在此，我们介绍一种将荧光素酶转导至人T细胞的方法，以促进 体内 在评估T细胞结合型双特异性抗体抗肿瘤疗效及作用机制的研究中，对双特异性抗体诱导的T细胞向肿瘤迁移的追踪
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摘要
摘要
T细胞靶向性双特异性抗体（T-BsAbs）目前正处于针对实体瘤的临床前开发和临床试验的不同阶段。其抗肿瘤疗效常受到多种因素影响，例如抗体的价态、空间构型、结构域间距离以及Fc区突变，这些因素主要通过影响T细胞向肿瘤部位的归巢能力发挥作用，而T细胞归巢仍是当前面临的主要挑战之一。本文介绍一种将荧光素酶转导至活化人源T细胞的方法，从而实现 体内 在T-BsAb治疗研究中对T细胞进行追踪。可在治疗过程中的多个时间点定量评估T-BsAb将T细胞重定向至肿瘤的能力，使研究人员能够将T-BsAb及其他干预措施的抗肿瘤疗效与T细胞在肿瘤中的持续存在相关联。该方法避免了在治疗期间为通过组织学评估T细胞浸润而牺牲动物的需要，并可在多个时间点重复检测，以确定治疗期间及治疗后T细胞迁移的动力学特征。
引言
T细胞结合型双特异性抗体（T-BsAbs）是一类经过工程化设计的抗体，通过一个结合臂与T细胞结合，另一个结合臂与肿瘤抗原结合，从而赋予多克隆T细胞人工特异性。该技术已成功应用于血液系统肿瘤（靶向CD19的贝林妥欧单抗1），目前还有多种T-BsAbs正处于针对多种实体瘤的临床前和临床研发阶段2。T-BsAbs以主要组织相容性复合体（MHC）非依赖的方式激活多克隆T细胞，因此即使下调人类白细胞抗原（HLA）表达的肿瘤也对此类疗法敏感3,4。T-BsAbs已开发出数十种不同结构形式，在T细胞和肿瘤结合臂的价态、空间排列、结构域间距离以及是否包含Fc结构域等方面存在差异，其中Fc结构域的存在会影响抗体半衰期，并可能诱导效应功能5。本实验室先前的研究表明，这些因素显著影响T-BsAbs的抗肿瘤疗效，其效力差异可达1000倍6。通过上述研究，我们确定IgG-[L]-scFv结构为T-BsAbs的理想平台（有关T-BsAb结构的更多细节请参见代表性结果部分），并已将该平台应用于包括GD2（神经母细胞瘤）、HER2（乳腺癌和骨肉瘤）、GPA33（结直肠癌）、STEAP1（尤文肉瘤）、CD19（B细胞恶性肿瘤）和CD33（B细胞恶性肿瘤）在内的....
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方案
以下程序已由纪念斯隆-凯特琳癌症中心的机构动物护理和使用委员会评估并批准。
1. 用荧光素酶转染293T细胞并收集病毒上清液
- 293T 细胞的培养
- 向每升 DMEM 培养基中加入 110 mL 热灭活胎牛血清（FBS）和 11 mL 青霉素-链霉素，配制完全培养基。
- 将 5 × 106 个 293T 细胞解冻后，转移至含有上述配制培养基的 T175 培养瓶中。
- 每 3 天按 1:10 比例传代一次，共传代 6 天。注意细胞融合度不要超过 90%。
- 293T 细胞的转染
注意：以下试剂用量是针对一个 T175 培养瓶的 293T 细胞计算的。若需转染更多培养瓶，请相应调整用量。- 用移液器将 1.5 mL 培养基分别加入两个 50 mL 离心管中。在其中一个管中加入 10 µg VSV-G 质粒、20 µg Gag/pol 质粒和 20 µg 红色甲虫荧光素酶（CBR-TDR）质粒，混匀；在另一管中加入 100 µL DNA in vitro 转染试剂，混匀。两管均在室温（RT）孵育 5 分钟。
注意：本研究中所用的所有质粒均由 Vladimir Ponomarev 博士提供。 - 将含有 DNA ....
- 用移液器将 1.5 mL 培养基分别加入两个 50 mL 离心管中。在其中一个管中加入 10 µg VSV-G 质粒、20 µg Gag/pol 质粒和 20 µg 红色甲虫荧光素酶（CBR-TDR）质粒，混匀；在另一管中加入 100 µL DNA in vitro 转染试剂，混匀。两管均在室温（RT）孵育 5 分钟。
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结果
如步骤4.3所述，成像过程中可将小鼠置于不同体位，以评估不同组织中T细胞的存在情况。仰卧位便于评估注射后早期常见于肺部的T细胞。将小鼠侧卧、皮下异种移植瘤朝上，可最佳观察T细胞向肿瘤部位的迁移。雌性C.Cg-Rag2tm1Fwa Il2rgtm1Sug本研究中所有实验均使用 JicTac 小鼠。 图1 显示了一项实验的图像，该实验中携带GD2阳性异种移植瘤的小鼠接受了转导荧光素酶的T细胞治疗 ex 体内分别注射GD2 BsAb或荧光素酶转导的T细胞与GD2 BsAb17. 图1A 表明武装T细胞向肿瘤迁移的速度快于未武装T细胞（图1B，使肺部提前2天恢复。 图1C 展示了该现象的定量分析结果。 图1E.......
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讨论
尽管靶向T细胞的双特异性抗体（T-BsAb）药物博纳吐单抗（blinatumomab）已获批用于CD19阳性血液系统恶性肿瘤，但T-BsAb在实体瘤中的成功应用却困难得多。卡妥索单抗（catumaxomab）是一种靶向上皮细胞黏附分子（EPCAM）的T-BsAb，曾获批用于卵巢癌患者恶性腹水的治疗，但此后因商业原因停止生产。19目前尚无其他T细胞双特异性抗体（T-BsAbs）被批准用于实体瘤，这凸显了此类疗法所面临的挑战。细胞因子释放综合征（CRS）导致的毒性是常见问题，尽管可通过糖皮质激素和细胞因子抑制剂进行管理。除毒性外，T-BsAbs在实体瘤临床试验中普遍存在疗效不足的问题。诱导T细胞向肿瘤部位迁移并长期存留已被证明十分困难，这可能归因于肿瘤微环境（TME）中多种免疫抑制因素的影响。14然而，即使在临床前阶段，一种表现良好的T-BsAb为何有效也常常不明确 体外 无法有效治疗肿瘤 体内.
T细胞追踪方法 体内 实时监测本文所述的.......
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披露
NKC 报告从 Y-mAbs Therapeutics 获得商业研究资助。NKC 是由 MSK 授权给 Y-mAbs Therapeutics、Biotec Pharmacon/Lallemand 和 Abpro-labs 的已授权专利的发明人和所有者。MSK 和 NKC 在 Y-mAbs 中拥有经济利益。NKC 报告从 Eureka Therapeutics 获得股票期权。HFG 和 MEC 无相关披露信息。
致谢
作者谨此感谢 Vladimir Ponomarev 博士分享了本文代表性结果部分所述实验中所用的荧光素酶载体。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 293T 细胞 | ATCC | CRL-11268 | |
| BSA | Sigma Aldrich | A7030-10G | |
| CD3/CD28 磁珠 | Gibco (ThermoFisher) | 11161D | |
| D-萤光素钾盐 | Goldbio | LUCK-1G | |
| DMEM | Gibco (ThermoFisher) | 11965092 | |
| 体外 DNA 转染试剂（polyjet） | SignaGen Laboratories | SL100688 | |
| EDTA | Sigma Aldrich | E9884-100G | |
| FBS | Gibco (ThermoFisher) | 10437028 | |
| Gag/pol 质粒 | Addgene | 14887 | |
| GFP 质粒 | Addgene | 11150-DNA.cg | |
| 青霉素-链霉素 | Gibco (ThermoFisher) | 15140122 | |
| 重组人 IL-2 | R&D Systems | 202-IL-010/CF | |
| Retronectin | Takara | T100B | |
| 胰蛋白酶 | Gibco (ThermoFisher) | 25-300-120 | |
| VSV-G 质粒 | Addgene | 8454 |
参考文献
- Gökbuget, N., et al. Blinatumomab for minimal residual disease in adults with B-cell precursor acute lymphoblastic leukemia. Blood. 131 (14), 1522-1531 (2018).
- Runcie, K., Budman, D. R., John, V., Seetharamu, N. Bi-speci....
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