富含脂质的肝细胞在肝脏再生过程中具有内在作用，但通常在密度梯度离心过程中丢失。本文介绍了一种优化的细胞分离方案，可保留脂肪变性肝细胞，从而在小鼠部分肝切除术后获得具有代表性的再生肝细胞群体。
本文内容
摘要
摘要
部分肝切除术已广泛用于研究小鼠肝脏再生，但为后续单细胞应用分离出高产量且存活率高的肝细胞仍具挑战性。在小鼠正常肝脏再生的前两天内，可观察到再生肝细胞中脂质显著积聚。这种被称为再生相关性短暂性脂肪变性（TRAS）的现象虽为暂时性，但与主要增殖阶段存在部分重叠。密度梯度纯化是目前大多数原代肝细胞分离方案的核心步骤。由于梯度纯化依赖于细胞的密度和大小，因此会将非脂肪变性肝细胞与脂肪变性肝细胞分离开。因此，脂肪变性的肝细胞常被丢失，导致所获得的肝细胞群体缺乏代表性。
本文所述方案介绍了一种简便且可靠的 体内 无论脂质含量如何分离再生肝细胞。在雄性C57BL/6小鼠肝切除术后24-48小时，采用经典的两步胶原酶灌注法分离肝细胞。标准蠕动泵驱动预热的灌注液 通过 将导管插入下腔静脉，利用逆行灌注技术经门静脉流出，灌注残余肝脏。通过胶原酶消化使肝细胞从格利森囊分离。经洗涤和仔细离心后，肝细胞可用于后续各项分析。总之，本文介绍了一种简单且可重复的小鼠部分肝切除术后分离再生肝细胞群体的技术。该方法也有助于脂肪肝疾病的研究。
引言
即使在发生重大组织损失后，肝脏仍能自我再生。这种独特的再生能力在部分（70%）肝切除的实验模型中得到了明确体现，该模型最早由 Higgins 和 Anderson 于 1931 年在大鼠中首次描述1。在此模型中，通过手术切除较大的肝叶，将动物体内 70% 的肝脏组织移除。剩余的肝叶随后通过代偿性肥大迅速生长，通常在术后约 1 周内恢复原有的肝脏质量，但并不恢复原有的肝脏结构2,3。此外，研究人员还开发了不同切除比例的其他肝切除模型，例如 86% 扩展性肝切除，其中残留肝组织过小而无法恢复，最终导致 30%–50% 的实验动物出现肝切除后肝功能衰竭（PHLF）并相继死亡4,5,6。这些模型可根据切除组织的多少，用于研究正常或失败的肝脏再生过程（图 1）。
尽管肝切除小鼠模型已被成功使用多年，但直到最近更先进的分析方法才使得在单细胞水平上获得更深入的见解成为可能。然而，对于大多数这些方法而言，获得单个肝细胞是基本前提。目前大多数原代肝细胞分离方案均基于两步胶原酶灌注技术，随后通过密度梯度纯化，以将活肝细胞与碎片、非实质细胞以及死亡细胞分离开来7,8,9。该方法最早由Berry和Friend于1969年提出10，并在1972年由Seglen及其同事进行了改进11,12。然而，由于梯度离心依赖于细胞的密度和大小，富含脂质的肝细胞在标准纯化过程中常常丢失。虽然此类损失在许多研究问题中可能微不足道，但对于早期肝再生研究而言却至关重要。在再生的最初两天内，再生小鼠肝脏中的肝细胞会积累脂质，导致细胞体积增大、密度降低。这种与再生相关的短暂性脂肪变性（TRAS）为肝脏再生提供能量来源，具有暂时性，但部分与主要增殖阶段重叠，并且在肝小叶（肝脏的功能单位）内分布不均13,14。然而，在大范围86%肝切除术后，TRAS同样会发生但持续存在，原因是再生受阻，脂质无法被氧化14。因此，在70%或86%肝切除术后采用梯度纯化法分离肝细胞将导致所得细胞群体缺乏代表性，因为大多数富含脂质的肝细胞因其密度较低而在纯化过程中丢失15。
在本改良的分离方案中，于C57BL/6小鼠肝切除术后24-48小时，采用经典的两步胶原酶灌注法分离肝细胞。通常，细胞分离所需的残余肝脏插管和灌注操作在此时间段内进行 通过 门静脉。然而，大范围切除术后残留的小部分肝脏中门静脉血管阻力较高16，因此灌注过程需十分轻柔。由于肝切除术不影响下腔静脉，因此可轻松进行逆向灌注 通过 下腔静脉插管。标准蠕动泵驱动加温后的溶液 通过 通过门静脉流出，采用逆行灌注法将导管插入下腔静脉至肝脏残余部分补充图 S1）。肝细胞通过胶原酶消化从格利森囊分离并释放。经过洗涤及采用低速离心法逐步分离获取活肝细胞后，这些肝细胞可用于任何后续分析。
方案
所有动物实验均遵循瑞士联邦动物管理条例，并经苏黎世兽医办公室批准（编号° 007/2017、156/2019）确保动物福利。使用10-12周龄雄性C57BL/6小鼠，维持12小时昼夜循环，自由摄食和饮水。每个实验组包含六至八只动物。见 材料表 有关本方案中使用的所有材料、仪器和试剂的详细信息。
1. 小鼠部分肝切除术
- 对于标准肝切除术（70%），结扎并切除左外侧叶、方叶的右部分以及方叶的左部分（图1B）。对于扩大肝切除术（86%）4，还需切除尾状叶和右前叶（图1C）。
- 注意：标准肝切除术是多年来用于肝脏再生研究的一种手术方法。该手术的实验方案已有文献报道3,17，包括Mitchell和Willenbring的视频辅助操作方案18。本研究中所用肝切除技术的更多细节详见补充文件1。
图1：小鼠的标准（70%）和扩大（86%）肝切除术。（A）小鼠肝脏的五个叶及其各自占总肝重的比例。（B）小鼠70%肝切除术的示意图。深色部分代表未来的残留肝脏。（C）小鼠86%肝切除术的示意图。深色部分代表未来的残留肝脏。（D）70%和86%肝切除术后切除组织的精确体积。（E）70%肝切除术后立即的小鼠腹部情况；（F）86%肝切除术后即刻（左）和48小时（右）的小鼠腹部情况。注意脂肪变性残留肝组织的苍白颜色（白色箭头）。n = 6–7/组。缩写：sHx = 标准肝切除术；eHx = 扩大肝切除术；LW = 肝重。请点击此处查看该图的放大版本。
2. 灌注液的制备
- 配制灌注、消化和保存缓冲液（见表1）。
- 根据需要加入氢氧化钠（NaOH）或盐酸（HCl），将所有缓冲液溶液在37 °C下的pH值调节至7.4。
- 将保存缓冲液和Williams' Medium E置于冰上。
- 配制流式细胞术缓冲液，并将其置于冰上保存。
表1：用于肝细胞消化和纯化的溶液与缓冲液。 请点击此处下载该表格。
3. 灌注设备的准备
- 将水浴加热至 42 °C 将灌注缓冲液（50 mL）和消化缓冲液（10–20 mL）放入水浴中。此时不要向消化缓冲液中添加胶原酶。
- 准备蠕动泵并插入管路。完整的灌注装置如图所示 图2.
- 使用鲁尔锁接头将26 G静脉套管连接至管路的出口端。将管路的入口端插入水浴中预热的灌注缓冲液管内。先用70%乙醇冲洗管路，随后用50 mL无菌氯化钠溶液（NaCl 0.9%）冲洗。用温热的灌注缓冲液预充管路（泵速3 mL/min）。
- 使用异氟烷吸入麻醉（800 mL/min 氧气）对小鼠进行镇静2，3%–5% 异氟烷用于诱导，2% 用于术中维持）。操作异氟烷时应在通风橱内进行，并确保通风充分。
- 术前30分钟皮下注射布托啡诺，剂量为0.1 mg/kg体重。
- 为防止低体温，将麻醉后的小鼠置于加热垫上，并在上腹部下方垫一卷布质纸巾，以抬高肝脏使其高于其他器官，便于暴露下腔静脉。
注意：不要使用过厚的组织，因为可能导致血管扭曲，影响灌注效果。 - 涂抹眼膏以防止角膜损伤。
- 手术开始前，通过测试足部退缩反射（对两只后足的足垫进行夹捏）确保动物已充分麻醉。若出现反应，需追加麻醉剂并重新测试，确认无反应后再开始操作。
- 用70%乙醇清洁腹部。
- 重新切开缝线，轻轻拉开切口边缘以开放正中切口。如果肝切除术距今已超过24–48小时，则拆除缝线，并用剪刀剪开皮肤。
- 将5-0聚丙烯缝线固定于胸骨，向头侧牵拉并保持该位置固定。使用牵开器或简易夹子维持腹腔开放。应尽可能充分暴露腹腔，以优化操作通路和视野。
- 使用棉签将肠管移向右侧，以暴露门静脉和下腔静脉。用湿布固定肠管。
- 将一个高度约为 2 cm 的重物（例如，用于容量瓶的硅胶涂层砝码环）放置在小鼠后肢旁边补充图 S2A）。将连接有26 G静脉套管的管路放置于物体上，并小心地将针头置于下腔静脉上方。调整管路的长度。
- 将制备好的胶原酶储备液加入预热的消化缓冲液管中。添加 250 µL 将贮存液加入10 mL消化缓冲液中。每只动物准备10–20 mL消化缓冲液。对于较大的动物或全肝脏灌注，可准备至30 mL消化缓冲液。
注意：建议在消化过程开始前约30分钟，将胶原酶贮存液加入预热的消化缓冲液中。
图2灌注系统概述。 (A) 带有灌注所需设备的手术台。B) 肝脏制备以及肝细胞提取与分离所需的材料。 请点击此处以查看此图的放大版本。
4. 插管与灌注
- 将泵速调节至 3 mL/min 并启动泵。使预热的灌注缓冲液流至针头处。弃去最初的 2–3 mL 灌注缓冲液。
- 进行下腔静脉插管。
- 在缓冲液流经针头的同时，以较小角度将 26 G 静脉套管插入肾下方的下腔静脉，确保针尖斜面朝上。
- 使用棉签轻轻将穿刺点下方的下腔静脉向尾侧牵拉，以提供张力，便于套管插入静脉。当针头进入管腔时，观察导管的回血腔内是否有血液出现。
- 再将针头向前推进 2–3 mm，以确保塑料导管的尖端也已进入静脉。
- 将塑料导管沿针头滑入下腔静脉约 5 mm，然后缓慢且极其小心地取出针头。
注意：不建议使用结扎线固定套管。此步骤耗时，因需先游离血管。若套管位置较松并有物体支撑，则无需进一步固定（参见 补充图 S2 中的灌注装置）。为稳定插管部位并防止反流，可在插管部位滴加一滴单体正丁基氰基丙烯酸酯。
- 当下腔静脉有血液滴出时，使用注射器注入温热的灌注缓冲液以充满套管。
- 将管路重新连接至套管，泵速仍保持在 3 mL/min，使灌注缓冲液进入肝脏。
- 2–3 秒后，观察肝脏表面是否出现白色斑点和/或门静脉扩张/肿胀，这表明灌注缓冲液正通过肝脏，并从中央静脉进入肝小叶（图 3）。
- 当肝脏表面出现白色斑点后，等待 1–2 秒内门静脉明显膨胀。用剪刀尽可能远离肝门处剪断门静脉。使用微血管夹标记（而非阻断）剪切位置（图 3B）。
注意：此操作有助于在灌注过程中评估肝脏内的血流情况。肝脏会立即排空血液，并在数秒内变为黄白色（图 3C）。在腹腔开口右侧皮肤处再做一剪口，有助于血液及灌注液的流出（图 3B 和 Supplementary Figure S2B,C）。 - 根据动物体重、肝脏大小以及先前肝切除的程度，将流速提高至 4–7 mL/min。
- 用镊子或血管夹夹闭门静脉 7–10 秒，确保无液体通过。
注意：夹闭期间肝脏会明显肿胀，松开后则回缩。此步骤对彻底冲洗整个肝脏并清除残留血液至关重要。 - 约 30 秒后进行第二次夹闭，确认肝脏再次出现肿胀与回缩。继续冲洗动物，直至从门静脉流出的缓冲液变得澄清，但至少持续 3–4 分钟。
注意：泵速取决于所用导管及肝脏大小，需根据个体情况评估调整。 - 在此操作阶段，动物应已因失血而安乐死。确认全身循环已停止（无心跳或心脏颤动）。为确保死亡，此时应实施双侧气胸，作为安乐死的辅助物理方法。
注意：若全身循环已停止（无心跳或心脏颤动），可略微降低泵速。
图3：从插管到消化的灌流过程。（A）小鼠肝脏解剖结构，显示下腔静脉（白色箭头）和门静脉（黄色箭头）。（B）下腔静脉插管。导管用结扎线固定（白色箭头），门静脉切开处的流出位置用微血管夹标记（未夹闭）。（C）注意在灌流液完全清除肝脏残留血液前，肝脏表面出现的斑块状结构（白色箭头）。皮肤已切开（黄色箭头），并放置棉签以确保血液和灌流液顺利排出。可间歇性使用血管夹或镊子进行夹闭。（D）肝脏应完全清除血液（*）。当含胶原酶的消化液进入肝脏后，肝脏在夹闭后不再松弛，且肝叶体积增大。（E）一段时间后，可观察到肝脏表面出现气泡样外观（*）。请点击此处查看该图的放大版本。
5. 消化
- 暂停灌注泵，迅速将进样管从灌注缓冲液转移至预热的消化缓冲液中，然后重新启动泵。
- 在消化缓冲液到达肝脏之前，再次用血管夹夹闭门静脉 3-4 秒。确保夹闭释放后肝脏松弛，且灌注液保持澄清。
注意：消化缓冲液含有酚红，易于与澄清的灌注缓冲液区分，便于在管路中追踪。 - 一旦消化缓冲液到达肝脏，立即使用微血管夹再次夹闭门静脉。
注意：夹闭时肝脏会膨胀，但在释放夹子后不会松弛，此现象属正常。 - 为促进消化过程，用血管夹在膈肌下方直接闭合上腔静脉，使消化缓冲液从下腔静脉经肝脏流向已开放的门静脉流出端。
注意：此夹闭操作可确保绕过体循环，避免与残留血液成分或抑制物发生不必要的接触。此步骤为可选，因为在假手术后，增大的肝组织会遮挡上腔静脉，难以操作；但在肝切除小鼠中则更容易接近。 - 以 5 mL/min 的流速持续消化约 4 分钟。随着消化进行，观察肝脏是否开始肿胀，表面是否出现小块透明或清澈区域。此外，肝脏应呈现出类似湿布的质地，外观近乎湿软（图 3E）。可用湿润的棉签轻轻触碰以检测其软硬度。
- 继续灌注，直至肝脏表面质地出现明显变化。观察到肝脏颜色变得极浅，呈现气泡状外观（图 3E），且格利森囊（即肝脏被膜）与实质组织分离时，应立即停止消化，因为过度消化会损伤肝细胞。在空气进入肝脏前拔除针头。
注意：通常需要 10-20 mL 消化缓冲液才能达到充分消化效果。具体用量取决于动物体型、肝切除程度、管路设置以及胶原酶溶液的质量。必要时可延长灌注时间，但不应提高灌注速度。血管系统内压力过高可能导致肝脏破裂，使灌注/消化液泄漏至腹膜后间隙。
6. 肝脏的制备
- 轻柔地将肝脏从腹腔中取出。由于此时肝脏非常脆弱，操作时需格外小心。
- 用镊子夹住肝叶之间的中央结缔组织，并轻轻向上提起，作为固定支点。
- 切断肝脏与其他器官的所有连接，移除胆囊，并将肝脏置于冰冻的保存缓冲液中。
注意：理想情况下，应立即进行肝细胞提取和后续处理，以维持肝细胞的活性。但如有必要，肝脏可在 4 °C 下短期保存（例如用于运输），但延迟时间不应超过 30–40 分钟。
7. 肝细胞提取
- 将肝脏转移至一个10 cm的培养皿中，并加入10 mL冰冻的Williams' Medium E。
- 用尖头镊子在肝脏表面多处轻轻刺破格利森氏囊。用两把镊子夹住肝脏中央部位（例如肝门处的结缔组织），缓慢拉开，使包膜撕裂而不损伤肝细胞。通过轻轻摇晃包膜释放细胞（补充图S3）。
注意：理想情况下，肝脏应易于撕裂并释放细胞。切勿用力拉扯。可使用细胞刮刀帮助完全去除所有细胞，提高细胞得率。切勿用剪刀将肝脏剪成碎片。 - 将5 mL肝组织匀浆通过100 µm细胞滤网过滤至50 mL离心管中。用10 mL新鲜的冰冻培养基冲洗滤网。再将剩余的5 mL匀浆通过同一细胞滤网过滤。
注意：使用25 mL移液管转移含有解离肝细胞的肝匀浆（图4A）。使用开口较小的较小移液管会增加剪切力，导致肝细胞不可逆损伤。 - 加入总共30 mL冷培养基冲洗培养皿，过滤后将悬液加入50 mL离心管直至装满。所有分离的细胞现均处于悬液中（图4B）。
图4：通过温和离心进行纯化。（A）提取步骤后剩余的肝脏匀浆。（B）匀浆的显微图像（20倍放大），注意可见明显的碎片污染。（C）纯化离心步骤，以及（D）需弃去的上清液的显微图像。（E）纯化后肝细胞组分的显微图像。比例尺 = 100 µm。请点击此处查看该图的放大版本。
8. 肝细胞分离
- 在 4 °C 条件下以 50 × g 离心 5 分钟（加速度和刹车力度调至最低）。
注意：肝细胞比非实质肝细胞密度更高。由于离心力较低，只有肝细胞形成沉淀，而其他细胞（如免疫细胞、红细胞和窦状隙细胞）则保留在上清液中。 - 吸除大部分上清液，保留 1 mL 用于通过轻轻旋转离心管重悬细胞。
- 加入 40 mL 冷的 Williams' E 培养基，在 4 °C 条件下再次以 50 × g 离心 10 分钟（低加速度，低刹车），以进一步去除死亡的肝细胞和细胞碎片，沉淀存活且富含脂质的肝细胞（图 4C）。
- 弃去大部分上清液，保留 1 mL 用于通过旋转离心管重悬细胞。
- 加入 40 mL 冷的 Williams' E 培养基，在 4 °C 条件下再次以 50 × g 离心 5 分钟（低加速度，低刹车）。
- 吸除大部分上清液，保留 1 mL 用于通过轻轻旋转离心管重悬细胞。
注意：在细胞固定或分析完成前，不得中断此过程。肝细胞非常脆弱，灌注、消化和纯化过程中的任何延迟都可能损伤细胞。 - 加入台盼蓝后，使用改进型 Neubauer 计数板测定最终细胞浓度。
注意：目前大多数碎片和非实质肝细胞已被去除，70% 肝切除术后可获得约 10–15 × 106 个肝细胞的纯净沉淀。 - 根据所需浓度加入更多冰上预冷的培养基。将肝细胞悬液用于后续分析或启动原代细胞培养。
注意：在此阶段，悬液中仅残留少量免疫细胞和非实质肝细胞（<5%）。如需进一步纯化，可通过磁珠分选或荧光激活细胞分选（MACS/FACS）对 CD31+ 和 CD45+ 细胞进行阴性筛选。迄今为止，尚未发现可用于肝实质细胞的可靠且稳定的表面标志物。
9. 流式细胞术用分离肝细胞的制备
- 将肝细胞在 100 × g 条件下离心 5 分钟。
- 弃去上清液，并根据细胞悬液的浓度加入适量的流式细胞术缓冲液。
- 取 1 mL 细胞悬液加入流式管中，在 100 × g 条件下离心 5 分钟后弃去上清液。
- 向细胞中加入 100–200 µL 稀释后的 Alexa Fluor 488 Zombie Green 活性染料（稀释比例 1:400），轻轻振荡混匀。通过手动振荡或使用涡旋振荡器以低速（最大 2–3）振荡 2 秒，小心重悬肝细胞。
注意：请勿使用细小的移液器吸头重悬细胞。肝细胞非常脆弱，剪切力会造成损伤并降低细胞活性。若无法避免移液操作，请使用 1,000 µL 移液器，并剪去吸头最细部分以增大孔径，缓慢移取细胞。 - 根据所需的染色条件，将流式管置于冰上或室温保存。在避光条件下孵育 20–30 分钟。
- 加入 2 mL 流式细胞术缓冲液，洗涤细胞 3 次。每次洗涤后均在 100 × g 条件下离心 5 分钟。
- 加入 2 mL 固定缓冲液（1:1 混合的 4% 多聚甲醛与 PBS）。通过手动振荡或使用涡旋振荡器以低速（最大 2–3）振荡 2 秒，小心重悬肝细胞。
- 固定细胞 30 分钟。
- 再次在 100 × g 条件下离心 5 分钟，弃去上清液，加入流式细胞术缓冲液。
注意：细胞在分离后最多可在流式细胞术缓冲液中保存 72 小时，再进行分析。
10. 使用流式细胞术分析肝细胞
- 使用荧光激活细胞分选仪分析肝细胞。
注意：考虑到肝细胞相对较大的尺寸，需调整电压。建议从低电压开始，前向散射（FSC）电压不超过350 V，侧向散射（SSC）电压不超过220 V。- 根据细胞估计的较大尺寸调整FSC和SSC的电压。通过SSC-A和FSC-A识别肝细胞群体，并记录所有事件（图5A）。
- 观察到碎片和非实质细胞位于FSC与SSC密度图的左下角，应予以排除（图5A）。
- 由于双联体细胞可能影响分析结果，构建侧向散射高度（SSC-H）与侧向散射面积（SSC-A）的密度图以排除双联体，如图5B所示。
- 通过设门筛选CD31-（内皮细胞标志物）和CD45-（免疫细胞标志物）的细胞，确定最终的肝细胞群体（图5C）。
结果
在肝切除术后16小时，肝再生相关性苍白（TRAS）达到高峰，并在标准肝切除术后32-48小时内逐渐消失，但在扩大肝切除术后可持续超过48小时。肉眼可见，TRAS表现为肝脏残留部分的苍白外观（图1F），可在肝切除术后16至48小时的小鼠中观察到。
70%肝切除术后小鼠的估计最终肝细胞产量为10-15 × 106，扩展性86%肝切除术后为4-9 × 106，最终平均活力分别为78%和65%。该产量与整只小鼠肝脏的总产量50-70 × 106相比，符合预期百分比（图6A、C）。部分肝切除术后，肝细胞体积较正常肝脏增大，与其脂质含量增加相对应（图6B）。门控策略见补充图S4。
图6：肝细胞产量、细胞大小和活力。（A）整个小鼠肝脏以及70%和86%肝切除术后24小时残余肝脏的细胞计数。（B）分离肝细胞的计算细胞体积。注意在70%和86%肝切除术后24小时，细胞大小均显著增加。（C）纯化过程每一步后分离肝细胞的活力。活力通过流式细胞术使用Alexa Fluor 488 Zombie Green活力染料测定。百分比数据来自所有肝细胞单细胞群体。门控策略详见补充图S6和补充图S4。误差线表示标准差，n = 6–8/组。缩写：sHx = 标准肝切除术；eHx = 扩展肝切除术；w/o resection = 假手术。请点击此处查看该图的放大版本。
在小鼠部分肝切除术后24小时，可通过细胞颗粒度增加（图7；门控策略见补充图S5）或直接观察到肝细胞体积增大后胞内出现脂滴（图8 和 补充文件1）来发现肝细胞内脂质含量升高。
图7：通过流式细胞术检测到的颗粒度和细胞大小增加。（A）肝切除术后24小时分离肝细胞中颗粒度增加，作为脂质囊泡存在的间接标志。（B）显示侧向散射（SSC）的直方图。（C）百分比表示具有高细胞质颗粒强度的细胞比例，通过SSC信号测定。误差线表示标准差，n = 6–8/组。缩写：sHx = 标准肝切除术；eHx = 扩大肝切除术；w/o resection = 假手术；FSC = 前向散射信号；SSC = 侧向散射信号。请点击此处查看该图的放大版本。
图8：苏丹IV染色作为分离新鲜肝细胞脂肪含量的检测指标。（A）来自未经手术处理的完整小鼠肝脏的肝细胞。70%肝切除术后24小时（B）和86%肝切除术后（C）肝细胞体积增大且脂肪含量增加。注意同时存在较大的脂肪变性肝细胞和较小的非脂肪变性肝细胞。比例尺 = 30 µm（B-D）。误差线表示标准差，n = 6–8/组。缩写：sHx = 标准肝切除术；eHx = 扩大肝切除术；w/o resection = 假手术。请点击此处查看该图的放大版本。
最终悬液中仅残留极少量的免疫细胞和非实质细胞。如需进一步纯化，可采用FACS或MACS方法。CD31阴性筛选+ 和 CD45+ 通过流式细胞术对细胞进行分析，用于展示和定量非实质细胞（图5).
图5：流式细胞术设门策略及CD31-和CD45-实质细胞的筛选。（A）包含所有记录事件的设门图；考虑到肝细胞相对较大的体积，需调整电压设置。FSC电压不应超过350 V，SSC电压不应超过220 V。（B）单细胞设门。（C）通过设门筛选CD31-（内皮细胞标志物）和CD45-（免疫细胞标志物）的细胞以获得肝实质细胞。如有需要，可在荧光激活细胞分选仪中进行该筛选，以获取实质细胞用于后续分析；n = 4–5/组。缩写：FSC = 前向散射；SSC = 侧向散射。请点击此处查看该图的放大版本。
为了证明改进后的方案在保留脂肪变性肝细胞方面的有效性，采用经典的密度梯度法分离肝细胞7（图9A）。与改进后的方案（图9B）不同，在密度梯度顶部可明显观察到一层脂肪细胞。对细胞的分析证实，经密度梯度离心后，沉淀物中几乎不含脂质积聚的肝细胞。相反，脂肪层中的细胞富集了脂肪变性肝细胞，同时含有大量非实质细胞和死亡细胞（图9A）。因此，传统的分离方法会导致脂肪变性细胞的丢失，而本改进方案省略了密度梯度步骤，能够保留富含脂质的细胞亚群，从而实现对肝脏再生过程的无偏倚研究，避免偏向于瘦型肝细胞。
图9：经典密度梯度分离方案与改进方案在获取脂肪变性肝细胞产量上的比较。（A）采用经典密度梯度纯化方法（磷酸盐缓冲液中密度梯度溶液终浓度为90%），死亡的肝细胞会聚集在密度梯度溶液上方形成一层细胞层。（B）该细胞层不仅包含非实质细胞和无活性肝细胞，还包含有活性的、体积较大的脂肪变性肝细胞。（C）密度梯度离心后获得的沉淀物主要由体积较小的非脂肪变性肝细胞组成，几乎不含脂肪变性细胞。此即经典方案所获得的“纯”细胞组分。（D）采用改进方案后，富含脂滴的肝细胞不会丢失，所有肝细胞均被沉淀下来。上清液（E）主要由死亡和破碎的肝细胞以及非实质细胞组成，而沉淀物（F）则为不同大小和脂质含量的肝细胞混合物。比例尺 = 100 µm。请点击此处查看该图的放大版本。
补充文件1：补充实验方案。（A）苏丹IV脂质染色；（B）小鼠标准及扩展肝切除术。请点击此处下载该文件。
补充图S1：灌注装置示意图。 (1) 插管下腔静脉。(2) 用温热的灌注缓冲液灌注肝脏以螯合钙离子。(3) 将含有胶原酶和 Ca 的消化缓冲液预热2+ 解离细胞 体内. 取出肝脏，并（4）置于冰上预冷的保存缓冲液中（最多30分钟）。 请点击此处下载此文件。
补充图 S2：灌注装置。 （A）带有异氟烷喷嘴、红光加热灯和灌注管的灌注台。可在管路下方放置重物以固定其位置，减少移位风险。（B）灌注开始的最初几分钟内，部分血液会从门静脉流出，并积聚在开放的腹腔中。（C）在腹壁一侧做切口以引流血液，棉签有助于促进引流。请点击此处下载该文件。
补充图 S3：格利森囊。（A）用尖头镊子在肝脏表面多处轻轻撕破格利森囊，然后轻轻摇动囊膜以释放肝细胞。（B）肝脏应易于撕裂分开。（C）空的肝脏囊（格利森囊），其中悬浮着已释放的肝细胞。请点击此处下载该文件
补充图 S4：活力筛选的流式细胞术设门策略。 （A）记录所有事件。（B）单细胞设门。（C）使用 Alexa Fluor 488 Zombie Green 活力染料进行活/死细胞染色。请点击此处下载该文件。
补充图 S5：粒度测量的流式细胞术设门策略。 （A）记录所有事件。（B）单细胞设门。（C）侧向散射光（SSC；x 轴）与前向散射光（FSC；y 轴）的散点图，用于分析粒度水平。请点击此处下载该文件。
补充图 S6：肝细胞纯化。（A）第一次离心步骤后的细胞沉淀；注意培养基上方的脂肪层。（B）第二次离心后的肝细胞沉淀。（C）纯化过程结束时的纯化肝细胞。请点击此处下载该文件。
讨论
已发表的方案提供了一种可靠且简便的方法，用于分离获得高产量的正常及脂肪变性小鼠肝细胞，适用于单细胞下游分析或经FACS分选后的细胞群体分析。与密度梯度纯化法相比，其显著优势在于细胞内的脂质含量几乎不影响肝细胞的有效得率。因此，脂肪变性肝细胞的比例得以保留并包含在后续分析中。这一点不仅对于脂肪生成性肝病的研究至关重要，而且在研究大部肝切除术后相关过程时也极为关键，因为在肝再生的最初2-3天内，肝细胞会表现出时空动态的脂肪变性。尽管在肝切除术后已开展过对分离肝细胞的（单细胞）分析19,20,21，但可以推断，所分析的细胞群体至少部分缺失了富含脂质的肝细胞，因此结果未能完全代表真实情况，而偏向于瘦型肝细胞。
目前，TRAS 的功能尚未完全阐明。例如，肝小叶内脂质含量的空间差异仍不清楚。因此，需要一种能够在不将这些细胞精确排除在分析之外的情况下实现定性和定量检测的方法（例如用于单细胞转录组学、流式细胞术和代谢组学分析）。
总体而言，与使用密度梯度纯化法分离含脂质肝细胞（例如来自非酒精性脂肪性肝炎（NASH）小鼠的肝细胞）的其他方法相比，该改进方案的肝细胞得率显著更高15。然而，不同制备批次之间的细胞得率、活力和脂质含量可能存在差异。多种因素可能对此有影响。
首先，不同批次的胶原酶或胶原酶混合物在酶活性上可能存在差异；然而，与传统胶原酶相比，批间差异的重要性较低。尽管如此，仍可能需要调整工作浓度。通过适当的储存方式（干燥的冻干粉及重悬后的储备液保存于 -15 至 -25 °C）并避免反复冻融，可进一步减小差异，但无法完全消除。因此，建议在同一系列实验中仅使用同一特定批次的胶原酶。此外，酶活性取决于消化缓冲液到达肝脏时的温度，胶原酶 I 与 II 混合物的最适温度范围为 35 °C 至 37 °C22。较低的温度会降低酶活性，而高于 50 °C 的温度则可能导致蛋白质发生不可逆变性。应预先进行测试，并通过调节消化缓冲液的初始温度、塑料管的长度与直径以及流速来优化实验条件。例如，在 60 cm 长的管道中，缓冲液温度下降最多可达 10 °C。必要时可使用加热垫或红外灯对温度进行校正。胶原酶在 pH 7.4 时表现出最佳消化能力；因此，建议在使用前将缓冲液的 pH 值在约 37 °C 的工作温度下即调节至所需值。
其次，在开始消化过程之前，必须用灌注缓冲液充分冲洗肝脏（或整只小鼠），以清除血清或白蛋白等潜在的抑制物。理想情况下，应在全身循环停止后才开始灌注，以确保消化缓冲液仅从下腔静脉流经肝脏，再通过已打开的门静脉流出。via 上腔静脉可用小型血管夹闭合，以避免与残留的血液成分或抑制物接触。另一种优化肝脏冲洗的方法是间歇性夹闭门静脉，操作时应格外小心；一旦消化缓冲液到达肝脏，应仅进行一次夹闭，以避免损伤已消化的细胞。
第三，再生肝细胞较为敏感，经验表明，它们需要更短的消化时间以及更细致的操作，以避免过度消化和细胞损伤。为了尽可能轻柔地收获肝脏，建议用钳子夹住肝门部位，首先切断上腔静脉，并分离肝脏与静脉及膈肌的连接。随后切断下腔静脉和门静脉，即可游离肝脏，并轻松解除其与胃肠道韧带、一侧的食管以及另一侧右肾的连接。在肝切除小鼠中，可小心抓住中叶结扎线之一以取出肝脏。若试图强行拉出肝脏，可能导致格利森氏囊（Glisson's capsule）破裂，导致分离的细胞丢失。
最后，灌流操作及肝细胞的后续处理必须连续进行，不得中断或延迟，否则将立即且不可避免地影响细胞活力。理想情况下，灌流操作应由至少两人组成的团队完成，并一次仅处理一只动物。然而，这种对时间和人力的要求是本方法的局限性之一，尽管替代方法也同样存在此类限制。
另一个局限性在于所得细胞悬液的最终纯度，因为避免了脂肪变性肝细胞在密度梯度离心中丢失的优势，同时会残留少量非实质细胞和/或免疫细胞。在本研究展示的样本中，CD45+（免疫细胞）和CD31+（内皮细胞）的比例低于5%；而在流式细胞术分析中若首先根据细胞大小进行筛选，则CD45+和CD31+的比例分别为1.2%和2.2%（图5）。对于大多数应用而言，该纯度水平已足够，但对于高度敏感的检测方法或后续用于原代细胞培养的情况，可能需要更高的纯度。已有大量研究采用CD31和CD45作为系统性标志物，通过MACS23,24或FACS25对肝细胞群体进行分选。
这种改进的分离方法非常适合研究肝脏再生，特别是适用于含有大量脂肪变性肝细胞的早期阶段。以持续性脂肪变性为特征的肝切除后肝功能衰竭（PHLF）是一个尤为重要的研究对象。在大范围肝切除术后残留肝脏组织较少的情况下，可能引发PHLF，且其确实是肝外科手术后死亡的最常见原因。目前对PHLF的病理生物学机制仅部分明确，尚无有效治疗方法26。鉴于PHLF显著限制了肝外科手术的应用（例如治疗肝脏恶性肿瘤），探究其发病机制并确定潜在干预措施是一项明确的临床医学需求。
对于以肝脂肪变性为起始点的疾病，同样存在研究需求。一个典型的例子是非酒精性脂肪性肝病（NAFLD），其可进展为非酒精性脂肪性肝炎（NASH），并最终发展为肝细胞癌（HCC）27。久坐不动的生活方式与西方饮食模式的广泛传播已导致NAFLD在全球范围内流行，因此，HCC的发病率预计也将上升28,29。而肝脂肪变性本身又与肥胖、代谢综合征及2型糖尿病密切相关，这些疾病的发病率均呈上升趋势30。因此，肝脂肪变性正给当前的医疗保健系统带来日益沉重的负担，亟需有效的管理手段。这种改进的两步胶原酶灌注法能够实现对脂肪变性肝细胞的单细胞水平研究，从而有助于探索肝细胞脂质积聚的成因及其后果。
本方案介绍了一种简单、快速且可靠的从部分（70%）和扩大（86%）肝切除术后小鼠体内 in vivo 分离再生肝细胞的技术。该方法不依赖梯度纯化，可用于研究肝脏再生过程，并保留传统分离方案中通常丢失的富含脂质的肝细胞。此外，该方法还可应用于与脂肪变性改变相关的多种肝脏疾病的研究，且不仅限于小鼠物种。
披露
作者声明不存在任何竞争利益。
致谢
本研究由瑞士国家科学基金会（项目资助号 310030_189262）资助。
材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 试剂 | |||
| Alexa Fluor 488 Zombie green | BioLegend | 423111 | 胺反应性活率染料 |
| Attane Isoflurane ad us. vet. 99.9% | Provet AG | QN01AB06 | 注意：需要通风 |
| EDTA 溶液 | Sigma-Aldrich | E8008-100ML | - |
| 乙醇 | Sigma-Aldrich | V001229 | 用水稀释至 70% |
| 胎牛血清 (FCS) | Gibco | A5256701 | - |
| Hanks' 平衡盐溶液 (HBSS)，含 Ca2+、Mg2+，含酚红 | Sigma-Aldrich | H9269-6x600ML | 用于消化/保存 |
| Hanks' 平衡盐溶液 (HBSS)，无 Ca2+，无 Mg2+，无酚红 | Sigma-Aldrich | H6648-6x500ML | 用作灌注缓冲液 |
| HEPES 溶液，1 M | Sigma-Aldrich | 83264-100ML-F | - |
| Histoacryl 组织粘合剂（丁基-2-氰基丙烯酸酯） | B. Braun | 1050052 | 用于固定插管部位 |
| Hoechst 33258 染色染料溶液 | Abcam | ab228550 | - |
| Liberase 研究级 | Roche | 5401119001 | 冻干胶原酶 I/II |
| 0.9% NaCl 500 mL Ecotainer | B. Braun | 123 | - |
| Paralube Vet 软膏 | Dechra | 17033-211-38 | - |
| 磷酸盐缓冲液 (PBS) | Gibco | A1286301 | - |
| Sudan IV – 脂质染色 | Sigma-Aldrich | V001423 | - |
| Temgesic（盐酸丁丙诺啡）注射液 0.3 mg/mL | Indivior Europe Ltd. | 345928 | 麻醉药品，需安全存放 |
| 台盼蓝，0.4%，无菌过滤 | Sigma-Aldrich | T8154 | 用于细胞计数 |
| Williams’ Medium E | Sigma-Aldrich | W4128-500ML | - |
| 材料 | |||
| 25 mL 刻度移液管，Greiner Cellstar | Merck | P7865 | - |
| 50 mL Falcon 管 | TPP | - | - |
| BD Neoflon Pro IV 导管 26 G | BD Falcon | 391349 | - |
| 细胞刮刀，旋转刀片宽度 25 mm | TPP | 99004 | - |
| Falcon 细胞筛，100 µm 尼龙 | BD Falcon | 352360 | - |
| 带孔无菌手术巾 | - | - | 可重复使用的布料 |
| 16# 管用填充喷嘴（内径 3.1 mm） | Drifton | FILLINGNOZZLE#16 | 插入管中使用 |
| 流式细胞仪管，5 mL | BD Falcon | 352008 | - |
| 雄性鲁尔接头转接头，管内径 3.2 mm | Drifton | LM41 | 连接注射器的管路 |
| 培养皿，96 x 21 mm | TPP | 93100 | - |
| Prolene 5-0 | Ethicon | 8614H | 用于胸骨牵开 |
| Prolene 6-0 | Ethicon | 8695H | 用于皮肤缝合 |
| Prolene 8-0 | Ethicon | EH7470E | 结扎胆囊 |
| 16# 管，壁厚 1.6 mm，内径 3.2 mm，外径 6.4 mm | Drifton | SC0374T | 灌注管 |
| 设备 | |||
| BD LSRFortessa 细胞分析流式细胞仪 | BD | - | - |
| Isis 啮齿类动物剃毛器 | Aesculap | GT421 | - |
| 异氟烷工作站 | Provet | - | - |
| 低速离心机 – Scanspeed 416 | Labogene | - | - |
| 改进型 Neubauer 计数板 | Marienfeld | - | - |
| 氧气浓缩器 – EverFlo | Philips | 1020007 | 0 – 5 L/min |
| Pipetboy – Pipettor Turbo-Fix | TPP | 94700 | - |
| Shenchen 灌注泵 – YZ1515x | Shenchen | YZ1515x | - |
| 手术显微镜 – SZX9 | Olympus | - | - |
| ThermoLux 加热垫 | Thermo Lux | - | - |
| Vortex Genie 2，2700 转/分钟 | NeoLab | 7-0092 | - |
| 水浴锅 – Precision GP 02 | Thermo scientific | - | 调节至 42 °C |
参考文献
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