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方法文章

设计生物反应器以提高工程化心肌组织的数据采集效率与模型通量

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DOI：

10.3791/64368

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2023年6月2日

 ,  ,  ,  ,  , 
1Cardiovascular Research Institute, Icahn School of Medicine at Mount Sinai

本文内容

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摘要

利用干细胞衍生的心肌细胞生物工程构建的三维心脏组织已成为研究健康与疾病状态下人类心肌的有前景模型 体外 在重现天然心脏微环境关键特征的同时，本文描述了一种利用人诱导多能干细胞来源的心肌细胞构建和分析高内涵工程化心脏组织的实验方案。

摘要

心力衰竭仍然是全球死亡的首要原因，迫切需要更优的人类心脏临床前模型。组织工程对基础科学领域的心脏研究至关重要； 体外 人类细胞培养消除了动物模型中存在的物种间差异，而更接近组织的三维环境（例如包含细胞外基质和异细胞耦联）可模拟 体内 与传统的塑料培养皿中的二维培养相比，这些条件在更大程度上模拟了体内环境。然而，每种模型系统都需要专用设备，例如定制设计的生物反应器和功能评估装置。此外，这些实验方案通常较为复杂、劳动密集，且常因组织体积小而脆弱导致实验失败。

本文介绍了一种利用诱导多能干细胞来源的心肌细胞构建稳定的人源工程心脏组织（hECT）模型系统的方法，用于长期监测组织功能。平行培养六个具有线性条带结构的hECT，每个hECT 悬挂在一对连接于PDMS支架上的力传感聚二甲基硅氧烷（PDMS）支柱上。每个支柱顶端均装有一个黑色PDMS稳定支柱追踪器（SPoT），这一新特性显著提升了使用的便捷性、通量、组织保留能力及数据质量。该形状设计可实现对支柱偏转的可靠光学追踪，从而获得更精确的收缩力记录，并提供绝对的主动张力与被动张力数据。帽状结构设计消除了因hECTs从支柱滑脱而导致的组织失效问题；此外，由于SPoT是在PDMS支架制备完成后额外添加的步骤，因此可在不显著改变生物反应器制备流程的前提下，将其整合至现有的基于PDMS支柱的设计中。

该系统用于演示在生理温度下测量人工程化心肌组织（hECT）功能的重要性，并显示在数据采集过程中组织功能的稳定性。总之，我们描述了一种先进的模型系统，可重现关键的生理条件，从而提高用于体外（in vitro）应用的工程化心肌组织的生物保真度、效率和实验严谨性。

引言

工程化心肌组织模型具有多种几何形状和构型，可用于模拟传统二维细胞培养难以实现的天然心肌微环境的各个方面。其中最常见的构型之一是线性组织条带，其两端带有柔性锚点，可诱导组织自组装，并为组织提供明确定义的预负荷以及相应收缩力的读出信号,1,2,3,4,5,6,7,8,9,10,11,12,13,14,15,16,17,18,19,20,21
,22,23,24,25,26,27。所产生的力可通过光学追踪组织缩短过程，并结合弹性梁理论，利用测得的挠度和锚点的弹簧常数来计算得出1,2,3,4,5,6,7,8,9,10,11,12,13,14,15,16,17,18,19,20,
21,22,25,26,28。

然而，心脏组织工程仍是一个不断发展的领域，尚存一些挑战。每种模型系统都需要专用设备，例如定制的生物反应器和功能评估装置10,29,30,31。由于实验流程繁琐、所需细胞数量多以及组织脆弱，这些构建物的微环境在尺寸和复杂性上常常受限于通量较低的问题。为应对这一挑战，一些研究团队转向制备仅包含数百至数千个细胞的微组织，以促进适用于药物发现的高通量检测。然而，这种缩小的尺度使得功能的准确评估更加复杂12，并消除了天然心脏微环境的关键特征（如营养物质/氧气扩散梯度和复杂的结构36），同时也限制了可用于后续分子和结构分析的材料量（通常需要将多个组织合并）。表1总结了文献中线性组织条模型的一些构型1,2,3,4,5,6,7,8,9,10,11,12,13,14,15,16,17,18,19,20,
21,22,23,24,25,26,37,38,39,40。

组别每组织细胞数每板组织数板型格式锚定特征功能数据采集方法共用培养基浴？原位功能测量？
Yoshida (ECT)38400万6改良6孔板*力传感器直接测力否否
Chan (hESC-CM-ECTs)2631万6定制6孔培养皿 PDMS柱直接测力是否
Feinberg (dyn-EHT)16150万6定制6孔培养皿 PDMS丝组织形态否是
RADISIC (BioWire)39, 4011万8聚合物丝丝线形态是是
Costa (单个hECT)1, 2100万–200万4**10 cm培养皿**PDMS柱光学偏转（边缘/物体追踪）是是
Costa (多hECT)3–950万–100万66 cm培养皿PDMS柱光学偏转（边缘/物体追踪）是是
Costa (带SPoT的多hECT)100万66 cm培养皿带黑色帽的PDMS柱光学偏转（物体追踪）是是
Passier (EHT)1724.5万3612孔板带黑色帽的PDMS柱光学偏转（物体追踪）是是
Vunjak-Novakovic13, 18100万126 cm培养皿带帽的PDMS柱光学偏转（边缘检测）是是
Vunjak-Novakovic (MilliPillar)1455万6定制6孔培养皿 带帽的PDMS柱光学偏转（物体追踪）；钙成像否是
Eschenhagen (EHT)10, 19–21100万1212孔板带帽的PDMS柱光学偏转（柱偏转的边缘检测）；钙成像否是
Zandstra (CaMiRi)222.5万–15万9696孔板带钩的PDMS柱光学偏转（边缘检测）否是
Murry23, 2490万2424孔板带帽的PDMS柱，集成磁体磁传感器否是
Reich (µTUG)11, 12, 25未定义156156孔培养皿带帽的PDMS柱，集成磁体光学追踪（荧光微珠）是是

表1：文献中部分线性工程化心肌组织模型的特征。线性工程化心肌组织模型在尺寸、通量、锚定结构设计、共用培养基浴的便利性，以及功能表征是否需要独立的肌肉浴系统方面存在差异。* 研究人员使用了一种基于标准6孔板尺寸的市售工程化组织系统。 ** 一种模块化系统，其中单个组织生物反应器可根据需要固定在任意塑料培养皿中的指定数量和位置。

本文介绍了我们已建立的线性人源工程化心肌组织（hECT）模型的最新制备方案1,2,3,4,5,6,7,8,9,15,27，以及评估hECT收缩功能的方法。每个可容纳多组织的生物反应器可在共用的培养基环境中同时培养最多六个hECT，其结构由两个固定在刚性聚砜框架上的硅基弹性体聚二甲基硅氧烷（PDMS）制成的"支架"部件组成。每个PDMS支架包含六个 柔性的 集成式测力柱，测力柱直径为0.5 mm，长度为3.25 mm；两个支架共同构成六对测力柱，每对用于固定一个hECT。将生物反应器倒置有助于克服因培养基水分冷凝或气液界面弯月面畸变而对从下方观察hECT造成的视觉干扰。hECT每次收缩均会引起末端集成测力柱的偏转，通过光学手段测量该偏转信号，并将其处理为力-时间曲线，以表征hECT的收缩功能1,2,3,4,5,6,7,8,9,15,27。与通常用于此类尺寸组织的单组织生物反应器相比，多组织设计提高了实验通量，并支持对具有潜在不同细胞组成的相邻组织之间的旁分泌信号进行研究。该系统已在已发表的研究中得到验证，相关应用包括疾病建模4,8、旁分泌信号研究6,7、异质细胞共培养5,9以及药物筛选7,9。

在此系统中，人工程化心肌组织（hECT）被设计为长约6 mm、直径约0.5 mm，以实现低噪声条件下对力测量的稳定光学追踪。此外，组织复杂性（如扩散梯度和细胞排列）与每块组织仅需100万个细胞的可操作性需求之间达到了平衡。利用标准的CCD相机技术，低至1 µN的力（对应小于5 µm的支柱偏转）即可产生清晰信号，从而确保即使是一些hECT疾病模型中观察到的极微弱收缩功能，也能被精确测量。该系统还支持对单次收缩力曲线进行详细分析，进而实现对多达16项收缩性指标的高通量分析41，包括主动收缩力、收缩速率（+dF/dt）、舒张速率（−dF/dt）以及搏动节律变异性。

本方案首先介绍生物反应器组件的制备方法。特别关注如何提高人工程化心脏组织（hECT）的产量、降低组织功能的技术变异性，以及优化组织评估的质量和深度。尽管组织制备和长期测试过程中的组织丢失是该领域公认的技术难题，并会降低研究的通量和效率，但大多数心脏组织工程研究并未报告组织丢失率27。本文所述的组织工程方法经过多年优化，可确保在大多数生物反应器中保留全部hECT（无论PDMS支架的制备方式如何）。然而，即使出现5%–20%的组织丢失，也可能显著影响统计效能，尤其是在细胞数量受限的小规模实验中（例如，某些疾病细胞系在分化过程中存在困难4，或商业化心肌细胞价格昂贵），或因处理条件受限（例如，各种处理化合物供应有限或成本较高）的情况下。

本方案描述了稳定型后部追踪器（SPoTs）的制备方法，这是PDMS支架的一种新特性，作为力传感微柱末端的帽状结构，用于固定人心外膜组织（hECTs）27。研究表明，这种帽状结构的几何形状显著减少了hECT从微柱上脱落或被拉脱的损失，从而为在不同刚度和张力条件下培养hECT提供了新的可能，而这些条件在无帽微柱上培养时具有挑战性。此外，SPoTs提供了一个高对比度的物体，其形状一致且定义明确，有助于提高对hECT收缩进行光学追踪的准确性27。随后，本文介绍了基于先前已发表方案的人诱导多能干细胞（iPSCs）的培养与心肌细胞分化方法3,42,43，以及hECT的制备、培养和功能检测的详细说明。

本文还强调了在生理温度下测量组织功能的重要性。人类心肌组织（包括胎儿期以及成年健康和病变组织）以及多种动物物种（包括大鼠、猫、小鼠、雪貂和兔）的心脏组织44,45在28 °C–32 °C时表现出与频率匹配的收缩力显著增强，相较于生理温度，这一现象被称为低温正性肌力效应45,46。然而，温度对工程化心肌组织功能的影响仍研究不足。目前文献中许多近期开发的工程化心脏组织模型被设计为在37 °C下进行功能评估，以模拟生理条件13,14,37。但据我们所知，工程化心脏组织收缩力的温度依赖性效应尚未得到系统研究。本方案描述了一种起搏电极设计，可在测试过程中最大限度减少热量散失，同时允许在实验装置中集成绝缘加热元件，从而在不破坏无菌条件的情况下将人源工程化心肌组织（hECTs）维持在生理温度27。随后，我们报告了温度对hECT功能的一些观察效应，包括收缩力、自发搏动频率、+dF/dt和−dF/dt的变化。总体而言，本文提供了制造该多组织力传感生物反应器系统的全部细节，可用于构建人源工程化心脏组织并评估其收缩功能，并提供了一组数据，为室温与37 °C下的测量结果比较奠定了基础27。

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方案

本方案使用了一株去标识化的诱导多能干细胞系SkiPS 31.3（最初利用一名健康45岁男性皮肤成纤维细胞重编程获得）47，因此根据本机构人类研究伦理委员会的指南，无需经过特定的机构审查委员会批准。所有细胞和人胚胎类囊胚结构（hECT）操作均须在配备HEPA过滤器的II级生物安全柜或层流工作台中无菌条件下进行。所有非无菌溶液均须通过0.22 µm滤膜过滤灭菌，并将所有细胞和hECTs置于37 °C、95%相对湿度、5% CO2的培养箱中维持培养。

1. 生物反应器的制备

  1. 生物反应器组件及铝制母模的制备
    注意：计算机辅助设计（CAD）文件见补充文件1。本实验方案可在这些步骤之间的任意位置暂停。建议聘请专业机械师来加工本节所述的母模，因为需要高精度（≤5 µm）和光滑的表面，以确保后续结构的准确性，并使聚砜框架能够与聚四氟乙烯（PTFE）底板实现良好的压配合（目标为紧密的摩擦配合，但不过紧）。
    1. 使用数控（CNC）铣床，根据图1A中的示意图，用PTFE材料加工底板。人工程化心脏组织（hECTs）将在六个等距排列的孔中形成（白色箭头所示）。
    2. 使用数控（CNC）铣床，根据图1B中的示意图，用铝材加工聚二甲基硅氧烷（PDMS）支架的负型母模，包含三个框架支撑结构（绿色星号）。钻出六个等距分布、直径为0.5 mm的孔（品红色箭头），用于形成PDMS柱。
    3. 使用数控（CNC）铣床，根据图1C中的示意图，用聚砜材料加工生物反应器框架。框架支撑结构（绿色星号）应与支架母模中的框架支撑结构相对应（见图1B，绿色星号）。
    4. 使用数控（CNC）铣床，根据图1D中的示意图，用铝材加工铝制母模夹具。每个槽内包含一个高0.25 mm的三角形凸台（橙色三角形），用于在PDMS支架母模（图1B，品红色箭头）的孔中提供一个空腔，使PDMS能够流过。
  2. 使用铝制负型母模浇铸PDMS支架
    1. 使用热塑性熔融沉积成型3D打印机，打印两个PDMS支架浇铸装置的支架（补充文件1）。打印参数如下：层高为0.1 mm，壁/底/顶厚度为1 mm，填充密度为90%，三角形填充，打印温度为230 °C，打印平台温度为70 °C，并添加边缘以增强附着力。
    2. 将四个铝制负型母模放入母模夹具中（图2AI），使柱孔与三角形凸台对面的空腔对齐（见图1D）。用一块0.5 mm厚的矩形硅胶片（图2B，白色箭头）包裹装置作为密封垫，防止液态PDMS泄漏，并使用螺钉夹具将装置夹紧在两个平行的3D打印支架之间。
    3. 在浅容器中，将0.5 mL PDMS固化剂加入5 mL PDMS弹性体基础液中（按1:10比例，遵循制造商说明），剧烈搅拌5分钟。将PDMS混合物放入真空室中脱气，在室温下施加强真空（0.1–1 kPa）20–60分钟，直至气泡完全消失。
    4. 将PDMS混合物倒入浇铸装置中，过量填充以确保每个槽完全覆盖（图2AII）。如需对每个PDMS支架进行唯一标识，可在PDMS支架主体中加入少量彩色玻璃珠（图2AII），位置位于柱体的对面（图2B）。将浇铸装置放回真空室（确保其水平放置），施加强真空至少12小时。在无尘环境中室温静置约48小时，使PDMS完全固化，并确保细小柱体达到最大强度。避免使用烘箱，以免导致3D打印部件变形。
      注意：本实验方案可在此处暂停。
  3. 从铝制负型母模中取出PDMS支架
    1. 拆除夹具、支架和硅胶片。使用不锈钢剃刀片修剪掉浇铸装置顶部和框架支撑上的PDMS薄膜，并用手轻轻将PDMS支架从母模夹具侧面分离。将钝头不锈钢刀片插入母模与夹具之间的空腔中，撬开两者（图2CI，II），确保填充空腔的PDMS保留在夹具上（因其与柱体相连）。使用锋利的不锈钢刀片切除剩余的PDMS薄膜，并从柱体尖端切除空腔中的PDMS（图2C III–V）。
    2. 关键步骤：将PDMS支架从母模中完全分离（图2D）。从无柱体的一侧开始，用手缓慢将PDMS支架从母模上剥离，交替操作两侧，直至所有柱体完全脱离母模。
    3. 重复上一步骤，直至所有PDMS支架和柱体均被释放。使用锋利的刀片修剪支架上任何残留的多余PDMS。最终得到一个PDMS支架（图2E），其具有六个完整的柱体（橙色箭头）和用于识别的彩色珠子（蓝色箭头）。
      注意：本实验方案可在此处暂停。
  4. 稳定柱体追踪器（SPoT）的制备
    1. 使用热塑性熔融沉积成型3D打印机，打印SPoT浇铸装置的各个部件（补充文件2及图3AI，II）。打印参数如下：层高为0.1 mm，壁/底/顶厚度为1 mm，填充密度为80%，三角形填充，打印温度为230 °C，打印平台温度为70 °C，并添加边缘以增强附着力。
    2. 确保3D打印部件之间以及PDMS支架与三叉夹具之间具有牢固的压配合，并确认PDMS支架安装后柱体恰好到达孔底且无弯曲。如有必要，可对塑料部件进行修整或打磨。
    3. 在小型称量皿（或类似的小型浅容器）中，将0.5 mL黑色PDMS A组分与0.5 mL B组分（按1:1比例，遵循制造商说明）混合，充分搅拌至颜色均匀。将混合后的黑色PDMS放入真空室中，在强真空下脱气20分钟。将脱气后的黑色PDMS倒入3D打印底板中，填满孔洞，并轻敲以确保无气泡残留。尽可能刮除底板上多余的PDMS。
    4. 将三叉部件卡入底板，并将PDMS支架放入三叉夹具的凹槽中（图3AII，青色矩形），确保柱体末端浸入圆形孔中的黑色PDMS中（图3B，C）。在室温下避尘静置48小时，使黑色PDMS完全固化。
      注意：本实验方案可在此处暂停。
    5. 滑出三叉部件，尽量减少对柱体的拉力。使用小型镊子刮除围绕每个SPoT的黑色PDMS薄膜；然后，将细尖弯头镊子插入SPoT孔中，将其从3D打印底板上分离（图3D）。
    6. 检查SPoT（图3E），并使用精细Vannas剪刀修剪掉在步骤1.4.5中未清除的任何残留黑色PDMS薄膜。通过将PDMS支架安装到聚砜框架上，再将整体滑入黑色底板中，确认最终柱体长度是否正确（图4A）。
      注意：本实验方案可在此处暂停。
    7. 配对PDMS支架，并通过框架卡扣将其安装到框架上（图4A）。将装置连同PTFE底板一起装入袋中进行高压灭菌，至少运行30分钟循环（温度<122 °C，以减少变形）。

figure-protocol-1
图 1：hECT 生物反应器组件。（A）聚四氟乙烯（PTFE）基板的俯视图（左）和侧视图（右），基板上设有六个等距排列的孔，用于构建人源工程化心肌组织（hECT）（白色箭头所示）。（B）用于制备聚二甲基硅氧烷（PDMS）支架的铝制阴模铸型的侧视图（左）和俯视图（右），其上具有六个等距排列的柱状凸起（品红色箭头所示）以及三个用于连接生物反应器框架的缺口（绿色星号所示）。（C）用于PDMS支架的聚砜框架的侧视图（左）和底视图（右），其上具有三个等距分布的框架支撑结构（绿色星号所示），与PDMS支架铸型（图B）中的框架支撑位置相对应。（D）铝制铸型夹具的俯视图（上）和侧视图（下），夹具上有四个用于放置PDMS支架铸型的槽，每个槽均带有一个高0.25 mm的三角形凸缘（最左侧凸缘以橙色高亮显示）。本图经 van Neste27 修改。缩写：hECT = 人源工程化心肌组织；Ø = 直径；PTFE = 聚四氟乙烯；PDMS = 聚二甲基硅氧烷；R = 半径。 请点击此处查看此图的放大版本。

figure-protocol-2
图 2：PDMS 支架的制备。（A）CAD 渲染图显示了铸模装置的斜视图。（I）将负模 PDMS 支架母模插入铸模夹具的四个槽中，使形成 PDMS 柱的孔（品红色箭头）位于三角形支架对面的死区上方（图 1D，橙色三角形）。（II）将 PDMS 倒入负模母模的每个型腔中。（III）向未固化的 PDMS 中加入彩色微珠，作为颜色编码的识别系统。（B）照片显示组装好的 PDMS 支架铸模装置，其两侧用两个 3D 打印的支架夹紧，并通过螺钉夹具固定，夹紧的两侧包裹有 0.5 mm 厚的硅胶片（白色箭头）以密封。彩色微珠的放置位置应确保不覆盖形成柱体的直径为 0.5 mm 的孔（品红色箭头）。（C）PDMS 固化后，将模具从铸模夹具中取出。（I）将钝化的不锈钢剃须刀片或类似的薄金属工具插入模具与铸模夹具之间，以撬开模具（II）。（III）PDMS 流经柱孔时形成的薄膜（青绿色括号）附着在柱尖端，必须使用锋利刀片将其切除（IV、V）。（D）将 PDMS 支架从模具上分离。（E）照片显示嵌入玻璃微珠用于识别（蓝色箭头）的 PDMS 支架的斜视图（上）、侧视图（中）和底视图（下）。柱的尖端（橙色箭头）已用黑色墨水标记。比例尺 = 1 cm。本图改编自 van Neste27。缩写：CAD = 计算机辅助设计；PDMS = 聚二甲基硅氧烷。请点击此处查看此图的放大版本。

figure-protocol-3
图3：SPoT的制备。（A）计算机辅助设计（CAD）示意图，显示SPoT铸造夹具的（I）底座和（II）三叉部件的关键尺寸。（AI，黑色箭头）圆形SPoT模具的尺寸设定为深0.2 mm、直径1.2 mm，每个模具用于容纳单个SPoT的黑色聚二甲基硅氧烷（PDMS）。俯视图中可见的11.1 mm × 27 mm平台（AII，顶部，青色矩形）向下凹陷0.4 mm（如下方侧视图所示），用于在固化过程中固定PDMS支架。（B）CAD示意图显示SPoT铸造装置的组装方式。（C）组装完成的SPoT铸造装置实物照片。（D）PDMS固化后，将三叉夹具从PDMS支架下方滑出，并使用精细镊子将SPoT从孔中取出。（E）PDMS支架无SPoT（上）和有SPoT（下）的照片。插图显示柱状结构的放大视图。比例尺 = 1 cm（E），2.5 cm（E中的放大图像）。本图改编自van Neste27。缩写：CAD = computer-aided design；Ø = 直径；PDMS = polydimethylsiloxane；R = 半径；SPoT = stable post tracker。 请点击此处查看该图的放大版本。

2. 细胞培养

  1. 诱导多能干细胞（iPSC）的培养
    注意：不同的细胞系可能需要调整传代稀释比例、传代频率和/或培养基添加剂的滴定浓度。
    1. 使用合格的基底膜基质（按照生产商说明书，用1:1的DMEM/F12培养基稀释）包被细胞培养处理过的6孔板，在37 °C孵育至少30分钟。根据生产商说明书配制500 mL iPSC培养基，并加入5 mL青霉素-链霉素储备液（10,000 IU/mL至10,000 µg/mL）。
    2. 传代iPSC时，吸除孔中培养基，每孔用1 mL磷酸盐缓冲液（PBS）洗涤一次。每孔加入1 mL iPSC解离液，在超净台中孵育1分钟。
    3. 吸除iPSC解离液，将细胞在37 °C（无任何培养基）孵育5分钟。每孔加入1 mL含2 µM噻唑紫定（thiazovivin）的iPSC培养基以中和解离液。
    4. 使用2 mL移液管将细胞集落解离为约含10个细胞的团块，再用额外1 mL含2 µM噻唑紫定的iPSC培养基洗涤每孔。将2 mL细胞悬液接种至新包被了基底膜基质的6孔板中（步骤2.1.1）。
    5. 24小时后，移除培养基，更换为新鲜的iPSC培养基（不含噻唑紫定）。每48小时用2 mL iPSC培养基换液一次，或每72小时用4 mL培养基换液一次。当细胞达到80%融合度时，以1:6的比例进行传代，每3天传代一次 。
      注意：不同细胞系可能需要调整稀释比例和传代频率。
  2. 心肌细胞分化
    1. 当iPSC单层细胞融合度达到80%–90%时，开始诱导分化。
    2. 通过向500 mL RPMI 1640培养基中加入10 mL不含胰岛素的B27补充剂和5 mL青霉素-链霉素储备液，配制分化培养基。通过向500 mL RPMI 1640培养基中加入10 mL含胰岛素的B27补充剂和5 mL青霉素-链霉素储备液，配制心肌细胞维持培养基。
      注意：分化培养基和心肌细胞维持培养基可在4 °C保存最多2周。
    3. 第0天：用1 mL DMEM/F12洗涤细胞，每孔加入2 mL含10 µM CHIR99021和稀释基底膜基质的分化培养基。
    4. 第1天：24小时后，或当细胞融合度降至70%以下时，用1 mL DMEM/F12洗涤细胞，加入2 mL分化培养基，继续孵育48小时。
    5. 第3–4天：用1 mL DMEM/F12洗涤细胞，加入2 mL含5 µM IWR-1的分化培养基。第4天重复一次。
    6. 第5–6天：用1 mL DMEM/F12洗涤细胞，加入2 mL分化培养基。第6天重复一次。
    7. 第7–10天：用1 mL DMEM/F12洗涤细胞，加入2 mL心肌细胞维持培养基。每24小时重复一次。
    8. 第11天及以后：每48–72小时更换为4 mL新鲜的心肌细胞维持培养基。吸液和加液时动作应缓慢，避免损伤剧烈搏动的单层细胞。

3. hECT 培养

  1. 心肌细胞的收获
    1. 在诱导分化后的第8至60天收获心肌细胞单层，用于hECT的制备。预期每孔可获得200万至500万个细胞。
      注意：若细胞在第10天仍未开始搏动，则分化很可能不成功。强烈搏动的单层细胞常在分化第11至15天后从培养板上脱落，并收缩形成致密组织。建议在此时使用或重新铺板这些细胞。
    2. 用2 mL PBS将每孔心肌细胞清洗两次。每孔加入1 mL室温的0.25%胰蛋白酶-EDTA溶液。于37 °C孵育5–10分钟，直至细胞变圆，并在轻敲培养板时可脱落。
    3. 每孔加入1 mL含10% FBS的心肌细胞维持培养基以中和消化作用。使用5 mL移液管头轻轻吹打单层细胞，转移至50 mL锥形管中，使细胞团块分散为含10–20个细胞的小聚集体。
    4. 在转移10 µL细胞悬液与10 µL台盼蓝混合前，通过倒置锥形管混匀细胞悬液。使用自动细胞计数仪或玻璃血细胞计数板进行细胞计数。若无需使用全部细胞，或需预留部分细胞用于流式细胞术分析，则应适当分装细胞悬液。
      注意：此时可加入辅助细胞（如成纤维细胞）。
    5. 以250 × g离心5分钟。立即尽可能吸除上清液，避免扰动细胞沉淀，并将沉淀置于冰上。操作应迅速，以尽量减少细胞在沉淀状态下的时间。
  2. hECT的制备
    1. 参照表2中的体积，并根据细胞沉淀中的细胞数量进行调整，使每个hECT含有100万个细胞。每步操作后均需缓慢吹打混匀，避免产生气泡。
      注意：步骤3.2.2–3.2.3需避光操作，因部分组分对光敏感。
    2. 在1.7 mL微量离心管中配制2.9 g/mL I型胶原溶液：加入13.442 µL蒸馏水、4.4 µL 10× PBS和0.638 µL 1 M NaOH。再加入25.52 µL 5 mg/mL胶原储备液，缓慢混匀。
    3. 配制细胞外基质混合液（表2中的ECM混合液）：依次加入5.5 µL 0.2 N pH 9 HEPES溶液和5.5 µL 10× MEM，充分混匀直至呈现均匀的浅黄色至浅粉色。取35.2 µL ECM混合液加入细胞沉淀中，再加入4.4 µL基底膜基质。
    4. 打开已灭菌的生物反应器组件袋（步骤1.4.7，图4A）。佩戴经70%乙醇消毒的手套，从灭菌袋中取出黑色底板，放入60 mm培养皿中，使孔面朝上。缓慢向每孔加入44 µL细胞混合液，避免引入气泡。如有必要，使用移液器移除因移液操作或PTFE材料疏水性而产生的气泡。调整hECT体积，使液面与孔口齐平（图4BI）。
    5. 更换一副无菌手套，从灭菌袋中取出带有PDMS支架的聚砜框架。将框架轻轻放置在底板上，使框架两端嵌入底板末端的凹槽中（图4BII、III）。检查生物反应器，确保所有支柱垂直且框架无倾斜，然后将其放入60 mm培养皿中。
    6. 向60 mm培养皿中加入1 mL含10% FBS的心肌细胞维持培养基（注意不要扰动hECT），以提高培养皿内湿度，促进hECT固化。将无盖的60 mm培养皿放入高壁（20 mm高）的100 mm培养皿中，盖上100 mm培养皿盖，然后将生物反应器放回37 °C、5% CO2培养箱，使胶原在细胞悬浮状态下形成凝胶。
    7. 2小时后，从培养箱中取出培养皿。加入13 mL含10% FBS的心肌细胞维持培养基，倾斜培养皿以促使培养基流入PTFE底板与PDMS支架之间。
    8. 从侧面检查生物反应器，确保PTFE底板与PDMS支架的疏水表面之间无气泡滞留，然后将培养皿放回培养箱。若存在滞留气泡，可将生物反应器倾斜出液面使气泡破裂，再缓慢放回；或使用带凝胶加样头的微量移液器虹吸排出空气，注意不要扰动支柱。
  3. 底板移除
    1. 通过框架间隙观察hECT的收缩情况。在24–96小时内，hECT逐渐收缩并变得更为不透明（图4CI–III）。当hECT与底板壁之间出现明显间隙时（图4CII），进行两次半量换液，将培养基更换为不含FBS的心肌细胞维持培养基。当hECT的直径较原始直径收缩至少30%时（图4CIII），移除底板。向含有生物反应器的60 mm培养皿中加满心肌细胞维持培养基，使液面与皿口齐平，并向新的60 mm培养皿中加入14 mL培养基。
    2. 关键步骤：佩戴无菌手套，将生物反应器连同培养皿一起翻转，使底板朝上（图4BIV）。参照步骤3.2.8检查是否有气泡滞留。缓慢抬起底板，保持其水平（图4BV）。
    3. 若在移除底板过程中hECT脱落但仍留在底板上，可使用无菌弯头精细镊子将hECT从底板转移至60 mm培养皿中。用镊子引导hECT的一端靠近支柱，再用另一把镊子固定支柱，将hECT穿入支柱孔中。如有必要，对第二个支柱重复此操作。
    4. 当所有hECT均固定在支柱上后，将带有hECT的框架转移至新的60 mm培养皿中，使支柱朝下放置（图4BVI）。检查生物反应器，确保hECT仍位于支柱上，紧邻SPoT位置。
    5. 若hECT因表面张力被推至支柱底部，可用一对无菌弯头镊子稳定框架。将另一对镊子从框架槽口插入，保持闭合状态。当镊子尖端降至PDMS支架下方后，旋转镊子使其接触支柱，并用闭合的镊尖轻轻将hECT推向支柱末端，直至其落在SPoT上（图4BVI，插图）。
  4. hECT的维持培养
    1. 每24–48小时使用心肌细胞维持培养基进行半量换液（培养2周后，可减少至每周两次）。
    2. 当hECT在第3天左右出现自发性搏动簇，第5天出现可见支柱偏转的协调性搏动时，即可开始功能检测，并可根据需要重复检测。
      注意：若hECT在第7天仍未出现协调性搏动，则后续出现的可能性极低。
组分体积 (μL)
蒸馏 H2O13.4422.9 mg/mL 胶原蛋白溶液“ECM 混合物”终末 hECT 细胞混合物
1N NaOH0.638
10x PBS4.4
5 mg/mL 胶原蛋白储备液25.52
0.2 N pH 9 HEPES5.5
10x MEM5.5
转移至细胞沉淀的 ECM 混合物体积35.2
Matrigel 体积4.4

表2：hECT试剂。 应按列表顺序添加各组分，并置于冰上保存。

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图4：生物反应器组装及人源工程化心肌组织（hECT）制备。（A）（I）两个聚二甲基硅氧烷（PDMS）支架（左侧，浅蓝色）安装在聚砜框架（右侧，棕褐色）上。（II）聚四氟乙烯（PTFE）底板（黑色，左侧）随后安装至框架（右侧），使每对支柱嵌入底板的孔中。（B）（I）将44 µL心肌细胞悬浮液加入基于胶原的细胞外基质中，分别加入底板的六个孔内。（II、III）将带有PDMS支架的框架压合到底板上。1–4天后，可将hECT从底板上取下。（IV）首先将生物反应器翻转，然后（V）将底板从框架上取下。（VI）生物反应器的侧视图，显示六个hECT。插图：放大视图，显示hECT在支柱上的位置相对于稳定支柱追踪器（SPoT）的位置（插图）。（C）计算机辅助设计（CAD）渲染图，显示通过聚砜框架间隙观察到的hECT收缩程度的三个水平（[I] 低、[II] 中、[III] 高）。本图改编自van Neste27。缩写：CAD = 计算机辅助设计；PDMS = 聚二甲基硅氧烷；PTFE = 聚四氟乙烯；SPoT = 稳定支柱追踪器；hECT = 人源工程化心肌组织。请点击此处查看该图的放大版本。

4. hECT 起搏设备

  1. 加热载物台外套
    1. 使用激光切割机从厚度为0.635 cm的透明亚克力板上切割出丙烯酸绝缘护套的各个部件（补充文件 3），各一个 图 5A- D，以及各两个 图5E，F.
    2. 组装部件（B), (C), (D），以及（E）来自 图5，并使用丙烯酸胶水粘合，如图所示 图5GI. 安装顶板（图 5GII），让胶水固化数小时，然后将加热台滑入夹套侧面（图 5GIII).
    3. 外套安装到位后，使用胶带将插件固定在加热载物台的腿部之间，并安装前面板（图 5GIV）以完成组装（图 5GV).
  2. 石墨电极的制备
    1. 使用带锯将6.25 mm厚、25 mm宽的石墨棒切割成35 mm长的块状；然后沿长度方向以曲线切割每个块，使每个电极一端高度为13–16 mm，另一端高度为8–10 mm。在上角钻两个直径为0.7 mm的孔图6AI）。用纸巾擦拭石墨片，并在水中超声处理20分钟以去除石墨粉尘。确保电极卡在培养皿壁与25 mm宽的生物反应器之间，以保证电极之间距离的一致性（图 6AII).
    2. 将一根长150 mm、直径0.25 mm的钢丝穿过电极上的孔，并将其弯曲，使其能够贴合60 mm培养皿的边缘并环绕100 mm培养皿的壁，以便盖上皿盖（图 6AII).
    3. 每次使用后，将电极浸泡于蒸馏水中 1–2 小时以去除吸附的培养基，随后过夜晾干，再进行高压灭菌处理 132 °C 30分钟。开始测量前，将一个电极放置在生物反应器的两侧图6AII将导线放置妥当，确保100 mm培养皿盖能够闭合，然后将生物反应器放回培养箱中平衡。

figure-protocol-5
图5：用于隔热加热玻璃载台的亚克力外壳。 CAD图像展示了为玻璃载台设计的亚克力外壳各部件的关键尺寸。(A) 顶板上开有一个27 cm × 18.5 cm的孔，以便生物反应器皿放置在加热元件上。角落中的橙色矩形表示建议放置小间隔块的位置，以在夹克顶部与加热元件之间留出空间。(B) 外壳底板上有两个切口，用于加热台的支腿插入（绿色星号）。(C&D) 两个侧板安装在顶板下方。(D) 左侧板包含一个3 cm × 0.3 cm的切口（插图），用于穿过载台电源线。(E) 长条形面板安装在前部和后部。(F) 将玻璃台放入外壳后，插入填充件以填补间隙。(G) (I) 侧板和后板连接到底板上，然后(II) 安装顶板。(III) 将玻璃台滑入外壳中（品红色箭头）。(IV) 在台面支腿之间安装插入件，后板则贴合开口以封闭箱体。(V) 完成的外壳组件。该图改编自van Neste27。缩写：CAD = 计算机辅助设计；R = 半径；Ø = 直径。 请点击此处查看此图的放大版本。

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图6：人源工程化心肌组织（hECT）收缩的数据采集。（A）（I）从石墨棒上切割而成的电极照片。品红色箭头指示用于连接不锈钢导线的孔洞。比例尺 = 1 cm。（II）斜视图（左）和俯视图（右），显示石墨电极在生物反应器中的放置方式。电极置于25 mm宽的生物反应器与培养皿壁之间，以确保电极间距一致。导线弯曲设计以便关闭培养皿盖子。（B）在层流洁净台内hECT起搏装置的照片——所有设备均放置于隔振台上，以减少洁净台产生的振动噪声。生物反应器（品红色箭头指示）置于带夹套的加热载物台上，并由上方LED光源照明。解剖显微镜水平对准直角反射镜（橙色星号），以从下方观察生物反应器，并配备有CCD相机（左侧）。青色支架指示用于持续温度监测的水浴装置，可向闭环加热载物台控制器提供反馈信号。本图改编自van Neste27。缩写：hECT = human engineered cardiac tissue；LED = light-emitting diode。请点击此处查看该图的放大版本。

5. hECT 功能测定

  1. 设置起搏工作区
    1. 打开加热载物台 39.5 °C，并根据要求将起搏设备安装在层流洁净台内的防振台上 图6B将解剖显微镜安装在臂架支架上，并使其对准一个直角反射镜图6B，橙色星号）放置在玻璃台下方的升降架上，以便从下方观察生物反应器。将高速CCD相机固定在显微镜上，并连接至计算机。用紫外光照射装置15分钟，以对工作区域进行灭菌。
    2. 将生物反应器（图6B，品红色箭头所示）置于带夹套的加热载物台上，由上方双头鹅颈式LED光源照射（与光纤灯相比，LED灯的灯颈可更牢固地固定在主机上）。为尽量减少额外噪声，需确保振动台上的起搏设备（以及振动台本身）不与层流洁净台的任何部分接触。
    3. 将第二个装有预热蒸馏水的60 mm培养皿放入100 mm培养皿中，并置于加热台上图6B，青色括号），并配备温度探针以持续监测温度。根据需要调节加热载物台的温度设定，使参考培养皿的温度维持在36-37 °C.
    4. 将显微镜放大倍数设置为1.5倍（或选择其他合适的放大倍数，以确保能够以足够的分辨率完整观察到hECT）。
  2. 调整相机设置
    1. 打开相机软件。调整视频画面大小，尽可能裁剪视野，同时确保完整显示整个hECT。这可以最大化相机速度。
    2. 设定 捕获率 到 每秒90帧. 调整 曝光时间 和 光源位置 优化视野内照明条件的均匀性，并最大限度提高SPoTs的对比度。
  3. 采集软件设置
    1. 打开方波刺激器，并将其连接到计算机。调整参数设置以输出 双相脉冲 与一个 振幅 的 12 V 和一个 持续时间 的 5 ms.
    2. 打开数据采集软件，然后打开 "AutomatedPostTracking3.vi" 文件（补充文件 4）。加载后，点击 白色箭头 在 左侧 工具栏上的按钮以初始化程序（图7A).
    3. 使用放置在加热载物台上的玻璃血细胞计数板校准软件。在工具栏中图7B），点击 线条工具 在血细胞计数板刻度上画一条横线，长度为1 mm（未示出）。在 距离校准（像素/毫米） 盒图7C），设定 参考长度（mm） 到 1，然后点击 计算 按钮
    4. 使用以下方法测量hECT的横截面积： 线条工具 在组织的宽度方向上画一条线。单击 1 在 横截面积（mm^2） 盒图7D）以计算面积（假设线性组织条呈圆柱形几何结构，该假设已在文献中确立1,2,3,4,5,6,7,8,9,10,11,12,15,16,18,19,20,
      21,22,23,24,25,26,37,38）。在hECT的不同部位重复上述操作，并将数值记录在框内另外两个按钮下方。输出的数据表文件将报告这三个数值的平均值，用于计算组织的直径。
  4. hECT功能表征
    1. 确保柱尖处于焦点位置。打开 阈值开关 (图7E），并调节滑块（图7F）直至SPoTs（图7G) 界限清晰，在 hECT 收缩时形状保持不变。
    2. 使用 矩形工具 在其中一个斑点（SpoT）周围绘制一个矩形图7，绿色矩形），然后单击 第1组 按钮内部 后边界 盒图 7H) 以设定围绕 SPoT 的矩形区域位置，确保 SPoT 始终位于矩形边界内。对另一个桩重复此操作，并记录下来 第2组.
    3. 调节 物体尺寸设置 (图7I）以防止程序追踪较小的物体。确保 追踪对象数量 每个矩形中保持不变 恒定的. 界面（图7J) 显示被追踪物体间实时测量的距离。利用此图监控噪声。
    4. 选择一个目录以保存文件（图7K）。将不同日期的数据分别存储在不同的文件夹中。选择当前 组织编号，并在其中写下任何希望添加的评论 评论 盒子
    5. 在……之下 起搏频率（Hz） 页眉图7L），表明 频率范围 期望的分钟 和 Max，以及所需 间隔 从最小值到最大值进行步进。若在整个捕获范围内对hECTs进行起搏，需测试不同的起搏频率以找到 最低频率 在……时 1:1 刺激：峰值比 实现后，继续 增加 频率直到该点 比例丢失测量 自发功能 通过选择一个任意的 频率范围 例如， 0.01 赫兹到 0.01 赫兹（Hz）并保持 方波脉冲刺激器输出关闭.
    6. 在右侧的框中，选择所需的 凝固时间（s） （在设定频率后但尚未记录数据的时间间隔），以使hECT适应新的起搏频率。指定 记录时间（s） 和 起搏电压（V）. 通过点击开始程序 启动程序 按钮（图7M).
      注意：结果将自动保存在选定的目录中。每次记录后，观察脚本显示的数据傅里叶变换（图7N），其中峰值对应于检测到的搏动频率。
    7. 如果需要，运行 "激发阈值测定" 用于确定刺激可见 hECT 所需最低电压的程序图7O）。如有需要，可计算柱体的最大和最小偏转量（图7P).

figure-protocol-7
图7：偏转后数据采集界面。（A） 运行软件的按钮。（B）工具栏，包含用于长度测量的直线工具和用于对象选择的矩形工具。（C）距离校准控制。（D）用于测量hECT横截面积的工具，可在三个不同位置进行测量。（E）阈值切换开关和（F）滑块，用于实时将视频流转换为高对比度图像。（G）在预览窗口中可见的一个SPoT。（H）用于选择SPoT的工具。（I）按尺寸过滤对象的滑块。（J）实时显示被追踪对象间测量距离的图表。（K）选择保存输出文件目录的选项。（L）设置后追踪程序（M）的频率范围、频率间隔、记录时间以及记录间隔时间的选项。（N）对最近保存的记录的偏转曲线进行傅里叶变换后的图形输出。（O）用于确定刺激hECT所需最小电压的程序。（P）用于计算微柱最大与最小偏转量的程序。缩写：hECT = 人源工程化心肌组织；SPoT = 稳定微柱追踪器。请点击此处查看该图的放大版本。

6. PDMS 支架的测量

  1. 未加载距离
    1. 在制备hECT之前，将所需的一对PDMS支架安装到框架上。使用步骤5.1中所述的起搏装置和软件进行功能测量。选择位于支柱末端的固定SPoTs。
    2. 必要时调整光源和/或阈值以减少 噪声 到 <2 µm在电子表格中记录图表中显示的平均活细胞y值。
  2. 柱高和hECT高度
    1. 从步骤中所述的起搏设置 5.2，取下倾斜反射镜和加热台。将生物反应器直接放置在实验升降台上，以获得生物反应器的侧视视角。
    2. 打开相机软件。调整 曝光时间 和 光源位置 优化视野内照明条件的均匀性，并最大限度提高柱状结构的可见度。
    3. 打开数据采集软件，然后打开 "PostMeasurement_PB3.vi" 文件（补充文件 5）。加载后，点击 白色箭头 在 工具栏左侧 启动程序。
    4. 使用玻璃血细胞计数板校准软件。点击 线条工具 在 垂直工具栏 到 左侧 观察窗的宽度，并画一条横线穿过 1 mm 血细胞计数板的刻度标记。在 距离校准（像素/毫米） 屏幕左下方的框中，设置 参考长度（mm） 到 1，然后点击 计算 按钮
    5. 在校准区域下方，设置所需的组织编号（用于标识） 组织编号 视野。将相机对准hECT的左侧柱，并选择 左侧 在 后侧 盒子
    6. 使用 线条工具 从基部（上方）到SPoTs尖端（下方）画一条线，并通过点击进行记录 测量术后身高.
    7. 从柱子的底部向hECT的远端边缘画一条线，并通过点击进行记录 测量组织顶部高度从柱基画一条线至hECT的近端边缘，并通过点击记录 测量组织基底高度.
    8. 此时，将生物反应器旋转以测量右侧支柱的高度。选择 右侧帖子 选择记录相同测量值的选项。单击 添加 单击按钮，将测量值填入电子表格，并自动计算hECT的平均高度，该数值将在步骤7中使用。
    9. 记录完组织高度后，单击“保存”按钮，将数值保存至文本文件。

7. 使用自定义分析脚本进行功能数据处理

  1. 在电子表格编辑器中，使用模板（补充文件 6）填写汇总文件。使用步骤 6.2 中获得的支柱间距和平均组织高度数值。确保文件夹中所有具有数据的 hECT 均在汇总文件中有所体现。将文件命名为“summary #.csv”，其中 # 表示实验进行的天数。
    注意：hECT 功能数据必须根据实验日期分别存放在不同的文件夹中。
  2. 确保已将包含 AnalyzeLogsGUI 脚本的文件夹（补充文件 7）以及包含 hECT 记录数据的文件夹均添加至路径中。
  3. 打开数据分析软件。在目录栏左侧，点击浏览文件夹按钮，导航至同时包含 AnalyzeLogsGUI 文件夹和 hECT 功能数据的父文件夹。在当前窗口侧边栏中，右键点击这些文件夹，选择添加到路径 | 添加选定的文件夹及其子文件夹。
  4. 打开“AnalyzeLogsGui_SC.m”文件。在编辑器选项卡中，点击运行按钮，等待图形用户界面（GUI）在新窗口中出现。
    1. 在日志选择框（图 8AI）中，点击选择目录按钮，导航至包含 hECT 功能数据的文件夹。从组织下拉菜单中选择要处理的特定 hECT。
    2. 在数据输入框（图 8AII）中，在舒张期距离字段输入步骤 6.1 中记录的无负载状态下支柱之间的距离。在支柱半径 (mm)字段中输入0.25。
    3. 在分析约束框（图 8AIII）中，选择要从分析中排除的频率，或选择要包含的特定频率（以逗号分隔）。默认情况下，开始时间和结束时间分别设置为0和−1，以处理整个记录时长。如有需要，可更改这些值以裁剪记录片段。
    4. 更改滤波参数（图 8AIV）中的多项式阶数和帧大小，以调整滤波过程中的平滑程度；移动峰值检测阈值滑块以设定脚本能识别的最小峰值大小。
      注意：该脚本包含尖峰去除选项，可截除由伪影引起的高大峰值；但不推荐使用此功能，因其会改变收缩波形的形状。建议通过裁剪记录的方式去除伪影（图 8AIII）。
    5. 使用附加选项（图 8AV）以获得额外的数据分析输出：支柱偏转分析用于运行额外的峰值检测算法，缩放图中自动调整 y 轴可自动调节收缩力曲线图（图 8B）的坐标轴范围，保存力-时间轨迹图可将每次收缩力图保存为 .fig 文件，保存力-时间数据可保存绘制在收缩力曲线图中的滤波后数据的 x 和 y 坐标。
    6. 点击运行分析，生成一个 .txt 文件，其中包含整个记录期间平均化的收缩力曲线特征参数（补充文件 8）。

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图8：抽搐力曲线计算。（A）在数据处理软件中运行“AnalyzeLogsGUI.m”文件将打开图形用户界面（GUI）窗口。（I） “日志选择”框允许用户选择包含hECT功能数据的文件夹目录。“天数”字段会根据第7.1步协议中生成的摘要文件的标题自动填充。通过“组织”下拉菜单选择要处理的hECT。（II）“数据输入”框包含支撑hECT的一对PDMS支柱的相关信息，例如无负载距离（在第6.1步协议中获得）和支柱半径（0.25 mm）。（III）“分析约束”框允许用户选择要排除或包含的频率，并对记录进行裁剪。（IV）“滤波参数”框包含选择如何对原始抽搐力曲线进行滤波的选项。“多项式阶数”和“帧大小”可改变滤波过程中的平滑程度。“峰值检测阈值”滑块决定脚本识别的最小峰值大小。“尖峰去除”选项可截断由伪影引起的高幅峰值。（V）其他选项包括“支柱偏转分析”，该功能运行额外的峰值检测算法；“缩放图中y轴自动缩放”，作用于抽搐力曲线；“保存力-时间轨迹曲线”，用于保存抽搐力图像；以及“保存力-时间数据”，用于保存绘制的抽搐力数据。（B）由面板A中的GUI截图生成的以1 Hz起搏的hECT持续30秒记录的抽搐力曲线示例。红色抽搐力曲线显示了根据AIV中参数滤波后的力，叠加在原始抽搐力曲线上（深蓝色曲线，当选中AV中的“显示未滤波数据”选项时出现）。缩写：hECT = 人类工程化心肌组织；GUI = 图形用户界面；PDMS = 聚二甲基硅氧烷。请点击此处查看该图的放大版本。

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结果

按照上述方案，我们课题组利用先前使用的一株健康人iPSC细胞系生成了心肌细胞9,15 在培养 8-61 天后制备成人心外膜组织。 图9A 显示从底部观察的hECTs代表性图像，分别在无SPoTs（上）和有SPoTs（下）条件下制备。功能测量在室温下进行（23 °C）以及生理温度下（36 °C在hECT构建后的37至52天之间。在PDMS支架的制备过程中，我们记录到经验丰富的操作者可获得80%的产率，即所有六个支柱均完整的PDMS支架；总体而言，至少五个支柱完整的PDMS支架产率可达95%（基于本实验室三位操作者的数据），其中 <柱高存在 3% 的变异。

与难以牢固附着在PDMS微柱尖端的标记墨水所产生的碎片化形状相比，SPoT在数据采集过程中提供了一个单一且定义明确的跟踪形状（图9B 和补充视频S1

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讨论

文献中已发表多种线性工程化心肌组织模型，其中一些模型如表1所述。部分模型涉及对组织收缩力的直接测量，但通常需要将构建物转移至独立的肌肉浴槽中进行38。大多数模型设计为将组织永久固定在两端，最常见的是固定在PDMS柱上1,2,3,4,5,6,7,8,9,10,

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披露

K.D.C. 是 Novoheart 的联合创始人兼首席科学官，并持有其控股公司 Medera Biopharmaceutical 的股权。Novoheart 未参与本研究的资助、设计或实施；然而，本研究的结果可能对 Novoheart 和 Medera 产生财务影响。其他作者声明不存在竞争利益。

致谢

作者感谢 Timothy Cashman 博士在此方法早期研究中的贡献。本研究获得了美国国立卫生研究院（NIH）（项目编号 R01-HL132226 和 K01 HL133424）以及勒杜克基金会国际卓越网络计划（CURE-PLaN）的资助。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
0.25 mm直径304不锈钢丝McMaster Carr6517K61 
0.25% 胰蛋白酶-EDTAGibco25200056
1.7 mL 微量离心管AxygenMCT-175-C
10 cm 培养皿（20 mm 高）康宁353003
10 mL 血清移液管德拉蒙德6-000-010
10 N NaOHFisher ScientificSS225-1用无菌蒸馏水按1:10比例稀释
10X 改良伊格尔培养基Sigma AldrichM0275
20 - 200 μL 微量移液器Eppendorf3123000055
200 μL 微量移液器吸头VWR76322-150
5 mL 血清移液管德拉蒙德6-000-005
50 mL 圆锥形离心管Falcon352070
6 cm 培养皿康宁353002
6 瓦 LED 双蛇形管照明器AmScope LED-6W 
6孔板康宁353046
90度角反射镜Edmund Optics45-594
丙烯酸粘合胶SCIGRIP#4
可调节的10 cm x 10 cm千斤顶Fisher Scientific14-673-50
铝合金6061McMaster Carr9008K82
A-Plan 10倍物镜ZEISS1020-863
高压灭菌袋Propper21002
B-27添加剂赛默飞世尔科技17504044
B-27添加剂（不含胰岛素）ThermoFisherA1895601
台式离心机Eppendorf5810 R
黑色ABSUltimaker2.85 mm 宽
牛I型胶原蛋白GibcoA1064401
CHIR99021Tocris4423
II 级生物安全柜Labconco3430009
透明亚克力板estreetplastics10025024366.25 mm 厚
数控立式铣床HaasVF-1
导电石墨棒McMaster Carr1763T33
解剖显微镜OlympusSZ61
Dulbecco改良Eagle培养基/Ham's F-12营养混合物赛默飞世尔科技11330032
乙醇Fisher ScientificA4094用水稀释至70%
EVE全自动细胞计数仪NanoEntekE1000
EVE细胞计数板NanoEntekEVS-050
胎牛血清Life Technologies10438026
精细弯头镊Fine Science Tools11253-25
Forma Series II 水套式 CO2 培养箱赛默飞世尔科技公司3110也称为 "培养箱"配备HEPA 100级过滤器
Fusion360 软件Autodesk也称为 "CAD 软件"
血细胞计数板（玻璃）Reichert14750.1 mm 深
HEPESSigma AldrichH3784
hESC 验证合格的基质胶康宁354277也称为 "基底膜基质". 储存于冷冻分装样品中
高速CCD相机PixelLINKP7410
倒置显微镜卡尔·蔡司工厂Axiovert 40 CFL10倍相差物镜
IWR-1Selleck ChemS7086
LabView 软件国家仪器公司2016
层流洁净工作台NuAireNU-201-330hECT功能分析所必需
笔记本电脑华硕科技雕属英特尔酷睿 i& 处理器，CPU 2.8GHz，16GB RAM
激光切割机尾声Helix 24
放大头戴镜ExcelBlades70020适用于需要精细操作的步骤
MatlabMathworks版本 2019b 或更高版本也称为 "数据分析软件"
微型Vannas剪刀，3 mm刀片WPI Instruments501839
显微镜支架立柱奥林巴斯SZ2-STU1
青霉素-链霉素储备液赛默飞世尔科技1514012210,000 IU/ml 青霉素；10,000 μg/ml 链霉素
不含二价阳离子的磷酸盐缓冲液Sigma AldrichP3813用蒸馏水稀释至1X和10X浓度
移液控制器德拉蒙德4-000-100
PixelLINK Capture OEMPixelLINK10.2.1.6也称为 "相机软件"
聚砜McMaster Carr86735K73半透明琥珀色
聚四氟乙烯（PTFE）McMaster Carr8545K176 黑色，模制
ReLeSR干细胞技术5872也称为 "iPSC 解离培养基"
罗斯韦尔公园纪念研究所1640培养基赛默飞世尔科技11875135
硅胶片SMI 制造有光泽，厚度为 0.02 英寸，硬度计读数 40
10/0 尺寸蓝色、绿色、红色和黄色玻璃小珠Michael's颜色应能耐受高压灭菌
刮勺Fisher Scientific14-373用于混合PDMS
方波脉冲刺激器 Astro-Med / Grass TechnologiesS88X
不锈钢剃刀片GEM62-0179-CTN由于硬度较低，优先选择非不锈钢材料
Stemflex赛默飞世尔科技A3349401也称为 "iPSC 培养基"
无菌蒸馏水赛默飞世尔科技5230
Sylgard 170  硅胶弹性体封装胶 黑色 0.9 kg 套件道DOWSIL 170 2LB 套件又称黑色聚二甲基硅氧烷（黑色 PDMS）
Sylgard 184 - 硅酮弹性体透明 1 磅装套件道DC 184 SYLGARD 0.5公斤 1.1磅 套件又称聚二甲基硅氧烷（PDMS）
温控加热载物台OkolabH401-HG-SMU设置高度为10 cm
热塑性3D打印机UltimakerUltimaker 3
ThiazovivinSelleck ChemS1459
台盼蓝NanoEntekEBT-001
真空室Bel-Art 零件F42027-0000
可变速度迷你带锯Micro-Mark82203
可变速度微型钻床Micro-Mark82959
减振台Labconco3618000
称量舟VWR10803-140
Talon圆柱形台钳夹具VWR97035-528AKA 螺丝夹

参考文献

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Formal Correction: Erratum: Designing a Bioreactor to Improve Data Acquisition and Model Throughput of Engineered Cardiac Tissues
Posted by JoVE Editors on 1/10/2024. Citeable Link.

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Designing a Bioreactor to Improve Data Acquisition and Model the Throughput of Engineered Cardiac Tissues

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Designing a Bioreactor to Improve Data Acquisition and Model Throughput of Engineered Cardiac Tissues

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