本文介绍了一种在三维（3D）细胞外基质中培养 IDG-SW3 细胞的实验方案。
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摘要
摘要
骨细胞被认为是由成骨细胞终末分化而来的非增殖性细胞。包埋在骨细胞外基质（类骨质）中的成骨细胞表达 Pdpn 基因以形成细胞树突并转化为前成骨细胞。随后，前成骨细胞表达 Dmp1 基因以促进基质矿化，从而转化为成熟的骨细胞。该过程称为骨细胞生成。IDG-SW3 是一种广泛使用的细胞系，用于研究骨细胞生成。 体外 成骨细胞生成研究。以往许多方法均采用I型胶原作为培养基质的主要或唯一组分。然而，除I型胶原外，类骨质还包含基质成分，该成分在促进细胞生长、黏附及迁移方面具有重要作用。此外，该基质物质具有透明性，可提高由I型胶原形成的凝胶的透明度，从而有利于通过成像技术观察树突的形成。因此，本文详细描述了一种利用细胞外基质与I型胶原共同构建三维凝胶以支持IDG-SW3细胞存活的实验方案。本研究中，对成骨细胞生成过程中的树突形成及基因表达进行了分析。经7天成骨诱导培养后，荧光共聚焦显微镜下可清晰观察到广泛的树突网络结构。实时PCR结果显示，相关mRNA水平 Pdpn 和 Dmp1 持续培养3周后，第4周时体视显微镜下可见不透明凝胶中充满矿物质颗粒，与X射线荧光（XRF）检测结果一致。这些结果表明，该培养基质可有效促进成骨细胞向成熟骨细胞的转变。
引言
骨细胞是由成骨细胞分化而来的终末分化细胞1,2一旦成骨细胞被类骨质包埋，便会经历成骨细胞生成过程，并表达 Pdpn 基因形成前成骨细胞， Dmp1基因矿化类骨质，以及 Sost 和 Fgf23 基因在骨组织中发挥成熟骨细胞功能3在此介绍一种三维培养系统，用于鉴定成骨细胞分化过程中树突的延伸及标志基因的表达。
IDG-SW3 细胞是一种源自转基因小鼠的永生化原代细胞系，在不同培养基中培养时，可扩展或复制从成骨细胞到晚期骨细胞的分化过程4。与 MLO-A5、MLO-Y4 及其他细胞系相比，IDG-SW3 细胞在功能蛋白表达谱、钙盐沉积能力以及对多种激素的反应方面更接近骨组织中的原代骨细胞4。
与二维培养系统相比，三维培养系统更能模拟 体内 细胞生长环境，包括营养梯度、低机械刚度以及周围的力学范围（表1）。大多数先前在三维系统中培养成骨细胞的方法均使用I型胶原作为配方中的唯一组分4,5,6，因为I型胶原纤维是钙和磷沉积的位点。然而，类骨质（即细胞外基质）中一种不可或缺的成分含有大量促进细胞生长、黏附和迁移的细胞因子7,8 且透明，便于成像观察。因此，本实验方案采用Matrigel（下文简称基底膜基质）作为骨细胞生成研究的次要组分。
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方案
本方案适用于在24孔板的4个孔中培养细胞。若需制备多个样品或多个孔板，应相应增加试剂用量。
1. I型胶原蛋白混合物的制备
注意：I型胶原蛋白和基底膜基质在室温下会迅速凝固。因此，胶原蛋白应置于冰上（2 °C 至 8 °C）操作。除非另有说明，所有使用的枪头和离心管必须预先冷却。所有操作均应在生物安全柜中进行。
- 将所有试剂和离心管置于冰上。
- 用移液器缓慢吸取 0.48 mL 胶原蛋白 I（5 mg/mL）和 0.1 mL 10 倍最低必需培养基（MEM）（含酚红），加入预冷的无菌 15 mL 离心管中。轻轻吹打混匀。
- 根据酚红指示剂的比色卡，加入适量 7.5%（w/v）NaHCO3（约 0.2 mL），将酚红指示剂调至橙色，表明 pH 值处于 7.0–7.4 范围内。
注：根据培养基的 pH 值，使用一定体积的 NaHCO3 将 pH 值调节至约 7.0–7.4。此外，可使用 NaOH 进行 pH 中和。 - 加入适量 ddH2O 将混合液终体积补至 1 mL。轻轻吹打混匀，备用。
注：ddH2O 的最终体积取决于步骤 1.3 中所用 NaHCO3 或 NaOH 的体积。
2. 细胞-基质混合物的制备
- 在冰上，将0.9 mL基底膜基质缓慢移液至新的15 mL离心管中。
- 在T25培养瓶中，使用4 mL完全培养基（含10%胎牛血清[FBS]的α-MEM），并添加50 U/mL INF-γ，在33 °C条件下培养IDG-SW3细胞。
- 当IDG-SW3细胞达到90%融合度时，移除培养基，并用磷酸盐缓冲液（PBS，整个实验过程中pH均为7.4）通过移液洗涤细胞。加入0.5 mL 0.25%胰蛋白酶-乙二胺四乙酸（EDTA），在37 °C消化30秒。
- 加入3.5 mL完全培养基（含10%胎牛血清[FBS]的α-MEM）以终止胰酶消化。将4 mL细胞悬液转移至15 mL离心管中。
- 在4 °C条件下，以300 × g离心5分钟，沉淀细胞。弃去上清液，并将细胞沉淀在冰上用1 mL完全培养基重悬。
- 使用血细胞计数板对细胞进行计数，并用完全培养基调整最终细胞密度至4 × 105 个/mL。取0.1 mL制备好的细胞悬液加入到步骤2.1中准备的0.9 mL细胞外基质中，通过轻柔吹打充分混匀。
注意：如需设置无细胞对照，可将0.1 mL完全培养基加入0.9 mL细胞外基质中作为阴性对照。
3. 接种细胞-凝胶混合物
- 在冰上，用移液器轻轻吹打混合步骤2.6和步骤1.4中得到的两种混合物，总体积为2 mL。将最终混合物0.5 mL分装至每个孔中（24孔板中的四个孔）。在37 °C孵育1小时，以形成细胞-凝胶混合物。
- 向每孔中的细胞-凝胶混合物中加入0.5 mL成骨诱导培养基（含50 µg/mL抗坏血酸和4 mM β-甘油磷酸钠的完全培养基，也称为成骨诱导培养基）4，在37 °C开始成骨分化。将此时间点记为第0天。
- 每隔2天，更换一半培养基，补充预热至37 °C的新鲜成骨诱导培养基。继续培养35天。
4. 使用共聚焦显微镜鉴定细胞活力与细胞树突
- 细胞染色
注意：钙黄绿素乙酰甲酯（calcein AM）是一种可渗透细胞的染料，可用于测定细胞活力。碘化乙啶同二聚体-I（EthD-1）不能穿透完整/活细胞的细胞膜。9因此，钙黄绿素AM/碘化乙啶-1（calcein AM/EthD-1）可用于鉴定细胞活力和细胞树突结构。- 在培养的第1天和第7天，移除钙黄绿素AM储存液（4 mM，溶于DMSO）和EthD-1储存液（2 mM，溶于DMSO/H2从冷冻箱中取出 O 1:4 [v/v]，并使其升至室温。
注意：矿化基质具有强烈的自发荧光信号，因此未矿化前的前成骨细胞阶段不显示 Dmp1 培养7天内的表达4 更适合用于观察细胞染色。 - 向 2 mL 的杜氏磷酸盐缓冲液（D-PBS）中加入 4 µL 的 2 mM EthD-1 储存液和 5 µL 的 4 mM 钙黄绿素 AM 储存液，充分混匀。所得工作液中钙黄绿素 AM 浓度约为 2 µM，EthD-1 浓度约为 4 µM。
- 将0.5 mL工作液移液至24孔板的各孔中。室温孵育30–45分钟，以染色细胞-凝胶基质。
- 孵育后，向新的35 mm玻璃底培养皿中加入约0.5 mL新鲜D-PBS。盖上培养皿盖，以防止样品污染或干燥。
- 使用弯头镊子，小心地将步骤4.1.3中染色的细胞-凝胶基质转移至步骤4.1.4的35 mm培养皿中。避免损伤或剪切细胞-凝胶基质。
- 在激光共聚焦荧光显微镜下观察标记的细胞。
- 在培养的第1天和第7天，移除钙黄绿素AM储存液（4 mM，溶于DMSO）和EthD-1储存液（2 mM，溶于DMSO/H2从冷冻箱中取出 O 1:4 [v/v]，并使其升至室温。
- 显微镜扫描设置
- 将35 mm培养皿置于载物台上。使用10倍物镜，通过目镜选择需要扫描的细胞-凝胶基质区域。由于树突延伸范围较大，不建议使用更高倍数的物镜。
- 选择光学滤光片。使用标准的荧光素带通滤光片可将钙黄绿素（Calcein）显示为绿色，使用碘化丙啶或德克萨斯红染料的滤光片可将EthD-1显示为红色。选择 "线性模式" 用于扫描并设置 "针孔" 至 2 µm。
- 选择8位数据深度和1,024像素 × 1,024像素的图像分辨率。
- 使用最优的激光和检测器设置进行连续线扫描成像（保持最低激光能量以避免潜在的光漂白）。
注意：最佳检测器设置取决于最终的荧光信号。
- 采集 "z轴扫描" 图像
- 根据绿色通道信号，通过连续扫描并同时调节焦距穿透样品，确定细胞-凝胶矩阵的扫描顶部和底部位置。
- 确定样品的顶部和底部后，选择所需的扫描范围。开始扫描。样品将根据步骤4.2中选定的设置从顶部到底部进行扫描，生成一系列图像。
- 细胞活力鉴定
- 从步骤4.3中选取一片样本。绿色通道表示活细胞，红色通道表示死细胞。
- 细胞树突识别
- 选择单一绿色通道，使用图像采集软件生成3D重建图像。深度信息以一系列彩虹伪彩图像显示。位于凝胶底部的树突显示为红色，而位于顶部的树突显示为蓝色。
5. 使用体视显微镜观察形态特征
- 在培养的第1天、第7天、第21天和第35天，移除培养基，用D-PBS将凝胶在孔板中洗涤两次。每孔加入0.5 mL含4%（v/v）多聚甲醛的D-PBS溶液，在室温下固定细胞-凝胶基质10分钟。
- 吸除孔中的多聚甲醛，用 D-PBS 在孔板中再洗涤细胞-凝胶基质两次。每孔中留 0.5 mL D-PBS 用于成像。
- 将培养板置于载物台上，使用0.5倍物镜通过目镜选择最佳位置。逐个对培养板中的细胞-凝胶复合物进行全场成像 "自动曝光" 在明场下
6. 使用XRF检测法鉴定矿物质沉积
- 在培养的第35天，检查液氮是否充足。启动XRF系统。打开样品室，使用弯头镊子将凝胶从培养板转移至仪器样品台中央。关闭样品室，等待30分钟，使仪器冷却后再使用。
- 将"曝光时间"设置为35 ms，"能谱范围"设置为0–40 keV，"电流"设置为770 µA，以完成采集参数设置。
- 通过移动样品台，选择三到五个扫描位点进行分析。
- 选择待检测元素（Ca 和 P），开始检测并导出结果。
注意：Ca 和 P 是羟基磷灰石中最丰富的元素。
7. 鉴定功能基因表达
- 在培养的第1天、第7天、第21天、第28天和第35天，移除培养基，并用预冷的D-PBS在培养板中清洗细胞-凝胶基质两次。
- 使用带弯头的镊子将凝胶从培养板转移至2.0 mL离心管中（根据培养时间，细胞-凝胶基质在第35天会逐渐 收缩至约0.1 mL）。确保每个离心管中仅放置一个凝胶。向每管中加入1 mL苯酚-氯仿和两颗无菌不锈钢研磨珠（4 mm，作为裂解基质）。将离心管对称地放入预冷的机械振荡匀浆仪样品槽中。
- 设置机械振荡参数：频率55 Hz，振幅1 cm，每次振荡1分钟，暂停10秒，共进行6个循环。启动珠磨均质过程。
- 采用苯酚-氯仿-异戊醇法从细胞-凝胶基质中提取总RNA。使用随机六聚体引物将2 µg总RNA逆转录为cDNA。
- 设计针对β-actin、Pdpn、Dmp1、Sost、 和Fgf23的引物用于实时PCR（表2）。其中β-actin为用于标准化的看家基因。Pdpn10和Dmp111主要在前成骨细胞和矿化成骨细胞中表达，而Sost12和Fgf2313则主要在成熟成骨细胞中表达。
- 将离心管置于热循环仪中，加热盖温度设为105 °C，进行PCR扩增，循环程序如下：初始变性95 °C 5分钟；随后进行35个循环，每循环95 °C 5秒、60 °C 30秒；最后在60 °C延伸30秒。采用ΔΔCt法分析相对表达倍数变化。
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结果
活/死细胞染色后，使用共聚焦激光显微镜观察细胞。所有细胞均呈钙黄绿素AM阳性（绿色），视野中几乎无EthD-1阳性细胞（红色），表明该方法制备的凝胶体系非常适用于骨细胞生成（图1A，左）。为更清晰地确定细胞的空间分布，采用伪彩色图像显示凝胶不同深度处的细胞树突；红色代表凝胶底部的树突，蓝色代表顶部的树突。结果表明，IDG-SW3细胞在该细胞-凝胶基质中生长良好，在成骨培养基中培养第7天时，细胞树突逐渐延伸形成网络结构（图1A，右，以及 图1B）。
在体视显微镜下，凝胶基质的透明度持续下降，至第35天时变为不透明，而无细胞的凝胶基质则无此变化（图2A）。第35天不透明凝胶的X射线荧光光谱（XRF）显示，凝胶内部已完全充满钙和磷的沉积物（图2B）。
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讨论
本方案的关键在于，步骤1和步骤2必须在冰上进行，以防止自发性凝血。本方法中，I型胶原蛋白的终浓度为1.2 mg/mL。因此，应根据不同生产商提供的胶原蛋白，计算出合适的ddH2O体积。
体内，成骨细胞从松质骨表面向内部迁移的极性运动参与了骨细胞的形成过程14。本方案使细胞脱离基质中具有方向性极性的生长方式。当然，将 IDG-SW3 细胞接种于无细胞凝胶基质表面是可选步骤。然而，本方案提供的胶原蛋白浓度不足以形成理论上可供成骨细胞浸润的平坦表面。为此，应测试不同比例的 I 型胶原蛋白与细胞外基质。
与类骨质相比，该凝胶的刚度远远不足。一些文献报道，通过添加多种化学物质来增强凝胶的强度，以更好地模拟类骨质的刚度。 体内6,15该方法的优点在于所形成的凝胶可为细胞成像和示踪提供透明度良好的介质 原位
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披露
作者无任何利益冲突需要披露。
致谢
我们感谢Lynda F. Bonewald博士惠赠IDG-SW3细胞系。本研究得到国家自然科学基金（82070902、82100935和81700778）及上海市 "科技创新" 扬帆计划（21YF1442000）
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 0.25% 胰蛋白酶-乙二胺四乙酸 | Hyclone | SH30042.01 | |
| 15 mL 离心管 | Corning, NY, USA | 430791 | |
| 7.5% (w/v) 碳酸氢钠 | Sigma-Aldrich, MO, USA | S8761 | |
| 抗坏血酸 | Sigma-Aldrich, MO, USA | A4544 | |
| 胶原蛋白 I | Thermo Fisher Scientific | A10483-01 | |
| 胎牛血清 | Thermo Fisher Scientific | 10099141 | |
| 匀浆器 | BiHeng Biotechnology, Shanghai, China | SKSI | |
| 激光共聚焦荧光显微镜 | Carl Zeiss, Oberkochen, Germany | LSM 800 | |
| 活/死细胞成像试剂盒 | Thermo Fisher Scientific | R37601 | |
| Matrigel 基质 | Corning, NY, USA | 356234 | |
| MEM (10X)，不含谷氨酰胺 | Thermo Fisher Scientific | 21430079 | |
| 多聚甲醛 | Sigma-Aldrich, MO, USA | 158127 | |
| 磷酸盐缓冲液 | Hyclone | SH30256.FS | |
| 体视显微镜 | Carl Zeiss, Oberkochen, Germany | Zeiss Axio ZOOM.V16 | |
| Trizol | Thermo Fisher Scientific | 15596026 | |
| X射线荧光分析 | EDAX, USA | EAGLE III | |
| β-甘油磷酸钠 | Sigma-Aldrich, MO, USA | G9422 |
参考文献
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