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利用荧光素异硫氰酸酯标记的葡聚糖评估小鼠肠道屏障完整性

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DOI：

10.3791/64710

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2022年11月18日

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1Nutrition and Microbiome Laboratory, Institut du cancer de Montréal, Centre de recherche du Centre hospitalier de l’Université de Montréal (CRCHUM), 2Digestive Surgery Service, Centre hospitalier de l’Université de Montréal (CHUM), Faculty of Medicine, Université de Montréal, 3Department of Medicine, Faculty of Medicine, Université de Montréal

本文内容

摘要

在本研究中，向小鼠给予荧光素异硫氰酸酯标记的（FITC）葡聚糖 通过 口服灌胃以评估肠道通透性 体内 以及血浆和粪便样本中。由于肠道屏障功能在多种疾病过程中受到影响，这种直接且定量的检测方法可应用于多个研究领域。

摘要

肠道屏障完整性是肠道健康的重要标志。虽然可通过检测血浆炎症标志物以及细菌向脾脏和淋巴结的易位等间接指标来评估肠道屏障完整性，但其金标准是直接量化特定分子穿越肠道黏膜层进入体循环的能力。本文采用一种无创、经济且低负担的技术，利用荧光素异硫氰酸酯标记的葡聚糖（FITC-dextran）实时定量并追踪小鼠的肠道通透性。在口服给予FITC-dextran前，需对小鼠进行禁食处理。随后通过灌胃法给予溶于磷酸盐缓冲液（PBS）中的FITC-dextran。灌胃后1小时，使用异氟烷对小鼠实施全身麻醉，并进行后续操作。 体内 在成像腔室中观察荧光。该技术旨在评估腹腔内残留荧光及肝脏摄取情况，提示荧光探针可能存在门静脉迁移。口服灌胃后4小时采集血液和粪便样本，随后处死小鼠。将血浆和粪便样本用PBS稀释后接种，记录荧光信号。随后根据标准曲线计算FITC-葡聚糖的浓度。在既往研究中 体内 成像结果显示，在低纤维饮食诱导肠道屏障功能减弱的小鼠中，荧光信号迅速扩散至肝脏；而在补充纤维以增强肠道屏障的小鼠中，荧光信号主要保留在胃肠道内。此外，本研究中对照组小鼠血浆荧光水平升高，粪便中荧光信号降低，而菊粉补充组小鼠则相反，其肠道内荧光信号水平较高，血浆中水平较低。综上所述，该实验方案可提供肠道通透性的定性与定量测量，作为评估肠道健康状况的指标。

引言

肠道屏障在健康和疾病中均发挥着重要作用。它需要在允许必需营养物质从肠腔渗透进入血液循环的同时，有效阻止病原体或抗原等促炎分子的侵入，从而维持复杂的平衡1。肠道通透性增加可由多种胃肠道疾病引起，例如肝脏疾病或炎症性肠病（IBD）2,3。以炎症性肠病之一的溃疡性结肠炎（UC）为例，慢性炎症会导致紧密连接结构破坏，进而造成肠道屏障功能障碍，并引发细菌易位，可能持续加剧黏膜和全身性炎症反应4。

因此，肠道屏障完整性是肠道健康的重要指标。然而，目前用于测量肠道通透性的方法存在诸多局限性。例如，检测血浆炎症标志物或细菌易位至脾脏和淋巴结的方法均为间接方法5,6其他方法可能具有侵入性且耗时较长。本文介绍一种非侵入性、经济高效的检测方法，可直接且定量地测量肠道通透性。该方法利用异硫氰酸荧光素标记的葡聚糖（FITC-dextran）通过检测荧光实现实时追踪肠道通透性 体内此外，通过测定血浆和粪便中FITC-葡聚糖的水平可定量评估肠道通透性（图1).

FITC-葡聚糖通透性检测此前已用于多种不同研究背景，包括帕金森病的动物模型7，脓毒症8缺血性卒中9，以及烧伤损伤10此外，该检测方法最近还被用于帮助理解肠道微生物组在不同疾病过程中的作用，以及如何将其作为潜在治疗靶点进行干预或调控。例如，该方法已被用于研究衰老过程中的微生物组及基于微生物组的治疗方法11，炎症性肠病（IBDs）12结直肠癌13，以及自闭症谱系障碍11由于肠道屏障功能与健康和疾病的诸多方面相关，该检测方法已被广泛应用。其相对简便的操作和较短的耗时使其非常适合用于检测 体内 怀疑会改变肠道屏障完整性的条件下。其定量结果有助于评估潜在治疗方法的有效性。

本研究采用FITC-葡聚糖法评估饮食对肠道屏障功能的影响，比较了接受对照饮食的小鼠与接受添加菊粉饮食的小鼠的肠道通透性。菊粉是一种有益的寡糖，已被证明可改善肠道屏障功能12,13。为进行体内荧光测量（背景值），另设一只未经处理的小鼠作为阴性对照，该小鼠给予PBS而非FITC-葡聚糖。本实验表明，FITC-葡聚糖法是评估肠道通透性的有效工具。

方案

所有操作均在获得CRCHUM机构动物护理委员会批准后，依照加拿大动物护理委员会的指南进行。实验所用8周龄雌性BALB/c小鼠购自商业来源（见 材料表），用于本研究。动物接受含10%菊粉（wt/wt）的饮食补充，持续2周。对照组小鼠接受不含菊粉补充剂的相似饮食。小鼠可自由摄食 随意摄取 饮食的获取。该检测方法的概述如图所示。 图1.

FITC-dextran absorption study diagram; rat, oral gavage, fluorescence measurement, analysis setup.
图1FITC-葡聚糖实验示意图。T−4- 灌胃前4小时撤除食物。 T0- 注射了FITC-葡聚糖 通过 灌胃给药 T1 - 灌胃后1 h， 体内 荧光被评估。 T4灌胃后4小时采集粪便和血浆样本，并测定荧光强度。 请点击此处以查看此图的放大版本。

1. FITC-葡聚糖的给药

  1. 在给予FITC-葡聚糖之前，将小鼠禁食4小时，同时维持 随意 饮水供应
    注意：禁食最好在光周期开始时（早晨）进行。禁食期间可将小鼠转移至无垫料的新笼中，以减少食粪行为。
  2. 准备 200 µL 浓度为 80 mg·mL⁻¹ 的溶液−1 4 kDa FITC-葡聚糖（参见 材料表)用无菌1×磷酸盐缓冲液（PBS）稀释（每只小鼠）。在给药前立即新鲜配制样品，并避光保存。
  3. 注射 200 µL FITC-葡聚糖悬液 通过 使用无菌的38 mm 22 G弯曲灌胃针（针尖呈球形或梨形）对每只小鼠进行口服灌胃（参见 材料表）。首次灌胃后启动计时器，每只小鼠灌胃后等待5-10分钟再进行下一只小鼠的灌胃，以确保 体内 测量（步骤2），始终维持在灌胃后1小时。保留剩余的FITC-葡聚糖悬浮液用于标准曲线制备。
    注意：灌胃后应立即恢复喂食，以确保粪便形成。

2. 体内 荧光测量

  1. 在灌胃后1小时，使用2.5%异氟烷或替代麻醉剂对小鼠进行麻醉。通过轻捏脚趾或尾巴确认动物已充分麻醉，确保其无反应。
    1. 使用电动剃须刀去除腹部区域的毛发，并在眼睛上充分涂抹眼用润滑软膏以防止干燥。然后将小鼠 individually 置于成像室中，呈仰卧位。
      注意：必须包括一只对照小鼠，给予 PBS 或生理盐水而非 FITC-葡聚糖，以消除背景干扰 体内 成像
  2. 使用荧光成像室对小鼠进行成像（参见 材料表使用激光长度为470 nm、分辨率为2.0 mm的设置，采集腹部区域的图像。
    1. 启动机器并点击并按住软件 开始 按钮。让系统预热。
      注意：系统可能需要 20 分钟或更长时间预热，因此必须提前启动设备，以免影响灌胃后 1 小时对小鼠的成像。
    2. 点击 设备状态 并确保所有已配置的设备均显示“OK”后再继续操作。
    3. 如有需要，通过点击来预热相应的激光器 激光控制 然后点击 激光名称 所需激光器的按钮。
    4. 点击开始一项新研究 新研究保存到相应文件中，并使用所需的名称命名。
    5. 点击 研究选项，然后输入 样本编号，并选择正确的激光器和实验。
    6. 打开成像室，将动物背侧朝下放置在扫描板上。用胶带固定四肢和尾巴，确保鼻部和口部紧密贴合麻醉管，维持2.5%异氟烷麻醉。
    7. 调节扫描板的高度，使扫描区域略位于动物体中线的腹侧。通过转动成像室内侧的调节旋钮来调整扫描板。关闭并锁紧成像室门。
    8. 使用以下方法选择要扫描的区域 吸取 工具。包括从肝脏上方到直肠的整个腹部宽度。点击 修改 用于调整已绘制区域的工具。
    9. 将扫描分辨率设置为 2.0 mm，然后单击 下一步电源自动化完成后，确保设置正确，并根据需要进行相应调整。点击 开始 开始扫描。
    10. 扫描完成后，将动物从成像室中取出，并置于培养箱中，以维持其体温，直至从麻醉中恢复。
    11. 点击 继续研究 保持设置，然后重复步骤 2.2.5–2.2.10，直至所有小鼠均完成扫描。
    12. 点击电源按钮并按住 3 秒，以关闭成像室。
  3. 通过使用成像系统配套的软件，在统一比例的图像上比较每只动物与对照小鼠的腹部荧光强度来评估荧光信号（参见 材料表).
    1. 通过查找选定的文件名打开图像文件。同时打开所有具有同步设置的文件。
    2. 使用图像设置工具栏，使用 同步图像 和 同步刻度 用于同步图像设置，以便进行准确比较。
    3. 保存带有调整后比例尺的图像。

3. 粪便样本和血浆中的荧光检测

  1. 在灌胃后4小时，从每只小鼠收集粪便颗粒至无菌管中。将试管置于冰上并避光保存。
  2. 麻醉小鼠 通过 腹腔注射 240 mg/mL 戊巴比妥钠（稀释比例 1:100；参见 材料表以0.03 mL/g体重的剂量给药。
    1. 在含有肝素或EDTA以防止凝血的血浆采集管中，收集至少700 µL的血液样本（参见 材料表通过将玻璃毛细管插入眼后静脉丛14.
      注意：采血的替代方法包括心脏穿刺或尾静脉采血。由于此为终末性操作，需对小鼠实施安乐死。 通过 颈椎脱位或其他人道方法。安乐死操作应遵循当地动物伦理委员会的建议。
  3. 将血液样本在 9,390 x g 室温孵育10分钟。将血浆转移至新的无菌管中，避光并置于冰上保存。
  4. 将50 mg粪便样本稀释于200 µL 1x PBS中，血浆用1x PBS按1:2比例稀释。可根据荧光信号强度调整稀释比例。
  5. 使用 FITC-葡聚糖在 1× PBS 中进行系列稀释，绘制标准曲线。起始浓度为 20 mg·mL⁻¹−1 FITC 葡聚糖，按1:1比例连续稀释7至10次。
    注意：因此，浓度必须读作 20 mg·mL−1，10 mg·mL−1，5 mg·mL−1，2.5 mg·mL−1，1.25 mg·mL−1, 0.625 mg·mL−1，0.3125 mg·mL−1等。
  6. 在不透光的黑色96孔板中加入100 µL样品和标准品，同时设置PBS空白对照。使用荧光酶标仪读取荧光信号（参见 材料表在530 nm吸收波长和485 nm激发波长下检测吸光度。
    注意：样品和标准品可设置重复孔或三复孔，然后取其荧光值的平均数。
  7. 通过将荧光值与标准曲线中的已知浓度进行比较，确定每份样品中 FITC-葡聚糖的浓度。在样品中，将测得的浓度乘以稀释倍数（步骤 3.5）。

结果

对……的分析 体内 荧光结果显示，与接受菊粉补充饮食的小鼠相比，仅接受对照饮食的小鼠肝脏对FITC-葡聚糖的摄取量更高，腹腔内残留荧光水平也更高（图2A在食用菊粉饮食的小鼠盲肠中可见部分荧光，但肝脏摄取极少或几乎未见，表明这些饮食可防止肠道通透性增加。

血浆和粪便样本中的荧光水平可用于加强并定量分析其 体内 对应组小鼠相比，接受菊粉补充饮食的小鼠血浆中异硫氰酸荧光素-葡聚糖（FITC-dextran）水平显著降低图2B）。这表明它们的肠道屏障功能得到改善，因为较少的FITC-葡聚糖能够透过肠屏障进入血液循环。与此一致，接受菊粉饮食的小鼠粪便中FITC-葡聚糖的水平显著高于仅接受对照饮食的小鼠（图2C这表明它们的肠道屏障功能完好，因为荧光素异硫氰酸酯标记的葡聚糖（FITC-dextran）保留在结肠内直至被正常排出。对照组小鼠粪便中FITC-dextran水平较低，说明其穿过肠屏障进入血液循环，而非被正常排出。血浆中高水平的FITC-dextran进一步支持了这一发现。

在530 nm处使用FITC-葡聚糖进行体内荧光分析；血浆和粪便浓度图表。
图 2：菊粉饮食补充可减少FITC-葡聚糖通过肠道屏障的易位。 （A）FITC-葡聚糖的残留荧光及肝脏摄取情况。红色 = 荧光强度最高；深紫色 = 荧光强度最低。最大荧光值为2.15 × 103，最小荧光值为0.378。（B）FITC-葡聚糖的血浆浓度。P = 0.010。（C）FITC-葡聚糖的粪便浓度。P = 0.00003。每组n = 4。数据以均值 ± 标准误表示。每个点代表一只小鼠。采用非配对Student t 检验。请点击此处查看该图的放大版本。

讨论

肠道屏障功能是多种不同疾病过程的重要组成部分。因此，以一种无创、经济且可量化的手段评估肠道通透性，对于在动物模型中准确表征这些疾病至关重要。荧光素异硫氰酸酯-葡聚糖（FITC-dextran）检测为此提供了可能。然而，该实验方案包含多个关键步骤，必须准确完成才能获得可靠的结果。首先，必须确保使用合适分子大小的FITC-dextran。在检测体内通透性时，4 kDa的FITC-dextran为最佳分子量；随着分子量增加，通透性会降低15。因此，使用不同分子量的FITC-dextran可能导致结果混淆或不可靠。此外，需准确记录每次灌胃的时间，并相应调整体内数据采集以及血浆和粪便样本收集的时间点。例如，若两只小鼠灌胃时间相隔10分钟，则其体内荧光读数以及粪便和血浆样本的收集也必须相隔10分钟。在相同时间点比较荧光强度，可更准确地反映通透性差异。此外，应交替测试不同组别的动物，以避免因时间顺序导致的聚集效应。不应先测试所有A组动物，再测试所有B组动物（AAABBB），而建议每只动物之间轮换组别进行测试（ABABAB）。

该检测方法可根据情况调整，仅对血浆和粪便样本进行评估，若无法获得成像设备亦可实施。尽管直接荧光成像 体内 可对肝脏摄取和腹腔残留荧光进行可视化观察，而血浆和粪便样本中的荧光检测仍可提供肠道通透性的定量测量。此外，如本实验所示，血浆和粪便中的荧光水平与 体内 成像。此外，该检测方法还可进行修改，仅包含 体内 成像。这使得动物能够在实验后继续存活，以便进一步测试其他参数或监测肠道通透性随时间的变化。因此，该检测方法具有可调节性，既易于操作又具备定量能力。最后，80 mg·mL的试剂以200 µL剂量给药−1 先前已在小鼠中使用过每只小鼠给予的FITC-葡聚糖，并证明在体重差异较小的小鼠中具有有效性16此外，需要注意的是，代表性结果部分所使用的小鼠体重均约为20 g，因此可对每只小鼠使用相同的剂量。然而，为考虑个体间体重差异，可按每克体重0.6–0.8 mg的剂量给予FITC-葡聚糖。17至关重要的是，无论使用何种剂量，均需将每只小鼠灌胃的体积限制在10 mL·kg以下−1 以预防并发症或不适18.

尽管FITC-葡聚糖检测法为评估肠道屏障功能提供了一种有效的方法，但仍存在一些局限性。该模型的一个局限性在于需要对小鼠进行数小时的禁食，这意味着将其结果与未禁食小鼠的结果进行比较是不可靠的。此外，在某些需要严格喂养时间安排的实验模型中，禁食可能会影响实验结果，例如在糖尿病动物模型中测量血糖时。

尽管存在这些局限性，FITC-葡聚糖检测法仍是一种分析肠道通透性的有效方法，因为它具有定量性、多功能性、成本效益高，并且比许多经典方法更具微创性。例如，常用于测量肠道通透性的探针包括小分子糖类探针或Cr-EDTA，这些方法具有一定优势19。然而，某些糖类探针仅具有特定肠段的通透性，由于它们在小肠远端被水解，因此无法反映结肠通透性19。另一方面，Cr-EDTA虽可提供结肠通透性信息，但需要持续24小时的检测，使得该方法的时间负担远高于FITC-葡聚糖检测法20。此外，这两种方法均无法实现本检测法所具备的直接体内成像能力。因此，相较于其他测量肠道通透性的方法，FITC-葡聚糖检测法提供了一种相对简便、直接且有效的选择。

最后，在炎症性肠病（IBDs）4、阿尔茨海默病21和肝病2等疾病过程中，肠道通透性是一个重要的可测参数，可通过FITC-葡聚糖检测法加以测定，从而改进相关研究。例如，在开发针对IBDs的新型治疗方法（如免疫疗法）时，该检测可用于评估治疗药物在维持肠道屏障完整性方面的有效性。考虑到肠道屏障功能受损可能参与了溃疡性结肠炎（UC）中慢性炎症的持续发展，因此评估治疗手段在防止通透性增加方面的保护作用至关重要4。这仅是一个例子，但FITC-葡聚糖检测法是一种简便且可量化的手段，可用于多个不同研究领域和方面对肠道通透性进行测量。

披露

作者声明无任何利益冲突。

致谢

本工作由加拿大自然科学与工程研究理事会资助（资助号 RGPIN-2018-06442，授予 MMS）。我们感谢 CRCHUM 动物实验中心以及心血管表型分析平台的 Junzheng Peng 博士。

材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
含50 ppm铁的饲料（10% 菊粉）Envigo TekladTD.190651代表性结果
含50 ppm铁的饲料（FeSO₄）Envigo TekladTD.190723代表性结果
BALB/c小鼠，49–55日龄，雌性Charles River 028BALB/C代表性结果
BD 1 mL 结核菌素注射器，滑动接头Becton, Dickinson and Company309659用于灌胃
BD Microtainer 管（含锂肝素，LH）Becton, Dickinson and Company365965用于血浆采集
Centrifuge 5420 离心机EppendorfS420KN605698
弯曲灌胃针（灌胃套管），7.7.0，38 mm × 22 GHarvard Apparatus Canada34-024已不再供应——可考虑 Instech Labs 提供的替代产品（FTP-22-38） 
Euthanyl（戊巴比妥钠）240 mg/mLBimeda-MTC Animal Health Inc.141704按1:100稀释；按0.03 mL/g体重经腹腔注射给药
FITC-葡聚糖 4TdB Labs20550
肝素化毛细管Kimble Chase Life Science and Research2501用于眶后采血
微孔板，聚苯乙烯，96孔，平底（烟囱井），黑色，Flutrac，中等结合力Greiner Bio-one655076
MiniARCO 毛发去除套装Kent ScientificCL8787-KIT用于去毛
Optix MX2 和 Optix OptiviewAdvanced Research Technologies2.02.00.6荧光成像设备及配套软件
1×磷酸盐缓冲液（PBS）Wisent Inc311-010-LL
Puralube Vet 软膏Dechra12920060眼科软膏，用于预防麻醉期间眼部损伤
Spark 多功能酶标仪Tecan30086376

参考文献

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FITC

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