实时空隙点测定

Summary

本文介绍了一种通过将视频监测纳入常规空隙点测定来研究小鼠排尿行为的新方法。这种方法提供有关排尿事件的时间、空间和体积信息，以及一天中明亮和黑暗阶段小鼠行为的细节。

Abstract

正常的排尿行为是膀胱、尿道和尿道括约肌在神经系统适当控制下协调功能的结果。为了研究小鼠模型中的自愿排尿行为，研究人员开发了空隙斑点测定法（VSA），这是一种测量沉积在动物笼子地板上的滤纸上的尿斑数量和面积的方法。虽然技术上简单且便宜，但该测定在用作终点测定时具有局限性，包括缺乏排尿事件的时间分辨率和难以量化重叠的尿点。为了克服这些限制，我们开发了一种视频监控的VSA，我们称之为实时VSA（RT-VSA），它使我们能够确定排尿频率，评估排尿量和排尿模式，并在一天的黑暗和光明阶段进行6小时时间窗口的测量。本报告中描述的方法可以应用于各种基于小鼠的研究，这些研究探索健康和疾病状态下自愿排尿的生理和神经行为方面。

Introduction

尿液储存和排尿由中枢回路（中枢神经系统）协调，该回路通过盆腔和下胃神经接收有关膀胱充盈状态的信息。尿路上皮是排列从肾盂到近端尿道的尿路上皮，对尿液中存在的代谢废物和病原体形成紧密的屏障。它是感觉网的一个组成部分，它感知膀胱的充盈状态并将其传达给下面的组织和传入神经^1，2。尿路上皮屏障的破坏或尿路上皮机械转导通路的改变可导致排尿功能障碍以及下尿路症状，例如尿频、尿急、夜尿和尿失禁³，⁴，⁵，^6，7。同样，衰老、糖尿病、下尿路感染、间质性膀胱炎和其他影响膀胱或控制其功能的相关回路的疾病过程已知会导致膀胱功能障碍⁸，⁹，^10，11，¹²，¹³，¹⁴，¹⁵，

Protocol

尿路上皮压电1 /2双敲除小鼠（Pz1/2-KO，基因型: 压电1 fl^/fl;压电2 fl^/fl;Upk2^CRE+/-）和对照（Pz1/2-C，基因型: Piezo1 fl^/fl;压电2 fl^/fl;Upk2^CRE-/-）由从Jax实验室获得的亲本菌株（Piezo1 fl^/fl 菌株#029213; 压电2 fl^/fl 应变 # 027720; Upk2^CRE+/- 应变 # 029281）。实验中使用雌性（1.5-3个月大，体重17-20g）和雄性（2-4个月大，体重23-29g）小鼠。对于环磷酰胺诱导的膀胱炎实验，使用野生型C57Bl / 6J雌性（3个月大，体重~20g）（杰克逊实验室，菌株#000664）。在匹兹堡大学机构动物护理和使用委员会的批准下，动物被饲养并在匹兹堡大学动物护理设施中进行实验。所有动物实验均按照《关于人道护理和使用实验动物的公共卫生服务政策》和《动物福利法》的相关准则和规定进行。

1. 实时空隙点测定（RT-VSA）保持架的组装

1. RT-VSA钻机由一个装有两个紫外线灯泡的紫外线支架和两个广角....

Results

尿路上皮 压电1/2 基因敲除小鼠的排尿行为

在排尿周期的储存阶段，假设尿路上皮细胞感知膀胱中积聚的尿液所施加的张力，并将这种机械刺激转化为细胞反应，例如浆膜 ATP 释放^1，3。我们之前已经证明，机械激活的PIEZO1和PIEZO2通道在小鼠尿路上皮^3，36中表达。为了确定尿路上皮PIEZO通道对正常排尿行为是否重要，我们对尿路上皮条件Piezo1 / 2双敲除小鼠（Pz1 / 2-KO）小鼠和年龄和性别匹配的对照（ Pz1 / 2-C ; 图9）。我们在一天的黑暗和光明阶段测试雌性和雄性小鼠6小时，并分析步骤6.1中所述的数据。当我们比较对照组一天中明相和暗相之间的排尿活动时，注意到女性和男性在其活动期间PVS的数量和.......

Discussion

视频监控的结合是一种经济高效的修改，与传统的VSA相比具有几个优势。在通常用作终点测定的经典VSA中，很难区分重叠的空隙点。这不是一个微不足道的问题，因为当测定延长几个小时时，小鼠倾向于在同一区域多次排尿，通常是在笼子的角落。因此，RT-VSA的第一个优点是调查人员可以很容易地识别部分或全部沉积在一起的单个斑点。 图 12 所示的实验很好地说明了这一点。在这种情况下，视频记录确认鼠标在同一角落排空三次，沉积重叠的空白点。如果仅在实验结束时以VSA的典型方式分析滤纸，则只能区分一个点。因此，虽然经典的终点VSA可用于识别排尿行为的巨大差异，但它可能无法区分更微妙的表型。随着当前遗传学的进步和转基因动物的产生，开发能够准确评估排尿行为的方法至关重要。

其次，RT-VSA为研究者提供有关排尿事件的时间信息。因此，人们可以确定真正的排尿频率，以及建立排尿事件之间的关系。例如，在经典VSA中，在单个大型PVS旁边观察到一组SVS的情况下，人们无法轻易区分小鼠在实验过程中是否排尿多次（三个小空隙和一个大空隙），或者动物是否沉积了一个大.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
1.00 英寸X 1.00 英寸T 型槽轮廓 - 四个开放的 T 型槽 – 切割至 10 英寸	80/20	1010	数量：20
1.00 英寸X 1.00 英寸T 型槽轮廓 - 四个开放的 T 型槽 – 切割至 12 英寸	80/20	1010	数量：6
1.00"X 1.00 英寸T 型槽轮廓 - 四个开放的 T 型槽 – 切割至 40 英寸	80/20	1010	数量：4
1.00"X 1.00 英寸T 型槽轮廓 - 四个开放的 T 型槽 –切割至 14.75 英寸	80/20	1010	数量：12
1.00"X 1.00 英寸T 型槽轮廓 - 四个开放的 T 型槽 –切割至 32 英寸	80/20	1010	数量：5
1/4-20 双滑入式经济型 T 形螺母	80/20	3280	数量：16
1/4-20 三滑入式经济型 T 形螺母	80/20	3287	数量：18
10 & 25 系列 2 孔 - 18mm 开槽内角支架，带双支撑	80/20	14061	数量：6
10 系列 3 孔 - 直平板	80/20	4118	数量： 8
10 系列 5 孔 - "L" 平板	80/20	4081	数量： 8
10 系列 5 孔 - "T" 平板	80/20	4080	数量： 8
10 系列 5 孔 - 三通平板	80/20	4140	数量： 2
10 系列标准升降铰链 - 右手组件	80/	20 2064	数量： 2
10 至 15 系列 2 孔 - Lite 过渡内角支架	80/20	4509	数量：6
个 24 英寸长的紫外线管灯	ADJ Products LLC	T8-F20BLB24	数量：2 20W 灯泡 – 24 英寸波长：365nm
亚克力镜板	专业塑料		数量：1 82.5 cm x 26.5 cm
亚克力镜板	专业塑料		数量：2 26.5 cm X 30.5 cm
亚克力镜板	专业塑料		数量：2 82.5 cm x 30.5 cm
AR 聚碳酸酯（抗紫外线）	80/20	65-2641	数量： 2 4.5mm 厚， 透明， 38.5 cm x 26.5 cm
AR 聚碳酸酯（抗紫外线）	80/20	65-2641	数量： 4 4.5mm 厚， 透明， 38.5 cm x 21.5 cm
AR 聚碳酸酯（抗紫外线）	80/20	65-2641	数量： 4 4.5mm 厚， 透明， 26.5 cm x 21.5 cm
AR 聚碳酸酯（抗紫外线）	80/20	65-2641	数量： 4 4.5mm 厚，透明 37.5 cm x 23.9 cm
AR 聚碳酸酯（抗紫外线）	80/20	65-2641	数量：4 4.5mm 厚，透明，24.4 cm x 23.9 cm
色谱纸（薄纸）	Thermo Fisher Scientific	57144
Cosmos 吸墨纸（厚纸）	Blick Art Materials	10422-1005
Excel	Microsoft Corporation
GraphPad 棱镜	GraphPad 软件	版本 9.4.0	绘图和统计软件
ImageJ FIJI	NIH
Parafilm	Merck		透明膜
Quick Time Player 10.5 软件	苹果		多媒体播放器
安全间谍	本软件		视频监控软件系统
标准端紧固件，1/4-20	80/20	3381	数量：80
紫外线透射亚克力	Spartech	Polycast Solacryl SUVT	数量：2 38.5 厘米 x 26.5 厘米
水凝胶：HydroGel	ClearH2O	70-01-5022	（https://www.clearh2o.com/product/hydrogel/）
网络摄像头	罗技	C930e	数量： 4