荧光培养基与 5 mL 青霉素-链霉素混合。在4°C下储存长达1个月;使用前在37°C下平衡。
8. 制备非离子洗涤剂溶液
   1. 将 20% w/v 非离子洗涤粉（例如 F-127）与 PBS 混合。使用0.22μm过滤器过滤，并在4°C下储存长达6个月;使用前在室温下平衡。
9. 制备钙染料培养基
   1. 在荧光光亮培养基中混合非离子洗涤剂溶液（终浓度为0.04%v / v）和0.1x钙染料（例如Cal520 AM）。在 50 mL 锥形管中，加入 10 μL Cal520 和 20 μL 非离子洗涤剂溶液。混合直至完全溶解。在加入细胞之前，将溶液放在黑暗中。

2. 缓冲液的制备

1. 制备透化和封闭缓冲液:该缓冲液含有 10 mL PBS、5% wt/v BSA 和 0.3% v/v Triton-X-100。
2. 制备流式细胞术缓冲液:该缓冲液含有 50 mL PBS、1% wt/v BSA 和 0.3% v/v Triton-X-100。
3. 流式细胞术洗涤缓冲液:该缓冲液含有 50 mL PBS 和 1% wt/v BSA。
4. 球状体洗涤缓冲液 （SWB）:该缓冲液在 1 L PBS 中含有 1 mL Triton-X-100、2 mL 10%（DPBS 中的 w/v）SDS 和 2 g BSA。
   注意:SWB可以在4°C下储存长达2周。
5. 制备包埋溶液 （ES）:要制备 100 mL 包埋溶液，请将 50 mL 甘油与 9.09 mL dH₂O、1 mL Tris 缓冲液（1 M，pH 8.0）和 200 μL EDTA （0.5 M） 混合。加入 22.7 克果糖，在室温下在黑暗中混合直至溶解。澄清后，加入 22.2 克果糖并混合直至溶解。然后加入15g尿素并混合直至溶解（在黑暗中储存在4°C）。
6. 准备PBT（含吐温-20的PBS）缓冲液。该缓冲液含有PBS/吐温-20（0.1% v/v）。对于 1 L PBS，加入 1 mL 吐温-20。

3. 小分子的制备

1. 在DMSO中以50μL的10mM等分试样复溶噻唑维林（ROCK抑制剂）粉末，并在-20°C下储存长达6个月。避光。
2. 在DMSO中制备2.5 mM等分试样，每份10μLCal-520 AM，并将其在-20°C下储存长达6个月。避光。

4. 心球生成

注意:对于大量 CS，在带有 2 mL hiPSC-CM 重镀培养基的 6 孔超低附着板中接种多达 100 万个 CM。这项研究在96孔板的每个孔中使用了至少2，500（2.5k CS）至20，000（20k CS）hiPSC-CM。

1. 对于一个 96 孔板，制备含有至少 2 x 10⁶ 人诱导的多能干细胞衍生心肌细胞 （hiPSC-CM） 的细胞培养物¹⁰。
2. 当培养的hiPSC-CMs达到汇合时，向每个孔中加入0.1mL / cm² 无菌心脏分离溶液（例如，tryple）。将板在37°C孵育15分钟。
3. 使用 5 mL 移液管，用 2 mL 温热的基础培养基冲洗以机械方式解离细胞，制成单细胞悬液。用明场显微镜（4倍放大倍率）确认脱离;单元格将看起来是白色的，呈圆形。
4. 将细胞悬液转移到15mL锥形管中，并以300× g离心3分钟。
5. 吸出上清液并将细胞重悬于 1 mL hiPSC-CM 重镀培养基中。
6. 使用 1，000 μL 移液管吸头，机械解离细胞沉淀。混合三到四次后，溶液看起来均匀。计数细胞。将 100 μL 重镀培养基中适量的细胞转移到每个超低附着圆底 96 孔中。
7. 将CS板放在培养箱中以70rpm的轨道振荡器上放置24小时。将培养箱条件设置为 37 °C、5% CO 2、21% O₂ 和 90% 湿度。
8. 从每个孔中吸出 50 μL 培养基，并在前 48 小时内每孔加入 100 μL RPMI + B27 培养基。
   注意:始终将 50 μL 培养基保存在 96 孔板中，以避免意外误吸和球体破裂。
9. 从每个孔中吸出 100 μL 培养基，每孔加入 100 μL 成熟培养基。将细胞保持在成熟培养基中，每2-3天刷新一次培养基。

5. CS的冷冻保存

注意:CS 可以冷冻保存以长期储存。CS可以从CS生成后的第3天开始进行，CS可以直接冷冻保存在96孔板的孔中，也可以作为CS悬浮液保存在冷冻管中。

1. 通过将板放在冰上10分钟来预冷板。
2. 以70 x g 离心球状体板3分钟。
3. 取出上清液直至残留 50 μL，每孔加入 200 μL 冰冷的 hiPSC 冷冻培养基。
   注意:在整个手术过程中将CS悬浮液保持在冰上。对于带有球状体的 6 孔板，在 500 μL 冷冻培养基冷冻管中冷冻一个孔。
4. 用板密封膜密封板。
   注意:96孔板需要存放在聚苯乙烯盒中，或者，如果没有，可以按照步骤5.5.1中所述制作硅模具。
5. 为确保孔板和冷冻机之间的均匀热交换，请将板小心地放入聚苯乙烯盒或硅胶模具中。
   1. 准备硅模具:以 10:1 的比例剧烈混合硅弹性体套件的两种成分。使用真空泵将溶液除泡15-20分钟。随后，将溶液浇铸在孔板的底部，并使用真空泵去泡10分钟。将模具放入烘箱中，在60°C下固化8小时，以获得从板上剥离的半柔性弹性体。
6. 将板在-80°C下冷冻在聚苯乙烯盒或制备的硅模具中至少4小时。
7. 将板转移到液氮罐或-150°C冰箱中长期储存。

6. 心球解冻

注意:一次不要解冻多个板，以确保快速解冻过程。

1. 在50 mL锥形管中制备20mL预热的37°C基础培养基。
2. 从液氮中收集带有CS的细胞板，并将其置于培养箱中15分钟。将培养箱条件设置为 37 °C、5% CO 2、21% O₂ 和 90% 湿度。
3. 除去上清液和细胞沉淀残留物，并将每个孔重悬于温暖的基础培养基中。每孔使用 200 μL 培养基。
4. 以70 x g 离心3分钟。
5. 重复步骤 6.3 和 6.4。
6. 除去上清液直至细胞沉淀残留，并在每个孔中加入 200 μL CM 解冻培养基。
7. 将CS板放在培养箱中以70rpm的速度放在轨道振荡器上24小时。将培养箱条件设置为 37 °C、5% CO 2、21% O₂ 和 90% 湿度。
8. 从每个孔中吸出 50 μL 培养基，并在前 48 小时内每孔加入 100 μL RPMI + B27 培养基。
9. 从每个孔中吸出 100 μL 培养基，每孔加入 100 μL 成熟培养基。将细胞保持在成熟培养基中，每2-3天刷新一次培养基。

7. 细胞内 Ca²⁺ 瞬变的评估

注意:CS在培养中总共培养3周;冷冻前 2 周和解冻后 1 周。"新鲜"控件与年龄匹配。

1. 培养 1 周后，解冻的 CSS 最适合钙处理光学成像。使用钙染料（例如Cal520AM）评估细胞中Ca²⁺ 的摄取和释放。
2. 每孔用100μL钙染料培养基处理它们，并在培养箱中孵育60分钟。将培养箱条件设置为 37 °C、5% CO 2、21% O₂ 和 90% 湿度。
   注:Cal520AM 对光敏感。在黑暗中执行所有加载程序和实验。
3. 准备钙采集和分析系统。
   1. 为显微镜供电，确保环境控制选项已打开。
   2. 调整相机和取景光圈尺寸以最小化背景区域。
      注意:这里使用了徕卡雷霆DMi8显微镜;其他显微镜系统也适用，直到它们允许超过30帧/秒（FPS）的采样率。
4. 在10 s内录制具有2−10个峰的一致流的视频，并扫描96孔板，最初向左移动，然后以锯齿形方式向下以覆盖整个板。使用488nm激光测量钙信号;在钙释放期间将对比度设置为带有亮绿色信号的黑色背景。
5. 获取Ca²⁺ 瞬变后，根据制造商的说明使用荧光痕量分析软件（例如，CyteSeer，Vala Sciences）分析数据。

8. 解离心脏球体的流式细胞术分析

注意:在本研究中，流式细胞术用于确定解冻过程前后CS的活力。

1. 使用 5 mL 移液管将 CS 收集在 15 mL 锥形管中以避免球体损坏，并以 70 x g 离心 3 分钟。吸出上清液并加入 1 mL PBS。
2. 以200 x g 离心3分钟。吸出上清液并通过加入 1 mL 心脏脱离溶液（例如 tryple）解离 CS。将管在37°C孵育15分钟。
3. 使用 5 mL 移液管，用 2 mL 基础培养基冲洗机械解离细胞，直到在显微镜下观察时可以看到单个细胞。
4. 以200 x g 离心3分钟。
5. 吸出上清液，并在 1x PBS 中用 200 μL 4% 多聚甲醛 （PFA） 溶液固定 CM。在室温下孵育10分钟。
6. 以200 x g 离心3分钟。吸出上清液并加入 1 mL PBS。
   注意:暂停点:固定的hiPSC-CMs可以在4°C下储存长达4周。
7. 将细胞悬液转移到FACS管中，并以200× g离心3分钟。吸出上清液并将 1 x 10⁵ 个细胞重悬于 50 μL 透化缓冲液中。
8. 将细胞在4°C孵育30分钟。
9. 对于免疫荧光流式细胞术分析，执行步骤8.9.1-8.9.4。
   1. 将细胞重悬于含有α-肌动蛋白抗体的流式细胞术缓冲液（50μL）中，稀释度为1:300。在另一个 FACS 管中，用相应的同种型对照（例如，FITC小鼠IgM，κ同种型[1:200稀释]）将1 x 10⁵ 个细胞重悬于流式细胞术缓冲液（50μL）中。同样，将 1 x 10⁵ 个细胞重悬于 50 μL 流式细胞术缓冲液中以进行阴性对照。
   2. 将细胞在4°C孵育30分钟。
   3. 加入2.5mL流式细胞术缓冲液，并在4°C下以200× g 离心细胞3分钟;弃去上清液并重复该洗涤步骤两次。
   4. 将细胞重悬于50μL流式细胞术缓冲液中，并加入二抗山羊抗小鼠（1:300稀释）。
      注意:将试管放在黑暗中，因为二抗溶液对光敏感。
10. 为了用碘化丙啶（PI）进行活性检查，每个样品加入150μL的PI（1:1，000）并孵育15分钟。
    注意:将试管放在黑暗中，因为PI溶液对光敏感。
11. 根据标准设门策略调整门，如 补充图1 所示，并用流式细胞仪分析细胞。

9. 整个3D球体的免疫荧光染色

注意:该协议基于免疫荧光标记时整个类器官的高分辨率3D成像方案，该协议先前发表于²⁹ 并针对心脏球体进行了调整。在此过程中，所有移液器吸头和锥形管都可以涂上1%wt/v BSA-PBS，以防止球体粘附在塑料上。要涂覆材料，请浸入 1% 的 BSA-PBS 中。小心不要使用 5 mL 移液管损坏球体，避免机械损坏。

1. 用 5 mL 移液管将 CS 收集在 15 mL 包被管中。球体肉眼可见。收集每种抗体组合~20-50个球状体。以70× g 离心3分钟并吸出上清液。
2. 使用包被的 1 mL 吸头小心地将球体重悬于 1 mL 冰冷的 4% 多聚甲醛 （PFA） 溶液中，置于 1x PBS 中。
3. 在4°C固定45分钟。20 分钟后，使用包被的 1 mL 吸头轻轻重悬球体。这均匀了所有球体之间的注视。
4. 将 10 mL 冰冷的 PBS 加入试管中，并通过倒置试管轻轻混合。在4°C孵育10分钟，并以70× g 旋转3分钟。
   注意:从此步骤开始，通常不需要涂覆尖端和锥形管，因为CS在固定后不会粘在尖端上。
5. 通过将沉淀重悬于冰冷的 SWB（每孔 200 μL SWB）中来阻断 CS，并将球状体转移到 24 孔悬浮培养板中。
   注意:来自一个大沉淀的CS可以分成多个孔以执行不同的染色。每种抗体组合使用 ~20-50 个 CS。
6. 在4°C孵育至少15分钟。
7. 在空孔中加入 200 μL SWB 作为参比孔。
   注意:对于免疫荧光染色，也可以使用48孔板或96孔板来减少抗体的使用。然而，由于每孔体积较小，染色和洗涤结果可能会降低。
8. 让球体沉淀在板的底部，让板以 45° 角倾斜 5 分钟。
9. 取出 SWB，将 CSS 留在 200 μL 的 SWB 中（使用参比孔估计 200 μL 的最小体积）。
10. 加入 200 μL 一抗 2x 浓缩的 SWB（例如，ɑ-肌动蛋白 [1:200] 和肌钙蛋白 T [1:200]），并在 4 °C 下孵育过夜，同时摇动/摇动（在水平摇床上 40 rpm）。
11. 第二天，向每个孔中加入 1 mL 的 SWB。
12. 让球体以 45° 角离开板 55 分钟，让球体沉降在板底部。
13. 取出 SWB，在板中留下 200 μL。加入 1 mL SWB 并缓慢摇动/摇动洗涤 2 小时。
14. 再重复步骤 9.12 和 9.13 两次。
15. 让CS沉降在板的底部，让板倾斜45°5分钟。取出 SWB，在每个孔中留下 200 μL
16. 加入 200 μL 的 SWB，加入二抗、偶联抗体和 2x 浓缩染料（例如 DAPI [1 μg/mL]、小鼠-AF488 [1:500]、兔-AF568 [1:500]），并在 4 °C 下在黑暗中孵育过夜，同时缓慢摇动/摇动。
17. 第二天，再重复步骤 9.12 和 9.13 两次。
18. 小心地将CS转移到1.5 mL管中，并以70 x g 离心3分钟。
19. 在不中断CS的情况下，通过移液尽可能多地去除SWB。
20. 使用 200 μL 尖端加入包埋溶液（ES;至少 50 μL，室温下），末端被切断并轻轻重悬以防止气泡形成并在室温下孵育 20 分钟。
21. 同时，在载玻片上用指甲油或硅酮密封剂制作一个方形容器。
22. 切下 200 μL 吸头的末端，并将 ES 中的 CSS 转移到方形容器的中间。
23. 在上面放一个方形盖玻片。为减少气泡，请先放置盖玻片的一侧，然后将盖玻片从一侧缓慢降低到另一侧，直到表面下没有滞留的空气，然后松开盖玻片。
24. 轻轻推盖玻片的所有边缘，将其密封在指甲油或硅酮密封胶上。
25. 将载玻片在室温下放置过夜。第二天，载玻片准备好进行成像。
    注意:ES的光学清除会导致轻微的组织收缩。然而，这不能影响CS的整体形态。通过将载玻片储存在4°C（至少1周）或-20°C（至少6个月）下，可以在此处暂停染色程序。

图1A所示的实验方案描述了从先前扩展的hiPSC-CM生成CS。CS在接种后第1天在超低附着圆底板中获得3D结构，并且可以培养长达6周（图1B）。通过免疫荧光染色评估，3周龄CS中的大多数细胞表达肌瘤蛋白，如α-肌动蛋白和肌钙蛋白T，并显示出规则的肌节组织（图1C）。为了定量α-肌动蛋白阳性细胞，进行了流式细胞术分析。根据免疫荧光结果，流式细胞术数据在第0天（76.9%±16.6%）和3周龄CS（71.1%±22.7%）中显示出相当高水平的α-肌动蛋白（图1D），表明培养过程中细胞组成恒定且高度纯化。与 hiPSC-CM 衍生球体（第 42 天）中连接（GJA1、JPH2 和 PKP2）、桥粒 （DES） 和线粒体 （ATP5A） 的心脏基因表达增加，与 hiPSC-CM 在 2D 中培养 90 天相比（图 1E）。这些基因的表达是细胞间相互作用和成熟的标志30。

随后，在不同时间点评估CSs的功能特性，即跳动速率和Ca2+处理（图2）。如图2A，B所示评估了钙瞬态参数，如上升时间、峰值时间、衰减时间和钙瞬态持续时间（CTD90）。在生成后的前 3 周，击败 CS 的百分比相似，但在第 6 周 （Wk6） CS 中显着下降（图 2C）。与Wk1相比，Wk3的跳动率显着降低，与CS的跳动百分比类似，在Wk6处急剧下降（图2D）。在Wk6，观察到CS恶化，这可以解释跳动速率和跳动CS数量的下降。 钙瞬态参数的测量表明Wk2处的峰值显着更高（图2E），而与Wk1相比，Wk3处的上升时间，衰减时间和CTD90显着增加（图2F-H).综上所述，这些结果表明，hiPSC-CM衍生的球体在生成后第2周和第3周左右在功能上是最佳的。

图3显示了球体尺寸对跳动速率和钙处理的影响。通过在 96 孔板的孔中接种 2.5 x 10 4、5 x 104、10 x 104 和 20 x 104 hiPSC-CM 来生成 CS，每个条件总共 24 个 CS/孔（图 3A）。正如预期的那样，球体尺寸随着所用细胞数量的增加而增加，范围从 178 ± 36 μm 到 351 ± 65 μm（图 3A，右图）。在四种不同的播种密度下测量了3周龄CS中的Ca2+瞬变（图3B）。对击败CS的测量表明，只有约50%的较小尺寸CS（2.5K和5K-CS）跳动，而较大尺寸的CS（10K和20K-CS）的百分比显着更高（约85%）（图3C）。5K、10K和20K-CS显示出类似的跳动率（约28 bpm），与2.5K-CS相比明显更高（图3D）。钙图像的峰值在所有测试条件下相似（图3E），但是，与较小的CS（2.5K和5K-CS）相比，较大尺寸的CS（10K和20K-CS）的上升时间（图3F）、衰减时间（图3G）和CTD90（图3H）显着增加。综上所述，这些结果表明，当使用10K至20K hiPSC-CMs/孔的接种密度时，hiPSC-CM衍生的球状体是钙处理筛选的最佳选择。

接下来，我们评估了冷冻保存对CS活力和功能的影响。在分析之前，解冻的CS在培养物中维持1周（图4A）。如流式细胞术（图4B）和钙黄绿素-AM（图4C）细胞活力测试所示，冷冻保存不影响CS内的细胞活力。 此外，与新鲜年龄匹配的CS相比，解冻的CS显示出相似的肉瘤蛋白表达水平（图4D）。这些数据表明，CSs可以有效地冷冻保存，用于随后的心脏功能分析和高通量筛选。

最后，在新鲜和冷冻保存的CS中测量打浆活性和Ca2+处理（图5）。分别在解冻后的不同时间点测量击败CSs的百分比，分别为2天，5天和7天。虽然大多数新鲜CS随着时间的推移显示出跳动活性，但显然冷冻保存的CS需要长达1周的培养才能恢复其跳动活性（图5B）。解冻的CS与新鲜CS的跳动率没有显着变化;然而，在一些冷冻CS中没有观察到自发跳动活动（图5C）。尽管与新鲜CS相比，冷冻/解冻CS的峰值显着降低（图5D），但与新鲜CS相比，冷冻/解冻CS的上升时间，腐烂时间和CTD90没有显着变化（图5E-G）。这些数据表明，解冻后，重要的是让CS在培养箱中恢复至少1周，然后再测量跳动活性和Ca2+瞬态。

综上所述，这些结果表明，hiPSC-CM衍生球体的冷冻保存可保持心肌细胞活力，肌瘤结构及其功能特征，例如自发跳动活性和钙处理。因此，hiPSC-CM衍生的球状体代表了在 体外准确概括心脏电生理学的合适模型。

图1:心脏球体的生成 。 （A）基于Wnt的定向心脏分化，hiPSC-CM的后续扩增以及CS的产生示意图 biorender.com。（B）CS培养不同时间点的明场图像。比例尺，200 μm。周代表周。（C）3周龄CS中心脏肌瘤蛋白α-肌动蛋白和肌钙蛋白T的代表性免疫荧光图像。 免疫荧光:Hoechst（蓝色），α-肌动蛋白（绿色）和肌钙蛋白T（红色）。比例尺，200 μm。右侧放大的合并图片显示了肌节组织。比例尺，50 μm。 （D）在CSs形成之前（第0天）和3周前（第0天）和3周对α-肌动蛋白阳性细胞进行流式细胞术定量。 （n = 14-23每种条件。（E）对培养90天（2D）的hiPSC-CMs和培养42天的球状体样品进行RT-qPCR，以确定与细胞连接，中间丝和线粒体相关的不同心脏基因的表达水平。（n = 1-3 批次）。数据表示为平均值±标准偏差。 NS（非显著性），由非配对 t 检验计算得出。 请点击此处查看此图的大图。

图2:CS在生成后不同周的跳动率和钙处理。 （A）Cyteseer软件中Vala科学分析算法计算的钙瞬态参数示例。（B）CSs在生成后不同时间点（周）的代表性钙瞬态迹线和延时图像。比例尺，200 μm。 （C）自发跳动活动的时程量化表示为跳动CS的百分比。 （D）培养期间CS的跳动率。（E-H）钙瞬变的定量，显示峰值、上升时间、衰减时间和CTD90。显示的数据是SD±平均值，生物学重复= 3，技术重复= 38，50，66和7。*p < 0.05， ****p < 0.001;单因素方差分析，然后是Tukey的事后多重比较测试。缩写;CTD = 钙瞬时持续时间，Wk = 周，CSs = 人心球。请点击此处查看此图的大图。

图 3:使用不同细胞接种密度生成的 CS 中的跳动速率和钙处理。 （A）使用不同数量的hiPSC-CM生成的CS的明场成像（左）和尺寸测量（右）。比例尺，200 μm。 （B）2.5K-20K-CSs的代表性钙瞬态迹线和延时图像。（中，四）2.5K-20K-CS的跳动率和跳动率。（E-H）2.5K-20K-CS中的峰值、上升时间、衰减时间和CTD90。数据平均值±SD.生物学重复= 3，技术重复= 28-39。*p < 0.05， ****p < 0.001;单因素方差分析，然后是Tukey的事后多重比较测试。缩写:CTD = 钙瞬时持续时间，Wk = 周，k = x 1，000 个细胞，CSs = 心脏球状体。请点击此处查看此图的大图。

图4.冷冻保存对心脏球状体活力和结构的影响。 （A）CS生成，随后的生物样本库和解冻的示意图。（B）新鲜和冷冻保存的CS中的流式细胞术细胞活力测试。作为阳性对照，使用10%Triton-X溶液处理5分钟。（每个条件 n = 4）。数据表示为标准偏差±平均值。 ** **p < 0.001;单因素方差分析，然后是Tukey的事后多重比较测试。（C）培养7天后新鲜与解冻CS中的钙黄绿素-AM细胞活力测试（n = 15-17每个条件，** **p <0.001，通过配对t检验;比例尺，200μm）。（D）新鲜和解冻CS中α-肌动蛋白和肌钙蛋白T表达的代表性明场（左）和免疫荧光染色。 免疫荧光:Hoechst（蓝色），α-肌动蛋白（绿色）和肌钙蛋白T（红色）。右侧合并的图片显示了CS中的肌节条纹。 比例尺，50 μm。 缩写:X = 选择的解冻日，PI = 碘化丙啶，Cal-AM = 钙黄绿素-AM，EthD-I = 乙锭同型二聚体 I。 请点击此处查看此图的大图。

图5:新鲜与解冻CS中的钙瞬变。 （A）冷冻保存前和解冻后1周CS的代表性钙瞬态迹线和延时图像。（B）新鲜和冷冻/解冻的心脏球体的跳动百分比。条形表示单个实验。（C）新鲜和冷冻/解冻的心脏球体的跳动速率。（D-G）钙瞬态参数的量化:峰值、上升时间、衰减时间和CTD90。数据平均值±标准偏差*p < 0.05，****p < 0.001;单因素方差分析，然后是Tukey的事后多重比较测试。缩写;CTD = 钙瞬时持续时间，CSs = 心脏球状体。请点击此处查看此图的大图。

补充图1:流式细胞术分析的代表性门控策略。 （A）纯人群中α-肌动蛋白阳性hiPSC-CMs的代表性门控策略与阴性对照和同种型对照的比较。α-肌动蛋白阳性分析细胞的数量为25 x 105。缩写;SSC = 侧散射，PI+ = 碘化丙啶阳性。（B）用于新鲜，解冻，阳性对照（Triton-X）和阴性对照（未染色）的活力分析的代表性门控策略。 请点击此处下载此文件。

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