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利用荧光素酶转导的人源T细胞追踪双特异性抗体诱导的T细胞迁移

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DOI：

10.3791/64390

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2023年5月12日

 ,  , 
1Department of Pediatrics, Memorial Sloan Kettering Cancer Center

本文内容

摘要

在此，我们介绍一种将荧光素酶转导至人T细胞的方法，以促进 体内 在评估T细胞结合型双特异性抗体抗肿瘤疗效及作用机制的研究中，对双特异性抗体诱导的T细胞向肿瘤迁移的追踪

摘要

T细胞靶向性双特异性抗体（T-BsAbs）目前正处于针对实体瘤的临床前开发和临床试验的不同阶段。其抗肿瘤疗效常受到多种因素影响，例如抗体的价态、空间构型、结构域间距离以及Fc区突变，这些因素主要通过影响T细胞向肿瘤部位的归巢能力发挥作用，而T细胞归巢仍是当前面临的主要挑战之一。本文介绍一种将荧光素酶转导至活化人源T细胞的方法，从而实现 体内 在T-BsAb治疗研究中对T细胞进行追踪。可在治疗过程中的多个时间点定量评估T-BsAb将T细胞重定向至肿瘤的能力，使研究人员能够将T-BsAb及其他干预措施的抗肿瘤疗效与T细胞在肿瘤中的持续存在相关联。该方法避免了在治疗期间为通过组织学评估T细胞浸润而牺牲动物的需要，并可在多个时间点重复检测，以确定治疗期间及治疗后T细胞迁移的动力学特征。

引言

T细胞结合型双特异性抗体（T-BsAbs）是一类经过工程化设计的抗体，通过一个结合臂与T细胞结合，另一个结合臂与肿瘤抗原结合，从而赋予多克隆T细胞人工特异性。该技术已成功应用于血液系统肿瘤（靶向CD19的贝林妥欧单抗1），目前还有多种T-BsAbs正处于针对多种实体瘤的临床前和临床研发阶段2。T-BsAbs以主要组织相容性复合体（MHC）非依赖的方式激活多克隆T细胞，因此即使下调人类白细胞抗原（HLA）表达的肿瘤也对此类疗法敏感3,4。T-BsAbs已开发出数十种不同结构形式，在T细胞和肿瘤结合臂的价态、空间排列、结构域间距离以及是否包含Fc结构域等方面存在差异，其中Fc结构域的存在会影响抗体半衰期，并可能诱导效应功能5。本实验室先前的研究表明，这些因素显著影响T-BsAbs的抗肿瘤疗效，其效力差异可达1000倍6。通过上述研究，我们确定IgG-[L]-scFv结构为T-BsAbs的理想平台（有关T-BsAb结构的更多细节请参见代表性结果部分），并已将该平台应用于包括GD2（神经母细胞瘤）、HER2（乳腺癌和骨肉瘤）、GPA33（结直肠癌）、STEAP1（尤文肉瘤）、CD19（B细胞恶性肿瘤）和CD33（B细胞恶性肿瘤）在内的多个靶点7,8,9,10,11,12,13。

在实体瘤中成功实施T细胞双特异性抗体（T-BsAb）治疗的主要挑战之一是克服免疫抑制性肿瘤微环境（TME），以促进T细胞向肿瘤部位的迁移14上述影响T-BsAb疗效的因素对T细胞向肿瘤归巢的能力具有显著影响，但这种效应在体外难以评估 体内 系统进行实时监测。本论文详细描述了在临床前研究中使用转导荧光素酶的T细胞评估双特异性T细胞衔接抗体（T-BsAbs）治疗过程中T细胞向免疫缺陷小鼠模型不同组织迁移的方法。该方法的总体目标是提供一种手段，用于评估T细胞在肿瘤及其他组织中的浸润情况，同时实时获取T细胞归巢动力学及其存续时间的信息，而无需在治疗过程中处死动物。对于越来越多专注于细胞免疫治疗的研究人员而言，能够追踪T细胞 体内 在临床前动物模型中至关重要。我们旨在提供所采用的荧光素酶转导T细胞追踪方法的详尽、细致描述，以便其他研究人员能够轻松地复制该技术。

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方案

以下程序已由纪念斯隆-凯特琳癌症中心的机构动物护理和使用委员会评估并批准。

1. 用荧光素酶转染293T细胞并收集病毒上清液

  1. 293T 细胞的培养
    1. 向每升 DMEM 培养基中加入 110 mL 热灭活胎牛血清（FBS）和 11 mL 青霉素-链霉素，配制完全培养基。
    2. 将 5 × 106 个 293T 细胞解冻后，转移至含有上述配制培养基的 T175 培养瓶中。
    3. 每 3 天按 1:10 比例传代一次，共传代 6 天。注意细胞融合度不要超过 90%。
  2. 293T 细胞的转染
    注意：以下试剂用量是针对一个 T175 培养瓶的 293T 细胞计算的。若需转染更多培养瓶，请相应调整用量。
    1. 用移液器将 1.5 mL 培养基分别加入两个 50 mL 离心管中。在其中一个管中加入 10 µg VSV-G 质粒、20 µg Gag/pol 质粒和 20 µg 红色甲虫荧光素酶（CBR-TDR）质粒，混匀；在另一管中加入 100 µL DNA in vitro 转染试剂，混匀。两管均在室温（RT）孵育 5 分钟。
      注意：本研究中所用的所有质粒均由 Vladimir Ponomarev 博士提供。
    2. 将含有 DNA in vitro 转染试剂的培养基逐滴加入含 DNA 质粒的管中（约 30 秒内加完），用移液器轻轻混匀。室温孵育 20 分钟。
    3. 在上述 20 分钟孵育期间，加入 5–10 mL 0.05% 胰蛋白酶使 293T 细胞脱落。细胞脱落后，加入 10 mL 培养基，于 800 × g 离心 5 分钟。将细胞沉淀重悬于 1.5 mL 培养基中。
    4. 将含有 DNA in vitro 转染试剂和 DNA 质粒的混合液加入 293T 细胞悬液中，37 °C 孵育 30 分钟。
    5. 将细胞转移至 T175 培养瓶，加入 18 mL 培养基。37 °C 过夜孵育。
    6. 次日，用玻璃移液管小心吸除培养基，避免细胞脱落。更换为 18 mL 新鲜培养基，置于 37 °C 培养箱中过夜孵育。
  3. 病毒上清液的收集
    1. 用移液器收集病毒上清液并置于冰上。在 800 × g 条件下离心 5 分钟，以沉淀细胞和碎片。
      注意：若细胞沉淀量较大，可能是收集上清时细胞从培养瓶脱落所致。这些细胞可重新接种于新的培养瓶中，并加入新鲜培养基继续培养。
    2. 使用 0.22 µm 滤器过滤病毒上清液。
    3. 立即使用病毒上清液。如需短期保存，可置于冰上或 4 °C 不超过 24 小时；如需长期保存，应于 -80 °C 冻存。

2. 活化人T细胞的扩增及其与荧光素酶的转导

  1. 人T细胞的活化 体外
    1. 向无菌15 mL离心管中加入10 mL含0.1%牛血清白蛋白（BSA）和2 mM乙二胺四乙酸（EDTA）的磷酸盐缓冲液（PBS），加入磁珠（每两个T细胞加一粒磁珠），置于磁力架上2分钟，吸除PBS，以洗涤磁珠。
    2. 按照步骤1.1.1所述配制培养基，然后加入IL-2至终浓度为30 IU/mL，并加入洗涤后的磁珠。每激活两百万个T细胞，配制2.5 mL培养基。
    3. 使用血细胞计数板和台盼蓝染色法计数T细胞（新鲜纯化或先前纯化、冻存、解冻并洗涤的T细胞）。将T细胞加入步骤2.1.2中制备的培养基中，轻轻颠倒混匀试管。T细胞将至少扩增20倍，具体扩增倍数取决于细胞来源及其总体健康状况。通过计算处理小鼠所需的T细胞数量并除以20，确定需激活的T细胞数量。本实验中，根据预实验结果，每只小鼠使用20 × 10⁶个T细胞。
    4. 在24孔组织培养板的每个孔中加入含有两百万个T细胞、磁珠和IL-2的2.5 mL培养基。于37 °C、湿润、5% CO₂条件下培养2 培养箱
    5. 接下来3天内每天使用20倍显微镜观察T细胞，以确定转导荧光素酶的最佳时机。当细胞聚集成团并消耗培养基，使其颜色由红色/粉红色变为浅橙色时，表明细胞已准备就绪。
  2. 制备逆转录病毒结合蛋白包被板
    注意：在转导过程中，使用Retronectin包被培养板，因其可增强基因转导效率15.
    1. 向未经处理的6孔板的每个孔中加入2 mL PBS配制的20 µg/mL逆转录病毒结合蛋白（retronectin）溶液。室温孵育2小时，或37 °C孵育1小时。每两百万个待转导的T细胞需要一个retronectin包被的孔。
    2. 吸除 retronectin 时，避免刮擦培养板底部。
    3. 在6孔板中每孔加入3 mL含2% BSA的PBS（经无菌过滤），室温孵育30分钟。
  3. 离心接种法
    1. 吸出BSA溶液时，避免刮擦培养板底部。
    2. 用每孔 3 mL PBS 洗涤一次。继续孵育或更换新鲜 PBS，将酶标板盖好后于 4 °C 过夜保存。
    3. 每孔加入 2 mL CBR-TDR 荧光素酶病毒上清液（于步骤 1.3 中收集）。
    4. 以 1,240 x 离心 g 32 °C 下孵育 90 分钟。
  4. 转导
    1. 计数T细胞。
    2. 吸弃病毒上清，注意不要刮擦培养板底部。
    3. 每孔接种两百万个T细胞至6 mL含30 IU/mL人IL-2的杜尔贝科改良伊格尔培养基（DMEM）中。
    4. 每天观察T细胞。当T细胞接近汇合时即可进行扩增，通常在培养2天后。
    5. 当细胞接近汇合时，用移液管轻轻将细胞从培养板底部吹下，并将每孔细胞转移至单独的T75培养瓶中。每瓶加入9 mL培养基，使总体积达到15 mL。
    6. 第二天，再加入15 mL培养基。加入培养基后的次日，细胞即可用于注射小鼠。通过流式细胞术检测转导效率（荧光素酶载体包含一种TD番茄荧光蛋白，可在PE通道中观察到）16.

3. 荧光素酶转导T细胞在免疫缺陷小鼠体内的植入

  1. 制备并计数用于注射的T细胞。
    1. 从培养瓶中取出T细胞并进行计数。当细胞扩增至20至30倍时即可用于注射，通常在激活后的第7天达到此状态。
    2. 将T细胞在800 x g条件下离心 g 孵育5分钟。加入2 mL培养基重悬，使用磁力架去除磁珠。
    3. 对于需要将T细胞与双特异性抗体分别注射的实验，计数T细胞并重悬，使最终浓度为每100 µL培养基中含有2000万T细胞。跳至步骤3.2。对于使用 离体 武装的T细胞（EATs），跳至步骤3.1.4。
    4. 对于使用以下条件的实验 离体 武装T细胞后，对T细胞进行计数，并按每组每只小鼠2000万个细胞的量分装至各自的1.5 mL离心管中。例如，若共有三组，每组五只小鼠，则准备三个1.5 mL离心管，每管含1亿个T细胞。
    5. 将1.5 mL离心管在800 x g 孵育5分钟。小心移除上清液，避免扰动T细胞沉淀。用不超过50 µL含双特异性抗体的培养基重悬细胞。室温孵育30分钟。
      注意：本研究实验所用的是实验室制备的特异性IgG-[L]-scFv T细胞结合双特异性抗体。进行T细胞武装时，每20 × 10⁶个细胞使用5 µg抗体。6 T细胞。也可使用市售的双特异性抗体。
    6. 加入 1,450 µL 培养基至每根试管以洗去多余的抗体。在 800 x g 孵育5分钟后，小心吸除培养基，并将细胞重悬于每100 µL培养基中含2000万个武装T细胞的浓度。
  2. 注射与移植至小鼠体内
    1. 在充满3.5%（v/v）异氟烷与1 L/min氧气混合气体的麻醉舱中对小鼠进行麻醉。当小鼠后肢足底回缩反射消失时，表明其已完全麻醉。
      注意： 在整个操作过程中提供热支持。
    2. 使用26 G针头，每只小鼠经眶后静脉注射2000万T细胞，体积为100 µL培养基。
    3. 皮下注射 1,000 U 重组 IL-2 以支持 T 细胞存活 体内.
    4. 将双特异性抗体经眶后注射（注入未用于T细胞注射的眼部）或腹腔注射。让小鼠从麻醉中恢复并放回笼中。
      ​注意：此处再次使用了实验室自主研发的专有抗体，但也可使用市售抗体替代。本实验中，每只小鼠每次给药剂量为 0.3–10 µg 抗体，每周给药两次，持续 3–4 周。

4. 在体 表达荧光素酶的T细胞移植小鼠的成像

注意：此步骤应在成像当天进行，而成像当天不一定是将T细胞和/或抗体给予小鼠的当天。通常，我们在将荧光素酶转导的T细胞给予小鼠后24小时进行成像。

  1. D-荧光素的制备
    1. 将1 g D-荧光素溶解于33.3 mL无菌PBS中（终浓度：30 mg/mL）。
    2. 将溶解后的D-荧光素分装至33个1.5 mL微量离心管中，每管1 mL，并将离心管保存于-20 °C。
    3. 成像当天，根据待成像动物数量解冻足够量的30 mg/mL D-荧光素。每管可供10只动物使用。
      注意：使用后应将剩余的D-荧光素重新冻存。D-荧光素在至少五次冻融循环中保持稳定。
  2. 向小鼠给药D-荧光素
    注意：在向小鼠注射D-荧光素前，应打开成像软件并初始化系统。相机冷却可能需要数分钟，因此应在小鼠注射D-荧光素前完成此步骤，以确保在底物给药后5分钟内开始成像。
    1. 将最多五只小鼠置于麻醉室中，使用1 L/min氧气携带3.5%（v/v）异氟烷进行吸入麻醉。当小鼠后肢足底回缩反射消失时，表明已完全麻醉。
    2. 小鼠完全麻醉后，使用26 G针头经眶后静脉注射每只小鼠100 µL 30 mg/mL D-荧光素（每只小鼠3 mg）。在对下一组小鼠给药前，先完成本组小鼠的成像。在对前一组小鼠成像的同时，将下一组小鼠放入异氟烷麻醉室进行麻醉。
  3. 成像荧光素酶转导的T细胞
    1. 将麻醉后的小鼠转移至成像仪的避光暗室中，继续以0.5 L/min流速供给3%异氟烷维持麻醉。将小鼠侧卧放置，使携带异种移植瘤的一侧 flank 朝上对准相机。另取仰卧位拍摄一组图像，用于评估T细胞在肺部的分布情况。
    2. 在采集控制面板中选择生物发光、拍照和叠加模式。将曝光时间设为自动，binning设为中等，光圈值（F/Stop）设为1，开始采集图像。首次成像后，将后续图像的曝光时间设定为与首次自动计算出的时间一致，以便直接比较不同图像。为确定在不引起像素饱和的前提下获得最强信号的最佳曝光时间，可尝试采集多个不同曝光时间的图像。
    3. 成像结束后，将小鼠撤离异氟烷，放回笼中，并观察至其清醒并能自主活动。
    4. 重复步骤4.2.1至4.2.4，直至所有组别均完成成像。

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结果

如步骤4.3所述，成像过程中可将小鼠置于不同体位，以评估不同组织中T细胞的存在情况。仰卧位便于评估注射后早期常见于肺部的T细胞。将皮下异种移植瘤朝上侧卧位放置，最有利于评估T细胞向肿瘤部位的迁移。雌性C.Cg-Rag2tm1Fwa Il2rgtm1Sug本研究中所有实验均使用 JicTac 小鼠。 图1 显示了一项实验的图像，该实验中携带GD2阳性异种移植瘤的小鼠接受了转导荧光素酶的T细胞治疗 ex 体内分别注射GD2 BsAb或荧光素酶转导的T细胞与GD2 BsAb17. 图1A 表明武装T细胞向肿瘤迁移的速度快于未武装T细胞（图1B，使肺部提前2天恢复。 图1C 展示了该现象的定量分析结果。 图1E

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讨论

尽管靶向T细胞的双特异性抗体（T-BsAb）药物博纳吐单抗（blinatumomab）已获批用于CD19阳性血液系统恶性肿瘤，但T-BsAb在实体瘤中的成功应用却困难得多。卡妥索单抗（catumaxomab）是一种靶向上皮细胞黏附分子（EPCAM）的T-BsAb，曾获批用于卵巢癌患者恶性腹水的治疗，但此后因商业原因停止生产。19目前尚无其他T细胞双特异性抗体（T-BsAbs）被批准用于实体瘤，这凸显了此类疗法所面临的挑战。细胞因子释放综合征（CRS）导致的毒性是常见问题，尽管可通过糖皮质激素和细胞因子抑制剂进行管理。除毒性外，T-BsAbs在实体瘤临床试验中普遍存在疗效不足的问题。诱导T细胞向肿瘤部位迁移并长期存留已被证明十分困难，这可能归因于肿瘤微环境（TME）中多种免疫抑制因素的影响。14然而，即使在临床前阶段，一种表现良好的T-BsAb为何有效也常常不明确 体外 无法有效治疗肿瘤 体内.

T细胞追踪方法 体内 实时监测本文所述的...

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披露

NKC 报告从 Y-mAbs Therapeutics 获得商业研究资助。NKC 是由 MSK 授权给 Y-mAbs Therapeutics、Biotec Pharmacon/Lallemand 和 Abpro-labs 的已授权专利的发明人和所有者。MSK 和 NKC 在 Y-mAbs 中拥有经济利益。NKC 报告从 Eureka Therapeutics 获得股票期权。HFG 和 MEC 无相关披露信息。

致谢

作者谨此感谢 Vladimir Ponomarev 博士分享了本文代表性结果部分所述实验中所用的荧光素酶载体。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
293T 细胞ATCCCRL-11268
BSASigma AldrichA7030-10G
CD3/CD28 磁珠Gibco (ThermoFisher)11161D
D-萤光素钾盐GoldbioLUCK-1G
DMEMGibco (ThermoFisher)11965092
体外 DNA 转染试剂（polyjet）SignaGen LaboratoriesSL100688
EDTASigma AldrichE9884-100G
FBSGibco (ThermoFisher)10437028
Gag/pol 质粒Addgene14887
GFP 质粒Addgene11150-DNA.cg
青霉素-链霉素Gibco (ThermoFisher)15140122
重组人 IL-2R&D Systems202-IL-010/CF
RetronectinTakaraT100B
胰蛋白酶Gibco (ThermoFisher)25-300-120
VSV-G 质粒Addgene8454

参考文献

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