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方法文章

利用清醒状态下闭合性头部损伤的轻度创伤性脑损伤模型评估突触可塑性的变化

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DOI：

10.3791/64592

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2023年1月20日

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Division of Medical Sciences, University of Victoria, 2Island Medical Program, University of British Columbia

本文内容

摘要

在此，展示了如何利用清醒状态下的闭合性头部损伤模型来研究重复性轻度创伤性脑损伤（r-mTBI）对海马突触可塑性的影响。该模型可复制r-mTBI患者的重要病理特征，并可与电生理记录、行为学检测及分子生物学分析等技术联合使用 体外 电生理学

摘要

轻度创伤性脑损伤（mTBI）是北美地区普遍存在的健康问题。目前迫切需要在临床前研究中采用生态学上有效的闭合性头部mTBI模型，以提高向临床人群转化的可行性。清醒状态下的闭合性头部损伤（ACHI）模型采用改良的可控皮层冲击器实施闭合性头部损伤，可在无需开颅或使用麻醉剂的情况下，诱导出具有临床相关性的行为功能缺陷。

该技术通常不会引起死亡、颅骨骨折或脑出血，更符合轻度损伤的特征。事实上，ACHI 手术的轻度特性使其成为研究重复性轻度创伤性脑损伤（r-mTBI）的理想模型。越来越多的证据表明，r-mTBI 可导致累积性损伤，引发行为症状、神经病理学改变以及神经退行性病变。r-mTBI 在参与体育运动的青少年中较为常见，而此类损伤发生于突触重组和髓鞘化活跃的发育阶段，使得年轻人群对 r-mTBI 的长期影响尤为易感。

此外，重复性轻度创伤性脑损伤（r-mTBI）可发生于亲密伴侣暴力事件中，而目前针对此类情况尚缺乏客观的筛查手段。在本实验中，采用ACHI模型对经历r-mTBI的幼年大鼠海马区突触功能进行了评估。损伤后，使用组织切片机制备海马脑片，以评估r-mTBI后1天或7天时海马区的双向突触可塑性。总体而言，ACHI模型为研究人员提供了一种生态效度良好的模型，可用于研究轻度创伤性脑损伤（mTBI）和重复性轻度创伤性脑损伤（r-mTBI）后突触可塑性的变化。

引言

创伤性脑损伤（TBI）是一个重要的健康问题，每年在加拿大和美国约有200万例病例1,2。TBI影响所有年龄组和性别，其发病率高于任何其他疾病，尤其是乳腺癌、艾滋病、帕金森病和多发性硬化症3。尽管TBI普遍存在，但其病理生理机制仍不甚清楚，治疗手段也十分有限。部分原因在于，所有TBI中约85%被归类为轻度（mTBI），而过去认为mTBI仅引起轻微且短暂的行为改变，不会导致长期的神经精神后果4,5。目前人们已认识到，mTBI的恢复可能需要数周至数年时间5,6，可能诱发更严重的神经系统疾病4，甚至反复的"亚震荡性"撞击也会对大脑造成影响7。这一点令人担忧，因为在冰球/橄榄球等运动项目中的运动员，每场比赛或训练期间可能经历>10次头部亚震荡性撞击7,8,9,10。

青少年的轻度创伤性脑损伤发病率最高， 在加拿大，大约每10名青少年中就有1人每年会因运动相关的脑震荡寻求医疗救治11,12实际上，任何亚震荡性头部撞击或轻度创伤性脑损伤（mTBI）都可能对大脑造成弥散性损伤，还可能使大脑处于更易受损的状态，从而增加后续损伤和/或更严重神经系统疾病的风险。13,14,15,16,17在加拿大，这在法律上是被认可的 通过 罗恩定律指出，先前的损伤可能增加大脑对后续损伤的易感性18但对重复性轻度创伤性脑损伤（r-mTBI）的机制理解仍严重不足。然而，已有明确证据表明，单次及重复性轻度创伤性脑损伤可能影响学龄期间的学习能力19,20，具有性别特异性的结果21,22,23,24并损害晚年的认知能力16,25,26事实上，队列分析强烈表明，生命早期的重复性轻度创伤性脑损伤与日后的痴呆症密切相关。27,28轻度重复性创伤性脑损伤（r-mTBI）还可能与慢性创伤性脑病（CTE）相关，后者以高磷酸化tau蛋白的积聚、进行性皮质萎缩以及显著的炎症反应为特征。27,29,30,31尽管r-mTBI与CTE之间的关联目前尚存争议32该模型将使研究人员能够在临床前环境中对它们进行更深入的探讨。

轻度创伤性脑损伤（mTBI）常被称为“"看不见的损伤"，因其发生在封闭的颅骨内，即使使用现代影像技术也难以检测33,34。一个准确的mTBI实验模型应遵循两个基本原则。第一，应能重现临床患者中常见的生物力学力35。第二，该模型应诱导出异质性的行为学结果，这一点在临床患者中也极为普遍36,37,38。目前，大多数临床前模型的损伤程度往往更严重，通常涉及开颅手术、立体定位头颅固定、麻醉以及可控性皮层冲击（CCI），这些方法造成的结构损伤和行为缺陷比临床通常观察到的更为显著33。另一个值得关注的问题是，许多涉及开颅手术的脑震荡临床前模型本身就会引发脑内炎症，从而可能加剧后续损伤所导致的mTBI症状和神经病理变化39,40。麻醉也会引入多种复杂的混杂因素，包括降低炎症反应41,42,43、调节小胶质细胞功能44、谷氨酸释放45、NMDA受体介导的Ca2+内流46、颅内压以及脑代谢47。此外，麻醉还会通过增加血脑屏障（BBB）通透性、tau蛋白过度磷酸化和皮质类固醇水平，同时降低认知功能，进一步引入混杂效应48,49,50,51。此外，弥散性闭合性头部损伤构成了临床上绝大多数mTBI病例52。这类损伤还允许研究者更好地探究多种可能影响行为学结果的因素，包括性别21、年龄53、伤间间隔15、损伤严重程度54以及损伤次数23。

加速/减速力的方向（垂直或水平）对于行为学和分子学结果也是一个重要的考虑因素。Mychasiuk 及其同事的研究比较了两种弥散性闭合性轻度创伤性脑损伤（mTBI）模型：落锤法（垂直方向受力）和侧向撞击法（水平方向受力）55。行为学和分子学分析均显示，mTBI 后的结果具有模型特异性和性别依赖性的异质性。因此，那些能够避免手术操作、同时包含线性和旋转力的动物模型，更能真实反映此类损伤通常发生的生理条件33,56。ACHI 模型正是为满足这一需求而开发的，可在大鼠中快速、可重复地诱导 mTBI，同时避免使用已知可能干扰性别差异分析的操作（如麻醉）57。

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方案

所有动物实验均获得维多利亚大学动物护理委员会批准，符合加拿大动物护理委员会（CCAC）标准。所有雄性Long-Evans大鼠均为本实验室自繁或外购（见材料表）。

1. 饲养与繁殖条件

  1. 让动物在断奶前（出生后第21天）于饲养环境中适应1周。
  2. 将大鼠饲养在标准笼具中，温度维持在 22.5 °C ± 2.5 °C， 随意摄取 自由获取食物和水，保持12小时光照/12小时黑暗循环。
  3. 将动物按性别匹配，每组两到三只同窝仔鼠共同饲养，并随机分配至假手术组或重复性轻度创伤性脑损伤（r-mTBI）组。
  4. 在上午7:30至晚上11:30之间进行所有操作。

2. 清醒状态下闭合性头部损伤操作的建立

  1. 在撞击装置下方放置一块 2.75 英寸 的低密度泡沫垫（100 cm × 15 cm × 7 cm），以允许头部产生旋转运动。
    注：该泡沫垫的弹簧常数约为 2,500 N/m，但可在 3,100 至 5,600 N/m 之间变化58。泡沫垫的硬度等级（低、中、高）尚未显示可预测损伤结果59。泡沫垫为非消耗性材料，通常每年更换一次，或在污染或损坏时更换。
  2. 打开改良的皮层撞击装置（图 1A），并将速度设定为 6 m/s。
    ​注：这些参数旨在诱导幼年和青少年大鼠出现急性神经功能障碍，其特征类似于轻度创伤性脑损伤（mTBI）；但此类参数可能不适用于老年动物或其他物种（如小鼠或雪貂）。有关常见 ACHI 参数的综述，请参见60。

3. 轻度创伤性脑损伤的诱导

  1. 当大鼠达到出生后第24天（PND 24）时，将其转移至将要进行操作的实验操作室。确保该房间与其常规饲养环境相分离。
  2. 将大鼠轻轻放入固定锥形管中，确保其鼻部和鼻孔靠近锥形管前端的小开口，以保证充分通气。使用塑料发夹在锥形管尾端将其夹紧，防止大鼠放入后发生移动。
    1. 使用固定评分（restraint score）记录动物对固定锥形管及ACHI操作的配合程度或耐受性。
      注：固定评分可用于评估动物的应激水平。因此，可依据固定评分制定排除标准，以减少因过度应激反应导致的个体间差异。
      1. 根据动物进入锥形管的意愿、活动情况以及发声行为，给予0至4分的评分。若动物对固定无任何抵抗，则评分为0；若动物转动1–2次，且几乎无发声或扭动，则评分为1；若动物转动2–3次，并伴有一定程度的发声或扭动，则评分为2；若动物转动5–10次，并表现出较多发声和扭动，则评分为3；若动物转动超过10次，且频繁发声和扭动，则评分为4。
        注：该评分标准亦见于评分表本身（补充表S1 和 补充表S2）。
  3. 在大鼠被固定期间，手动将头盔（图1B）置于中线位置，使定位盘覆盖左侧顶叶（图1C、D）。
  4. 将大鼠放置于泡沫垫上，并手动将撞击装置设置为伸出位置。手动降低撞击头，使其接触头盔上的定位盘。随后手动将撞击装置设置为回缩位置，使撞击头退至高于头盔10 mm处。
  5. 使用立体定位臂上的旋钮将撞击头再下降10 mm，使其再次接触头盔上的定位盘。拨动撞击开关，使动物头部以6 m/s的速度在10 mm行程内迅速加速。
  6. 设备激活后，立即从固定锥形管中取出动物，并立即执行神经功能评估方案（NAP）。
    ​注：在本实验中，该方案总共重复八次，每次间隔2小时。

4. 假手术损伤的诱导

  1. 按照第3节中所述的所有实验步骤操作，但将大鼠放置在冲击活塞路径旁边，不施加任何损伤。

5. 神经系统评估方案

注意：NAP 可用于评估意识水平以及认知和感觉运动功能。

  1. 在基线水平以及轻度创伤性脑损伤（mTBI）或假手术损伤诱导后即刻，按照文献56,61所述方法，使用NAP对大鼠进行评估。在桌面上放置大鼠的饲养笼和恢复笼，两笼相距100 cm。将平衡木均匀地置于两笼正上方中央位置，并在平衡木下方放置折叠毛巾或其他缓冲材料。
  2. 如需评估，检查意识水平。若动物在mTBI后无反应，应使用秒表记录其恢复呼吸所需时间以及从仰卧位翻转至俯卧位所需时间，以评估呼吸暂停（呼吸停止）和翻正反射延迟。
    注：在ACHI模型中，翻正反射丧失和呼吸暂停较为罕见，但在幼年动物中偶尔可见。
  3. 使用以下测试序列评估大鼠的认知与感觉运动功能。在完成意识水平评估后，迅速连续进行这些测试。
    注：若未观察到行为缺陷，这四项测试的总分最高为12分。行为缺陷将导致分数降低。
    1. 惊吓反应
      1. 将大鼠放入空的恢复笼中，在笼子上方约50 cm处用力拍手。根据以下评分系统记录动物对声音的反应：
        3分 = 对声音产生快速惊吓反应（例如耳部运动/抽动、跳跃、全身僵直）。
        2分 = 反应迟缓或仅有轻微僵直反应。
        1分 = 仅观察到耳部运动。
        0分 = 对声音无任何反应。
    2. 肢体伸展
      1. 将横梁（长100 cm × 宽2 cm × 厚0.75 cm）水平架设在大鼠的饲养笼与恢复笼之间，抓住大鼠尾根部将其提起并靠近横梁，确保大鼠能够轻松抓握横梁。根据以下评分系统评估大鼠双侧前肢向横梁伸展的能力：
        3分 = 双侧前肢完全伸展并抓住横梁。
        2分 = 仅一侧肢体伸展。
        1分 = 前肢间歇性伸展或回缩。
        0分 = 前肢松弛，无伸展动作。
    3. 横梁行走
      1. 将动物面朝其饲养笼，放置于横梁中央50 cm标记处。确保横梁与大鼠饲养笼和恢复笼之间的距离相等（两笼间距约80 cm）。允许大鼠沿横梁行走。根据以下评分系统评估大鼠平衡与行走能力：
        3分 = 在10秒内成功走完横梁，脚滑次数少于两次。
        2分 = 成功走完横梁，但脚滑次数超过两次。
        1分 = 无自主移动，仅见“游泳”样动作。
        0分 = 无法沿横梁行走，或在10秒内无法移动。
    4. 旋转横梁
      1. 将大鼠重新置于横梁中央，确保其保持平衡。将横梁抬高至离下方毛巾或软垫表面80 cm处，手动以每秒一圈的速度旋转横梁，持续4秒（共旋转四圈）。根据以下评分系统评估大鼠在旋转过程中停留在横梁上的能力：
        3分 = 大鼠在全部四次旋转中均停留在横梁上。
        2分 = 大鼠在第四次旋转时掉落。
        1分 = 大鼠在第二次或第三次旋转时掉落。
        0分 = 大鼠在第一次旋转时即掉落。
  4. NAP评估完成后，将mTBI组和假手术组大鼠放回其饲养笼。如需进行重复性轻度创伤性脑损伤（r-mTBI）操作，可重复上述步骤。损伤后应使用笼边监测清单（补充文件1）监测动物健康状况。若在笼边监测中发现任何异常（任何非“N”评分），应立即使用头部撞击后疼痛评分与高级监测清单（补充文件2）进行完整的疼痛评估。

6. 切片制备

注意：在本研究中，动物在轻度创伤性脑损伤（mTBI）后1天或7天接受重复性轻度创伤性脑损伤（r-mTBI）处理，随后评估突触可塑性。在相应时间点，动物被单独置于带盖笼中转移至实验室，然后实施安乐死。

  1. 将所有用于制备海马脑片的手术器械（标准剪刀、解剖剪、镊子、咬骨钳、刮匙和冷却块）置于冰箱中（-20 °C）过夜冷藏（图2A）。
    注意：组织胶水和孵育 chamber 不应冷藏。
  2. 配制人工脑脊液（aCSF），其中包含 125 mM NaCl、2.5 mM KCl、1.25 mM NaHPO4、25 mM NaHCO3、2 mM CaCl2、1.3 mM MgCl2 和 10 mM 葡萄糖（300 ± 10 mOsm；pH 7.2–7.4）。
    注意：aCSF 主溶液在整个实验过程中必须持续通入碳合气（95% O2/5% CO2）。
  3. 在处死动物前（步骤6.8），准备 12.5 mL 琼脂糖溶液。将 0.25 g 琼脂糖加入 12.5 mL 磷酸盐缓冲液（1× PBS）中，放入 50 mL 锥形管内，每次微波加热 10 秒，直至完全溶解。
  4. 将琼脂糖保持在 42 °C 的温热状态，并置于加热板上轻轻振荡，防止其凝固。
  5. 在冰上设置切片工作站，包括一个培养皿和一个盛有冰冻 aCSF（4 °C）的小烧杯（50 mL），以及一个倒置的培养皿，其顶部放置一张湿润的滤纸（图2A）。持续向小烧杯中的 aCSF 通入碳合气。
  6. 将水浴锅预热至 32 °C。向恢复 chamber 中加入 aCSF，并持续通入碳合气（图2B）。
  7. 将动物转移至实验操作房间。
  8. 使用 5% 异氟烷作为吸入性麻醉剂对动物进行麻醉（直至消失缩足反射），随后使用小型断头器迅速断头。
  9. 在盛有冰冻 aCSF（4 °C）的培养皿中从颅骨中取出脑组织，操作时将颅骨浸没于 aCSF 中，以帮助组织快速冷却。
    注意：此操作通常在 5 分钟内完成，只要脑组织始终浸没于冷藏 aCSF 中，取出速度并非关键因素。
  10. 将脑组织放入盛有冷藏且通入碳合气的 aCSF 的小烧杯中，进一步清洗并冷却样本。
  11. 将脑组织转移至倒置的培养皿中，置于滤纸上。使用锋利的手术刀切除小脑和前额叶皮层，以"修块"脑组织。沿脑中线做切口，分离两个半球。
    注意：以下操作每次仅处理一个半球。未处理的半球必须始终保持浸没在盛有冰冻（4 °C）且通入碳合气的 aCSF 的烧杯中。
  12. 为制备横切面海马脑片，将脑半球置于内侧面。将手术刀刀片向内倾斜约 30°，从脑背侧表面切去一层薄片，以提供一个平整的表面，便于将脑组织固定在切片机活塞上。将脑组织翻转至背侧朝下，用干燥滤纸轻轻吸去多余 aCSF。使用氰基丙烯酸酯胶水将脑组织背侧粘附于活塞上，使腹侧朝上。
    注意：确保胶水不溢出活塞边缘，否则会导致其与用于容纳琼脂糖的金属管粘连，从而阻碍活塞运动。
  13. 将活塞的外管套在脑组织上方，并将液态琼脂糖倒入管中，直至完全覆盖脑组织。使用冷却块夹紧活塞管，使琼脂糖迅速凝固（图2A）。
  14. 将活塞插入切片机腔室中，并用螺丝固定腔室。固定刀片，并向切片机腔室中加入冰冻且充氧的 aCSF。
  15. 在切片机上（图2B），将切片速度设为4，振荡频率设为6，并将连续/单次切片开关切换至连续模式。按下启动按钮，开始以400 µm厚度进行切片。
  16. 当切片机进行切片时，使用大口径巴斯德移液管将每一片切下的脑片立即转移至含充氧 aCSF 的恢复浴中（图2C）。
    注意：每切下一片脑片后，可依次放入恢复浴的不同孔中。本方案通常每个半球可获得 6 至 8 片包含海马结构的脑片。可参考大鼠脑图谱62 来确定各脑片在大鼠脑中的背腹向位置。
  17. 让脑片在 32 °C 下恢复 30 分钟，随后在室温（23 °C）下继续恢复 30 分钟。
  18. 重复上述步骤，制备第二个半球的脑片。

7. 野外电生理学

注意：为获取齿状回（DG）的细胞外场电位记录，请执行以下步骤。在经过60分钟恢复后，单个海马脑片即可用于细胞外场电位记录。

  1. 使用市售的微电极拉制仪，从长度为10 cm、外径为1.5 mm、内径为1.1 mm的硼硅酸盐玻璃毛细管中拉制记录电极（1–2 MΩ）。
    注意：记录电极的电阻应约为1 MΩ，尖端尺寸约为1 mm。电极参数的一致性对于获得良好的记录至关重要。
  2. 开启用于记录的计算机及相关设备：放大器、数据采集器、刺激器、显微操作器、温度控制器、显微镜光源和真空泵。
  3. 将aCSF倒入烧杯中，并连接至重力控制的灌流系统。打开灌流系统上的aCSF阀门，使aCSF开始流入灌流室。维持流速约为每秒一至两滴或2 mL/min。在整个电生理记录过程中持续用碳合气（carbogen）饱和aCSF。
    注意：在场电位记录期间，必须保持碳合气饱和aCSF的恒定滴速。同时，参比电极必须完全浸没在aCSF中。
  4. 使用巴斯德移液管将海马脑片从恢复浴槽转移至持续灌流碳合气饱和aCSF的灌流室中，并将温度维持在30 ± 0.5 °C。调整脑片方向，使齿状回和颗粒细胞层位于视野中可见的位置。使用弯曲的金属丝网固定脑片。启动数据采集软件。
    注意：在此步骤中可暂时关闭真空泵，以便自由操作组织。此操作应迅速完成，因为过度操作可能损伤组织。此外，若操作耗时过长，灌流室可能因aCSF过多而溢出。待脑片正确放置并固定后，重新开启真空泵。
  5. 使用直立显微镜结合斜向光学系统观察齿状回（DG）。将同心双极刺激电极置于分子层中三分之一处，以激活内侧穿通路径（MPP）纤维。随后，将充满aCSF的玻璃微电极置于MPP中（图3A、B）。初始时应使两电极相距较远（例如，刺激电极靠近CA3区，记录电极位于DG膝部上方），以避免接触组织造成纤维损伤。
    注意：理想情况下，所有记录中两电极应与细胞层保持等距，且相距约200 μm。
  6. 在刺激电极和记录电极定位完成后，使用放大器、数据采集器和记录软件观察诱发电场反应。
  7. 为获得合适的场兴奋性突触后电位（fEPSP），当操作者熟练时，以0.2 Hz（每5秒一次）的频率施加0.12 ms的电流脉冲进行刺激；对于不熟练的操作者，建议使用0.067 Hz（每15秒一次）以避免过度刺激。确保fEPSP的幅度至少为0.7 mV，且具有清晰的纤维群峰（fiber volley），其幅度小于fEPSP。
    注意：为获得最大的场反应，必须将两个电极与细胞层保持等距，并保持足够距离（约200 μm），以产生较小的纤维群峰。微调电极位置可能有助于增强反应幅度，但应尽量减少调整以避免组织损伤。
  8. 通过逐步增加刺激强度确定fEPSP的最大幅度，然后将刺激强度设定为使fEPSP达到最大幅度的70%。
    注意：在长时程抑制（LTD）研究中，最大幅度设定为70%；在长时程增强（LTP）研究中，则设定为50%。最大幅度通过调节刺激强度直至fEPSP幅度不再增加来确定。例如，若fEPSP的最大幅度为2 mV，则LTD实验中应将其调整为1.4 mV，LTP实验中为1.0 mV，以便后续观察fEPSP的抑制或增强效应。
  9. 以0.067 Hz的频率施加0.12 ms脉冲，建立持续20分钟的稳定预处理基线。若脑片被视为稳定，需满足以下条件：fEPSP初始斜率的变异度 <10%，且通过绘制的fEPSP斜率点拟合的最佳直线斜率 <0.5。当确认EPSP在20分钟内保持稳定后，继续进行后续记录步骤。
    注意：可在aCSF中添加多种受体拮抗剂以阻断或增强LTD和LTP。如需使用，应确保脑片在此基线期暴露于这些药理学试剂，并满足稳定记录的要求。示例参见63、64、65。
  10. 首先，通过双脉冲刺激和构建刺激-反应输入-输出曲线来评估基础突触特性的变化。进行双脉冲测试时，以0.033 Hz的频率施加一系列间隔为50 ms的成对脉冲。对于输入-输出曲线，以0.033 Hz的频率施加10个递增的刺激强度（0.0–0.24 ms），绘制fEPSP反应幅度的变化。
  11. 为研究主要依赖CB1受体激活的长时程抑制（LTD）64、66，采用10 Hz的刺激方案（共6,000个脉冲，持续10 Hz刺激10分钟）。该方案持续10分钟。
  12. 在后处理记录阶段，恢复单脉冲刺激（0.12 ms，频率0.067 Hz），持续额外60分钟。
  13. 后处理记录结束后，再次施加双脉冲刺激，随后进行输入-输出曲线测定。将这些结果与基线记录进行比较，以观察突触前释放特性的改变，并有助于评估脑片在长期记录中的健康状态。
  14. 数据分析时应谨慎，并严格遵循排除标准，判断单个脑片的数据是否应保留在突触可塑性数据集中。排除标准包括：预处理基线期间fEPSP斜率拟合直线斜率过大（斜率 >0.5）、预处理基线不稳定（变化 >10%），或后处理期不稳定（后处理50–60分钟期间斜率 >1.5）的脑片。

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结果

清醒状态下的闭合性头部损伤模型是一种在幼年大鼠中诱导重复性轻度创伤性脑损伤（r-mTBI）的有效方法。采用ACHI模型暴露于r-mTBI的大鼠未表现出明显的行为缺陷。在r-mTBI操作过程中的任何时间点，实验动物均未出现翻正反射延迟或呼吸暂停，表明该操作确实属于轻度TBI。然而，在神经行为评估（NAP）中出现了细微的行为差异；如上所述，大鼠在四项感觉运动任务（惊吓反应、肢体伸展、横杆行走和旋转横杆）中按0至3分进行评分，3分表示在该任务中无任何功能障碍。因此，NAP评分越低，表明动物功能受损越严重。在基线水平时，假手术组与r-mTBI组大鼠的NAP评分无差异。在完成所有ACHI操作后，与假手术组相比，r-mTBI组大鼠在NAP任务中表现出显著的功能障碍（图4）。然而，正如先前报道的在多日（即2天或4天）内施加冲击的结果所示，在同一天内连续增加损伤次数并未加重或产生额外的行为缺陷。因此，r-mTBI的ACHI模型在急性损伤后的时间点可引起虽细微但具有显著性的行为功能障碍。

在实施损伤方案后，于损伤后第1天（PID1）和第7天...

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讨论

大多数临床前研究采用的轻度创伤性脑损伤（mTBI）模型未能重现临床患者中所见的生物力学力。本文展示了如何利用ACHI模型在幼年大鼠中诱导重复性轻度创伤性脑损伤（r-mTBI）。这种闭合性头部r-mTBI模型相较于更具侵入性的操作方法具有显著优势。首先，ACHI通常不会导致颅骨骨折、脑出血或死亡，而这些均是模拟临床r-mTBI情况时的禁忌表现 "温和的" 临床人群中的创伤性脑损伤61其次，ACHI 不需要使用开颅手术，这一点意义重大，因为已知开颅手术会引发炎症反应，从而加重症状和神经病理变化。67第三，ACHI 不需要使用麻醉。这一点同样重要，因为麻醉不仅可能具有神经保护作用，还可能损害突触可塑性以及学习和记忆功能。48,49,50,51,

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披露

作者声明无利益冲突。

致谢

感谢维多利亚大学Christie实验室所有过去和现在的成员为本实验方案的开发所做出的贡献。本项目得到了加拿大卫生研究院（CIHR：FRN 175042）和自然科学与工程研究理事会（NSERC：RGPIN-06104-2019）的资金支持。图1中的头骨图示使用BioRender制作。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
3D打印头盔 由Christie实验室设计并制作（详见Christie等（2019），《Current Protocols in Neuroscience》中的规格说明） 
琼脂糖 费希尔科技（BioReagents）BP160500
麻醉室自制N/A聚甲基丙烯酸甲酯容器
自动加热控制器Warner ElectricTC-324B
Axon Digidata分子器件公司1440A低噪声数据采集系统
平衡梁 可自制或购买（长100 cm × 宽2 cm × 厚0.75 cm）
氯化钙Bio Basic Canada Inc. CD0050用于aCSF
相机Dage MTINC-70
碳合气气罐PraxairMM OXCD5C-K二氧化碳5%，氧气95%
Clampex软件分子器件公司Clampex 10.5版本
Compresstome振动切片机PrecisionaryVF 310-0Z
同心双极电极FHC公司CBAPC75
右旋糖（D-葡萄糖）费希尔科技（化学）D16-3aCSF
数字刺激隔离放大器  Getting Instruments, Inc. Model 4D
磷酸氢二钠费希尔科技（化学）S373-500PBS
解剖工具
Feather双刃刀片电子显微科学公司72002-10
滤纸Whatman 11001-055
Flaming/Brown微电极拉制仪Sutter InstrumentP-1000
毛发夹扣可从任何百货商店获得
饲养与恢复笼来自动物护理单元的常规大鼠笼
Hum Bug噪声消除器Quest Scientific 726300
异氟烷USPFresenius KabiCP0406V2
Isotemp 215数字水浴锅费希尔科技 15-462-15
Leica Impact One CCI装置Leica Biosystems探头经改装以适配7 mm橡胶撞击头
雄性Long-Evans大鼠查尔斯河实验室（St. Constant, PQ）
低密度泡沫垫3"聚氨酯泡沫板 
氯化镁费希尔科技（化学）M33-500aCSF
雄性Long Evans大鼠查尔斯河实验室动物购自查尔斯河实验室，或在维多利亚大学自行繁殖
MultiClamp 700B放大器分子器件公司Model 700B
pH试纸VWR Chemicals BDHBDH83931.601
氯化钾费希尔科技（化学）P217-500aCSF, PBS
磷酸钾SigmaP9791-500GPBS
按钮控制器Siskiyou Corporation MC1000e四轴闭环控制器按钮
样品盘ELITechGroupSS-033用于蒸汽压渗透压计
小毛巾
碳酸氢钠费希尔科技（化学）S233-500aCSF
氯化钠费希尔科技（化学）S271-3用于aCSF, PBS
磷酸钠费希尔科技（化学）S369-500aCSF
软质塑料束缚锥Braintree Scientific型号 DC-200
秒表许多实验室成员使用iPhone完成此功能
带高边沿的桌子或大型推车 用于NAP和ACHI
薄壁硼硅酸盐玻璃管（带丝）Sutter InstrumentBF150-110-10外径：1.5 mm；内径：1.10 mm；长度：10 cm
直立式显微镜奥林巴斯Olympus BX5OWI5x MPlan 0.10 NA物镜
蒸汽压渗透压计VaproModel 5600aCSF渗透压应为300–310 mOSM
Vetbond组织粘合剂3M1469SB
Vibraplane减震隔离台Kinetic Systems9101-01-45

参考文献

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