在三维细胞外基质中培养 IDG-SW3 细胞

摘要

本文介绍了一种在三维（3D）细胞外基质中培养 IDG-SW3 细胞的实验方案。

摘要

骨细胞被认为是由成骨细胞终末分化而来的非增殖性细胞。包埋在骨细胞外基质（类骨质）中的成骨细胞表达 Pdpn 基因以形成细胞树突并转化为前成骨细胞。随后，前成骨细胞表达 Dmp1 基因以促进基质矿化，从而转化为成熟的骨细胞。该过程称为骨细胞生成。IDG-SW3 是一种广泛使用的细胞系，用于研究骨细胞生成。 体外 成骨细胞生成研究。以往许多方法均采用I型胶原作为培养基质的主要或唯一组分。然而，除I型胶原外，类骨质还包含基质成分，该成分在促进细胞生长、黏附及迁移方面具有重要作用。此外，该基质物质具有透明性，可提高由I型胶原形成的凝胶的透明度，从而有利于通过成像技术观察树突的形成。因此，本文详细描述了一种利用细胞外基质与I型胶原共同构建三维凝胶以支持IDG-SW3细胞存活的实验方案。本研究中，对成骨细胞生成过程中的树突形成及基因表达进行了分析。经7天成骨诱导培养后，荧光共聚焦显微镜下可清晰观察到广泛的树突网络结构。实时PCR结果显示，相关mRNA水平 Pdpn 和 Dmp1 持续培养3周后，第4周时体视显微镜下可见不透明凝胶中充满矿物质颗粒，与X射线荧光（XRF）检测结果一致。这些结果表明，该培养基质可有效促进成骨细胞向成熟骨细胞的转变。

引言

骨细胞是由成骨细胞分化而来的终末分化细胞^1,2一旦成骨细胞被类骨质包埋，便会经历成骨细胞生成过程，并表达 Pdpn 基因形成前成骨细胞， Dmp1^{基因矿化类骨质，以及} Sost 和 Fgf23 基因在骨组织中发挥成熟骨细胞功能³在此介绍一种三维培养系统，用于鉴定成骨细胞分化过程中树突的延伸及标志基因的表达。

IDG-SW3 细胞是一种源自转基因小鼠的永生化原代细胞系，在不同培养基中培养时，可扩展或复制从成骨细胞到晚期骨细胞的分化过程⁴。与 MLO-A5、MLO-Y4 及其他细胞系相比，IDG-SW3 细胞在功能蛋白表达谱、钙盐沉积能力以及对多种激素的反应方面更接近骨组织中的原代骨细胞⁴。

与二维培养系统相比，三维培养系统更能模拟 体内 细胞生长环境，包括营养梯度、低机械刚度以及周围的力学范围（表1）。大多数先前在三维系统中培养成骨细胞的方法均使用I型胶原作为配方中的唯一组分⁴

方案

本方案适用于在24孔板的4个孔中培养细胞。若需制备多个样品或多个孔板，应相应增加试剂用量。

1. I型胶原蛋白混合物的制备

注意：I型胶原蛋白和基底膜基质在室温下会迅速凝固。因此，胶原蛋白应置于冰上（2 °C 至 8 °C）操作。除非另有说明，所有使用的枪头和离心管必须预先冷却。所有操作均应在生物安全柜中进行。

1. 将所有试剂和离心管置于冰上。
2. 用移液器缓慢吸取 0.48 mL 胶原蛋白 I（5 mg/mL）和 0.1 mL 10 倍最低必需培养基（MEM）（含酚红），加入预冷的无菌 15 mL 离心管中。轻轻吹打混匀。
3. 根据酚红指示剂的比色卡，加入适量 7.5%（w/v）NaHCO₃（约 0.2 mL），将酚红指示剂调至橙色，表明 pH 值处于 7.0–7.4 范围内。
   注：根据培养基的 pH 值，使用一定体积的 NaHCO₃ 将 pH 值调节至约 7.0–7.4。此外，可使用 NaOH 进行 pH 中和。
4. 加入适量 ddH₂O 将混合液终体积补至 1 mL。轻轻吹打混匀，备用。
   ​注：ddH₂O 的最终体积取决于步骤 1.3 中所用 NaHCO₃ 或 NaO....

结果

活/死细胞染色后，使用共聚焦激光显微镜观察细胞。所有细胞均呈钙黄绿素AM阳性（绿色），视野中几乎无EthD-1阳性细胞（红色），表明该方法制备的凝胶体系非常适用于骨细胞生成（图1A，左）。为更清晰地确定细胞的空间分布，采用伪彩色图像显示凝胶不同深度处的细胞树突；红色代表凝胶底部的树突，蓝色代表顶部的树突。结果表明，IDG-SW3细胞在该细胞-凝胶基质中生长良好，在成骨培养基中培养第7天时，细胞树突逐渐延伸形成网络结构（图1A，右，以及 图1B）。

在体视显微镜下，凝胶基质的透明度持续下降，至第35天时变为不透明，而无细胞的凝胶基质则无此变化（图2A）。第35天不透明凝胶的X射线荧光光谱（XRF）显示，凝胶内部已完全充满钙和磷的沉积物（图2B）。

.......

讨论

本方案的关键在于，步骤1和步骤2必须在冰上进行，以防止自发性凝血。本方法中，I型胶原蛋白的终浓度为1.2 mg/mL。因此，应根据不同生产商提供的胶原蛋白，计算出合适的ddH₂O体积。

体内，成骨细胞从松质骨表面向内部迁移的极性运动参与了骨细胞的形成过程¹⁴。本方案使细胞脱离基质中具有方向性极性的生长方式。当然，将 IDG-SW3 细胞接种于无细胞凝胶基质表面是可选步骤。然而，本方案提供的胶原蛋白浓度不足以形成理论上可供成骨细胞浸润的平坦表面。为此，应测试不同比例的 I 型胶原蛋白与细胞外基质。

与类骨质相比，该凝胶的刚度远远不足。一些文献报道，通过添加多种化学物质来增强凝胶的强度，以更好地模拟类骨质的刚度。 体内^6,15该方法的优点在于所形成的凝胶可为细胞成像和示踪提供透明度良好的介质 原位

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
0.25% 胰蛋白酶-乙二胺四乙酸	Hyclone	SH30042.01
15 mL 离心管	Corning, NY, USA	430791
7.5% (w/v) 碳酸氢钠	Sigma-Aldrich, MO, USA	S8761
抗坏血酸	Sigma-Aldrich, MO, USA	A4544
胶原蛋白 I	Thermo Fisher Scientific	A10483-01
胎牛血清	Thermo Fisher Scientific	10099141
匀浆器	BiHeng  Biotechnology, Shanghai, China	SKSI
激光共聚焦荧光显微镜	Carl Zeiss, Oberkochen, Germany	LSM 800
活/死细胞成像试剂盒	Thermo Fisher Scientific	R37601
Matrigel 基质	Corning, NY, USA	356234
MEM (10X)，不含谷氨酰胺	Thermo Fisher Scientific	21430079
多聚甲醛	Sigma-Aldrich, MO, USA	158127
磷酸盐缓冲液	Hyclone	SH30256.FS
体视显微镜	Carl Zeiss, Oberkochen, Germany	Zeiss Axio ZOOM.V16
Trizol	Thermo Fisher Scientific	15596026
X射线荧光分析	EDAX, USA	EAGLE III
β-甘油磷酸钠	Sigma-Aldrich, MO, USA	G9422