利用干细胞衍生的心肌细胞生物工程构建的三维心脏组织已成为研究健康与疾病状态下人类心肌的有前景模型 体外 在重现天然心脏微环境关键特征的同时，本文描述了一种利用人诱导多能干细胞来源的心肌细胞构建和分析高内涵工程化心脏组织的实验方案。
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摘要
摘要
心力衰竭仍然是全球死亡的首要原因，迫切需要更优的人类心脏临床前模型。组织工程对基础科学领域的心脏研究至关重要； 体外 人类细胞培养消除了动物模型中存在的物种间差异，而更接近组织的三维环境（例如包含细胞外基质和异细胞耦联）可模拟 体内 与传统的塑料培养皿中的二维培养相比，这些条件在更大程度上模拟了体内环境。然而，每种模型系统都需要专用设备，例如定制设计的生物反应器和功能评估装置。此外，这些实验方案通常较为复杂、劳动密集，且常因组织体积小而脆弱导致实验失败。
本文介绍了一种利用诱导多能干细胞来源的心肌细胞构建稳定的人源工程心脏组织（hECT）模型系统的方法，用于长期监测组织功能。平行培养六个具有线性条带结构的hECT，每个hECT 悬挂在一对连接于PDMS支架上的力传感聚二甲基硅氧烷（PDMS）支柱上。每个支柱顶端均装有一个黑色PDMS稳定支柱追踪器（SPoT），这一新特性显著提升了使用的便捷性、通量、组织保留能力及数据质量。该形状设计可实现对支柱偏转的可靠光学追踪，从而获得更精确的收缩力记录，并提供绝对的主动张力与被动张力数据。帽状结构设计消除了因hECTs从支柱滑脱而导致的组织失效问题；此外，由于SPoT是在PDMS支架制备完成后额外添加的步骤，因此可在不显著改变生物反应器制备流程的前提下，将其整合至现有的基于PDMS支柱的设计中。
该系统用于演示在生理温度下测量人工程化心肌组织（hECT）功能的重要性，并显示在数据采集过程中组织功能的稳定性。总之，我们描述了一种先进的模型系统，可重现关键的生理条件，从而提高用于体外（in vitro）应用的工程化心肌组织的生物保真度、效率和实验严谨性。
引言
工程化心肌组织模型具有多种几何形状和构型，可用于模拟传统二维细胞培养难以实现的天然心肌微环境的各个方面。其中最常见的构型之一是线性组织条带，其两端带有柔性锚点，可诱导组织自组装，并为组织提供明确定义的预负荷以及相应收缩力的读出信号,1,2,3,4,5,6,7,8,9,10,11,12,13,14,15....
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方案
本方案使用了一株去标识化的诱导多能干细胞系SkiPS 31.3（最初利用一名健康45岁男性皮肤成纤维细胞重编程获得）47，因此根据本机构人类研究伦理委员会的指南，无需经过特定的机构审查委员会批准。所有细胞和人胚胎类囊胚结构（hECT）操作均须在配备HEPA过滤器的II级生物安全柜或层流工作台中无菌条件下进行。所有非无菌溶液均须通过0.22 µm滤膜过滤灭菌，并将所有细胞和hECTs置于37 °C、95%相对湿度、5% CO2的培养箱中维持培养。
1. 生物反应器的制备
- 生物反应器组件及铝制母模的制备
注意：计算机辅助设计（CAD）文件见补充文件1。本实验方案可在这些步骤之间的任意位置暂停。建议聘请专业机械师来加工本节所述的母模，因为需要高精度（≤5 µm）和光滑的表面，以确保后续结构的准确性，并使聚砜框架能够与聚四氟乙烯（PTFE）底板实现良好的压配合（目标为紧密的摩擦配合，但不过紧）。- 使用数控（CNC）铣床，根据图1A中的示意图，用PTFE材料加工底板。人工程化心脏组织（hECTs）将在六个等距排列的孔中形成（白色箭头所示）。
- 使用数控（CNC）铣床，根据
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结果
按照上述方案，我们课题组利用先前使用的一株健康人iPSC细胞系生成了心肌细胞9,15 在培养 8-61 天后制备成人心外膜组织。 图9A 显示从底部观察的hECTs代表性图像，分别在无SPoTs（上）和有SPoTs（下）条件下制备。功能测量在室温下进行（23 °C）以及生理温度下（36 °C在hECT构建后的37至52天之间。在PDMS支架的制备过程中，我们记录到经验丰富的操作者可获得80%的产率，即所有六个支柱均完整的PDMS支架；总体而言，至少五个支柱完整的PDMS支架产率可达95%（基于本实验室三位操作者的数据），其中 <柱高存在 3% 的变异。
与难以牢固附着在PDMS微柱尖端的标记墨水所产生的碎片化形状相比，SPoT在数据采集过程中提供了一个单一且定义明确的跟踪形状（图9B 和补充视频S1
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讨论
文献中已发表多种线性工程化心肌组织模型，其中一些模型如表1所述。部分模型涉及对组织收缩力的直接测量，但通常需要将构建物转移至独立的肌肉浴槽中进行38。大多数模型设计为将组织永久固定在两端，最常见的是固定在PDMS柱上1,2,3,4,5,6,7,8,9,10,
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披露
K.D.C. 是 Novoheart 的联合创始人兼首席科学官，并持有其控股公司 Medera Biopharmaceutical 的股权。Novoheart 未参与本研究的资助、设计或实施；然而，本研究的结果可能对 Novoheart 和 Medera 产生财务影响。其他作者声明不存在竞争利益。
致谢
作者感谢 Timothy Cashman 博士在此方法早期研究中的贡献。本研究获得了美国国立卫生研究院（NIH）（项目编号 R01-HL132226 和 K01 HL133424）以及勒杜克基金会国际卓越网络计划（CURE-PLaN）的资助。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 0.25 mm直径304不锈钢丝 | McMaster Carr | 6517K61 | |
| 0.25% 胰蛋白酶-EDTA | Gibco | 25200056 | |
| 1.7 mL 微量离心管 | Axygen | MCT-175-C | |
| 10 cm 培养皿（20 mm 高） | 康宁 | 353003 | |
| 10 mL 血清移液管 | 德拉蒙德 | 6-000-010 | |
| 10 N NaOH | Fisher Scientific | SS225-1 | 用无菌蒸馏水按1:10比例稀释 |
| 10X 改良伊格尔培养基 | Sigma Aldrich | M0275 | |
| 20 - 200 μL 微量移液器 | Eppendorf | 3123000055 | |
| 200 μL 微量移液器吸头 | VWR | 76322-150 | |
| 5 mL 血清移液管 | 德拉蒙德 | 6-000-005 | |
| 50 mL 圆锥形离心管 | Falcon | 352070 | |
| 6 cm 培养皿 | 康宁 | 353002 | |
| 6 瓦 LED 双蛇形管照明器 | AmScope | LED-6W | |
| 6孔板 | 康宁 | 353046 | |
| 90度角反射镜 | Edmund Optics | 45-594 | |
| 丙烯酸粘合胶 | SCIGRIP | #4 | |
| 可调节的10 cm x 10 cm千斤顶 | Fisher Scientific | 14-673-50 | |
| 铝合金6061 | McMaster Carr | 9008K82 | |
| A-Plan 10倍物镜 | ZEISS | 1020-863 | |
| 高压灭菌袋 | Propper | 21002 | |
| B-27添加剂 | 赛默飞世尔科技 | 17504044 | |
| B-27添加剂（不含胰岛素） | ThermoFisher | A1895601 | |
| 台式离心机 | Eppendorf | 5810 R | |
| 黑色ABS | Ultimaker | 2.85 mm 宽 | |
| 牛I型胶原蛋白 | Gibco | A1064401 | |
| CHIR99021 | Tocris | 4423 | |
| II 级生物安全柜 | Labconco | 3430009 | |
| 透明亚克力板 | estreetplastics | 1002502436 | 6.25 mm 厚 |
| 数控立式铣床 | Haas | VF-1 | |
| 导电石墨棒 | McMaster Carr | 1763T33 | |
| 解剖显微镜 | Olympus | SZ61 | |
| Dulbecco改良Eagle培养基/Ham's F-12营养混合物 | 赛默飞世尔科技 | 11330032 | |
| 乙醇 | Fisher Scientific | A4094 | 用水稀释至70% |
| EVE全自动细胞计数仪 | NanoEntek | E1000 | |
| EVE细胞计数板 | NanoEntek | EVS-050 | |
| 胎牛血清 | Life Technologies | 10438026 | |
| 精细弯头镊 | Fine Science Tools | 11253-25 | |
| Forma Series II 水套式 CO2 培养箱 | 赛默飞世尔科技公司 | 3110 | 也称为 "培养箱"配备HEPA 100级过滤器 |
| Fusion360 软件 | Autodesk | 也称为 "CAD 软件" | |
| 血细胞计数板（玻璃） | Reichert | 1475 | 0.1 mm 深 |
| HEPES | Sigma Aldrich | H3784 | |
| hESC 验证合格的基质胶 | 康宁 | 354277 | 也称为 "基底膜基质". 储存于冷冻分装样品中 |
| 高速CCD相机 | PixelLINK | P7410 | |
| 倒置显微镜 | 卡尔·蔡司工厂 | Axiovert 40 CFL | 10倍相差物镜 |
| IWR-1 | Selleck Chem | S7086 | |
| LabView 软件 | 国家仪器公司 | 2016 | |
| 层流洁净工作台 | NuAire | NU-201-330 | hECT功能分析所必需 |
| 笔记本电脑 | 华硕科技 | 雕属 | 英特尔酷睿 i& 处理器，CPU 2.8GHz，16GB RAM |
| 激光切割机 | 尾声 | Helix 24 | |
| 放大头戴镜 | ExcelBlades | 70020 | 适用于需要精细操作的步骤 |
| Matlab | Mathworks | 版本 2019b 或更高版本 | 也称为 "数据分析软件" |
| 微型Vannas剪刀，3 mm刀片 | WPI Instruments | 501839 | |
| 显微镜支架立柱 | 奥林巴斯 | SZ2-STU1 | |
| 青霉素-链霉素储备液 | 赛默飞世尔科技 | 15140122 | 10,000 IU/ml 青霉素；10,000 μg/ml 链霉素 |
| 不含二价阳离子的磷酸盐缓冲液 | Sigma Aldrich | P3813 | 用蒸馏水稀释至1X和10X浓度 |
| 移液控制器 | 德拉蒙德 | 4-000-100 | |
| PixelLINK Capture OEM | PixelLINK | 10.2.1.6 | 也称为 "相机软件" |
| 聚砜 | McMaster Carr | 86735K73 | 半透明琥珀色 |
| 聚四氟乙烯（PTFE） | McMaster Carr | 8545K176 | 黑色，模制 |
| ReLeSR | 干细胞技术 | 5872 | 也称为 "iPSC 解离培养基" |
| 罗斯韦尔公园纪念研究所1640培养基 | 赛默飞世尔科技 | 11875135 | |
| 硅胶片 | SMI 制造 | 有光泽，厚度为 0.02 英寸，硬度计读数 40 | |
| 10/0 尺寸蓝色、绿色、红色和黄色玻璃小珠 | Michael's | 颜色应能耐受高压灭菌 | |
| 刮勺 | Fisher Scientific | 14-373 | 用于混合PDMS |
| 方波脉冲刺激器 | Astro-Med / Grass Technologies | S88X | |
| 不锈钢剃刀片 | GEM | 62-0179-CTN | 由于硬度较低，优先选择非不锈钢材料 |
| Stemflex | 赛默飞世尔科技 | A3349401 | 也称为 "iPSC 培养基" |
| 无菌蒸馏水 | 赛默飞世尔科技 | 5230 | |
| Sylgard 170 硅胶弹性体封装胶 黑色 0.9 kg 套件 | 道 | DOWSIL 170 2LB 套件 | 又称黑色聚二甲基硅氧烷（黑色 PDMS） |
| Sylgard 184 - 硅酮弹性体透明 1 磅装套件 | 道 | DC 184 SYLGARD 0.5公斤 1.1磅 套件 | 又称聚二甲基硅氧烷（PDMS） |
| 温控加热载物台 | Okolab | H401-HG-SMU | 设置高度为10 cm |
| 热塑性3D打印机 | Ultimaker | Ultimaker 3 | |
| Thiazovivin | Selleck Chem | S1459 | |
| 台盼蓝 | NanoEntek | EBT-001 | |
| 真空室 | Bel-Art 零件 | F42027-0000 | |
| 可变速度迷你带锯 | Micro-Mark | 82203 | |
| 可变速度微型钻床 | Micro-Mark | 82959 | |
| 减振台 | Labconco | 3618000 | |
| 称量舟 | VWR | 10803-140 | |
| Talon圆柱形台钳夹具 | VWR | 97035-528 | AKA 螺丝夹 |
参考文献
- Serrao, G. W., et al. Myocyte-depleted engineered cardiac tissues support therapeutic potential of mesenchymal stem cells. Tissue Engineering. Part A. 18 (13-14), 1322-1333 (2012).
- Turnbull, I. C., et al.
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重印与许可
勘误
Formal Correction: Erratum: Designing a Bioreactor to Improve Data Acquisition and Model Throughput of Engineered Cardiac Tissues
Posted by JoVE Editors on 1/10/2024. Citeable Link.
An erratum was issued for: Designing a Bioreactor to Improve Data Acquisition and Model the Throughput of Engineered Cardiac Tissues. The title was corrected from:
Designing a Bioreactor to Improve Data Acquisition and Model the Throughput of Engineered Cardiac Tissues
to:
Designing a Bioreactor to Improve Data Acquisition and Model Throughput of Engineered Cardiac Tissues
