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从多能干细胞生成人血管类器官

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DOI：

10.3791/64715

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2023年1月20日

 , 
1School of Biomedical Engineering, University of British Columbia, 2Life Sciences Institute, University of British Columbia, 3Department of Medical Genetics, University of British Columbia, 4Institute of Molecular Biotechnology of the Austrian Academy of Sciences (IMBA)

通讯作者： Nicolas Werschler <nico.werschler@ubc.ca>

本文内容

摘要

本方案描述了从人类多能干细胞和诱导性多能干细胞生成自组织血管的方法。这些血管网络表现出广泛且相互连接的内皮细胞网络，周围分布着周细胞、平滑肌肌动蛋白以及连续的基底膜。

摘要

类器官被定义为一种经工程化构建的多细胞结构 体外 模拟其对应组织的组织 体内 器官，以便在组织培养皿中研究该器官的特定方面。人类多能干细胞（hPSC）来源的类器官研究范围和应用已显著拓展，涵盖大脑、视网膜、泪管、心脏、肺、肠、胰腺、肾脏及血管等多种组织。特别是人类微血管生成方法的发展，为研究人类血管发育及疾病建模开辟了新途径 体外 用于新药测试和分析病毒感染（包括SARS-CoV-2）中的药物效应或组织嗜性。缺乏可视化指导的复杂且冗长的实验方案严重阻碍了多种干细胞来源类器官的可重复性。此外，类器官形成过程和自组织行为本身具有内在的随机性，因此有必要建立光学可视化方案，以推动对细胞命运获取与编程机制的理解。本文介绍了一种可视化引导的实验方案，用于由人多能干细胞（hPSCs）工程化构建三维人源血管类器官（BVOs）。BVOs具有连续的基底膜、血管内皮细胞，并与壁细胞形成有序的结构连接，表现出人类微血管系统在功能、形态和分子层面的特征。BVO的形成始于细胞聚集体的生成，随后经历中胚层诱导和血管诱导过程。通过将聚集体嵌入三维胶原蛋白与可溶性基底膜基质中，可启动并支持血管成熟及网络结构的形成。人类血管网络在2至3周内形成，并可在可扩展的培养系统中进一步扩增。重要的是，将BVOs移植至免疫缺陷小鼠体内后，其可与小鼠内源性循环系统发生吻合，并特化为功能性的动脉、静脉和微动脉。本研究所提供的可视化引导方案将推动人类类器官研究的发展，尤其有助于血管在正常发育、组织血管化及疾病过程中的相关研究。

引言

血管功能障碍和血管疾病会导致器官功能出现显著并发症。心血管疾病（CVD）是全球首要的死亡原因1，也是美国医疗成本不断上升的主要因素。CVD 病例数量每年持续增加，且越来越多地出现在年轻年龄组（20–45 岁）2。目前已开发出多种in vivo模型，用于研究血管的发育与成熟、血管疾病以及内皮功能障碍3,4。当前，结合来自干细胞或成体组织分离的单系或多系定义细胞的体外方法，能够在in vivo条件下构建出可模拟人类血管功能和解剖结构部分特征的血管网络5,6。在从中胚层发育的过程中，血管是最早形成的机能性系统之一，其形成方式要么是通过称为"血管发生"的组装过程，要么是由已有血管扩展和分支形成，后者被称为"血管生成"7。

利用发育生物学和自组织组装的优势，Wimmer 等人首次报道了由人多能干细胞（hPSCs）衍生的可自组织形成三维人血管类器官，该类器官具有人类微血管的功能、形态和分子特征8. 与人类血管系统相似9这些人脑类血管器官（hBVOs）被生成后具有内皮层、连续的基底膜以及周围包绕的壁细胞8,10. hBVOs 可以被移植 体内 并与内源性循环系统吻合，还可经历成熟过程 体外 并作为心血管疾病（如糖尿病）的模型8 或病毒（如 SARS-CoV-2）感染中的组织嗜性11. 虽然我们此前发表过一份书面方案10目前尚无针对这一复杂技术的可用视频实验方案。

通过简明的逐步流程，hBVO 的形成经历了聚集体形成、使用 WNT 激动剂 Chiron（CHIR99021）诱导中胚层，以及骨形态发生蛋白-4（BMP4）的作用12,13, 血管诱导 通过 血管内皮生长因子A（VEGFA）和佛司可林（Fors）12，以及在定制的出芽基质中包埋8,10血管成熟和网络形成发生在将细胞聚集体嵌入出芽基质之后。这些人类血管网络在2-3周内形成，可从出芽基质中取出，并在可扩展的培养系统中进一步生长长达6个月。本文提供了人类干细胞来源血管系统形成与应用的光学引导操作流程。

方案

本研究中进行的所有实验均使用 commercially available H9 人 iPSC 细胞系。其他常见的 commercial 和 non-commercial 人多能干细胞系（如 H9、NC8）也已通过测试，并证明可有效用于本方案中人血管类器官的生成。具体细节请参见我们此前发表的报告8,10。

1. 人源血管类器官生成所需的培养基与试剂配制

  1. 制备聚集培养基。
    1. 混合40 mL无L-谷氨酰胺和HEPES缓冲液的低渗透压DMEM/F12培养基（适用于人胚胎干细胞和诱导多能干细胞生长的优化培养基）、10 mL KnockOut血清替代物（KOSR）、0.5 mL 200 mM L-丙氨酰-L-谷氨酰胺二肽（溶于0.85% NaCl）、0.5 mL 非必需氨基酸（NEAA）、35 µL β-巯基乙醇（BME，将100 µL 2-巯基乙醇溶于10 mL无菌PBS中）以及Y-27632（细胞通透性、选择性Rho相关卷曲螺旋蛋白激酶[ROCK]14抑制剂，10 mM，使用比例为1:200）（参见材料表）。
  2. 制备N2B27基础培养基（添加N2和B27补充剂的基础培养基）。
    1. 混合25 mL DMEM/F12培养基、25 mL Neurobasal培养基、1 mL B27补充剂、0.5 mL N2补充剂、250 µL 200 mM L-丙氨酰-L-谷氨酰胺二肽（溶于0.85% NaCl）以及35 µL β-巯基乙醇（参见材料表）。
  3. 制备中胚层诱导培养基。
    1. 在N2B27培养基中添加ChiR（12 µM，GSK3α/β抑制剂，可促进中胚层诱导）和BMP-4（30 ng/mL，MSX2激活剂，可诱导中胚层谱系）。
      注：ChiR储备液浓度为10 mM（使用比例为1:833，即每毫升N2B27中加入1.2 µL）；BMP-4储备液浓度为100 µg/mL（使用比例为1:3333，即每毫升N2B27中加入0.3 µL）（参见材料表）。
  4. 制备血管诱导培养基。
    1. 在N2B27培养基中添加VEGFA（100 ng/mL）和佛司可林（forskolin，2 µM）（参见材料表）。
  5. 制备细胞外基质（ECM）。
    1. 每12孔板的一个孔使用1 mL ECM（用于包埋30–50个细胞聚集体）。在每个孔所用的1 mL ECM溶液中，使用0.5 mL形成底层，"第1层"，作为ECM基础；另0.5 mL与细胞聚集体混合用于上层，"第2层"。该方法通过ECM悬浮体系为人类血管网络向各个方向出芽提供充足的空间和支持。
      注：总体而言，1 mL ECM包含500 µL纯化的牛I型胶原蛋白、250 µL由Engelbreth-Holm-Swarm小鼠肉瘤细胞分泌的可溶性基底膜基质（参见材料表）以及250 µL基础基质溶液（见步骤1.5.2）。现配现用，并置于冰上直至使用。
    2. 为制备适用于四个12孔板（共48孔）的基础基质溶液，混合5.627 mL 0.1 N NaOH、2.498 mL 10x DMEM、473 µL HEPES、368 µL 7.5%碳酸氢钠、233 µL 200 mM L-丙氨酰-L-谷氨酰胺二肽（溶于0.85% NaCl）以及3.451 mL Ham's F-12培养基（参见材料表）。
      注：剩余的基础基质溶液可转移至带盖的50 mL高透明度聚丙烯锥形管中，于4 ˚C保存，最长可使用2个月。
  6. 制备出芽培养基。
    1. 特别配制50 mL无血清灵活培养基（SFM），以支持人类造血细胞的发育，加入1.3 mL无血清灵活培养基营养补充剂、15%胎牛血清（FBS）、250 µL青霉素-链霉素、500 µL 200 mM L-丙氨酰-L-谷氨酰胺二肽（溶于0.85% NaCl）、VEGFA（100 ng/mL）和FGF2（100 ng/mL）（参见材料表）。
  7. 制备封闭缓冲液。
    1. 混合0.5 g牛血清白蛋白、1.5 mL胎牛血清、250 µL Tween 20、250 µL Triton X-100、500 µL脱氧胆酸钠（1% wt/vol储备液）以及47.5 mL 1x磷酸盐缓冲液（PBS）（参见材料表）。反复吹打直至所有组分充分溶解，溶液澄清透明。

2. 人类多能干细胞与诱导多能干细胞的维持与培养

  1. 使用经 LDEV 无血小板裂解物的低生长因子基底膜基质（1:50 稀释）包被的 6 孔细胞培养板，在干细胞培养基（参见 材料表）中进行细胞培养。
  2. 当细胞融合度达到约 70% 时，在 37 ˚C 条件下使用 1 mL 哺乳动物细胞解离酶（参见 材料表）消化 3–4 分钟进行传代。
    注意：以 1:6 的比例传代可提高细胞活力，且大多数人类干细胞系可在 2–4 天内达到融合状态。为提高细胞活力，传代后 24 小时内使用添加 ROCK 抑制剂 Y-27632（10 mM，1:1,000）的培养基。
  3. 每日更换培养基，直至细胞融合度达到 70%。
    注意：在本研究中，当细胞融合度为 70% 时，一个 6 孔细胞培养板中的单孔约含有 100 万个 H9 hPSCs。

3. 第0天——从单细胞悬液生成多能性细胞团

注意：6 孔培养板中两个孔的细胞融合度达到 70% 时，可获得约 175 个 hBVOs。

  1. 使用移液器或真空系统吸除培养基，加入 1 mL 细胞解离试剂（参见材料表），于 37 ˚C 培养 5 分钟。
  2. 在细胞孵育于细胞解离试剂期间，根据所需 6 孔超低吸附培养板（参见材料表）的孔数，在 15 mL 锥形管中配制相应体积的聚集体培养基（步骤 1.1）。
  3. 吸除 1 mL 细胞解离试剂，将细胞重悬于 1 mL 聚集体培养基中。在计数样本前，通过轻柔的上下吹打形成单细胞悬液。
    注意：人多能干细胞（hPSCs）对机械应力非常敏感，不能承受剧烈的吹打操作。
  4. 使用自动细胞计数仪10或显微镜下的标准化系统进行细胞计数，并计算实验所需的细胞数量。
    备注：根据不同的细胞系，每孔 200,000 至 300,000 个细胞被认为是形成聚集体的理想范围（例如，4 孔共需 800,000 至 1,200,000 个细胞）。
  5. 将适量的细胞悬液加入已装有聚集体培养基的 15 mL 高透明度聚丙烯锥形管中。轻柔地上下吹打稀释后的细胞悬液，以确保细胞分布均匀。
  6. 将 3 mL 稀释后的细胞悬液加入 6 孔超低吸附培养板中每个目标孔内。
  7. 将培养板放入培养箱（37 ˚C，5% CO2，>90% 湿度），并尽量减少开关培养箱门的次数。
    备注：此初始步骤最好在晚间或培养箱使用较少时段完成。即使轻微的振动也可能影响聚集体的大小和形态，从而干扰实验结果。

4. 第1天——类胚体的中胚层诱导

  1. 确保接种后24小时，在显微镜下可见由2-10个细胞组成的小型细胞团。收集这些细胞团，并在更换为中胚层诱导培养基（步骤1.3）前让其自然沉降。
  2. 为6孔超低吸附培养板的每孔准备一个15 mL高透明度聚丙烯锥形管。
  3. 采用环形运动方式（例如类似轨道摇床的动作），将各孔中的细胞团聚集至孔中央，使用1 mL移液器轻柔地收集每个孔中的细胞团及其周围培养基，转移至对应的15 mL高透明度聚丙烯锥形管中，并在室温下静置使细胞团沉淀。
  4. 收集完成后，设定1小时计时器，此为大多数细胞系/细胞团在此阶段完成沉淀所需的时间。
    注意：若时间少于1小时，可能导致部分尚未完全沉降至15 mL锥形管底部的细胞团丢失。
  5. 1小时后，小心使用移液器或高灵敏度抽吸泵吸除上清液，确保细胞团仍完整保留在15 mL锥形管底部。
  6. 将每个15 mL锥形管中的细胞团重悬于2 mL中胚层诱导培养基中，并放回6孔超低吸附培养板的对应孔中。
  7. 将培养板放回培养箱（37 ˚C），继续培养至第4天。
    注意：若细胞团发生贴壁或相互融合生长，可使用1 mL移液器每天轻柔吹打每孔细胞团一次，以维持细胞团大小均一。

第5天 - 第4天：诱导血管化并启动细胞聚集体

  1. 收集细胞聚集体，并在更换为血管诱导培养基之前（步骤1.4），使其充分沉降。
  2. 为6孔超低吸附培养板的每孔准备一个15 mL锥形管。
  3. 采用环形运动方式（例如类似轨道摇床的动作），将各孔中的细胞聚集体集中至孔中央，使用1 mL移液器轻柔地收集每个孔中的细胞聚集体及其周围培养基，并转移至对应的15 mL锥形管中。
  4. 收集完成后，设定30分钟计时器，使细胞聚集体自然沉降。
    注意：此阶段大多数细胞系均需30分钟沉降时间。若时间少于30分钟，可能导致尚未完全沉降至15 mL锥形管底部的细胞聚集体丢失。
  5. 30分钟后，小心使用移液器或高灵敏度抽吸泵吸除上清液，确保细胞聚集体仍完整保留在15 mL锥形管底部。
  6. 将每个15 mL锥形管中的细胞聚集体用2 mL血管诱导培养基重悬，并放回6孔超低吸附培养板的对应孔中。
  7. 将培养板放回培养箱（37 ˚C），继续培养至第6天。
    注意：使用1 mL移液器，每天轻柔吹打每孔中的细胞聚集体上下一次，以维持聚集体大小均一，并防止其相互融合或黏附。

第6天 - 聚集体包埋与血管芽体诱导

  1. 在冰上操作，配制所需体积的细胞外基质（ECM）溶液（步骤1.5）。
    注意：以下为一个12孔板孔（30–50个类器官）的操作流程，可根据需要进行调整。
    1. 对于12孔板的一个孔，加入0.5 mL ECM作为底层，再在上层加入含类器官的0.5 mL ECM。此操作形成ECM "夹心"结构，是实现有效三维类器官出芽所必需的。
  2. 将500 µL ECM加入12孔板的一个孔中。确保无气泡产生，并完全覆盖孔底及侧壁弯月面。此为ECM夹心结构的第一层。
  3. 将培养板放回37 ˚C孵育2小时。
    注意：2小时孵育时间对于ECM有效聚合至关重要。时间过短可能影响ECM完整性。
  4. 在第一层ECM接近完成聚合时，用环形运动将类器官聚集至各孔中央，使用1 mL移液器轻柔吸取每个孔中的类器官及其周围培养基，并转移至对应的15 mL锥形管中。
  5. 静置10–15分钟使类器官沉降，随后吸除上清液。
  6. 将含有类器官的15 mL锥形管置于冰上5分钟。在此冷却期间，从培养箱中取出已聚合第一层ECM的12孔板。
    注意：冷却类器官有助于防止第二层ECM过早聚合。
  7. 迅速而小心地操作以避免产生气泡，将类器官重悬于500 µL ECM中，并将ECM-类器官悬液加至已聚合的第一层上方。注意不要触碰第一层，使用200 µL移液枪头轻柔地将第二层ECM和类器官均匀分布至整个孔内。
  8. 将培养板再次置于37 ˚C孵育2小时。
    注意：2小时孵育时间对于ECM有效聚合至关重要。时间不足可能影响ECM完整性，并削弱第一层与第二层之间的牢固黏附。
  9. 加入1 mL预热至37 °C的出芽培养基（步骤1.6），以诱导血管分化。类器官出芽通常在包埋后1至3天内出现。每3天更换一次培养基，之后每隔一天更换一次。
    注意：出芽培养基必须预热，否则可能导致ECM层脱落，并影响其完整性。

第11天 - 脑类器官的分离与成熟

  1. 在无菌条件下，使用无菌刮勺的圆头端轻轻松动含有血管网络的ECM出芽基质。此时，凝胶应呈现为一个自由漂浮的圆盘状。
    1. 使用无菌镊子和无菌刮勺的圆头端，小心地将凝胶圆盘（包括其中的血管网络）转移至一个10 cm培养皿的盖子内。
  2. 将带有凝胶的皿盖置于体视显微镜下，调节至所需放大倍数并调焦，然后使用无菌针头切割出单个的血管网络，尽量减少在此过程中带出的无血管化ECM成分。
    注意：细胞会随着时间自然降解周围的ECM；然而，减少每次类器官切割时附带的ECM量，可提高成像质量和独立血管网络的完整性。
  3. 当所有类器官从凝胶中分离后，轻柔地将其转移回超低吸附6孔板中的一个孔内，加入3 mL出芽培养基。此时，类器官可放置过夜，也可立即进入步骤7.4。
  4. 使用1 mL移液器将单个类器官从6孔板转移至超低吸附96孔板的孔中。转移后，向96孔板的每个孔中加入200 µL预热（37 °C）的出芽培养基。
    注意：一个来自12孔板的血管类器官孔中的内容物需分配至96孔板的30–40个孔中。
  5. 在96孔板中分离培养4–6天后，确认类器官呈现圆形且形态健康的特征。此时，类器官已准备好进行固定和染色前处理。

第15天——BVO的固定、封闭与染色

  1. 使用剪切过的1 mL枪头，将类器官转移至1.5 mL微量离心管中。
  2. 小心操作以避免吸走任何脑类器官（BVOs），使用200 µL或1,000 µL移液器吸除微量离心管中剩余的出芽培养基，然后加入1 mL含4%多聚甲醛（PFA）的PBS溶液，固定1小时。
    注意：建议在室温下于摇床上（125 rpm）进行固定。每个微量离心管中最多可容纳60个BVOs，超过此数量将影响固定和洗涤效果。
    警告：PFA为有害化学品，应在通风橱中谨慎使用，并遵循制造商提供的使用说明及适当的废弃物处理方法。
  3. 用0.25% PBS-Tween对新固定的BVOs洗涤3次，每次15分钟。
  4. 如果类器官直径大于1 mm，需在室温下使用含1% Triton X-100的PBS溶液对BVOs进行30–60分钟的通透处理。
  5. 吸除全部0.25% PBS-Tween溶液，并加入1 mL封闭缓冲液（见步骤1.7）。
    注意：尽管封闭时间可能因抗体而异，但在摇床（125 rpm）上室温孵育2小时足以减少染色过程中的非特异性抗体结合。类器官可在4 ˚C的封闭缓冲液中保存长达2周。
  6. 移除封闭缓冲液，加入用1 mL封闭缓冲液按1:100稀释的一抗溶液，在4 ˚C摇床（12 rpm）上过夜孵育，确保类器官完全浸没于一抗溶液中。
    注意：过夜孵育适用于本研究所使用的一抗。所需的一抗和二抗及其相应的稀释比例详见材料表。
  7. 一抗过夜孵育后，移除一抗溶液，并用0.25% PBS-Tween洗涤3次，每次15分钟。
  8. 加入用1 mL封闭缓冲液按1:250稀释的二抗以及按1:1,000稀释的DAPI，在室温下孵育2小时或在4 ˚C过夜。
    注意：若样本已按上述方法正确制备，则室温孵育2小时或4 ˚C过夜均适用于本研究所使用的抗体。
  9. 孵育结束后，移除二抗溶液，并用0.25% PBS-Tween洗涤3次，每次15分钟。
    ​注意：染色完成后，类器官可在PBS中保存最多2周。

9. 血管类器官（BVOs）的包埋

  1. 将固定用垫片粘附到所需的成像盖玻片上（参见 材料表）。
  2. 使用剪切过的1 mm移液枪头，用1 mL移液器将单个类器官转移至垫片上的孔中，并吸除残留的PBS。
  3. 向孔中加入150–200 µL预热至75 ˚C的透明化溶液（参见 材料表），确保类器官完全浸没。
    注意：样品在接触温热的透明化溶液后1小时内应变得透明。
    1. 若1小时透明化时间不足，可将类器官置于避光、加盖的容器中，在室温下继续孵育6小时至过夜。若过夜孵育，请确保有足够的透明化溶液，防止样品干燥。
  4. 透明化完成后，使用100–200 µL移液枪头小心吸除透明化溶液。轻柔地将类器官移至垫片孔的中央，然后逐滴加入已预热至75 ˚C的封片凝胶（参见 材料表），直至填满孔内空间。
  5. 将第二张盖玻片轻轻放置在封片垫片上方，使样品密封于上下盖玻片之间的空间中。在4 ˚C避光条件下静置过夜，使封片凝胶完全固化。
    注意：固化完成后，可在边缘涂覆指甲油以进一步密封已封片的样品。

结果

本方案中描述的步骤专门设计用于从人多能干细胞（hPSCs）中可控且精确地生成人血液血管类器官。从hPSC培养物中形成直径为30–100 µm的细胞聚集体标志着该方案的起始点（图1，图2B）。这些聚集体随后经历逐步诱导，依次分化为中胚层（第1–4天）和血管谱系（第4–6天），然后进行包埋（第6天）（图2A–D），而包埋是血管网络形成的必要步骤。到第7或第8天时，应可见近似辐射对称的血管出芽（图2E），并持续至第10天（图2F，G）。将人血液血管类器官（hBVOs）从细胞外基质（ECM）中取出并转移至96孔超低吸附板，可降低出芽网络的脆弱性，并使其能够在悬浮培养（图2H）条件下持续维持长达6个月。到第15天时，hBVOs呈现出广泛且相互连接的内皮细胞（CD31+）网络，周围包绕着周细胞（PDGFR-ß+）和平滑肌肌动蛋白（SMA+）阳性细胞（图3A–D）。连续的IV型胶原（ColIV+）基底膜包裹着血管网络（图3E）。内皮细胞（CD31+、VE-钙黏蛋白+）和周细胞（PDGFR-ß+）分别约占类器官细胞群体的30%–35%和60%–65%8。血管的活跃出芽过程由内源性组织的顶端细胞（CD31+）群体引导，这些细胞表现出典型的顶端细胞形态特征，例如大量丝状伪足8，10。在类器官成熟过程的第15天，可见PDGFR-ß+和SMA+的壁细胞包绕内皮血管网络（图3A，C）。在从ECM中取出并在悬浮培养中进一步成熟（即第15天）后，hBVOs可用于相应的分析或移植至小鼠肾包膜下。

人类干细胞分化时间线；中胚层诱导至血管网络提取示意图
图1hBVO方案示意图，突出显示时间点及逐步进展。 在 Rho 激酶抑制剂 Y27632 存在的情况下，看似均一的 hPSC 或 hiPSC 培养物中会发生聚集体形成。通过添加 BMP4 和 CHIR 的培养基诱导聚集体向中胚层命运分化。随后，将中胚层诱导培养基更换为添加 VEGFA 和 forskolin 的培养基，以促进聚集体向血管谱系发育。通过将聚集体包埋于 I 型胶原和可溶性基底膜基质中，并暴露于含 VEGFA 和 FGF2 的培养基，实现机械和化学信号刺激，从而诱导聚集体主体产生近乎辐射对称的血管出芽。所生成的血管网络可从 I 型胶原和可溶性基底膜基质中取出，转入悬浮培养，用于进一步成熟、分析或移植 关键词：hPSC，hiPSC，Y27632，BMP4，CHIR，VEGFA，forskolin，FGF2，I 型胶原，可溶性基底膜，血管分化，三维培养，血管出芽，中胚层诱导 体内. 请点击此处以查看此图的放大版本。

显微镜图像中的人类干细胞分化阶段；通过血管出芽生长的类器官。
图 2：在明场显微镜下捕获的 hBVO 生成逐步过程。（A）第 -1 天 hPSC（H9）集落的典型形态。（B）在含有 Y-27632 的 6 孔超低吸附培养板上生成 hPSC 聚集体（第 0 天）。（C）使用添加 BMP4 和 ChiR 的培养基对聚集体进行中胚层诱导（第 1 天）。也可观察到聚集体大小和形状的细微变化。（D）第 4 天，使用添加 VEGFA 和 forskolin 的培养基将聚集体向血管谱系诱导。（E）第 7 天出现早期血管出芽，即在将聚集体包埋于出芽基质并暴露于含 VEGFA 和 FGF2 的出芽培养基后的第一天（第 7 天）。（F）第 9 天，类器官形态健康，血管出芽持续进行。（G）第 10 天的晚期血管出芽。理想情况下，此时类器官中心致密的细胞结构已消失。（H）成熟（第 15 天）人类血管类器官的典型形态。通过切割去除周围基质，并在超低吸附 96 孔培养板中进一步成熟，使类器官呈现球形结构，内部包含血管网络。比例尺：（A、B、E、F）250 µm；（C、D）500 µm；（G、H）200 µm。请点击此处查看该图的放大版本。

共聚焦显微镜图像显示表达CD31、SMA、PDGFRß标记物的细胞网络；荧光分析。
图3：成熟（第15天）人源血管类器官的整体染色。 (A) 自组织内皮（CD31）成熟（第15天）人血管类器官的展示+，品红色）网络及周围周细胞（PDGFR-β+，青色）和α-平滑肌肌动蛋白（SMA）+，黄色）覆盖度。B更高倍镜下的放大图像 A 详细说明脊髓性肌萎缩症（SMA）+ （黄色）和 PDGFR-β+ （青色）血管网络的表达。C) 内皮细胞（CD31）的详细展示+，品红），周细胞（PDGFR-β）+，青色）以及α-平滑肌肌动蛋白（SMA）+，黄色）相互作用。D) 血管内皮整体染色（CD31+，品红）-平滑肌肌动蛋白（SMA）+，黄色）在成熟血管类器官横截面（左）及高倍放大（右）中的相互作用。E) 血管基底膜（Col IV）的自组装形成+，灰度）通过壁细胞与内皮管的紧密关联。比例尺：（A,D[左] 100 µm; (B,D[右]E) 25 µm. 请点击此处以查看此图的放大版本。

讨论

干细胞来源的类器官培养技术的最新突破为构建更先进且具有生理相关性的人类血管系统模型提供了基础。本文介绍的由本实验室开发的人血液管类器官（hBVO）模型8,10，为深入探索人类血管发生机制以及疾病建模和再生治疗的新途径提供了强有力的手段8,10,11. 多个 体内 已采用多种模型来探究血管的发育与成熟、血管疾病及内皮功能障碍3,4. 不同的方法结合了源自干细胞或成体组织的单谱系和多谱系定义的细胞 体内 构建可复制的人类血管网络5,6本方案利用发育生物学与自组织原理，首次实现了从单个人多能干细胞（hPSC）生成多细胞谱系的人类血管网络。8,10.

每种干细胞系都具有独特的基因组成，在来源、功能和反应性方面与其他细胞系存在差异15。因此，人源血液管状类器官（hBVOs）的实验方案经过开发和优化，以确保其能够稳定、可重复地适用于多种（>12）不同的人多能干细胞（hPSC）细胞系8,10。本文所述方法可在两周内生成由hPSC衍生的血液管状类器官。然而，培养基成分或hBVO生成技术的任何改变，均可能导致血管网络及类器官生成失败。不同干细胞系之间增殖速率的差异也会显著影响干细胞实验的可重复性15，从而影响类器官的培养效果。例如，在生成BVOs过程中，增殖能力更强的细胞或第1天形成的较大聚集体，其内在代谢环境以及气体和营养物质的扩散参数均有所不同。这反过来会改变生长因子的作用时间和效率、分化程度及血管前体化水平，最重要的是，会影响聚集体在嵌入Ⅰ型胶原和可溶性基底膜基质后形成血管网络的能力。

氧气的被动扩散以及从外部环境提供必需营养物质对于三维类器官的长期细胞生长和组织形态发生并不理想 体外16尽管受多种因素影响（例如，组织代谢率、营养物质和气体的生物可利用性、静态或动态环境），通常认为150 µm为氧气扩散的极限距离。2 且已确定培养组织的营养扩散限制 体外，考虑到从生理学角度来看，人体组织中的活细胞呈 cord 状结构，且距离有灌注的血管不超过 150 µm17尽管也有人提出有效的气体和营养物质扩散距离为70–200 µm18,19,20,21构建密度、温度、pH值和培养基成分显著影响扩散效率。由于在第6天包埋后表面积优化以及整合素β受体的相互作用，直径为250–300 µm的聚集体表现优于那些 >直径为500-600 µm，可实现完整的血管出芽过程，并形成最小程度压缩的类器官核心。因此，聚集体的大小至关重要，且会受到初始接种时所用细胞数量以及聚集体形成时间的影响。可调控聚集体大小和数量的微孔板22 是本方案中使用超低吸附6孔板所导致的随机聚集体形成技术的一种可行替代方法。在hBVO方案的前6天内，对时间控制和聚集体大小管理的一致性是成功发育的关键指标之一，甚至可能是最重要的指标 真正有效的 血管类器官

在第1天（中胚层诱导）和第4天（血管诱导）进行培养基更换时，必须与细胞聚集体的沉降过程同步完成。尽管离心是一种诱人的替代方法，但施加于结构松散的聚集体上的额外作用力可能导致不必要的聚集、结构重组和剪切损伤，从而对后续阶段的分化、成熟及出芽效率产生负面影响。第6天包埋操作过程中保持冰上操作，对于维持细胞外基质（ECM）的正常聚合及分层结构形成至关重要。在聚集体包埋及出芽诱导期间，若将ECM暴露于高于4˚C的温度和/或非7.4的pH条件下，不仅会影响ECM的聚合速率和层状结构完整性，还会降低包埋聚集体的出芽效率。ECM出芽基质具有弹性特性，便于将其从12孔培养板完整剥离并转移至无菌切割表面。从基质中分离的单个类器官转移至超低吸附96孔板后，可消耗周围残留的ECM，并维持具有连续基底膜的、自组织形成的由壁细胞包绕的内皮微血管网络。

尽管本提案未涉及，但通过改变培养基成分可模拟疾病，进而引发人脑血管类器官（hBVOs）的病理反应8,11。目前，利用hBVO系统进行疾病建模的潜力尚不明确，这无疑是值得深入探索的领域。此外，将我们的血管类器官技术应用于先前无血管结构的类器官构建物的血管化过程23，也具有重要意义和广泛的应用前景。

披露

作者的经济利益与本研究无任何关联。血管类器官技术已授权给 Stemcell Technologies 公司。J.M.P. 是 Angios Biotech 公司的创始人及股东，该公司致力于开发用于血管移植治疗的血管类器官。一项与此工作相关的专利申请已提交，专利号为 US20200199541A1，发明人为 Reiner A. Wimmer、Josef M. Penninger 和 Dontscho Kerjaschki。

致谢

感谢我们实验室所有成员提供的宝贵意见和讨论。JMP 获得了以下资助：T. von Zastrow 基金会、奥地利科学基金会（FWF）维特根斯坦奖（Z 271-B19）、奥地利科学院、创新药物计划 2 联盟（IMI 2 JU）第 101005026 号拨款协议、Leducq 心血管研究跨大西洋卓越网络、艾伦研究所杰出研究员计划，以及加拿大 150 研究讲席计划 F18-01336，还有加拿大卫生研究院（CIHR）的 COVID-19 拨款 F20-02343 和 F20-02015。

材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
1 M HEPES Gibco15630080
2-巯基乙醇Millipore60-24-2
7.5% 碳酸氢钠Gibco5080094
Accutase GibcoA1110501细胞解离试剂 
牛血清白蛋白第五组分（BSA）AppliChemA1391, 0100
Alexa Fluor 488–抗兔 IgG（Fab′)2 片段—杰克逊免疫研究公司711-546-152
Alexa Fluor 488–抗绵羊IgG—Life TechnologiesA11015
Alexa Fluor 647–抗山羊IgG（Fab′)2 片段—杰克逊免疫研究公司705-606-147
自动细胞计数仪 InvitrogenCountess II
B27添加剂Gibco12587010
生物安全柜 更快SafeFAST Premium 212
BMP4Miltenyi BioTec130-111-165
CD31内皮细胞DAKOM0823
CD31内皮细胞R&研发AF806
纤维素擦拭布
离心HeraeusMultifuge 4 KR
CHIR99021Tocris Bioscience4423
透明指甲油（essence 品牌，凝胶型，01 号绝对纯净）
CO2 培养箱 新不伦瑞克Galaxy 170S
IV型胶原蛋白基底膜MilliporeAB769
共聚焦显微镜（10x，20x，63x物镜）LeicaSP8
计数室载玻片——包括0.1%台盼蓝InvitrogenC10283
盖玻片（22 × 50 mm）
Cy3–抗小鼠 IgG（Fab′)2 片段—杰克逊免疫研究公司715-166-150
DAPI SigmaD9542
DMEM/F12Gibco11330-032
杜尔贝科改良伊格尔培养基（DMEM） SigmaD5648-10L
Eppendorf管
Falcon 管Fisher Scientific14-432-22
胎牛血清（FBS）Gibco10270-106
FGF2Miltenyi BioTec130-093-841
精细镊子FST11254-20
Fisherbrand Superfrost 切角载玻片Fisher Scientific12-550-016
Forskolin SigmaF3917
Geltrex LDEV-Free、hESC认证、低生长因子基底膜基质Fisher ScientificA1413302
GlutamaxGibco35050061
Ham's F12 Gibco11765054
水平层流净化台，若体视显微镜无法放入生物安全柜中 赛默飞世尔科技Heraguard
倒置相差组织培养显微镜 ZeissVert.A1
iSpacer SunJinLabIS009
KnockOut DMEM/F12 Gibco12660012
KnockOut血清替代物 Gibco10828028
N2 补充剂 Gibco17502048
Neurobasal 培养基Gibco21103049
非必需氨基酸（NEAAs）Gibco11140035
轨道摇床
Parafilm
PBS 中的多聚甲醛（4%）Boston BioProductsBM-155
PDGFR-β周细胞R&研发AF385
PDGFR-β周细胞细胞信号传导3169S
青霉素-链霉素Gibco15140122
pH 指示试纸（6.5-10）Mquant，Millipore109543
磷酸盐缓冲液（PBS）Gibco10010023
移液器（P1000、P200 和 P20）Gilson，Integra Pipetboy
Prime Surface-U 96孔板 苏米隆MS9096-U
PurCol Advanced BioMatrix5005
RapiClear CS 凝胶SunJinLabRCCS005
RapiClear CS 封片液SunJinLabRCCS002
血清移液管（5、10 和 25 mL）Falcon357529, 357530, 357515
SMA血管平滑肌细胞/周细胞Sigma2547
脱氧胆酸钠SigmaD6750
氢氧化钠溶液（NaOH，1.0 N）SigmaS2770
可溶性基底膜基质（即 Matrigel）康宁356231
不锈钢微型刮勺（圆头端）Fisher Scientific21-401-5
不锈钢双头勺Fisher ScientificBelArt H367290018
Stemflex 培养基赛默飞世尔科技A3349401干细胞培养基 
StemPro-34 SFMGibco10639011无血清培养基 
体视显微镜ZeissStemi 2000
无菌滤芯吸头（1,000、300 和 20） μLBiozym，SurphobVT0270, VT0250, VT0220
组织培养–经处理的12孔板 TC BD Falcon353043
组织培养–经处理的6孔板 Eppendorf30720113
Triton X-100 Sigma93420
Tryple Express 酶（1x），酚红赛默飞世尔科技12605010哺乳动物细胞解离酶 
Tween 20SigmaP7949
超低吸附6孔板康宁 3471
VEGFA Peprotech100-20
水浴（37 °C)Fisher ScientificIsotemp 210
Y-27632Calbiochem688000

参考文献

  1. Okwuosa, I. S., Lewsey, S. C., Adesiyun, T., Blumenthal, R. S., Yancy, C. W. Worldwide disparities in cardiovascular disease: Challenges and solutions. International Journal of Cardiology. 202, 433-440 (2016).
  2. Page, R. L., Ghushchyan, V., Nair, K. A call to action: Responding to the future forecasting of cardiovascular disease in America. American Health & Drug Benefits. 4 (5), 280-288 (2011).
  3. Ferrara, N., Davis-Smyth, T. The biology of vascular endothelial growth factor. Endocrine Reviews. 18 (1), 4-25 (1997).
  4. Ishitobi, H., et al. Flk1-GFP BAC Tg mice: An animal model for the study of blood vessel development. Experimental Animals. 59 (5), 615-622 (2010).
  5. Campisi, M., et al. 3D self-organized microvascular model of the human blood-brain barrier with endothelial cells, pericytes and astrocytes. Biomaterials. 180, 117-129 (2018).
  6. Xu, Y., et al. A novel strategy for creating tissue-engineered biomimetic blood vessels using 3D bioprinting technology. Materials. 11 (9), 1581(2018).
  7. Risau, W. Mechanisms of angiogenesis. Nature. 386 (6626), 671-674 (1997).
  8. Wimmer, R. A., et al. Human blood vessel organoids as a model of diabetic vasculopathy. Nature. 565 (7740), 505-510 (2019).
  9. Fleischer, S., Tavakol, D. N., Vunjak-Novakovic, G. From arteries to capillaries: Approaches to engineering human vasculature. Advanced Functional Materials. 30 (37), 1910811(2020).
  10. Wimmer, R. A., Leopoldi, A., Aichinger, M., Kerjaschki, D., Penninger, J. M. Generation of blood vessel organoids from human pluripotent stem cells. Nature Protocols. 14 (11), 3082-3100 (2019).
  11. Monteil, V., et al. Inhibition of SARS-CoV-2 infections in engineered human tissues using clinical-grade soluble human ACE2. Cell. 181 (4), 905-913 (2020).
  12. Patsch, C., et al. generation of vascular endothelial and smooth muscle cells from human pluripotent stem cells. Nature Cell Biology. 17 (8), 994-1003 (2015).
  13. Bruveris, F. F., Ng, E. S., Stanley, E. G., Elefanty, A. G. VEGF, FGF2, and BMP4 regulate transitions of mesoderm to endothelium and blood cells in a human model of yolk sac hematopoiesis. Experimental Hematology. 103, 30-39 (2021).
  14. Julian, L., Olson, M. F. Rho-associated coiled-coil containing kinases (ROCK): Structure, regulation, and functions. Small GTPases. 5, 29846(2014).
  15. Anitua, E., Prado, R. Addressing reproducibility in stem cell and PRP therapies. Trends in Biotechnology. 37 (4), 340-344 (2019).
  16. McMurtrey, R. J. Analytic models of oxygen and nutrient diffusion, metabolism dynamics, and architecture optimization in three-dimensional tissue constructs with applications and insights in cerebral organoids. Tissue Engineering Part C: Methods. 22 (3), 221-249 (2016).
  17. McKeown, S. R. Defining normoxia, physoxia and hypoxia in tumours-Implications for treatment response. The British Journal of Radiology. 87 (1035), 20130676(2014).
  18. Thomlinson, R. H., Gray, L. H. The histological structure of some human lung cancers and the possible implications for radiotherapy. British Journal of Cancer. 9 (4), 539-549 (1955).
  19. Olive, P. L., Vikse, C., Trotter, M. J. Measurement of oxygen diffusion distance in tumor cubes using a fluorescent hypoxia probe. International Journal of Radiation Oncology. 22 (3), 397-402 (1992).
  20. Torres Filho, I. P., Leunig, M., Yuan, F., Intaglietta, M., Jain, R. K. Noninvasive measurement of microvascular and interstitial oxygen profiles in a human tumor in SCID mice. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 91 (6), 2081-2085 (1994).
  21. Lanzen, J., et al. Direct demonstration of instabilities in oxygen concentrations within the extravascular compartment of an experimental tumor. Cancer Research. 66 (4), 2219-2223 (2006).
  22. Ungrin, M. D., Joshi, C., Nica, A., Bauwens, C., Zandstra, P. W. Reproducible, ultra high-throughput formation of multicellular organization from single cell suspension-derived human embryonic stem cell aggregates. PLoS One. 3 (2), 1565(2008).
  23. Sun, X. Y., et al. generation of vascularized brain organoids to study neurovascular interactions. eLife. 11, 76707(2022).

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