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Summary

在这里，我们描述了一种用荧光素酶转导人T细胞的方法，以促进双特异性抗体诱导的T细胞向肿瘤的 体内跟踪， 以评估T细胞结合双特异性抗体的抗肿瘤功效和机制。

Abstract

T细胞结合双特异性抗体（T-BsAbs）处于实体瘤临床前开发和临床试验的不同阶段。化合价、空间排列、域间距离和Fc突变等因素影响这些疗法的抗肿瘤疗效，通常是通过影响T细胞归巢到肿瘤，这仍然是一个主要挑战。在这里，我们描述了一种用荧光素酶转导活化的人T细胞的方法，允许在T-BsAb治疗研究期间对T细胞进行 体内 跟踪。T-BsAbs将T细胞重定向到肿瘤的能力可以在治疗期间的多个时间点进行定量评估，使研究人员能够将T-BsAbs和其他干预措施的抗肿瘤功效与T细胞在肿瘤中的持久性相关联。该方法减轻了在治疗期间牺牲动物以组织学评估T细胞浸润的需要，并且可以在多个时间点重复以确定治疗期间和治疗后T细胞运输的动力学。

Introduction

T 细胞结合双特异性抗体 （T-BsAb） 是一种工程抗体，用于通过一个结合臂结合 T 细胞和通过另一个结合臂结合肿瘤抗原，为多克隆 T 细胞提供人工特异性。该技术已成功应用于血液系统癌症（靶向CD19的blinatumomab¹），并且许多T-BsAbs也处于各种实体瘤的临床前和临床开发^中2。T-BsAbs以主要组织相容性复合体（MHC）非依赖性方式接合多克隆T细胞，因此即使是下调人白细胞抗原（HLA）的肿瘤也容易受到^{这种类型的治疗3，4}。T-BsAbs已经以数十种不同的形式开发，在T细胞和肿瘤结合臂的化合价和空间排列，域间距离以及包含Fc结构域方面存在差异，这会影响半衰期并且可以诱导效应^{功能（如果}存在5）。我们实验室先前的工作表明，这些因素显着影响T-BsAbs的抗肿瘤功效，效力差异高达1，000^倍6。通过这项工作，我们将IgG-[L]-scFv格式确定为T-BsAb的理想平台（有关T-BsAb格式的更多详细信息，请参阅代表性结果部分），并将该平台应用于包括GD2（神经母细胞瘤），HER2（乳腺癌和骨肉瘤），GPA33（结直肠癌），STEAP1（尤因肉瘤），CD19（B细胞恶性肿瘤）和CD33（B细胞恶性^{肿瘤）在内的}靶点7^，8，⁹，¹⁰，¹¹，^12，13.

在实体瘤中成功实施T-BsAb疗法的主要挑战之一是克服免疫抑制肿瘤微环境（TME）以驱动T细胞向肿瘤的运输¹⁴。上述影响T-BsAb功效的因素对T-BsAb有效诱导T细胞归巢到肿瘤的能力有显著影响，但这种影响很难在 体内 系统中实时评估。本手稿详细介绍了在T-BsAbs临床前研究中使用荧光素酶转导的T细胞来评估治疗期间实验免疫功能低下小鼠模型中T细胞转运到各种组织的应用。该方法的总体目标是提供一种评估肿瘤和其他组织中T细胞浸润的方法，以及实时洞察T细胞归巢动力学和持久性，而无需在治疗期间牺牲动物。对于越来越多的专注于细胞免疫疗法的研究人员来说，在临床前动物 模型中追踪体内 T细胞的能力至关重要。我们的目标是提供我们用于跟踪荧光素酶转导T细胞的方法的彻底，详细的描述，以使其他研究人员能够轻松复制该技术。

Protocol

以下程序已由纪念斯隆凯特琳的机构动物护理和使用委员会评估和批准。 1. 用荧光素酶转染293T细胞并收获病毒上清液 293T细胞培养通过将以下内容添加到一升DMEM中来制备培养基：110 mL热灭活胎牛血清（FBS），11 mL青霉素链霉素。 解冻5 x 106 293T细胞，并将其转移到T175烧瓶中，培养基如上所述制备。 每 10 天以 1：10 的比例拆分 3 细胞，持续 6 天。不要让细胞汇合超过90%。 293T细胞的转染注意：计算以下试剂量，用于转染一个293T细胞的T175烧瓶。如果要转导更多烧瓶，请相应地调整。使用移液器将 1.5 mL 培养基转移到两个 50 mL 管中的每一个。向一个试管中加入 10 μg VSV-G 质粒、20 μg Gag/pol 和 20 μg 点击甲虫红 TD 番茄 （CBR-TDR） 荧光素酶质粒并混合。向另一管中加入 100 μL DNA 体外 转染试剂并混合。将两个试管在室温（RT）下孵育5分钟。注意：本手稿中描述的所有质粒均由Vladimir Ponomarev博士提供。 将含有DNA体 外 转染试剂的培养基滴液转移到含有DNA质粒的管中（约30秒），并用移液管轻轻混合。在室温下孵育20分钟。 在这20分钟的孵育期间，通过加入5-10mL的0.05%胰蛋白酶来分离293T细胞。细胞分离后，加入 10 mL 培养基并以 800 x g 离心 5 分钟。将细胞重悬于 1.5 mL 培养基中。 将含有DNA 体外 转染试剂和DNA质粒的培养基加入293T细胞中，并在37°C下孵育30分钟。 转移到 T175 烧瓶中并加入 18 mL 培养基。在37°C孵育过夜。 第二天，用玻璃移液管小心地吸出培养基，不要分离细胞。用 18 mL 新鲜培养基更换。在培养箱中在37°C孵育过夜。 收获病毒上清液使用放在冰上的移液管除去病毒上清液。以800× g 离心5分钟以沉淀细胞和碎片。注意：如果细胞沉淀很大，则在去除上清液时，细胞可能会从烧瓶中破裂。这些细胞可以再次接种在带有新鲜培养基的新烧瓶中。 使用0.22μm过滤器过滤病毒上清液。 立即使用病毒上清液。将其放在冰上或在4°C下保存长达24小时，或在-80°C下冷冻以长期储存。 2. 用荧光素酶扩增和转导活化的人T细胞 体外活化人T细胞 通过将 10 mL 含有 0.1% 牛血清白蛋白 （BSA） 和 2 mM 乙二胺四乙酸 （EDTA） 的磷酸盐缓冲盐水 （PBS） 加入磁珠（每两个 T 细胞一个珠子）中洗涤珠子，将其置于磁铁架中 2 分钟，然后吸出 PBS。 按照步骤1.1.1中所述制备培养基，然后加入IL-2至终浓度为30 IU / mL并加入洗涤过的珠子。每活化 200 万个 T 细胞，制造 2.5 mL 培养基。 使用血细胞计数器和台盼蓝染色剂计数T细胞（新鲜纯化或先前纯化，冷冻，解冻和洗涤）。将T细胞加入步骤2.1.2制备的培养基中，轻轻倒置试管进行混合。T细胞将至少扩增20倍，具体取决于细胞的来源和总体健康状况。通过计算治疗小鼠所需的数量并除以20来确定要激活的T细胞的数量。在这里，基于初步实验，每只小鼠使用20 x 106个T细胞。 在 24 孔组织培养板的每个孔中接种含有 200 万个 T 细胞、磁珠和 IL-2 的 2.5 mL 培养基。在37°C下在加湿的5%CO2 培养箱中培养。 在接下来的 3 天内每天在 20 倍显微镜下检查 T 细胞，以确定何时用荧光素酶转导。当细胞聚集在一起并耗尽培养基时，它们就准备好了，将其从红色/粉红色变成浅橙色。 再连蛋白板的制备注意：Retronectin用于涂覆转导中使用的板，因为它增强了基因转导15。将 2 mL 的 20 μg/mL 再生连蛋白加入 PBS 中，加入未处理的 6 孔板的孔中。在室温下孵育2小时或在37°C孵育1小时。 每转导200万个T细胞需要一个Retronectin包被的孔。 吸出再连蛋白而不刮伤板底部。 在 6 孔板中每孔加入 3 mL 2% BSA 的 PBS（无菌过滤）。在室温下孵育30分钟。 喷射吸出BSA，不要刮伤板的底部。 每孔用 3 mL PBS 洗涤孔一次。继续或用新鲜的PBS替换，并将板盖在4°C下过夜。 每孔加入 2 mL CBR-TDR 荧光素酶病毒上清液（在步骤 1.3 中收集）。 在32°C下以1，240× g 离心90分钟。 转 导计数 T 细胞。 吸出病毒上清液而不刮伤板底部。 将每孔 200 万个 T 细胞接种在含有 30 IU/mL 人 IL-2 的 6 mL Dulbecco 改良鹰培养基 （DMEM） 中。 每天检查T细胞。T细胞在接近汇合时准备扩增，通常在2天后。 当细胞几乎汇合时，使用移液管轻轻地将它们从板底部洗掉，并将每个孔转移到单独的T75烧瓶中。加入 9 mL 培养基，每个烧瓶总共 15 mL 培养基。 第二天，再加入 15 mL 培养基。细胞应该准备好在添加培养基后的第二天注射到小鼠体内。通过流式细胞术确认转导成功（荧光素酶构建体含有在PE通道中可见的TD番茄荧光团）16。 3. 荧光素酶转导的T细胞在免疫功能低下的小鼠中的植入 准备并计数用于注射的T细胞。从烧瓶中取出T细胞并计数。当细胞扩增20倍-30倍时，通常在激活后第7天，就可以注射了。 将T细胞以800 x g 离心5分钟。重悬于 2 mL 培养基中，并使用磁架取出磁珠。 对于将 T 细胞与双特异性抗体分开注射的实验，计数 T 细胞并重悬，使最终浓度为每 100 μL 培养基 2000 万个 T 细胞。跳到步骤 3.2。对于使用 离体 武装T细胞（EAT）的实验，请跳至步骤3.1.4。 对于使用 离体 武装T细胞的实验，计数T细胞并将其分成每组单独的1.5mL管中，每只小鼠2000万个细胞。例如，如果有三组，每组五只小鼠，则准备三个1.5mL管，每个管有1亿个T细胞。 将 1.5 mL 管以 800 x g 离心 5 分钟。小心地取出培养基，不要干扰T细胞沉淀。重悬于不超过 50 μL 含有双特异性抗体的培养基中。在室温下孵育30分钟。注意：出于本研究中进行的实验的目的，使用了实验室中产生的专有IgG-[L]-scFv T细胞结合双特异性抗体。对于 T 细胞布防，每 20 x 106 T 细胞使用 5 μg 抗体。市售的双特异性抗体也可以使用。 通过向每个试管中加入 1，450 μL 培养基来洗去多余的抗体。以 800 x g 离心 5 分钟，小心吸出培养基，并以每 100 μL 培养基 2000 万个武装 T 细胞的浓度重悬。 注射和植入小鼠体内在1L / min氧气中提供3.5%（v / v）吸入异氟醚的腔室中麻醉小鼠。当后肢踏板撤退反射消失时，小鼠完全麻醉。注：在整个过程中提供热支持。 使用26 G针头，每只小鼠在100μL培养基中逆眶注射2000万个T细胞。 皮下注射 1，000 U 重组 IL-2 以支持 体内 T 细胞存活。 眶后（进入不用于T细胞注射的眼睛）或腹膜内给予双特异性抗体。让小鼠从麻醉中恢复并返回笼子。注意：同样，这里使用了实验室中产生的专有抗体，但可以使用市售抗体代替。在这里的实验中，每只小鼠每剂量施用0.3-10μg抗体。抗体每周给药两次，持续3-4周。 4 . 移植 有荧光素酶转导的T细胞的小鼠体内成像 注意：此步骤将在成像当天进行，不一定是向小鼠施用T细胞和/或抗体的同一天。通常，我们在给予荧光素酶转导的T细胞后24小时进行成像。 D-荧光素的制备将 1 g D-荧光素溶解在 33.3 mL 无菌 PBS 中（终浓度：30 mg/mL）。 将溶解的D-荧光素等分到33 x 1.5 mL微量离心管中，并将管保持在-20°C。 在成像当天，解冻足够的30mg / mL D-荧光素等分试样，用于成像的动物数量。一根管子足以容纳 10 只动物。注意：使用后重新冷冻剩余的 D-荧光素。D-荧光素至少五个冻融循环稳定。 D-荧光素对小鼠的给药注意：在给小鼠施用D-荧光素之前，打开成像软件并初始化系统。相机可能需要几分钟才能冷却，这应该在小鼠注射D-荧光素之前完成，以确保在给予底物后5分钟可以进行成像。在提供3.5%（v / v）吸入异氟醚的1L / min氧气的腔室中麻醉多达五只小鼠。当后肢踏板撤退反射消失时，小鼠完全麻醉。 小鼠完全麻醉后，通过用26G针头眶后注射，每只小鼠施用100μL 30mg / mL D-荧光素（每只小鼠3mg）。在将D-荧光素施用到下一组之前对这组小鼠进行成像。将下一组小鼠置于异氟醚室中进行麻醉，同时对前一组进行成像。 荧光素酶转导的 T 细胞成像将麻醉小鼠移至成像仪的光密室，并继续以0.5L / min的速度施用3%异氟醚。将小鼠侧放，使带有异种移植物的侧翼朝上。拍摄另一组图像，小鼠处于仰卧位，以评估肺部T细胞的存在。 使用 采集控制面板，选择 发光、 照片和 叠加。将曝光时间设为自动，将像素合并设为中等，将光圈/光圈设为1。获取图像。在第一张图像之后，设置曝光时间以匹配为第一张图像自动计算的曝光时间，以便可以直接比较后续图像。捕获具有多个曝光时间的图像以确定最佳曝光时间以在没有像素饱和的情况下获得最亮的信号可能很有用。 从异氟醚中取出小鼠，返回笼子，观察直到它们清醒并走动。 重复步骤 4.2.1 中的步骤，直到所有组都已映像。

Representative Results

如步骤4.3所述，小鼠可以在成像过程中以不同的位置定向，以评估不同组织中T细胞的存在。仰卧位可以评估肺部的T细胞，这在注射后的早期时间点很常见。皮下异种移植物朝上的侧位用于最好地评估 T 细胞向肿瘤的运输。雌性 C.Cg-Rag2tm1Fwa Il2rgtm1Sug / JicTac小鼠用于本手稿中描述的所有实验。图1显示了来自实验的图像，其中携带GD2阳性异种移植物的小?…

Discussion

虽然T-BsAb blinatumomab已被批准用于CD19阳性血液系统恶性肿瘤，但T-BsAbs在实体瘤中的成功实施已被证明要困难得多。Catumaxomab是一种针对上皮细胞粘附分子（EPCAM）的T-BsAb，被批准用于治疗卵巢癌患者的恶性腹水，但该药物的生产随后因商业原因而停止¹⁹。没有其他T-BsAb被批准用于实体瘤，这强调了与这种治疗相关的挑战。细胞因子释放综合征（CRS）引起的毒性是一个常见问题，尽?…

Materials

293T cells	ATCC	CRL-11268
BSA	Sigma Aldrich	A7030-10G
CD3/CD28 beads	Gibco (ThermoFisher)	11161D
D-Luciferin, Potassium Salt	Goldbio	LUCK-1G
DMEM	Gibco (ThermoFisher)	11965092
DNA in vitro transfection reagent (polyjet)	SignaGen Laboratories	SL100688
EDTA	Sigma Aldrich	E9884-100G
FBS	Gibco (ThermoFisher)	10437028
Gag/pol plasmid	Addgene	14887
GFP plasmid	Addgene	11150-DNA.cg
Penicilin-Streptomycin	Gibco (ThermoFisher)	15140122
Recombinant human IL-2	R&D Systems	202-IL-010/CF
Retronectin	Takara	T100B
Trypsin	Gibco (ThermoFisher)	25-300-120
VSV-G plasmid	Addgene	8454