需要JoVE订阅才能观看此内容。 请登录或开始免费试用

方法文章

实时空斑检测法

3K 次观看

⸱

DOI：

10.3791/64621

⸱

2023年2月10日

 ,  ,  ,  , 
1Renal-Electrolyte Division, Department of Medicine, University of Pittsburgh, 2Department of Cell Biology, University of Pittsburgh

本文内容

摘要

本文介绍了一种通过在传统排尿斑点实验中结合视频监测来研究小鼠排尿行为的新方法。该方法可提供排尿事件的时间、空间和体积信息，并详细记录小鼠在昼夜明暗周期中的行为特征。

摘要

正常的排尿行为是膀胱、尿道以及尿道括约肌在神经系统适当调控下协同作用的结果。为了在小鼠模型中研究自主排尿行为，研究人员开发了排尿斑点检测法（void spot assay, VSA），该方法通过测量小鼠笼底滤纸上的尿液斑点数量和面积来评估排尿情况。尽管该方法在技术上简单且成本低廉，但作为终点检测手段使用时存在局限性，例如无法精确分辨排尿事件的时间顺序，以及难以量化重叠的尿液斑点。为克服这些局限，我们开发了一种视频监测的VSA，称为实时VSA（real-time VSA, RT-VSA），该方法可测定排尿频率、评估排尿量和排尿模式，并可在白天的明期和暗期各连续6小时的时间窗内进行测量。本报告所述方法可广泛应用于多种基于小鼠的研究，用于探索健康与疾病状态下自主排尿的生理学及神经行为学特征。

引言

尿液的储存与排泄由中枢神经系统中的中枢回路协调控制，该回路通过盆腔神经和内脏大神经接收关于膀胱充盈状态的信息。尿路上皮是自肾盂至近端尿道的泌尿道内衬上皮，可形成一道紧密屏障，阻止尿液中的代谢废物和病原体侵入。它还是感觉网络的重要组成部分，能够感知膀胱的充盈状态，并将该信息传递至下方组织和传入神经1,2。尿路上皮屏障的破坏，或尿路上皮机械转导通路的改变，可能导致排尿功能障碍，并伴随尿频、尿急、夜尿增多和尿失禁等下尿路症状3,4,5,6,7。同样，衰老、糖尿病、下尿路感染、间质性膀胱炎以及其他影响膀胱或调控其功能的相关神经回路的疾病过程，均已被证实可导致膀胱功能障碍8,9,10,11,12,13,14,15,16,17,18,19。要更深入理解正常与异常的排尿行为，关键在于建立能够可靠区分不同排尿模式的方法。 

传统上，小鼠的自主排尿行为研究主要采用 Desjardins 及其同事开发的排尿斑点检测法（void spot assay, VSA）20，该方法因其操作简便、成本低廉且无创而被广泛采用8,21,22,23,24。该检测通常作为终点实验进行：将小鼠置于铺有滤纸的笼中一段时间，随后在紫外光（UV）照射下观察滤纸，通过计数尿液斑点的数量并评估其大小来分析排尿情况（在此条件下尿液斑点会发出荧光）20。尽管具有诸多优势，传统的 VSA 仍存在一些主要局限性。由于小鼠常在相同区域排尿，研究人员必须将实验时间限制在相对较短的范围内（≤4 h）25。即使在较短时间进行 VSA，仍几乎无法分辨落在大斑点之上的小排尿斑点（SVSs），也难以将 SVSs 与尾巴或脚掌附着的尿液残留区分开来。此外，很难判断 SVSs 是频繁但独立的排尿事件所致（这种表型常在膀胱炎反应中观察到4,26），还是排尿后滴沥所致（该表型与膀胱出口梗阻相关27）。同时，出于在工作时间内完成实验的需求，以及在光照关闭后难以进入动物饲养设施的限制，这类实验通常被局限于24小时昼夜节律的光照期。因此，这些时间限制阻碍了对小鼠在其活跃的夜间阶段排尿行为的评估，降低了分析受昼夜节律调控的特定基因或治疗效果的能力。 

为了克服其中一些局限性，研究人员已开发出一些替代方法，用于实时评估排尿行为26,28,29,30,31,32。其中一些方法需要使用昂贵的设备，例如代谢笼26,28,29，或使用热成像相机30；然而，这些方法也存在局限性。例如，在代谢笼中，尿液容易附着在网状地板的金属丝以及漏斗壁上，导致被收集和测量的尿量减少，因此难以准确获取微小排尿事件的数据。此外，代谢笼无法提供排尿事件空间分布的信息（即排尿发生在笼子角落还是中心区域）。由于热成像相机所使用的长波红外辐射无法穿透固体，因此通过视频热成像评估排尿活动必须在开放系统中进行，而这对活动性强的小鼠而言具有挑战性，因为它们能够跳跃数英寸的高度。另一种系统是自动化滤纸排尿染色法（aVSOP）33，该方法采用卷状滤纸，置于小鼠笼具的金属网地板下方，并以恒定速度卷动。该方法可避免传统VSA中出现的滤纸损坏和尿斑重叠问题，且允许研究者开展持续数天的实验。然而，该方法无法提供排尿事件的精确时间信息，也无法观察行为与尿斑出现之间的关联。为了获取这些信息，研究人员已将视频监测技术整合到排尿检测中，该方法可同时评估小鼠活动与排尿事件31,32。其中一种方法是在实验笼具下方放置蓝色发光二极管（LED）以及配备绿色荧光蛋白滤光片的摄像机，以可视化排尿事件，同时在笼具上方设置红外LED和摄像机以记录小鼠位置32。该装置已被用于在进行光纤光度法实验时监测排尿行为；然而，该系统明亮的光照环境要求研究人员给予小鼠利尿剂以刺激排尿。在另一项实验设计中，广角摄像机分别置于实验笼具的上方和下方，用于可视化小鼠运动活动和排尿事件。在此情况下，通过将置于笼具下方的紫外灯照射笼底衬垫的滤纸，使沉积其上的尿斑显现31。该装置被用于持续4分钟的短时检测，在白天光照阶段进行，以研究参与自主排尿行为的脑干神经元31。该系统是否适用于黑暗阶段或持续时间>4分钟的情况尚未见报道。 

本文介绍了一种改进的传统排尿行为分析方法（VSA），通过实现对小鼠排尿行为的长期视频监测，可在白天的光照期和黑暗期内长时间获取排尿事件的时间、空间及体积信息，并同时记录与小鼠行为相关的细节3,4,34。文中详细提供了排尿室的构建方法、实时排尿行为分析系统（RT-VSA）的实施步骤以及数据分析流程。RT-VSA 对于希望深入了解控制泌尿系统功能的生理机制、开发调控排尿的药理学方法，以及阐明影响下尿路疾病过程的分子基础的研究人员具有重要价值。 

访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。

方案

尿路上皮 Piezo1/2 双基因敲除小鼠（Pz1/2-KO，基因型：Piezo1fl/fl;Piezo2fl/fl;Upk2CRE+/-）和对照小鼠（Pz1/2-C，基因型：Piezo1fl/fl; Piezo2fl/fl; Upk2CRE-/-）由本实验室利用杰克逊实验室提供的亲本品系培育而成（Piezo1fl/fl 品系编号 029213；Piezo2fl/fl 品系编号 027720；Upk2CRE+/- 品系编号 029281）。实验中使用了雌性（1.5–3 月龄，体重 17–20 g）和雄性（2–4 月龄，体重 23–29 g）小鼠。环磷酰胺诱导膀胱炎实验则采用野生型 C57Bl/6J 雌性小鼠（3 月龄，体重约 20 g）（杰克逊实验室，品系编号 000664）。动物饲养及实验均在匹兹堡大学动物护理设施中进行，并经匹兹堡大学机构动物护理和使用委员会批准。所有动物实验均严格遵循《公共卫生服务政策关于实验动物的人道护理和使用》及《动物福利法》的相关指南和规定。

1. 实时排尿斑点检测（RT-VSA）笼具的组装

  1. RT-VSA装置由一个UV支架组成，该支架固定两个UV灯泡和两个广角摄像头（底部摄像头），用于记录白天光照阶段的排尿活动。将两个小鼠饲养舱放置在支架上。在每个小鼠饲养舱的盖子上安装广角摄像头（顶部摄像头），用于记录夜间黑暗阶段的排尿活动（图1A）。
  2. 使用1英寸×1英寸的T型槽铝型材构建UV支架和小鼠饲养舱的框架。有关用于构建两个小鼠饲养舱和UV支架的组件列表，请参见表1；有关组装后组件的不同视图和尺寸，请参见图1B–D。
  3. 每个小鼠饲养舱由八根切成10英寸的T型槽铝型材和四根切成14.75英寸的型材构成。首先组装小鼠饲养舱的底部，并使用标准端部紧固件（表1）按照图1所示方式组装T型槽型材。将38.5 cm × 26.5 cm的透紫外丙烯酸板安装在型材的内槽中，作为小鼠饲养舱的底板。
    注：有关使用标准端部紧固件组装T型槽型材的详细说明，请访问公司官网页面。
  4. 使用其余型材构建小鼠饲养舱的侧壁。将38.5 cm × 21.5 cm和26.5 cm × 21.5 cm的耐磨（AR）聚碳酸酯板安装在型材中，组成小鼠饲养舱的外壁。使用37.5 cm × 23.9 cm和24.4 cm × 23.9 cm的耐磨（AR）聚碳酸酯板构建小鼠饲养舱的内部结构。
  5. 使用标准端部紧固件1/4-20螺纹固定耐磨（AR）聚碳酸酯板。有关如何在型材中安装面板的说明，请参见步骤1.3注释中的网页说明。使用商用硅胶密封剂密封内部面板之间的接缝。
  6. 按照图1B所示，使用两根12英寸和两根14.75英寸的T型槽铝型材组装饲养舱的顶盖。将一块38.5 cm × 26.5 cm的耐磨（AR）聚碳酸酯板安装在型材的内槽中，完成顶盖的组装。
  7. 将12英寸的摄像头支架垂直安装在笼盖的长边方向上，并用两个轻型过渡内角支架（在图1B中标记为3）固定。使用一块平直金属板（标记为2）作为网络摄像头的安装支架，并按图1B所示方式安装。使用摄像头安装螺钉将摄像头固定在支架上。
  8. 使用10系列标准快拆铰链右向组件将顶盖连接至小鼠饲养舱主体（在图1B中标记为1）。
  9. 根据图1C,D所示，使用四根切成40英寸、四根切成32英寸和四根切成10英寸的T型槽铝型材构建UV支架。将一块82.5 cm × 26.5 cm的丙烯酸镜面板安装在型材中，构成UV舱的底部。
  10. 使用82.5 cm × 30.5 cm和26.5 cm × 30.5 cm的丙烯酸镜面板构建UV支架的侧壁。
  11. 使用10系列五孔T型平板（在图1C中标记为2）、10系列五孔L型平板（在图1C中标记为3）以及10系列五孔T型接头平板（在图1C中标记为1）固定UV支架。
  12. 将底部摄像头安装在一根切成32英寸的T型槽型材中，并使用两个轻型过渡角支架如图1D所示将其固定在支架底部。使用平直金属板将网络摄像头连接到T型槽型材上。
  13. 将UV灯安装在支架内部、前部和后部的型材上，并如图1D所示连接至平直金属板。
  14. 将四个网络摄像头连接至运行视频监控软件的计算机的USB端口。

2. 实验前动物饲养

  1. 将实验小鼠（无论是专门培育的还是从外部机构获得的）以每组四只的方式饲养。在可能的情况下，使用年龄相匹配的同性别雌性或雄性小鼠进行这些实验。若小鼠来自外部机构，在开展任何实验操作前，应让其至少适应新环境7天。
  2. 在动物设施中饲养期间，将小鼠置于标准笼具中，笼内应包含垫料和环境丰富化物品（例如塑料小屋、转轮、用于撕咬的纸片），并维持12小时光照/12小时黑暗的循环周期，自由饮水并自由摄取干燥小鼠饲料 ad libitum。

3. 一天中光照期和黑暗期的 RT-VSA 记录

注意：以下方案描述了使用 RT-VSA 评估小鼠在昼夜明暗周期中排尿行为的方法。动物维持在 12 小时光照与 12 小时黑暗的循环条件下，以北京时间（ZT）07:00 为 ZT = 0。光照期实验的记录开始于上午 10:30 至 11:00 之间（ZT = 3.5–4.0），黑暗期实验则开始于下午 18:00 至 18:30 之间（ZT = 11.0–11.5）。当动物需在两种条件下进行测试时，通常在两个独立的日子分别进行实验，且光照期与黑暗期测试之间至少间隔连续 5 天。实验不应在动物房清洁或更换笼具的日子进行，因为这些操作可能引起应激反应，从而影响排尿行为。所有操作步骤均应在尽量减少小鼠应激的条件下进行。

  1. 将实验动物从饲养地点转移至装有 RT-VSA 记录腔的实验操作房间。
  2. RT-VSA 记录腔的准备
    1. 在每个 RT-VSA 记录笼底部放置一张滤纸（24.3 cm × 36.3 cm）。根据一天中的时间，使用薄滤纸（用于光照期实验）或厚滤纸（用于黑暗期实验）。
      注意：在活跃的黑暗期使用厚滤纸，因其比薄滤纸更耐撕裂。顶部摄像头用于在黑暗期可视化沉积在厚滤纸上的尿液斑点。相比之下，在光照期使用底部摄像头，因为环境光会干扰顶部摄像头对滤纸上尿液斑点的检测。此时使用薄滤纸。我们发现底部摄像头难以有效检测沉积在厚滤纸上的微小排尿事件。
    2. 在滤纸上放置以下物品：一个塑料小屋（提供睡眠空间）、一个无菌的 1.5 mL 微型离心管（用于环境丰富化）、以及一个 60 mm × 15 mm 的塑料培养皿，内含两到三块小鼠干饲料和 14–16 g 以凝胶包形式提供的非湿润性水凝胶（ 图 2）。
      注意：使用 1.5 mL 微型离心管进行环境丰富化是本研究所用围栏 特有的设置。
    3. 记录腔准备就绪后，轻柔地将实验小鼠放入腔内，将其轻轻放置在滤纸上。确保动物从饲养笼转移到记录笼的过程中应尽量减少应激。
    4. 当所有实验动物均进入记录笼并盖上盖子后，用吸水性蓝色实验台垫覆盖在盖子顶部，以减少环境光在亚克力盖表面的直接反射。
    5. 打开下部腔体的紫外灯 。
      注意： 动物不会直接接触紫外光。推荐使用的紫外灯 详见材料部分。
  3. RT-VSA 记录
    1. 使用视频监控记录软件，从顶部和底部摄像头同步录制视频，该软件可配置为同时从多个网络摄像头或 USB 摄像头进行录制。
    2. 打开程序后，在程序窗口中按下 Command 和 R 键开始录制。以每秒 1 帧的速率进行视频录制。
    3. 开始录制后，立即轻柔地关闭房门并离开房间。确保在整个实验期间房间保持安静。
  4. 结束 RT-VSA 记录
    1. 在 7 小时后（光照期实验）或次日早晨（黑暗期实验）返回操作室。
    2. 按下 Command 和 T 键停止录制，关闭紫外灯。
    3. 停止录制后，软件会自动为每个摄像头生成一个电影文件（.m4v 格式），并将其保存在预先指定的目标文件夹中，文件夹名称与摄像头名称一致。请确认每个摄像头文件夹内的实验数据按日期分文件夹存储。
    4. 在每个日期/实验文件夹中，确认存在一个 .m4v 文件以及所有与视频帧对应的独立 .jpeg 文件。
    5. 注意：若电影文件损坏，可使用 .jpeg 文件恢复实验数据。
    6. 在桌面上创建一个以实验名称和日期命名的文件夹，并将所有 .m4v 文件复制到该文件夹中。在电影文件已保存并备份后，可根据需要删除 .jpeg 文件。
    7. 注意：对于光照期实验，软件将为每个摄像头生成一个电影文件；而对于黑暗期实验，每个摄像头将生成两个电影文件。这是因为当日期跨过午夜时，系统会生成一个新的 .m4v 文件。
    8. 将包含电影文件的文件夹复制到 U 盘，以便在外部计算机上进行分析。此步骤可能需要数分钟，可与步骤 3.5.1 至 3.5.3 并行进行。
  5. 记录笼的清洁及实验动物返回饲养地点
    1. 移除覆盖在笼盖上的蓝色垫子，将动物从记录笼转移回饲养笼中。
    2. 移除记录腔内的所有附件和食物残留物（即塑料小屋、塑料管、含饲料残渣和水凝胶的培养皿以及滤纸），并将其丢弃至生物危害废物容器中。
    3. 使用手持吸尘器清洁笼子，清除笼底的饲料残渣和粪便颗粒。随后，用 70% 乙醇喷洒笼底和内壁，并用软布擦拭内部。将笼盖打开，使其自然风干。
    4. 将装有动物的饲养笼放入次级容器中，运送回其原始饲养地点。

4. 标准曲线的生成

注意：需要标准曲线才能将空白斑点面积转换为尿液体积。如果在白天的光照期和黑暗期均进行实验，则应分别针对所使用的两种滤纸（薄滤纸和厚滤纸）各制作一条标准曲线。标准曲线需设两个重复。每个重复使用置于RT-VSA记录室中的滤纸进行测定。由于小鼠尿液成分复杂且具有紫外激发特性，应使用小鼠尿液制备标准曲线。

  1. 小鼠尿液采集
    1. 取一块柔性透明薄膜（10 cm × 15 cm），放置于实验台面上。
    2. 用一只手抓住小鼠的尾巴，另一只手捏住其颈背部皮肤固定小鼠。轻轻按摩其下腹部以诱导排尿。用透明塑料薄膜表面收集尿液。
    3. 将动物轻柔地放回笼中。使用移液器将透明膜表面的尿液转移至无菌的1.5 mL微量离心管中。对多只小鼠重复上述操作，直至收集约10 mL小鼠尿液，合并尿液样本，并于-20 °C保存。
      注意：需要总共约 10 mL 的小鼠尿液，以生成光相和暗相的重复校准曲线。为避免对实验小鼠造成应激，不得使用将用于 RT-VSA 实验的小鼠进行尿液采集。
  2. 标准曲线记录
    1. 解冻步骤4.1中收集的尿液，轻轻涡旋振荡10–15秒使其混匀。
    2. 在两个室温呼吸代谢测量系统（RT-VSA）记录笼中各放置一张薄滤纸（24.3 cm × 36.3 cm）。
    3. 用移液器将以下体积（μL）的尿液分别点在每张滤纸上：2、5、10、25、50、80、100、200、300、400、500 和 750。为防止因扩散导致斑点重叠，各斑点之间应保持足够的距离。
    4. 关闭笼盖并用垫子覆盖。
    5. 开始录制，通过按下 指令 和 R，应用与记录实验时相同的软件参数（步骤 3.3）。
    6. 注册校准曲线1小时，以确保尿液斑点充分扩散。按压 指令 和 T 停止记录。
    7. 在桌面上创建一个新文件夹，将 .m4v 文件放入该文件夹中，然后将数据传输至U盘以供后续分析。
    8. 采用类似步骤，使用厚滤纸生成重复曲线。在此过程中，增加垫片层数以加深内部颜色，模拟暗期条件。
  3. 校准曲线记录的分析
    1. 使用视频播放软件打开 .m4v 文件，并将窗口最大化以充满屏幕。为分析在厚滤纸上进行的校准曲线，应使用顶部相机获取的文件图3A）。为了分析在薄滤纸条上进行的校准曲线，使用底部相机获取的文件（图3B).
    2. 播放 .m4v 文件，前后移动时间滑块，以浏览完整的1小时校准曲线视频。
    3. 确定较小尿斑出现的时间范围（<25 μL）时信号强度最大且扩散达到最广。在此时间范围内截取屏幕图像。为截图文件命名，并将其保存为 .png 文件（图3A，上图面板）。
      注意：截图通过按下 F6 键获取。要设置 F6 用于截图，请选择： 系统偏好设置 > 键盘 > 快捷方式，并在右侧的方框中填写 F6 将屏幕截图保存为文件 选项
    4. 确定中等和大尿斑出现的时间范围（>50 μL）达到最大扩散面积时截取屏幕图像。当较大尿斑达到最大扩散时，部分较小的尿斑可能已不可见。为文件命名并将其保存为.png格式文件图3A，下图）
    5. 打开 ImageJ 软件（NIH），然后将 4.3.3 步骤中获得的 .png 文件图标拖放到软件界面以打开图像文件（图4A).
    6. 从工具栏中选择 多边形选择 图标，并标出滤纸的边界。
    7. 然后，选择 分析 从菜单栏中选择 设置测量参数 从展开的菜单中，以及弹出的窗口中进行选择 面积. 点击 好的这使得在执行步骤 4.3.8 时能够获得面积值。
    8. 接下来，选择 分析 再次从菜单栏中选择 测量 从展开的选项中，会弹出一个结果窗口，其中包含一列面积数据，以像素为单位显示面积值2 (图4B–D).
    9. 选择 自由选择 从工具栏中选择图标，并用其在单个空斑周围绘制一条线。按照步骤 4.3.8 测量面积。软件会在进行新测量时自动更新结果表格，新数据集将显示在先前数据的下方。记录每次分析的空斑在结果窗口“面积”列下方对应的数值图4E–G).
    10. 对每个重复点重复执行步骤 4.3.5 至 4.3.7。
    11. 将滤纸的总面积设为100%，并计算每个尿斑所占的面积百分比（%面积）。该归一化处理可校正因相机变焦或位置差异所导致的误差。
    12. 在绘图程序中创建一个新的XY表格，将尿液体积（单位：μL）的数值填入X列，将%面积的重复测量值填入Y列。
    13. 然后，选择 分析 > 分析 > XY分析 > 非线性回归（曲线拟合）在出现的参数窗口中，选择 模型 > 多项式 > 二阶 多项式（二次）.
    14. 然后，从方法选项卡中，点击并标记以下选择： 最小二乘回归, 无权重，以及 将每个重复的 Y 值视为独立的数据点。
    15. 从约束选项卡中选择 B0，约束类型 > 等于常数，以及在下方输入0 价值 柱。点击 好的.

5. 实验小鼠记录数据的分析

  1. 打开在光照期（底部摄像头）或黑暗期（顶部摄像头）采集的视频文件以进行分析。
  2. 通过前后移动时间滑块评估视频文件的质量，确认在将要分析的6小时时间窗口内滤纸保持完整（无撕裂或啃咬）。如果滤纸已破损，则不再进行进一步分析，因为小鼠可能已将尿液排到无法定量的暴露塑料表面（图5）。
  3. 为分析在光照期或黑暗期采集的实验数据，使用快进命令或时间条滑块移动至目标时间窗口。光照期的排尿活动记录时间为上午11:00至下午05:00（ZT = 4.0–10.0），黑暗期的记录时间为午夜至凌晨06:00（ZT = 17.0–23.0）。
  4. 通过点击 >> 图标以快进模式播放视频（或手动逐帧浏览），寻找小鼠排尿的证据。最简便的判断方法是观察滤纸上是否突然出现明亮的尿液斑点。另一个指标是观察行为变化，例如小鼠移动至笼子角落，并在排尿时出现短暂的静止期。
    注意：随着对排尿事件识别能力的提高，可逐步加快滚动或快进速度。然而，在患有细菌性或化学诱导性膀胱炎的小鼠中，由于其排尿次数极多且每次排尿量很小4,34，若视频浏览速度过快，可能会遗漏排尿事件。
  5. 记录每次排尿发生的时间。按照惯例，排尿时间以首次检测到尿液的时刻为准（图6A,B）。
  6. 为测量排尿斑点，首先使用滚动条在时间上向前（或向后）移动，找到尿液斑点扩散达到最大的时间点。在此处暂停视频，并按照步骤4.3.3所述方法截取屏幕图像。将计算机鼠标箭头置于待分析的斑点上，以便在截图中标记出目标斑点（图6C,D）。
  7. 使用与视频中出现顺序相对应的连续编号命名截图文件。
  8. 继续分析该文件，对视频中的每个排尿斑点重复执行步骤5.5和5.7。当所有排尿斑点分析完成后，通过截取一张截图并按照4.3.6中所述步骤测量滤纸的总面积。
  9. 按照步骤4.3.9所述方法计算每个尿斑的面积百分比（%面积）。利用步骤4中生成的校准曲线及作图软件中的插值函数，将%面积值转换为每次排尿的尿液体积（μL）。
    1. 在作图软件中，打开包含校准曲线数据的XY表格，并将%面积值插入Y列中校准曲线最后一个数据点的下方（图7A）。
    2. 点击 结果表格 选项卡，在模型选项卡下选择 从标准曲线插值未知样本，然后点击 确定。此时在结果表格选项卡旁会出现一个名为“插值X均值”的新选项卡，该表格中包含对应于每个排尿斑点尿液体积（μL）的插值结果（图7A,B）。
  10. 重复步骤5.1至5.9，以分析所有实验小鼠的数据。
  11. 创建一个工作簿文件，用于存储从步骤5.5至5.10获得的数据，每只小鼠使用一张独立的工作表（图7C）。分别为光照期实验和黑暗期实验各创建一个文件。这些主文件包含所有原始数据及后续分析所需的计算结果。

6. 实验小鼠排尿模式的分析

  1. 生成初生和次生空斑的轮廓图（图8A，B 和 图9).
    注意：根据频率分布研究23，体积≥20 μL的空斑通常代表 >总排尿量的95%所对应的区域被视为主排尿点（PVSs）8,23,35体积小于或等于20 μL的排尿斑点被视为次要性或小体积排尿斑点（SVSs）。区分主要性排尿斑点（PVSs）与小体积排尿斑点（SVSs）已被证明是表征排尿表型的有效方法。SVSs数量增加提示存在排尿功能障碍。35.
    1. 从包含排尿斑点数据的主文件中（光照期或黑暗期），根据斑点体积进行分类：当体积 ≥20 μL 时归类为 PVSs，体积 <20 μL 时归类为 SVSs。 <20 μL
    2. 统计PVS的数量，并计算其平均排空体积和总体积。统计SVS的数量，并计算其总体积。
    3. 生成柱状图，比较对照组与处理组小鼠在各项计算参数上的差异：PVS 数量、PVS 排出体积、PVS 总体积、SVS 数量、SVS 总体积。
  2. 可选：生成累积排尿量曲线图（阶梯函数），以显示随时间变化的排尿行为（图10 和 图11).
    1. 打开工作簿主文件，将排尿时间（以小时、分钟和秒表示）转换为小数形式。计算每个时间点的累积尿液体积（单位：μL）。
    2. 在绘图软件中生成一个XY表格，X列输入以小数形式表示的时间，Y列输入累积尿量。将时间和尿量数据复制到表格中。添加数据点（0; 0）和（6; 最大值）。这些点对于完成图表中的水平线至关重要：在实验开始时（时间：0 h），排尿量为零，对应点（0; 0）；在实验结束时（时间：6 h），累积排尿量等于最后一次排尿事件所得数值，对应点（6; 最大值）。
    3. 双击图表，应出现格式化图表窗口。选择 外观 标签，单击以取消选择该按钮 显示符号 并单击以选择 显示连接线/曲线. 点击 样式 选项并选择 存活率.

访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。

结果

尿路上皮Piezo1/2基因敲除小鼠的排尿行为

在排尿周期的储尿阶段，人们推测尿路上皮能够感知膀胱内积聚尿液所产生的张力，并将这种机械刺激转化为细胞反应，例如浆膜侧释放ATP1,3。我们先前已证实，机械激活型PIEZO1和PIEZO2通道在小鼠尿路上皮中表达3,36。为了确定尿路上皮PIEZO通道是否对正常的排尿行为具有重要作用，我们对尿路上皮条件性Piezo1/2双敲除小鼠（Pz1/2-KO）以及年龄和性别匹配的对照组小鼠（Pz1/2-C；图9）进行了RT-VSA实验。我们在昼夜周期的黑暗期和光照期内分别对雌性和雄性小鼠进行了6小时的测试，并按照步骤6.1所述方法分析数据。当比较对照组小鼠在光照期与黑暗期的排尿活动时，我...

访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。

讨论

引入视频监测是一种经济高效的改进方法，相较于传统的排尿斑点分析法（VSA）具有多项优势。在通常作为终点检测方法的常规VSA中，难以区分重叠的排尿斑点。这一问题不容忽视，因为当实验持续数小时时，小鼠倾向于在笼子的同一区域（通常在角落）多次排尿。因此，实时排尿斑点分析法（RT-VSA）的首要优势在于，研究人员能够轻松识别部分或完全重叠的单个排尿斑点。这一点在图12所示的实验中得到了充分展示。在此案例中，视频记录证实小鼠在同一角落排尿三次，形成了重叠的排尿斑点。如果仅在实验结束时按照常规VSA的方式对滤纸进行分析，则只能识别出一个斑点。因此，尽管传统的终点VSA在识别排尿行为的显著差异方面具有一定价值，但可能无法区分更为细微的表型差异。随着遗传学领域的不断进步以及转基因动物的广泛应用，开发能够准确评估排尿行为的方法显得至关重要。

其次，实时视频尿斑分析（RT-VSA）可为研究者提供关于排尿事件的时间信息。因此，研究者能够确定真实的排尿频率，并建立不同排尿事件之间的关联。例如，当观察到多个小尿斑（SVS）紧邻一个较大的主尿斑（PV...

访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。

披露

作者无任何利益冲突需要披露。

致谢

本工作由美国国立卫生研究院（NIH）资助项目R01DK119183（资助G.A.和M.D.C.）、P30DK079307项目资助的试点项目奖（资助M.G.D.）、美国泌尿学会职业发展奖、Winters基金会资助项目（资助N.M.），以及匹兹堡肾脏研究中心（P30DK079307）的细胞生理学与模式生物肾脏成像核心设施共同支持。

访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。

材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
1.00” X 1.00” T型槽型材 - 四个开放式T型槽 –  裁剪至10英寸80/201010数量：20
1.00” X 1.00” T型槽型材 - 四个开放式T型槽 –  裁剪至12英寸80/201010数量：6
1.00” X 1.00” T型槽型材 - 四个开放式T型槽 –  裁剪至40英寸80/201010数量：4
1.00” X 1.00” T型槽型材 - 四个开放式T型槽 – 裁剪至 14.75 英寸80/201010数量：12
1.00” X 1.00” T型槽型材 - 四个开放式T型槽 – 裁剪至32英寸80/201010数量：5
1/4-20 双滑入式经济型 T 型螺母80/203280数量：16
1/4-20 三滑入式经济型 T 型螺母80/203287数量：18
10 & 25 系列 2 孔 - 18 mm 凹槽内角支架，带双支撑80/2014061数量：6
10系列3孔—直型平板80/204118数量：8
10 系列 5 孔 - "L" 平板80/204081数量：8
10 系列 5 孔 - "T" 平板80/204080数量：8
10系列5孔-三通平垫片80/204140数量：2
10系列标准脱开式铰链 - 右手组装件80/202064数量：2
10 到 15 系列 2 孔 - 轻型过渡内角支架80/204509数量：6
24”长波紫外灯管ADJ Products LLCT8-F20BLB24数量：2
20W 灯泡 – 24” 波长：365 nm
亚克力镜面板专业塑料数量：1
82.5 cm x 26.5 cm
亚克力镜面板专业塑料数量：2
26.5 cm × 30.5 cm
亚克力镜面板专业塑料数量：2
82.5 cm x 30.5 cm
AR 聚碳酸酯（抗紫外线）80/2065-2641数量：2
4.5 mm 厚，透明，38.5 cm × 26.5 cm
AR聚碳酸酯（抗紫外线）80/2065-2641数量：4
4.5毫米厚，透明，38.5厘米 × 21.5厘米
AR 聚碳酸酯（UV 抗性）80/2065-2641数量：4
4.5毫米厚，透明，26.5厘米 × 21.5厘米
AR聚碳酸酯（抗紫外线）80/2065-2641数量：4
4.5毫米厚，透明，37.5厘米 × 23.9厘米
AR 聚碳酸酯（抗紫外线）80/2065-2641数量：4
4.5毫米厚，透明，24.4 厘米 × 23.9 厘米
层析纸（薄纸） Thermo Fisher Scientific57144
Cosmos 吸水纸（厚纸）Blick Art Materials10422-1005
ExcelMicrosoft Corporation
GraphPad PrismGraphPad Software版本 9.4.0绘图与统计分析软件
ImageJ FIJI美国国立卫生研究院
Parafilm默克透明薄膜
Quick Time Player 10.5 软件 Apple多媒体播放器
安全监控摄像头Ben 软件视频监控软件系统
标准端部紧固件，1/4-2080/203381数量：80
紫外透射亚克力SpartechPolycast Solacryl SUVT数量：2
38.5 cm x 26.5 cm 
水凝胶：HydroGelClearH2O  70-01-5022(https://www.clearh2o.com/product/hydrogel/)
网络摄像头LogitechC930e数量：4

参考文献

  1. Dalghi, M. G., Montalbetti, N., Carattino, M. D., Apodaca, G. The urothelium: life in a liquid environment. Physiological Reviews. 100 (4), 1621(2020).
  2. de Groat, W. C., Griffiths, D., Yoshimura, N. Neural control of the lower urinary tract. Comprehensive Physiology. 5 (1), 327(2015).
  3. Dalghi, M. G., et al. Functional roles for PIEZO1 and PIEZO2 in urothelial mechanotransduction and lower urinary tract interoception. JCI Insight. 6 (19), (2021).
  4. Montalbetti, N., et al. Bladder infection with uropathogenic Escherichia coli increases the excitability of afferent neurons. American Journal of Physiology. Renal Physiology. 322 (1), 1(2022).
  5. Montalbetti, N., et al. Increased urothelial paracellular transport promotes cystitis. American Journal of Physiology. Renal Physiology. 309 (12), 1070(2015).
  6. Montalbetti, N., et al. Urothelial tight junction barrier dysfunction sensitizes bladder afferents. eNeuro. 4 (3), (2017).
  7. Montalbetti, N., Stocker, S. D., Apodaca, G., Bastacky, S. I., Carattino, M. D. Urinary K+ promotes irritative voiding symptoms and pain in the face of urothelial barrier dysfunction. Scientific Reports. 9 (1), 5509(2019).
  8. Kim, A. K., Hamadani, C., Zeidel, M. L., Hill, W. G. Urological complications of obesity and diabetes in males and females of three mouse models: temporal manifestations. American Journal of Physiology. Renal Physiology. 318 (1), 160(2020).
  9. Bartolone, S. N., et al. Micturition defects and altered bladder function in the klotho mutant mouse model of aging. American Journal of Clinical and Experimental Urology. 8 (3), (2020).
  10. de Rijk, M. M., et al. Aging-associated changes in oxidative stress negatively impacts the urinary bladder urothelium. International Neurourology Journal. 26 (2), 111(2022).
  11. Coyne, K. S., et al. The prevalence of lower urinary tract symptoms (LUTS) and overactive bladder (OAB) by racial/ethnic group and age: results from OAB-POLL. Neurourology and Urodynamics. 32 (3), 230(2013).
  12. Wittig, L., Carlson, K. V., Andrews, J. M., Crump, R. T., Baverstock, R. J. Diabetic bladder dysfunction: a review. Urology. 123, (2019).
  13. Irwin, D. E., et al. Population-based survey of urinary incontinence, overactive bladder, and other lower urinary tract symptoms in five countries: results of the EPIC study. European Urology. 50 (6), 1314(2006).
  14. Bogart, L. M., Berry, S. H., Clemens, J. Q. Symptoms of interstitial cystitis, painful bladder syndrome and similar diseases in women: a systematic review. The Journal of Urology. 177 (2), 450(2007).
  15. Foxman, B. Urinary tract infection syndromes: occurrence, recurrence, bacteriology, risk factors, and disease burden. Infectious Disease Clinics of North America. 28 (1), 1(2014).
  16. Fall, M., Logadottir, Y., Peeker, R. Interstitial cystitis is bladder pain syndrome with Hunner's lesion. International Journal of Urology. 21, 79(2014).
  17. Birder, L. A. Urinary bladder, cystitis and nerve/urothelial interactions. Autonomic Neuroscience: Basic & Clinical. 182, 89(2014).
  18. Rosen, J. M., Klumpp, D. J. Mechanisms of pain from urinary tract infection. International Journal of Urology. 21 Suppl. 1, 26(2014).
  19. Birder, L., et al. Neural control of the lower urinary tract: peripheral and spinal mechanisms. Neurourology and Urodynamics. 29 (1), 128(2010).
  20. Desjardins, C., Maruniak, J. A., Bronson, F. H. Social rank in house mice: differentiation revealed by ultraviolet visualization of urinary marking patterns. Science. 182 (4115), 939(1973).
  21. Sugino, Y., et al. Voided stain on paper method for analysis of mouse urination. Neurourology and Urodynamics. 27 (6), 548(2008).
  22. Hill, W. G., Zeidel, M. L., Bjorling, D. E., Vezina, C. M. Void spot assay: recommendations on the use of a simple micturition assay for mice. American Journal of Physiology. Renal Physiology. 315 (5), (2018).
  23. Rajandram, R., et al. Intact urothelial barrier function in a mouse model of ketamine-induced voiding dysfunction. American Journal of Physiology. Renal Physiology. 310 (9), (2016).
  24. Ruetten, H., et al. A uropathogenic E. coli UTI89 model of prostatic inflammation and collagen accumulation for use in studying aberrant collagen production in the prostate. American Journal of Physiology. Renal Physiology. 320 (1), 31(2021).
  25. Wegner, K. A., et al. Void spot assay procedural optimization and software for rapid and objective quantification of rodent voiding function, including overlapping urine spots. American Journal of Physiology. Renal Physiology. 315 (4), (2018).
  26. Wood, R., Eichel, L., Messing, E. M., Schwarz, E. Automated noninvasive measurement of cyclophosphamide-induced changes in murine voiding frequency and volume. The Journal of Urology. 165 (2), 653(2001).
  27. Dmochowski, R. R. Bladder outlet obstruction: etiology and evaluation. Reviews in Urology. 7 (Suppl 6), S3–S13. , (2005).
  28. Aizawa, N., Homma, Y., Igawa, Y. Influence of high fat diet feeding for 20 weeks on lower urinary tract function in mice. Lower Urinary Tract Symptoms. 5 (2), 101(2013).
  29. Wang, Z., et al. Void sorcerer: an open source, open access framework for mouse uroflowmetry. American Journal of Clinical and Experimental Urology. 7 (3), 170(2019).
  30. Verstegen, A. M., Tish, M. M., Szczepanik, L. P., Zeidel, M. L., Geerling, J. C. Micturition video thermography in awake, behaving mice. Journal of Neuroscience Methods. 331, 108449(2020).
  31. Keller, J. A., et al. Voluntary urination control by brainstem neurons that relax the urethral sphincter. Nature Neuroscience. 21 (9), (2018).
  32. Hou, X. H., et al. Central control circuit for context-dependent micturition. Cell. 167 (1), 73(2016).
  33. Negoro, H., et al. Involvement of urinary bladder Connexin43 and the circadian clock in coordination of diurnal micturition rhythm. Nature Communication. 3, (2012).
  34. Montalbetti, N., Carattino, M. D. Acid-sensing ion channels modulate bladder nociception. American Journal of Physiology. Renal Physiology. 321 (5), (2021).
  35. Chen, H., Zhang, L., Hill, W. G., Yu, W. Evaluating the voiding spot assay in mice: a simple method with complex environmental interactions. American Journal of Physiology. Renal Physiology. 313 (6), (2017).
  36. Dalghi, M. G., et al. Expression and distribution of PIEZO1 in the mouse urinary tract. American Journal of Physiology. Renal Physiology. 317 (2), 303(2019).
  37. Birder, L., Andersson, K. E. Animal modelling of interstitial cystitis/bladder pain syndrome. International Neurourology Journal. 22, (2018).
  38. Okinami, T., et al. Altered detrusor gap junction communications induce storage symptoms in bladder inflammation: a mouse cyclophosphamide-induced model of cystitis. PLoS One. 9 (8), (2014).
  39. Tungtur, S. K., Nishimune, N., Radel, J., Nishimune, H. Mouse Behavior Tracker: An economical method for tracking behavior in home cages. Biotechniques. 63 (5), (2017).
  40. Negoro, H., Kanematsu, A., Yoshimura, K., Ogawa, O. Chronobiology of micturition: putative role of the circadian clock. The Journal of Urology. 190 (3), (2013).

访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。

重印与许可

标签

实时排尿量分析排尿行为小鼠模型尿斑分析自主排尿视频监测膀胱功能尿道括约肌环磷酰胺处理
实时空斑检测法
联系我们
向图书馆推荐

隐私政策

使用条款

政策

版权所有 © 2026 MyJoVE Corporation。保留所有权利。