小鼠结肠隐窝的三维培养用于研究肠道干细胞功能 离体

摘要

本实验方案描述了建立小鼠结肠类器官系统，用于研究在claudin-7基因敲除模型中结肠干细胞的活性与功能。

摘要

肠道上皮每5-7天更新一次，这一过程由位于隐窝区域底部的肠道上皮干细胞（IESC）群体所调控。IESC包括活跃的干细胞，它们能够自我更新并分化为多种上皮细胞类型，以及静息态干细胞，后者在组织损伤时作为储备干细胞发挥作用。肠道上皮的再生依赖于这些活跃IESC的自我更新和分化能力。此外，隐窝干细胞群体的平衡以及干细胞微环境的维持对肠道再生至关重要。类器官培养是一种重要且具有吸引力的研究方法，可用于研究调控干细胞存活与功能的蛋白质、信号分子及环境信号。该模型相比动物模型成本更低、耗时更短，且更易于操作。类器官还能模拟组织微环境，具有体内相关性。in vivo 相关性。本实验方案描述了结肠隐窝的分离、将分离得到的隐窝细胞嵌入三维凝胶基质系统，并进行培养以形成具有自我组织、增殖、自我更新和分化能力的结肠类器官。该模型允许研究人员对环境进行操控——例如敲除特定蛋白（如claudin-7）、激活或抑制信号通路等——以研究这些干预如何影响结肠干细胞的功能。具体而言，本研究探讨了紧密连接蛋白claudin-7在结肠干细胞功能中的作用。claudin-7对于维持肠道稳态以及屏障功能和完整性至关重要。在小鼠中敲除claudin-7会引发类似炎症性肠病的表型，表现为肠道炎症、上皮增生、体重减轻、黏膜溃疡、上皮细胞脱落以及腺瘤形成。此前已有报道指出，claudin-7在小肠上皮干细胞功能中是必需的。在本方案中，建立了结肠类器官培养系统，用于研究claudin-7在大肠中的作用。

引言

肠道类器官培养是一种三维（3D）ex vivo 系统，该系统通过从原代组织的肠隐窝中分离干细胞，并将其接种于凝胶基质中进行培养^1,2。这些干细胞具有自我更新、自我组织以及器官功能特性²。类器官能够模拟组织微环境，相较于二维（2D）in vitro 细胞培养模型更接近于in vivo模型，但其可操作性低于传统细胞培养^3,4。该模型克服了2D培养模型中存在的诸多障碍，例如缺乏正常的细胞间黏附、细胞与基质相互作用以及细胞群体的均一性问题，同时也减少了动物模型的局限性，如高昂的成本和漫长的实验周期⁵。肠道类器官——当由结肠隐窝来源的干细胞培养时也称为结肠类器官（colonoids）——本质上是包含上皮层和腔体的小型器官，其上皮层包含所有在in vivo条件下存在的细胞类型。该模型可用于研究肠道的多个方面，如干细胞微环境、肠道生理学、病理生理学以及肠道形态发生^3,5,6<....

方案

所有动物实验和操作均经东卡罗来纳大学（ECU）动物护理与使用委员会（IACUC）批准，并依照美国国立卫生研究院和东卡罗来纳大学关于实验动物护理与使用的指南进行。通过将 C57BL6 claudin-7-flox 转基因小鼠与 Villin-CreERT2 小鼠杂交，构建了可诱导的肠道特异性 claudin-7 基因敲除小鼠模型¹⁹。本研究使用了3月龄的雄性和雌性小鼠。

1. 试剂/仪器准备

1. 在开始相关实验前，将以下试剂/设备预冷：用于在隐窝分离过程中洗涤结肠组织的磷酸盐缓冲液（PBS）；用于上皮解离液孵育的摇床/旋转仪（置于4 °C冰箱中）。
   1. 去除凝胶基质（参见 材料表从 -20 °C 取出并在冰上解冻，然后接种。
   2. 在接种隐窝之前，将离心机预冷至 4 °C。
   3. 冷却0.1%柠檬酸钠缓冲液（参见 材料表）并置于冰上保存，直至后续使用 原位 细胞死亡检测
2. 在开始相关实验前，将以下试剂预热：接种前将96孔培养板预热24小时；L-WRN培养基（参见 材料表）在添加到培养板中的隐窝之前以及每次更换培养基之前。
   1. 将水浴加热至 94....

结果

为了研究claudin-7对结肠干细胞的调控作用，按照上述方法并如图1A所示，从小鼠结肠组织中分离出结肠隐窝。隐窝从原代组织中分离后，接种于96孔板中的三维基质中，培养11天（图1）。正常的健康隐窝在第2天时管腔闭合，形成类球状结构，并在约第5天开始出芽并分化为多种上皮细胞类型（图1B）。结肠类器官培养至第11天后收获，用于后续实验（图1B）。为了在培养中敲除claudin-7，隐窝先正常培养24小时。24小时后，加入3 µmol/L 4OH-他莫昔芬（TAM）处理，并继续培养10天。每2天更换一次含新鲜4OH-TAM的培养基。对照孔中使用DMSO作为溶剂对照。claudin-7缺陷的隐窝（claudin-7 KO）无法正常形成类球状结构，并在加入4OH-TAM处理1天后迅速开始死亡（图1B）。

讨论

类器官培养是研究干细胞功能、肠道生理学、药物筛选、人类肠道疾病以及组织再生与修复的优秀模型^{7,8,9,10,11,26}。尽管该技术具有诸多优势，但其建立过程可能具有挑战性。在整个实验流程的各个步骤中均需格外小心，尤其是在铺板阶段。将分离得到的隐窝与凝胶基质混合时，务必充分上下吹打，以彻底打散离心后形成的隐窝沉淀，并使隐窝在基质中均匀分布。同时，在吹打过程中应避免将气泡引入基质中。为此，吹打操作应缓慢进行，并将移液器枪头朝向1.5 mL离心管底部。

此外，在整个过程中凝胶基质不能完全凝固。为防止过早凝固，需通过小心移液进行混匀，然后将离心管置于冰上，并重复此过程。当分离的隐窝与凝胶基质充分混合.......

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
0.09 立方英尺省空间真空干燥器	United States Plastic Corp	78564	麻醉室
0.5 M EDTA pH 8.0	Invitrogen	AM9261
1.5 mL 微量离心管	ThermoFisher	69715
15 mL 锥形离心管	Fisher Scientific	14-959-53A
1× Dulbecco’s 磷酸盐缓冲液	Gibco	14190-144
2-甲基丁烷	Sigma	277258
4% 多聚甲醛	ThermoFisher	J61899.AK
4-羟基他莫昔芬（4OH-TAM）	Sigma	579002
50 mL 锥形离心管	Fisher Scientific	14-432-22
70 µm 尼龙细胞筛	Corning	352350
96 孔培养板	Greiner Bio-One	655180
B-27 补充剂（50×）	Gibco	12587-010
牛血清白蛋白	Fisher Scientific	BP1605-100
Claudin-7 抗小鼠兔抗体	Immuno-Biological Laboratories	18875
盖玻片（24 × 50-1.5）	Fisher Scientific	12544E
冷冻模具	vwr	25608-916
Cultrex RCF BME，2 型	R&D Systems	3533-005-02	凝胶基质
Cy3 抗兔抗体	Jackson Immunoresearch	111-165-003
杜瓦瓶	Thomas Scientific	1173F61
含 L-谷氨酰胺的高糖 DMEM	ATCC	30-2002
EVOS FLoid 成像系统	ThermoFisher	4477136
含 DAPI 的 Fluoro-Gel II	Electron Microscopy Sciences	17985-50
GlutaMAX（100×）	Gibco	35050-061
甘氨酸	JT Baker	4059-02
HEPES（1 M）缓冲液	Gibco	15630-080
Hoechst	ThermoFisher	62249
原位细胞死亡检测试剂盒，TMR Red	Roche	12156792910
异氟烷	Pivetal	07-893-8440
L-WRN 培养基	哈佛医学院胃肠道类器官分离与培养中心	N/A
小鼠手术器械包	Kent Scientific Corporation	INSMOUSEKIT
小鼠 EGF	PeproTech	315-09-500UG
N2 补充剂（100×）	Gibco	17502-048
最佳切割温度（OCT）包埋剂	Agar Scientific	AGR1180
青霉素-链霉素	Gibco	15140-122
Sequenza 染色架	vwr	10129-584
柠檬酸钠	Fisher Scientific	S-279
蔗糖	Sigma	S9378
Triton X-100	Sigma	X100
真空滤器（0.22 µm；醋酸纤维素）	Corning	430769
Y-27632 二盐酸盐	Tocris Bioscience	1254