小鼠部分肝切除术后再生肝细胞的分离

摘要

富含脂质的肝细胞在肝脏再生过程中具有内在作用，但通常在密度梯度离心过程中丢失。本文介绍了一种优化的细胞分离方案，可保留脂肪变性肝细胞，从而在小鼠部分肝切除术后获得具有代表性的再生肝细胞群体。

摘要

部分肝切除术已广泛用于研究小鼠肝脏再生，但为后续单细胞应用分离出高产量且存活率高的肝细胞仍具挑战性。在小鼠正常肝脏再生的前两天内，可观察到再生肝细胞中脂质显著积聚。这种被称为再生相关性短暂性脂肪变性（TRAS）的现象虽为暂时性，但与主要增殖阶段存在部分重叠。密度梯度纯化是目前大多数原代肝细胞分离方案的核心步骤。由于梯度纯化依赖于细胞的密度和大小，因此会将非脂肪变性肝细胞与脂肪变性肝细胞分离开。因此，脂肪变性的肝细胞常被丢失，导致所获得的肝细胞群体缺乏代表性。

本文所述方案介绍了一种简便且可靠的 体内 无论脂质含量如何分离再生肝细胞。在雄性C57BL/6小鼠肝切除术后24-48小时，采用经典的两步胶原酶灌注法分离肝细胞。标准蠕动泵驱动预热的灌注液 通过 将导管插入下腔静脉，利用逆行灌注技术经门静脉流出，灌注残余肝脏。通过胶原酶消化使肝细胞从格利森囊分离。经洗涤和仔细离心后，肝细胞可用于后续各项分析。总之，本文介绍了一种简单且可重复的小鼠部分肝切除术后分离再生肝细胞群体的技术。该方法也有助于脂肪肝疾病的研究。

引言

即使在发生重大组织损失后，肝脏仍能自我再生。这种独特的再生能力在部分（70%）肝切除的实验模型中得到了明确体现，该模型最早由 Higgins 和 Anderson 于 1931 年在大鼠中首次描述¹。在此模型中，通过手术切除较大的肝叶，将动物体内 70% 的肝脏组织移除。剩余的肝叶随后通过代偿性肥大迅速生长，通常在术后约 1 周内恢复原有的肝脏质量，但并不恢复原有的肝脏结构^2,3。此外，研究人员还开发了不同切除比例的其他肝切除模型，例如 86% 扩展性肝切除，其中残留肝组织过小而无法恢复，最终导致 30%–50% 的实验动物出现肝切除后肝功能衰竭（PHLF）并相继死亡^4,5,6。这些模型可根据切除组织的多少，用于研究正常或失败的肝脏再生过程（图 1）。

尽管肝切除小鼠模型已被成功使用多年，但直到最近更先进的分析方法才使得在单细胞水平上获得更深入的见解成为可能。然而，对于大多数这些方法而言，获得单个肝细胞是基本前提。目前大多数原代肝细胞分离方案均基于两步胶原酶灌注技术，随后通过密度梯度纯化，以将活肝细胞与碎片、非实质细胞以及死亡细胞分离开来^7,8,9。该方法最早由Berry和Friend于1969年提出¹⁰，并在1972年由Seglen及其同事进行了改进^11,12。然而，由于梯度离心依赖于细胞的密度和大小，富含脂质的肝细胞在标准纯化过程中常常丢失。虽然此类损失在许多研究问题中可能微不足道，但对于早期肝再生研究而言却至关重要。在再生的最初两天内，再生小鼠肝脏中的肝细胞会积累脂质，导致细胞体积增大、密度降低。这种与再生相关的短暂性脂肪变性（TRAS）为肝脏再生提供能量来源，具有暂时性，但部分与主要增殖阶段重叠，并且在肝小叶（肝脏的功能单位）内分布不均^13,14。然而，在大范围86%肝切除术后，TRAS同样会发生但持续存在，原因是再生受阻，脂质无法被氧化¹⁴。因此，在70%或86%肝切除术后采用梯度纯化法分离肝细胞将导致所得细胞群体缺乏代表性，因为大多数富含脂质的肝细胞因其密度较低而在纯化过程中丢失¹⁵。

在本改良的分离方案中，于C57BL/6小鼠肝切除术后24-48小时，采用经典的两步胶原酶灌注法分离肝细胞。通常，细胞分离所需的残余肝脏插管和灌注操作在此时间段内进行 通过 门静脉。然而，大范围切除术后残留的小部分肝脏中门静脉血管阻力较高¹⁶，因此灌注过程需十分轻柔。由于肝切除术不影响下腔静脉，因此可轻松进行逆向灌注 通过 下腔静脉插管。标准蠕动泵驱动加温后的溶液 通过 通过门静脉流出，采用逆行灌注法将导管插入下腔静脉至肝脏残余部分补充图 S1）。肝细胞通过胶原酶消化从格利森囊分离并释放。经过洗涤及采用低速离心法逐步分离获取活肝细胞后，这些肝细胞可用于任何后续分析。

方案

所有动物实验均遵循瑞士联邦动物管理条例，并经苏黎世兽医办公室批准（编号 007/2017、156/2019），以确保动物福利。使用10至12周龄的雄性C57BL/6小鼠，饲养于12小时昼夜循环环境中，自由摄食和饮水。每个实验组包含六至八只动物。有关本实验方案中使用的所有材料、设备和试剂的详细信息，请参见材料表。

1. 小鼠部分肝切除术

1. 对于标准肝切除术（70%），结扎并切除左侧叶、方叶的右部分以及方叶的左部分（图1B）。对于扩大肝切除术（86%）⁴，还需切除尾状叶和右前叶（图1C）。
2. 注：标准肝切除术是多年来用于肝脏再生研究的一种手术方法。该手术的实验方案已有报道^3,17，包括Mitchell和Willenbring提供的视频辅助方案¹⁸。本研究中所用肝切除技术的更多细节详见补充文件1。

图1：小鼠标准（70%）和扩大（86%）肝切除术。（A）小鼠肝脏的五个叶及其各自占肝脏总重量的比例。（B）小鼠70%肝切除术的示意图。深色部分表示未来的肝脏残留部分。（C）小鼠86%肝切除术的示意图。深色部分表示未来的肝脏残留部分。（D）70%和86%肝切除术后切除组织的精确体积。（E）小鼠70%肝切除术后即刻的腹部情况；（F）小鼠86%肝切除术后即刻（左）和48小时后（右）的腹部情况。注意脂肪变性残留肝组织的苍白颜色（白色箭头）。n = 6–7/组。缩写：sHx = 标准肝切除术；eHx = 扩大肝切除术；LW = 肝脏重量。请点击此处查看该图的放大版本。

2. 灌注液的制备

1. 配制灌注、消化和保存缓冲液（见表1）。
   1. 根据需要加入氢氧化钠（NaOH）或盐酸（HCl），将所有缓冲液在37 °C下的pH值调节至7.4。
   2. 将保存缓冲液和Williams' Medium E置于冰上。
2. 配制流式细胞术缓冲液，并将其置于冰上保存。

表1：用于肝细胞消化和纯化的溶液与缓冲液。 请点击此处下载该表格。

3. 灌注设备的准备

1. 将水浴锅预热至 42 °C，并将灌注缓冲液（50 mL）和消化缓冲液（10–20 mL）放入水浴中。此时不要向消化缓冲液中添加胶原酶。
2. 准备蠕动泵并插入管路。完整的灌注装置如图所示 图2.
   1. 使用鲁尔锁接头将26 G静脉套管连接至管路的出口端。将管路的入口端插入水浴中预热的灌注缓冲液管内。先用70%乙醇冲洗管路，随后用50 mL无菌氯化钠溶液（NaCl 0.9%）冲洗。用温热的灌注缓冲液预充管路（泵速3 mL/min）。
3. 使用异氟烷吸入麻醉（800 mL/min 氧气）使小鼠镇静₂，3%–5% 异氟烷用于诱导，2% 用于术中维持）。操作异氟烷时应在通风橱内进行，并确保通风充分。
4. 手术前30分钟皮下注射布托啡诺，剂量为0.1 mg/kg体重。
5. 为防止低体温，将麻醉后的小鼠置于加热垫上，并在上腹部下方垫一卷布质纸巾，以抬高肝脏使其高于其他器官，便于暴露下腔静脉。
   注意：不要使用过厚的组织，因为可能导致血管扭曲，影响灌注效果。
6. 涂抹眼膏以防止角膜损伤。
7. 手术开始前，通过测试足底退缩反射（对两只后足的足垫进行夹捏）确认动物是否已充分麻醉。若出现反应，需追加麻醉药物，并在开始操作前重新测试。
8. 用70%乙醇清洁腹部。
   1. 通过剪断缝线并轻轻拉开切口边缘，重新打开正中切口。如果肝切除术超过24–48小时，则拆除缝线，并用剪刀剪开皮肤。
   2. 将5-0聚丙烯缝线固定于胸骨，向头侧牵拉并保持固定。使用牵开器或简易夹子维持腹腔开放。应尽可能充分暴露腹腔，以优化操作通路和视野。
9. 用棉签将肠道向右侧移动，以暴露门静脉和下腔静脉。使用湿布固定肠道。
10. 将一个高度约为 2 cm 的重物（例如，容量瓶用硅胶涂层砝码环）放置在小鼠后肢旁边补充图 S2A）。将连接有26 G静脉套管的管路置于物体上，并小心地将针头放置于下腔静脉上方。调整管路长度。
11. 将制备好的胶原酶储备液加入预热的消化缓冲液管中。向10 mL消化缓冲液中加入250 µL储备液。每只动物准备10–20 mL消化缓冲液。对于较大的动物或全肝脏灌注，可准备最多30 mL消化缓冲液。
    注意：建议在消化过程开始前约30分钟，将胶原酶贮存液加入预热的消化缓冲液中。
    
    图2灌注系统概述。 (A) 带有灌注所需设备的手术台。B用于肝脏制备以及肝细胞提取与分离所需的材料。 请点击此处以查看此图的放大版本。

4. 插管与灌注

1. 将泵速调节至 3 mL/min 并启动泵。使预热的灌注缓冲液流至针头处。弃去最初的 2–3 mL 灌注缓冲液。
2. 进行下腔静脉插管。
   1. 在缓冲液流经针头的同时，以较小角度将 26 G 静脉套管插入肾下方的下腔静脉，确保针尖斜面朝上。
   2. 使用棉签轻轻将穿刺点下方的下腔静脉向尾侧牵拉，以提供张力，便于套管插入静脉。当针头进入管腔时，观察导管的回血腔内是否有血液出现。
   3. 再将针头向前推进 2–3 mm，以确保塑料导管的尖端也已进入静脉。
   4. 将塑料导管沿针头滑入下腔静脉约 5 mm，然后缓慢且极其小心地取出针头。
      注意：不建议用结扎线固定套管。此步骤耗时，因需先游离血管。若套管位置较松并有物体支撑，则无需进一步固定（参见 补充图 S2 中的灌注装置）。为稳定插管部位并防止反流，可在插管部位滴加一滴单体正丁基氰基丙烯酸酯。
3. 当下腔静脉有血液滴出时，使用注射器注入温热的灌注缓冲液以充满套管。
4. 将管路重新连接至套管，泵速仍维持在 3 mL/min，使灌注缓冲液进入肝脏。
5. 2–3 秒后，观察肝脏表面是否出现白色斑点和/或门静脉扩张/肿胀，这表明灌注缓冲液正通过肝脏，并从中央静脉进入肝小叶（图 3）。
6. 当肝脏表面出现白色斑点后 1–2 秒内，观察到门静脉明显膨胀时，用剪刀尽可能远离肝门处剪断门静脉。使用微血管夹标记（而非阻断）剪切位置（图 3B）。
   注意：此操作有助于在灌注过程中评估肝脏内的血流情况。肝脏会立即排空血液，并在数秒内变为黄白色（图 3C）。在腹腔开口右侧皮肤再做一剪口，有助于血液及灌注液的流出（图 3B 和 Supplementary Figure S2B,C）。
7. 根据动物体重、肝脏大小以及先前肝切除的程度，将流速提高至 4–7 mL/min。
8. 用镊子或血管夹夹闭门静脉 7–10 秒，确保无液体通过。
   注意：夹闭期间肝脏会明显膨胀，松开后则回缩。此步骤对彻底冲洗整个肝脏、清除残留血液至关重要。
9. 约 30 秒后进行第二次夹闭，确认肝脏再次膨胀并回缩。继续冲洗动物，直至从门静脉流出的缓冲液变得澄清，但至少持续 3–4 分钟。
   注意：泵速取决于所用导管及肝脏大小，需根据个体情况评估调整。
10. 此时，动物应已因失血而死亡。确认全身循环已停止（无心跳或心脏颤动）。为确保死亡，应在该阶段实施双侧气胸，作为安乐死的辅助物理方法。
    注意：若全身循环已停止（无心跳或心脏颤动），可略微降低泵速。

图3：从插管到消化的灌注过程。（A）小鼠肝脏解剖结构，显示下腔静脉（白色箭头）和门静脉（黄色箭头）。（B）下腔静脉插管。用结扎线固定套管（白色箭头），并用微血管夹标记门静脉开放处的流出位置（未夹闭）。（C）注意在灌注液清除肝脏残留血液之前，肝脏表面出现的斑块状结构（白色箭头）。切开皮肤（黄色箭头），并放置棉签以确保血液和灌注液的排出。可使用血管夹或镊子进行间歇性夹闭。（D）肝脏应完全清除血液（*）。当含有胶原酶的消化液进入肝脏后，肝脏在夹闭后不再松弛，且肝叶体积增大。（E）一段时间后，可观察到肝脏表面出现气泡样外观（*）。请点击此处查看该图的放大版本。

5. 消化

1. 暂停灌注泵，迅速将进样管从灌注缓冲液转移至预热的消化缓冲液中，然后重新启动泵。
2. 在消化缓冲液到达肝脏之前，再次夹闭门静脉 3-4 秒。确保夹闭释放后肝脏松弛，且灌注液保持澄清。
   注意：消化缓冲液含有酚红，易于与澄清的灌注缓冲液区分，便于在管路中追踪。
3. 一旦消化缓冲液到达肝脏，立即使用微血管夹再次夹闭门静脉。
   注意：夹闭时肝脏会膨胀，但在释放夹子后不会松弛，此现象属正常。
4. 为促进消化过程，使用血管夹在膈肌下方直接闭合上腔静脉，使消化缓冲液从下腔静脉经肝脏流向开放的门静脉流出。
   注意：此夹闭可确保绕过体循环，避免与残留血液成分或抑制物发生不必要的接触。此步骤为可选，因为在假手术后，由于肝组织肿大，难以接近上腔静脉；但在肝切除小鼠中则更容易操作。
5. 以 5 mL/min 的流速消化约 4 分钟。随着消化进行，观察肝脏开始膨胀的迹象，以及肝脏表面出现小块透明或清澈区域。此外，肝脏质地应类似于一块湿润的布料，外观几乎呈湿软状（图 3E）。可用湿润的棉签轻轻触碰以检测其软硬度。
6. 继续灌注，直至肝脏表面质地出现明显变化。观察到肝脏颜色变得非常浅，呈现起泡状外观（图 3E），且格利森囊（即肝脏被膜）与实质组织分离。一旦肝脏具备上述特征，应立即停止消化，因为过度消化可能损伤肝细胞。在空气进入肝脏前拔除针头。
   注意：通常需要 10-20 mL 消化缓冲液才能达到充分消化效果。具体用量取决于动物体型、肝切除程度、管路设置以及胶原酶溶液的质量。如有需要，应延长灌注时间而非提高灌注速度。血管系统内压力过高可能导致肝脏破裂，使灌注/消化液泄漏至腹膜后间隙。

6. 肝脏的制备

1. 轻柔地将肝脏从腹腔中取出。由于此时肝脏非常脆弱，操作时需格外小心。
2. 用镊子夹住肝叶之间的中央结缔组织，并轻轻向上提起，以此作为固定点。
3. 切断肝脏与其他器官的所有连接，移除胆囊，并将肝脏置于冰冻的保存缓冲液中。
   注意：理想情况下，应立即进行肝细胞提取和后续处理，以维持肝细胞的活性。但如有必要，肝脏可在 4 °C 下短期保存（例如用于运输），但延迟时间不应超过 30–40 分钟。

7. 肝细胞提取

1. 将肝脏转移至一个10 cm的培养皿中，并加入10 mL冰冻的Williams' Medium E。
2. 用尖头镊子在肝脏表面多处轻轻刺破格利森氏囊。用两把镊子夹住肝脏中央部位（例如肝门处的结缔组织），缓慢拉开，使包膜撕裂而不损伤肝细胞。通过轻轻摇晃包膜释放细胞（补充图S3）。
   注意：理想情况下，肝脏应易于撕裂并释放细胞。切勿用力拉扯。可使用细胞刮刀帮助完全去除所有细胞，提高细胞得率。切勿用剪刀将肝脏剪成碎片。
3. 将5 mL肝组织浆液通过100 µm细胞滤网过滤至50 mL离心管中。用10 mL新鲜的冰冻培养基冲洗滤网。再将剩余的5 mL组织浆液通过同一细胞滤网过滤。
   注意：使用25 mL刻度移液管转移含有解离肝细胞的肝组织浆液（图4A）。使用开口较小的较小移液管会增加剪切应力，导致肝细胞不可逆损伤。
4. 加入总共30 mL冷培养基冲洗培养皿，过滤后将悬液加入50 mL离心管中直至装满。所有分离的细胞现均处于悬液中（图4B）。

图 4：通过温和离心进行纯化。（A）提取步骤后剩余的肝脏匀浆。（B）匀浆的显微图像（20倍放大），注意可见明显的碎片污染。（C）纯化离心步骤，以及（D）将被弃去的上清液的显微图像。（E）纯化后的肝细胞组分的显微图像。比例尺 = 100 µm。请点击此处查看该图的放大版本。

8. 肝细胞分离

1. 在 4 °C 条件下以 50 × g 离心 5 分钟（加速度和刹车均设为最低）。
   注意：肝细胞比非实质肝细胞密度更高。由于离心力较低，只有肝细胞会形成沉淀，而其他细胞（如免疫细胞、红细胞和窦状隙细胞）则保留在上清液中。
2. 吸除大部分上清液，留下 1 mL 液体，通过轻轻旋转离心管重悬细胞。
3. 加入 40 mL 冰冷的 Williams' E 培养基，在 4 °C 条件下再次以 50 × g 离心 10 分钟（低加速度、低刹车），以进一步去除死亡的肝细胞和细胞碎片，获得存活且富含脂质的肝细胞沉淀（图 4C）。
4. 弃去大部分上清液，留下 1 mL 液体，通过旋转离心管重悬细胞。
5. 加入 40 mL 冰冷的 Williams' E 培养基，在 4 °C 条件下再次以 50 × g 离心 5 分钟（低加速度、低刹车）。
6. 吸除大部分上清液，留下 1 mL 液体，通过轻轻旋转离心管重悬细胞。
   注意：在细胞固定或分析完成前，不得中断此过程。肝细胞非常脆弱，灌注、消化和纯化过程中的任何延迟都可能造成细胞损伤。
7. 加入台盼蓝后，使用改进型 Neubauer 计数板测定最终细胞浓度。
   注意：目前大多数碎片和非实质肝细胞已被去除，70% 肝切除术后可获得约 10–15 × 10⁶ 个肝细胞的纯净沉淀。
8. 根据所需浓度，加入更多冰冻培养基。将肝细胞悬液用于后续分析，或开始原代细胞培养。
   注意：在此阶段，悬液中仅残留少量免疫细胞和非实质肝细胞（<5%）。如需进一步纯化，可通过磁性或荧光激活细胞分选（MACS/FACS）对 CD31⁺ 和 CD45⁺ 细胞进行阴性筛选。迄今为止，尚未发现可用于肝实质细胞的可靠且稳定的表面标志物。

9. 流式细胞术用分离肝细胞的制备

1. 将肝细胞在 100 × g 条件下离心 5 分钟。
2. 弃去上清液，并根据细胞悬液的浓度加入适量的流式细胞术缓冲液。
3. 取 1 mL 细胞悬液加入流式管中，在 100 × g 条件下离心 5 分钟，弃去上清液。
4. 向细胞中加入 100–200 µL 稀释后的 Alexa Fluor 488 Zombie Green 活性染料（稀释比例为 1:400），轻轻振荡混匀。通过手动轻轻摇晃或使用涡旋混合器以低速（最大 2–3）振荡 2 秒，仔细重悬肝细胞。
   注意：请勿使用细小的移液器吸头重悬细胞。肝细胞非常脆弱，剪切力会造成损伤并降低细胞活性。若无法避免移液操作，请使用 1,000 µL 移液器，并剪去吸头最细部分以增大孔径，缓慢吸取细胞。
5. 根据所需的染色条件，将流式管置于冰上或室温保存。在避光条件下孵育 20–30 分钟。
6. 加入 2 mL 流式细胞术缓冲液，洗涤细胞 3 次。每次洗涤后均在 100 × g 条件下离心 5 分钟。
7. 加入 2 mL 固定缓冲液（1:1 混合的 4% 多聚甲醛与 PBS）。通过手动轻轻摇晃或使用涡旋混合器以低速（最大 2–3）振荡 2 秒，仔细重悬肝细胞。
8. 固定细胞 30 分钟。
9. 再次在 100 × g 条件下离心 5 分钟，弃去上清液，加入流式细胞术缓冲液。
   注意：细胞在分离后最多可在流式细胞术缓冲液中保存 72 小时，再进行分析。

10. 使用流式细胞术分析肝细胞

1. 使用荧光激活细胞分选仪分析肝细胞。
   注意：考虑到肝细胞相对较大的尺寸，需调整电压。建议从低电压开始，前向散射（FSC）电压不超过350 V，侧向散射（SSC）电压不超过220 V。
   1. 根据细胞预估的较大尺寸，调整FSC和SSC的电压。通过SSC-A和FSC-A识别肝细胞群体，并记录所有事件（图5A）。
   2. 观察到碎片和非实质细胞位于FSC与SSC密度图的左下角，并被排除（图5A）。
   3. 由于双联体细胞可能影响分析结果，构建侧向散射高度（SSC-H）与侧向散射面积（SSC-A）的密度图以排除双联体，如图5B所示。
   4. 通过设门筛选CD31^-（内皮细胞标志物）和CD45^-（免疫细胞标志物）的细胞，确定最终的肝细胞群体（图5C）。

结果

在肝切除术后16小时，肝再生相关性苍白（TRAS）达到高峰，并在标准肝切除术后32-48小时内逐渐消失，但在扩大肝切除术后会持续超过48小时。肉眼可见，TRAS表现为肝脏残留部分的苍白外观（图1F），可在肝切除术后16至48小时的小鼠中观察到。

70%肝切除术后小鼠的估计最终肝细胞产量为10-15 × 10⁶，扩大至86%肝切除术后为4-9 × 10⁶，最终平均活力分别为78%和65%。这与来自整只小鼠肝脏的总产量50-70 × 10⁶相比，符合预期比例（图6A，C）。部分肝切除术后，肝细胞的细胞体积较正常肝脏增大，与其脂质含量增加相对应（图6B）。门控策略见补充图S4。

讨论

已发表的方案提供了一种可靠且简便的方法，用于分离获得高产量的正常及脂肪变性小鼠肝细胞，适用于单细胞下游分析或经FACS分选后的细胞群体分析。与密度梯度纯化法相比，其显著优势在于细胞内的脂质含量几乎不影响肝细胞的有效得率。因此，脂肪变性肝细胞的比例得以保留并包含在后续分析中。这一点不仅对于脂肪生成性肝病的研究至关重要，而且在研究大部肝切除术后相关过程时也极为关键，因为在肝再生的最初2-3天内，肝细胞会表现出时空动态的脂肪变性。尽管在肝切除术后已开展过对分离肝细胞的（单细胞）分析^19,20,21，但可以推断，所分析的细胞群体至少部分缺失了富含脂质的肝细胞，因此结果未能完全代表真实情况，而偏向于瘦型肝细胞。

目前，TRAS 的功能尚未完全阐明。例如，肝小叶内脂质含量的空间差异仍不清楚。因此，需要一种能够在不将这些细胞精确排除在分析之外的情况下实现定性和定量检测的方法（例如用于单细胞转录组学、流式细胞术和...

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
试剂
Alexa Fluor 488 Zombie green	BioLegend	423111	胺反应性活率染料
Attane Isoflurane ad us. vet. 99.9%	Provet AG	QN01AB06	注意：需要通风
EDTA 溶液	Sigma-Aldrich	E8008-100ML	-
乙醇	Sigma-Aldrich	V001229	用水稀释至 70%
胎牛血清 (FCS)	Gibco	A5256701	-
Hanks' 平衡盐溶液 (HBSS)，含 Ca2+、Mg2+，含酚红	Sigma-Aldrich	H9269-6x600ML	用于消化/保存
Hanks' 平衡盐溶液 (HBSS)，无 Ca2+，无 Mg2+，无酚红	Sigma-Aldrich	H6648-6x500ML	用作灌注缓冲液
HEPES 溶液，1 M	Sigma-Aldrich	83264-100ML-F	-
Histoacryl 组织粘合剂（丁基-2-氰基丙烯酸酯）	B. Braun	1050052	用于固定插管部位
Hoechst 33258 染色染料溶液	Abcam	ab228550	-
Liberase 研究级	Roche	5401119001	冻干胶原酶 I/II
0.9% NaCl 500 mL Ecotainer	B. Braun	123	-
Paralube Vet 软膏	Dechra	17033-211-38	-
磷酸盐缓冲液 (PBS)	Gibco	A1286301	-
Sudan IV – 脂质染色	Sigma-Aldrich	V001423	-
Temgesic（盐酸丁丙诺啡）注射液 0.3 mg/mL	Indivior Europe Ltd.	345928	麻醉药品，需安全存放
台盼蓝，0.4%，无菌过滤	Sigma-Aldrich	T8154	用于细胞计数
Williams’ Medium E	Sigma-Aldrich	W4128-500ML	-
材料
25 mL 刻度移液管，Greiner Cellstar	Merck	P7865	-
50 mL Falcon 管	TPP	-	-
BD Neoflon Pro IV 导管 26 G	BD Falcon	391349	-
细胞刮刀，旋转刀片宽度 25 mm	TPP	99004	-
Falcon 细胞筛，100 µm 尼龙	BD Falcon	352360	-
带孔无菌手术巾	-	-	可重复使用的布料
16# 管用填充喷嘴（内径 3.1 mm）	Drifton	FILLINGNOZZLE#16	插入管中使用
流式细胞仪管，5 mL	BD Falcon	352008	-
雄性鲁尔接头转接头，管内径 3.2 mm	Drifton	LM41	连接注射器的管路
培养皿，96 x 21 mm	TPP	93100	-
Prolene 5-0	Ethicon	8614H	用于胸骨牵开
Prolene 6-0	Ethicon	8695H	用于皮肤缝合
Prolene 8-0	Ethicon	EH7470E	结扎胆囊
16# 管，壁厚 1.6 mm，内径 3.2 mm，外径 6.4 mm	Drifton	SC0374T	灌注管
设备
BD LSRFortessa 细胞分析流式细胞仪	BD	-	-
Isis 啮齿类动物剃毛器	Aesculap	GT421	-
异氟烷工作站	Provet	-	-
低速离心机 – Scanspeed 416	Labogene	-	-
改进型 Neubauer 计数板	Marienfeld	-	-
氧气浓缩器 – EverFlo	Philips	1020007	0 – 5 L/min
Pipetboy – Pipettor Turbo-Fix	TPP	94700	-
Shenchen 灌注泵 – YZ1515x	Shenchen	YZ1515x	-
手术显微镜 – SZX9	Olympus	-	-
ThermoLux 加热垫	Thermo Lux	-	-
Vortex Genie 2，2700 转/分钟	NeoLab	7-0092	-
水浴锅 – Precision GP 02	Thermo scientific	-	调节至 42 °C