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方法文章

大鼠视网膜下植入物手术技术的开发

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⸱

DOI：

10.3791/64585

⸱

2022年12月2日

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1USC Roski Eye Institute, Keck School of Medicine of the University of Southern California, 2USC Dr. Allen and Charlotte Ginsburg Institute for Biomedical Therapeutics, University of Southern California, 3Department of Pathology, Keck School of Medicine of the University of Southern California, 4Regenerative Patch Technologies LLC, 5Eye center, Beijing Tsinghua Changgung Hospital, School of Clinical Medicine, Tsinghua University

本文内容

摘要

本方案描述了用于视网膜下装置植入的巩膜入路，这是一种可在视网膜疾病动物模型研究中实施的可行外科技术。

摘要

视网膜变性，例如年龄相关性黄斑变性（AMD），是全球致盲的主要原因之一。为开发基于再生医学的AMD治疗方法，已开展了多种研究，包括基于干细胞的治疗策略。由于存在多种在不同阶段发生视网膜变性疾病的品系，啮齿类动物作为视网膜变性动物模型，构成了转化研究的基础。然而，由于晶状体大小和玻璃体体积等解剖学差异，在啮齿类动物中模拟人类视网膜下植入物的递送方式具有挑战性。本手术方案旨在提供一种在大鼠视网膜下腔移植植入物的规范化操作方法，其中包含了关键步骤的详尽且易于操作的描述。该方案被设计为一种经济高效的手术流程，可在不同大鼠的临床前研究中实现可重复性。在开展手术实验前，需对适用于人类尺寸的植入物进行适当的微型化处理，包括调整其尺寸参数。本方法采用外部入路而非玻璃体内途径，将植入物递送至视网膜下腔。使用细锐针头在颞上象限行巩膜切口，随后进行前房穿刺以降低眼内压，从而在手术植入过程中减小阻力。接着，通过切口注入平衡盐溶液（BSS），以实现局部视网膜脱离（RD）。最后，将植入物置入视网膜下腔并进行可视化观察。术后通过谱域光学相干断层扫描（SD-OCT）成像评估植入物在视网膜下的定位情况。后续影像学随访确认植入物在视网膜下的稳定性，之后摘取眼球并进行固定，以供组织学分析。

引言

年龄相关性黄斑变性（AMD）是全球致盲的主要原因之一。据估计，2020年全球受AMD影响的人数达1.96亿，预计到2040年将上升至约2.88亿1。在过去十年中，已开发出多种治疗方法，旨在减轻AMD晚期阶段相关的视力变化，主要针对湿性AMD中出现的脉络膜新生血管的形成与进展。相比之下，干性AMD的治疗仍面临挑战，干性AMD中视网膜色素上皮（RPE）细胞功能障碍和丢失逐渐发展为RPE和视网膜萎缩，约占AMD病例的85%至90%，全球患病率为0.44%1,2。AMD被认为是一种多因素疾病，年龄、遗传和环境因素均参与其发病与进展过程；目前已有多种疗法正在研发中，以针对该疾病相关的不同病理生理通路3。

基于干细胞的疗法已发展成为一种新型治疗选择，用于替代干性年龄相关性黄斑变性（dry AMD）中功能衰竭的视网膜色素上皮（RPE）4。尽管多能干细胞的应用仍处于早期临床试验阶段，但已有多个临床试验证实了其安全性5,6,7。迄今为止，将干细胞植入视网膜下腔主要有两种途径：细胞悬液注射，或植入接种于生物相容性载体上的单层细胞片8,9,10,11,12。在临床前研究中，新的基于干细胞的治疗策略需要借助动物模型，以确保干细胞治疗剂能够递送至与人体应用相同的目标部位。由于解剖结构的差异，与最终用于人体的产品相比，相关操作步骤、手术器械和手术入路可能需要进行细微调整13,14。其中，对眼科手术技术进行适当改良已被广泛报道为一种适用于多种动物模型的有效策略15,16,17。

尽管先前已有文献提及大鼠视网膜下植入的手术技术，但目前尚无全面描述此类技术以克服研究人员可能遇到的技术难题的详细资料。因此，有必要对手术技术进行详尽说明，提供最佳实践和应避免的经验教训，并在必要时解决手术关键步骤中可能出现的问题。本文旨在为大鼠视网膜下腔植入物的手术植入提供一份全面的操作指南。

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方案

所有实验均经南加州大学机构动物照护与使用委员会（IACUC）批准，并遵循美国国立卫生研究院（NIH）《实验动物照护与使用指南》以及视觉与眼科研究协会（ARVO）关于动物在眼科与视觉研究中使用的声明。本研究共使用12只皇家外科医师学院（RCS）雄性大鼠。动物在本单位动物饲养设施中繁殖，待其出生后28 ± 1天龄时纳入研究。进行完整的眼科检查以确认无眼部异常。视网膜下植入物为由聚对二甲苯C制成并涂覆纤连蛋白的超薄膜，由特定商业机构设计（见材料表）。这些膜在厚度和通透性方面模拟人用尺寸的膜（超薄区域为6.0 µm厚的网状框架，带有20 µm的圆形孔隙）。为适应啮齿类动物眼球内部空间，将膜的长度和宽度（1.0 mm × 0.4 mm）较人用尺寸缩小18。

1. 动物护理与手术准备

  1. 称重动物以计算麻醉剂剂量，并按照步骤 1.2 进行麻醉。
  2. 通过腹腔注射氯胺酮和赛拉嗪混合物（分别为 35–50 mg/kg 和 5–10 mg/kg；参见材料表）对动物进行麻醉。使用 1.0 mL 注射器和 30 G 针头进行注射。
  3. 用另一个 1.0 mL 注射器抽取一半剂量的麻醉混合物（氯胺酮和赛拉嗪），用于在手术过程中维持适当的麻醉水平。
  4. 通过检查足底反射（用力捏压脚趾）是否消失来确认麻醉程度充分。
  5. 为清晰观察玻璃体腔和视网膜，需在处理眼内滴入 1% 托吡卡胺和 2.5% 去氧肾上腺素滴眼液（参见材料表）以散大瞳孔。
    1. 5 分钟后再次滴入第二剂散瞳滴眼液。
  6. 在动物麻醉期间，每 5–10 分钟向非手术眼内滴加人工泪液或眼用润滑凝胶，以保持角膜湿润。
  7. 在加热垫上覆盖无菌巾（参见材料表），并在手术托盘上铺好无菌巾。
  8. 在手术托盘上放置以下无菌器械，准备无菌手术区域：外科手套、视网膜下植入物及手术工具：蚊式钳（3 把）、显微精细剪刀（1 把）、持针器（1 个）、带齿精细镊（1 把）、无齿精细直镊（2 把）、微量注射器（1 个）、32 G 钝针（1 个）、27 G 或 30 G 针头（2 个）、4-0 丝线缝线（3 根）、棉签、平衡盐溶液（BSS）和盖玻片（参见材料表）。
  9. 在无菌条件下佩戴无菌手套，用微量注射器抽取 BSS 并连接 32 G 钝针。
  10. 将棉签插入 27 G 或 30 G 针头的针座中，作为手柄以实现对针头更精确的操作。
  11. 为在整个手术过程中维持无菌状态，若接触了非无菌器械或区域（如手术显微镜），应更换无菌手套。

2. 巩膜入路的视网膜下植入：手术技术

  1. 按照以下步骤暴露手术区域。
    1. 当动物进入麻醉状态且瞳孔已散大（步骤 1.5）后，将动物腹部朝下放置，头部朝向研究人员。
      注意：在整个手术过程中直至动物完全恢复之前，应始终将大鼠置于覆盖无菌巾的加热垫上。
    2. 将 5% 聚维酮滴液（参见材料表）滴入眼内，并用棉签清洁眼表及眼睑。
    3. 将手术显微镜（参见材料表）置于手术眼上方并进行调整。
      注意：建议在整个手术过程中使用眼科手术显微镜，以更清晰、更大倍数地观察眼部结构。
    4. 通过提起上眼睑并使用 4-0 不可吸收缝线使眼球突出，确保手术区域充分暴露。
      1. 使用 4-0 丝线缝线提起上眼睑。将缝线置于睑板腺水平处的眼睑前侧。通过蚊式钳夹住缝线尾端并固定于手术台面，以维持牵引力。
        注意：若缝线位置高于睑板腺水平，则会导致眼睑外翻而非上提。
      2. 使用显微外科精细剪刀在颞侧上象限进行球结膜切开术（peritomy）。
      3. 放置两根牵引缝线，以实现眼球的突出和前移。分离上直肌。
        1. 在角膜缘上部用精细齿状镊（0.12 mm 镊子）轻柔操作眼球，使眼球向下翻转，暴露巩膜。
        2. 在距上角膜缘后方约 1 mm 处（即上眼外肌所在位置）放置一根 4-0 丝线缝线。用蚊式钳夹住缝线两端。
      4. 分离颞侧直肌。在颞象限距角膜缘约 1 mm 处（对应颞侧眼外肌区域）放置第二根缝线（4-0 丝线）。用蚊式钳夹住缝线两端。
      5. 当两根眼外肌牵引缝线正确放置并夹紧后，向下并向内牵拉缝线，以暴露巩膜的颞侧上象限。
    5. 使用显微外科精细剪刀将球结膜切口向眼球后方延伸。
    6. 使用棉签控制结膜出血。
  2. 按照以下步骤进行巩膜切开、视网膜脱离（RD）及植入物置入。
    1. 使用 27 G 或 30 G 针头进行巩膜切开。确保切口大小约为 1.2 mm，位于角膜缘后方 1.5 mm 处。
      注意：建议形成隧道样巩膜切口结构，以便在操作眼球和置入植入物时稳定眼内结构。此类切口形态可防止眼内压突然波动。
    2. 有时，合适的切口构型需要一定练习。因此，若未能形成理想构型，可适当放松眼外肌牵引缝线的张力，以利于维持玻璃体腔内结构的稳定。
    3. 使用与巩膜切开相同的针头（27 G 或 30 G），在同一象限的周边角膜处进行前房穿刺（paracentesis）。
    4. 将安装在微升注射器上的 32 G 钝头针经巩膜切口插入眼内。
    5. 注入 100 µL 平衡盐溶液（BSS），以形成局灶性视网膜脱离（RD）。
    6. 松解眼外肌牵引缝线，使眼球恢复至正常位置。
    7. 为直接观察视网膜脱离情况，将载有眼科润滑凝胶的盖玻片静置并轻压于角膜表面。
    8. 调整显微镜物镜，聚焦于视网膜。
    9. 若未观察到视网膜脱离或脱离范围过小（小于一个象限），则通过向下并向内翻转眼球，重复步骤 2.2.4 至 2.2.8，再次注射 BSS，直至达到理想的视网膜脱离范围。
    10. 完成视网膜脱离后，使用游标卡尺（参见材料表）验证巩膜切口长度（如步骤 2.2.1 所述）。
    11. 使用精细显微外科剪刀在两个方向上剪开脉络膜组织。
    12. 将钝头针沿巩膜切口横向滑动，确认所有巩膜和脉络膜结构均已分离。
    13. 将植入物置入视网膜下腔。
    14. 使用两把精细手术镊（如打结镊，参见材料表），从植入物背面夹持，避免损伤其活性部分。
    15. 将植入物与切口平面保持平行，轻柔地将其滑入。
    16. 当植入物完全进入视网膜下腔后，松开镊子，并将其中一把镊子的钳口插入切口内 1–1.5 mm，进一步推进植入物。
    17. 松解眼外肌牵引缝线，并如上所述（步骤 2.2.7 和 2.2.8）使用显微镜和盖玻片检查植入物的位置。
  3. 松解并移除所有缝线。
    ​注意：手术完成后，立即进行频域光学相干断层扫描（SD-OCT）（步骤 3），以验证临床发现。若未能获得满意的植入物位置图像，则应在术后 7–10 天再次进行 SD-OCT 检查。

3. SD-OCT 成像

  1. 点击桌面上的 Heidelberg Eye Explorer 图标（一种图像管理软件；参见材料表）。
  2. 点击屏幕顶部的 新患者 图标。
    1. 填写所有请求的信息以生成动物编号，然后点击“接受”。
    2. 在设备类型中选择OCT成像系统（HRA + OCT；参见材料表）。
    3. 选择操作员，然后按确定。
    4. 对于正确的角膜曲率选项，按下确定按钮以接受默认的眼部数据。
  3. 确保已启动SD-OCT采集窗口，并准备进行SD-OCT成像。
  4. 按下位于摄像头旁触摸屏显示器上的黄色启动按钮，打开SD-OCT相机。
  5. 将动物放置在已适配于SD-OCT头托上方的动物载物台上。
    注：动物载物台适配器包含一块聚苯乙烯泡沫（参见材料表），可嵌入SD-OCT头部支架内，其尺寸足以容纳动物及加热垫。
  6. 调节台面高度和动物位置，使瞳孔与SD-OCT镜头中心对齐。
    注：当眼睛对准后，屏幕上将出现红外（IR）实时图像。
  7. 按下触摸屏上的IR + OCT按钮，或显示器右下角的OCT按钮，开始图像采集。
  8. 当SD-OCT进入实时状态后，选择单次扫描模式，并设置最高的ART帧数（100）。100帧ART扫描模式为默认模式。
  9. 使用相机操纵杆，在IR图像中将视神经居中。
  10. 将相机向前推进，直到IR图像被视网膜图像均匀填充。
    注：图像出现暗角表明相机距离眼睛过远或过近。
  11. 左右移动相机，直到在视网膜的颞侧区域观察到植入物。使用IR图像引导移动。
  12. 要通过B扫描观察植入物，请同时按下CTRL + ALT + SHIFT + O，以显示SD-OCT B扫描调节窗口。
  13. 调节窗口底部的"参考臂"，直至在SD-OCT图像中观察到视网膜/植入物。
    ​注：SD-OCT图像必须显示在蓝色参考角范围内。
  14. 关闭窗口。
  15. 使用操纵杆和相机手柄，前后、左右滑动并旋转相机，直至获得更平整、更清晰的SD-OCT图像。
  16. 在IR图像上拖动蓝色箭头，使其沿植入物方向放置。
  17. 当B扫描的饱和度和位置达到最佳状态后，按下触摸屏下方的黑色增益控制按钮，启动"自动实时追踪（ART）"功能。
  18. 当ART达到100帧时，在触摸屏上按下采集按钮。
  19. 所有图像采集完成后，点击窗口顶部的保存图像，然后点击退出。
  20. 在整个成像过程中，需频繁滴加润滑性眼药水（每5分钟一次），以保持角膜湿润。

4. 动物恢复

  1. 成像实验结束后，在角膜上涂抹抗生素软膏，以预防眼部感染并保持角膜湿润。
  2. 将动物俯卧于加热垫上，直至其完全恢复（约 20–30 分钟）并能自主活动。
  3. 手术结束后给予全身性镇痛剂（1.0–1.2 mg/kg 缓释型布托啡诺，皮下注射一次；参见 材料表）。
  4. 在动物恢复足够意识之前，不得使其无人看护。
  5. 在动物完全恢复之前，不得将其放回其他动物群体中。
  6. 待动物完全恢复后，将其放回饲养区域，并可自由获取食物和饮水 ad libitum。

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结果

在RCS大鼠（N = 12）中植入视网膜下植入物，证明了在大鼠中进行视网膜下递送的手术技术具有可行性和可重复性。本研究中，右眼为接受植入物治疗的眼（N = 12）。在手术结束时通过手术显微镜进行的临床评估显示，12只治疗眼中，9只眼的植入物位于视网膜下（75.00%），2只眼（16.67%）的植入物位于视网膜内，另有1只眼（8.33%）由于手术区域出现视网膜下出血导致介质混浊，无法直接观察到植入物及视网膜结构（表1）。术后立即进行的SD-OCT扫描显示，植入物位于视网膜下或视网膜内（分别为10例[83.33%]和1例[8.33%]）（图1A）。在上述因介质混浊而无法直接观察的同一只动物（n = 1）中，即使在术后10天的随访中，SD-OCT仍未能完全确认植入物的视网膜下位置。图1B、C展示了两只植入物正确放置于视网膜下腔的不同动物。该手术技术未出现其他手术相关并发症。通过苏木精-伊红（H&E）染色，进一步证实了植入物位于视网膜下（

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讨论

尽管该手术方法此前已有若干细微差异的描述，但本文的目的是全面介绍大鼠视网膜下植入手术的操作流程，以供学习该技术时遵循，并帮助研究人员克服可能遇到的手术难点和潜在并发症。本文所述的手术方案包括使用聚对二甲苯超薄膜，该材料已在我们的实验室中广泛使用多年9,10,16,18。然而，使用不同的注射装置以及植入视网膜下间隙的不同材料时，该技术的可重复性也已被观察到18,19。

巩膜入路用于视网膜下装置植入不仅限于基于干细胞的治疗；在小型动物模型中的视网膜移植手术也已有报道20,21。在视网膜电刺激领域，大鼠...

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披露

M.S.H.、D.R.H. 和 J.L. 是再生补片技术公司（Regenerative Patch Technologies，RPT）的联合创始人并担任该公司的顾问。其他作者声明，他们与任何组织或实体均无关联，亦未参与任何与本文所述主题或材料存在经济或非经济利益关系的组织或实体。

致谢

本研究由加州再生医学研究所DT3（MSH）和“预防失明研究”项目（南加州大学罗斯基眼科研究所）资助。我们感谢Fernando Gallardo和Ying Liu博士提供的技术支持。

资助方在本研究的设计或实施过程中未发挥任何作用。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
1 cc 注射器VWRBD309659
27 G 针头 1/2''VWRBD305109
30 G 针头 1/2''VWRBD305106
32 G 钝头针 - 小柄 RNHamilton7803-04
4-0 Perma Hand 黑色丝线 1X18" PC-5Ethicon1984G
6'' 无菌棉签VWR10805-154
5% 无菌眼科用聚维酮碘溶液Alcon8007-1
BSS 灌洗液 15 mLAccutomeAx17362
缓释型布托啡诺ZooPharmN/A
Castroviejo 卡尺StorzE2405
Castroviejo 缝合镊 0.12 mmStorzE1796
Clayman-Vannas 直剪StorzE3383S
盖玻片，方形WVR48366-227
EPS 聚苯乙烯块Silverlake LLCCFB8x12x2
Gonak 15 mLAccutomeAx10968眼用润滑剂
Halstead 直型无磁性蚊式止血钳StorzE6772
Hamilton 700 系列 100 µL 注射器Hamilton7638-01
HEYEX 软件Heidelberg N/A图像管理软件
Kelman-McPherson 打结钳（角形）StorzE1815 AKUS
氯胺酮（100 mg/mL）MWI501072
针持 9 mm 弯型精细锁扣式Storz3-302
新霉素/多粘菌素 B 硫酸酯/杆菌肽锌软膏 3.5 gAccutomeAx0720
眼科手术显微镜ZeissSN: 233922
去氧肾上腺素 2.5% 15 mLAccutomeAx0310
Spectralis SD-OCTHeidelberg SPEC-CAM-011210s3600
无菌手术单VWR100229-300
无菌外科手套VWR89233-804
T-Pump 加热系统GaymarTP650
托吡卡胺 1% 15 mLAccutomeAx0330
由聚对二甲苯 C 制成并涂覆连蛋白的超薄膜Mini Pumps LLC, CA专为此研究设计用作视网膜下植入物 
赛拉嗪（100 mg/mL）MWI510650

参考文献

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