本文描述了大量制备重组腺病毒的方法，这些病毒可用于转导天然啮齿类动物尿路上皮，从而实现外源基因的表达或内源性基因产物的下调。
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本文内容
摘要
摘要
除了形成高电阻屏障外，覆盖于肾盂、输尿管、膀胱和近端尿道的尿路上皮还被认为能够感知并传递其环境信息至下方组织，从而促进排尿功能与行为。尿路上皮屏障或其感觉/转导功能的破坏可能导致疾病。目前缺乏简单有效的方法来改变尿路上皮中的基因和蛋白表达，这限制了对这些复杂事件的研究。本文所述方法可使研究人员高效、简便地制备大量高滴度的腺病毒，用于高效转导啮齿类动物的尿路上皮。通过腺病毒转导可表达cDNA和小干扰RNA，并可在转导后12小时至数天内评估外源基因表达对尿路上皮功能的影响。这些方法在利用小鼠或大鼠动物模型研究正常与异常尿路上皮生物学方面具有广泛的应用价值。
引言
尿路上皮是衬覆于肾盂、输尿管、膀胱及近端尿道的特化上皮组织1它由三层结构组成：最表层为高度分化且具有极性的伞细胞层，常含有双核，其顶面与尿液接触；中间层为过渡扩增细胞层，其中部分细胞为双核，可在表层伞细胞急性丢失时生成新的伞细胞；最底层为单层基底细胞，其中一部分具有干细胞功能，能够在慢性损伤后再生整个尿路上皮。伞细胞主要负责形成高电阻的尿路上皮屏障，该屏障的组成包括顶膜（富含胆固醇和脑苷脂），对水和溶质具有低通透性，以及高电阻的顶侧连接复合体（由紧密连接、黏附连接、桥粒及相关的肌动球蛋白环构成）。1膀胱充盈期间，伞细胞的顶面及其连接环均会扩张，并在排尿后迅速恢复至充盈前状态1,2,3,4,5除了在屏障功能中的作用外，尿路上皮还被认为具有感觉和信号转导功能，可感知细胞外环境的变化（例如牵张），并传递这些信息 通过 向下方组织（包括尿路上皮下传入神经末梢）释放介质（如ATP、腺苷和乙酰胆碱）6,7....
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方案
涉及腺病毒制备的实验需要具备BSL2认证，并在匹兹堡大学环境健康与安全部门以及机构生物安全委员会的批准下进行。所有动物实验（包括需要ABSL2认证的腺病毒转导实验）均遵循《公共卫生服务政策关于实验动物的人道照护与使用》和《动物福利法》的相关指南与规定，并在匹兹堡大学机构动物照护与使用委员会的批准下实施。所有涉及重组病毒的操作均需佩戴手套、护目装备及适当的防护服。任何液体或固体废弃物均应按照下文所述方式进行处理。动物在转导后的垫料以及任何产生的动物尸体均应视为生物危害性材料，并根据机构政策进行处置。
1. 高滴度腺病毒储备液的制备
注意：有效转导啮齿类动物膀胱依赖于使用纯化且浓缩的病毒原液，通常为 1 x 107 至 1 × 108 每感染性病毒颗粒（IVP） µL. 本部分实验方案的重点是从现有的病毒制备物中制备高滴度的腺病毒储备液。所有步骤均应在细胞培养生物安全柜中使用无菌试剂和器械进行。尽管目前使用的腺病毒株均为复制缺陷型，但大多数机构仍要求对腺病毒及重组DNA的使用进行审批。这通常包括将特定细胞培养室指定为可用于腺病毒生产与扩增的BSL2级认证设施。在病毒生产与纯化的各个阶段，一般需采取佩戴口罩、护目用具、手套以及适当的防护服装等安全措施。在进行离心操作时，若离心管无紧密贴合的盖子，则建议使用安全盖。所有非一次性材料，包括可能被污染....
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结果
病毒制备
通过密度梯度离心纯化病毒的一个示例如图1A所示。在所加载的细胞材料与1.25 g/mL CsCl层之间的界面处可见浅粉红色条带，主要由破裂的细胞及其碎片组成（见图1A中的紫色箭头）。其略带粉红的颜色来源于步骤1.5中残留的少量培养基。目标病毒颗粒呈乳白色条带，位于1.25 g/mL CsCl与1.40 g/mL CsCl溶液之间的界面处（见图1A中的黄色箭头）。此外，还可观察到在富集的病毒颗粒上方2–3 mm处漂浮的一条物质带（见图1A中的细黑箭头），其成分为未组装的病毒颗粒和碎片，几乎不含完整病毒粒子（IVP），在收集病毒样品时应避免采集此部分。
使用 PD10 柱进一步纯化病毒并进行缓冲液置换的过程如图 1B所示，洗脱后各组分的 O.......
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讨论
尽管 Ramesh 等人致力于开发利用腺病毒转导治疗膀胱癌的策略18，最近的报告已证明这些技术在研究正常尿路上皮生物学/生理学及病理生理学方面的实用性10,18,19,20,21该方法的重要特征包括：（i）在整个啮齿类动物膀胱壁中， 仅尿路上皮被转导10,19,20,21,22在大鼠中，转导主要局限于伞细胞层，而在小鼠中，整个尿路上皮均.......
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披露
作者无任何利益冲突需要披露。
致谢
本研究工作获得了以下资助：P30DK079307 项下的试点项目资助（授予 M.G.D.），NIH 资助 R01DK119183（授予 G.A. 和 M.D.C.），NIH 资助 R01DK129473（授予 G.A.），美国泌尿学会职业发展奖及 Winters 基金会资助（授予 N.M.），匹兹堡肾脏研究中心肾脏细胞生理学与模式生物成像核心（P30DK079307）的支持，以及 S10OD028596（授予 G.A.），该资助用于购置本文中部分图像采集所使用的共聚焦成像系统。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 10 mL 移液管 | Corning Costar (Millipore Sigma) | CLS4488 | 无菌，血清移液管，独立包装 |
| 12 mL 超速离心管 | ThermoFisher | 06-752 | PET 薄壁超速离心管 |
| 15 mL 圆锥形离心管 | Falcon (Corning) | 352097 | 无菌 |
| 18 G 针头 | BD | 305196 | 18 G × 1.5 英寸针头 |
| 20 mL 移液管 | Corning Costar (Millipore Sigma) | CLS4489 | 无菌，血清移液管，独立包装 |
| 50 mL 圆锥形离心管 | Falcon (Corning) | 352098 | 无菌 |
| 5 mL 移液管 | Corning Costar (Millipore Sigma) | CLS4487 | 无菌，血清移液管，独立包装 |
| Cavicide | Henry Schein | 6400012 | 抗病毒溶液 |
| 细胞培养皿 - 15 cm | Falcon (Corning) | 353025 | 无菌，组织培养处理 （150 mm × 25 mm 培养皿） |
| 细胞刮刀 | Sarstedt | 893.1832 | 手柄长度 24 cm，刀片长度 1.7 cm |
| CsCl | Millipore Sigma | C-4306 | 分子生物学级 ≥ 98% |
| DMEM 培养基（高葡萄糖） | Gibco (ThermoFisher) | 11965092 | 含 4.5 g/L 葡萄糖 + L-谷氨酰胺 + 酚红 |
| EDTA | Millipore Sigma | EDS | 生物超纯级 ≥ 99% |
| 胎牛血清 | Hyclone (Cytiva) | SH30070.03 | 定义型血清 |
| 玻璃移液管 | Fisher Scientific | 13-678-20A | 5.75 英寸玻璃移液管，已高压灭菌 |
| 甘油 | Millipore Sigma | G-5516 | 分子生物学级 ≥ 99% |
| HEK293 细胞 | ATCC | CRL-3216 | HEK293T 细胞是表达 SV40 大 T 抗原的 HEK293 细胞变体 |
| 异氟烷 | Covetrus | 29405 | |
| 小鼠静脉导管 | Smith Medical Jelco | 3063 | 24 G × 3/4 英寸安全静脉导管 具射线不透性 |
| 大鼠静脉导管 | Smith Medical Jelco | 3060 | 22 G × 1 英寸安全静脉导管，具射线不透性 |
| KCl | Millipore Sigma | P-9541 | 分子生物学级 ≥ 99% |
| KH2PO4 | Millipore Sigma | P5655 | 细胞培养级 ≥ 99% |
| Na2HPO4•7 H2O | Millipore Sigma | 431478 | ≥ 99.99% |
| NaCl | Millipore Sigma | S3014 | 分子生物学级 ≥ 99% |
| N-十二烷基-β-D-麦芽糖苷 | Millipore Sigma | D4641 | ≥ 98% |
| 多动物用鼻罩 | 定制设计 | 商业可选产品包括 Parkland Scientific（RES3200）提供的型号 | |
| PD-10 柱 | GE Healthcare | 17-085-01 | 预装 Sephadex G-25M 的层析柱 |
| 青霉素/链霉素抗生素（100 倍浓缩液） | Gibco (ThermoFisher) | 15070063 | 100 倍浓缩溶液 |
| 分光光度计 | Eppendorf | BioPhotometer | |
| 支架和夹具 | Fisher Scientific | 14-679Q 和 05-769-8FQ | 可从多家供应商处获得 |
| 无菌滤器单元 | Fisher Scientific (Nalgene) | 09-740-65B | 0.2 µm 快流速滤器单元（150 mL） |
| 无菌滤器单元 0.2 µm（注射器式） | Fisher Scientific | SLGV004SL | 可连接至注射器的 Millipore Sigma Milex 0.22 µm 滤器单元 |
| 超高速离心机 | Eppendorf | 5810R | 配备 Eppendorf F34-6-38 固定角转子（12,000 rpm） |
| 注射器（1 mL） | BD | 309628 | 1 mL 鲁尔锁头注射器 - 无菌 |
| 注射器（3 mL） | BD | 309656 | 3 mL 滑动头注射器 - 无菌 |
| 台式离心机（低速） | Eppendorf | 5702 | 配备摆桶转子 |
| 移液管（转移用） | Fisher Scientific | 13-711-9AM | 聚乙烯 3.4 mL 转移移液管 |
| Tris 碱 | Millipore Sigma | 648310-M | 分子生物学级 |
| TrypLE 选择性蛋白酶溶液 | Gibco (ThermoFisher) | 12604013 | TrypLE Express 酶（1 倍浓度），不含酚红 |
| 超速离心机 | Beckman Coulter | Optima L-80 XP | 配备 Beckman SW41 转子（41,000 rpm） |
| 挥发器 | General Anesthetic Services, Inc. | Tec 3 | 异氟烷挥发器 |
| 涡旋混合器 | VWR | 10153-838 | 模拟式涡旋混合器 |
参考文献
- Dalghi, M. G., Montalbetti, N., Carattino, M. D., Apodaca, G. The Urothelium: Life in a liquid environment. Physiological Reviews. 100 (4), 1621-1705 (2020).
- Truschel, S. T., et al. Stretch-regulated exocytosis/endocytosis in bladder umbrella cells. Molecular ....
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