使用腺病毒介导的转导在天然膀胱尿氦中表达转基因

摘要

描述了用于生成大量重组腺病毒的方法，然后可用于转导天然啮齿动物尿路上皮，从而表达转基因或下调内源性基因产物。

摘要

除了形成高阻力屏障外，肾盂、输尿管、膀胱和近端尿道内壁的尿路上皮还被假设为感知其环境信息并将其传递到下层组织，从而促进排尿功能和行为。尿路上皮屏障或其感觉/换能器功能的破坏可导致疾病。由于缺乏改变尿路上皮中基因和蛋白质表达的简单策略，研究这些复杂事件受到阻碍。这里描述了允许研究人员产生大量高滴度腺病毒的方法，然后可以使用这些病毒以相对直接的方式高效转导啮齿动物尿路上皮。cDNA和小干扰RNA都可以使用腺病毒转导表达，并且可以在12小时至几天后评估转基因表达对尿路上皮功能的影响。这些方法对使用小鼠或大鼠动物模型研究正常和异常尿路上皮生物学具有广泛的适用性。

引言

尿路上皮是排列在肾盂、输尿管、膀胱和近端尿道¹ 上的特化上皮。它包括三个层:一层高度分化和极化的通常双核伞状细胞，其顶端表面沐浴在尿液中;具有双核转运扩增细胞群的中间细胞层，可产生浅表伞形细胞以应对其急性丢失;以及单层基底细胞，其中一部分作为干细胞发挥作用，可以再生整个尿路上皮以应对慢性损伤。伞状细胞主要负责形成高抗性尿路上皮屏障，其组成部分包括对水和溶质通透性低的顶膜（富含胆固醇和脑苷脂）和高抗性顶端连接复合物（由紧密连接、粘附连接、桥粒和相关肌动球蛋白环组成）¹.伞状细胞的顶端表面及其连接环在膀胱充盈过程中均膨胀，并在排尿后迅速恢复到预充盈状态1，²，^3，4，5。除了在屏障功能中的作用外，尿路上皮还被假设具有感觉和换能器功能，使其能够感知细胞外环境的变化（例如拉伸），并通过释放介质（包括ATP，腺苷和乙酰胆碱）将此信息传递到下层组织，包括尿路上皮下^{传入神经过程}6，^7，

方案

涉及产生腺病毒的实验，需要BSL2认证，是在匹兹堡大学环境健康与安全办公室和机构生物安全委员会的批准下进行的。所有进行的动物实验，包括腺病毒转导（需要ABSL2认证），均按照《关于人道护理和实验动物的公共卫生服务政策和动物福利法》的相关指南/规定进行，并得到匹兹堡大学机构动物护理和使用委员会的批准。所有涉及重组病毒的手术均应佩戴手套、护目镜和适当的服装。任何液体或固体废物都应按以下说明进行处理。转导后动物的垫料以及由此产生的任何动物尸体应作为生物危害材料处理，并根据机构政策进行处理。

1. 高滴度腺病毒储液的制备

注意:啮齿动物膀胱的有效转导取决于纯化和浓缩病毒储液的使用，通常每μL1 x 10⁷ 至1 x 10⁸ 感染性病毒颗粒（IVP）。该协议的这一部分侧重于从现有病毒制剂中生成高滴度腺病毒储液。所有步骤都应使用无菌试剂和工具在细胞培养罩中进行。虽然目前使用的腺病毒可用菌株存在复制缺陷，但大多数机构需要批准才能使用腺病毒和重组DNA。这通常包括将细胞培养室指定为BSL2批准的设施，以生产和扩增腺病毒。一些一般注意事项包括在病毒产生和纯化的所有阶段使用口罩、护目镜、手套和适当的服装。进行离心时，如果离心管没有紧密配合的盖子，建议使用安全帽。所有非一次性材料，包括可能被污染的离心机安全盖、瓶子和转子，都用抗病毒溶液处理（见 材料表<....

结果

病毒制备
通过密度梯度离心纯化病毒的示例如图 1A所示。浅粉红色条带位于上样细胞材料和1.25 g/mL CsCl层的界面处，主要由破碎的细胞及其碎片组成（参见 图1A中的洋红色箭头）。它的粉红色来自从方案中步骤1.5中携带的少量培养基。目标病毒颗粒呈乳白色条带，位于 1.25 g/mL CsCl 和 1.40 g/mL CsCl 溶液的界面处（参见 图 1A 中的黄色箭头）。人们还可以观察到一条物质带，它漂浮在富集病毒颗粒上方2-3毫米（见 图1A中的黑色细箭头）。它包含未组装的病毒和碎片，含有很少的IVP，在收集病毒样本时应避免使用。

使用PD10色谱柱进一步纯化病毒和缓冲液置换如图1B所示，洗脱后所得馏分的OD₂₆₀读数.......

讨论

虽然Ramesh等人专注于开发使用腺病毒转导治疗膀胱癌的策略¹⁸，但最近的报告表明这些技术在研究正常尿路上皮生物学/生理学和病理生理学的实用性10，¹⁸，¹⁹，^20，21.这种方法的重要特征包括:（i）在整个啮齿动物膀胱壁中，只有尿路上皮被转导10，¹⁹，²⁰，^21，22。在大鼠的情况下，转导主要局限于伞状细胞层，而在小鼠中，可以靶向整个尿路上皮.......

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
10 mL 移液器	Corning Costar （Millipore Sigma CLS4488		无菌血清移液器，独立包装
12 mL 超速离心管	ThermoFisher	06-752	PET 薄壁超速离心管
15 mL 锥形离心管	Falcon （Corning）	352097	无菌
18 G 针	BD	305196	18 G x 1.5 in 针头
20 mL 移液器	Corning Costar （Millipore Sigma CLS4489		无菌血清移液器，独立包装
50 mL 锥形离心管	Falcon （Corning）	352098	无菌
5 mL 移液器	Corning Costar （Millipore Sigma）	CLS4487	无菌血清移液器，独立包装
的 Cavicide	HenrySchein	6400012	抗病毒溶液
细胞培养皿 - 15 cm	Falcon （Corning）	353025	无菌，经组织培养处理 （150 毫米 x 25 毫米培养皿）
细胞刮刀	Sarstedt	893.1832	手柄长度 24 cm，刀片长度 1.7 cm
CsCl	Millipore Sigma	C-4306	分子生物学级 ≥ 98%
DMEM 培养基（高葡萄糖）	Gibco （ThermoFisher）	11965092	含 4.5 g/L 葡萄糖 + L-谷氨酰胺 + 酚红
EDTA	Millip ore Sigma		EDS Bioiultra 级 ≥ 99%
胎牛血清	Hyclone （Cytiva）	SH30070.03	定义血清
玻璃移液器	Fisher Scientific	13-678-20A	5.75 玻璃移液器，高压灭菌
甘油	Millipore Sigma	G-5516	分子生物学级 ≥ 99%
HEK293 细胞	ATCC	CRL-3216	HEK293T 细胞是 HEK293 细胞的一种变体，表达 SV40 大 T 抗原
异氟醚	Covetrus	29405
IV 导管 - 小鼠	Smith Medical Jelco	3063	24 G x 3/4 英寸 安全型 IV 导管  不透射
静脉导管 - 大鼠	Smith Medical Jelco	3060	22 G x 1 英寸 安全型 IV 导管 不透射线
KCl	Millipore Sigma	P-9541	分子生物学等级 ≥ 99%
KH2PO4	Millipore Sigma	P5655	细胞培养级  ≥ 99%
Na2HPO4•7 H2O	Millipore Sigma	431478	≥99.99%
NaCl	Millipore Sigma	S3014	分子生物学级 ≥ 99%
N-十二烷基-&β;-D-麦芽糖苷	Millipore Sigma	D4641	≥98%
适用于多种动物的鼻锥	，定制设计		的商业选项包括 Parkland Scientific （RES3200）
PD-10 色谱柱中的一种	GE Healthcare	17-085-01	预装柱填充于 Sephadex G-25M
青霉素/链霉素抗生素 （100x）	Gibco （ThermoFisher）	15070063	100x 浓缩溶液
分光光度计	Eppendorf	生物光度计
支架和夹具	Fisher Scientific	14-679Q 和 05-769-8FQ	可从众多供应商处获得
无菌过滤装置	Fisher Scientific （Nalgene）	09-740-65B	0.2 µm 快速流过滤装置 （150 mL）
无菌过滤装置 0.2 & micro;m （注射器）	Fisher Scientific	SLGV004SL	Millipore Sigma Milex 0.22 µm 连接到注射器的过滤器装置
超高速离心机	Eppendorf	5810R	配用 Eppendorf F34-6-38 固定角转子 （12,000 rpm）
注射器 （1 mL）	BD	309628	1 mL 注射器 Luer-lok 尖端 - 无菌
注射器 （3 mL）	BD	309656	3 mL 注射器滑动吸头 - 无菌
台式离心机（低速）	Eppendorf	5702	带水平转子
移液管	Fisher Scientific	13-711-9AM	聚乙烯 3.4 mL 移液管
Tris-base	Millipore Sigma	648310-M	分子生物学级
TrypLE 选择蛋白酶溶液	Gibco （ThermoFisher 12604013		TrypLE 表达酶 （1x），无酚红
超速离心	贝克曼库尔特	Optima L-80 XP	配备贝克曼 SW41 转头 （41,000 rpm）
蒸发器	General Anesthetic Services， Inc. （普通麻醉服务公司）	Tec 3	异氟醚蒸发器
涡旋混合器	VWR	10153-838	模拟涡旋混合器