离体 肺可用于多种实验，以在排除混杂变量的情况下收集生理数据 体内 实验。商业设备通常价格昂贵，且在可收集的数据类型方面存在局限。我们描述了一种构建完全模块化装置的方法，可适应多种研究设计。
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本文内容
摘要
摘要
离体肺组织是一种有用的研究模型，可应用于多个不同的研究领域，能够补充相应的体内和体外模型。希望使用离体肺组织的实验室需要了解关键步骤及固有的挑战，以建立一个经济、可靠且易于根据研究主题进行调整的实验系统。本文介绍了一种用于离体大鼠肺通气与灌注的DIY（自己动手制作）模型，可用于研究药物和气体对肺血管张力的影响，且不受心输出量变化的干扰。构建该模型包括：a）装置的设计与组装，以及b）肺组织的分离操作。该模型比商业化的替代方案更具成本效益，同时具备足够的模块化特性，可灵活适应特定研究问题的变化。为确保模型的稳定性并适用于多种不同的研究课题，必须克服多种技术障碍。一旦建立，该模型已被证明高度可调，适用于多种研究问题，并可轻松修改以用于不同学科领域的研究。
引言
离体肺灌注（EVLP）技术1在过去十年中的应用日益广泛，可用于研究肺移植2、缺血/再灌注损伤3、肺代谢4以及免疫反应5。分离但结构完整、并维持通气与灌注的肺脏，能够在排除神经调节、激素影响及体内血流动力学变化等混杂因素干扰的情况下，直接评估肺组织（包括肺血管系统）对潜在干预措施和/或治疗手段的反应，从而提供至关重要的研究能力。与此同时，该模型保留了通气与灌注之间的生理相互作用，这与体外（in vitro）条件形成鲜明对比。例如，一项研究肺部免疫反应的课题5，其所需的数据质量应与旨在扩大肺移植供体池规模的研究6相当。EVLP模型可应用于多种物种，包括小鼠3、大鼠7,8,9,10,11
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方案
实验的体内部分（从全身麻醉到安乐死）需事先获得相应的机构动物护理与使用委员会（IACUC）的批准。本文所述所有操作步骤均已获得范德堡大学医学中心（美国田纳西州纳什维尔）IACUC的批准（方案编号 M1700168），并遵循ARRIVE指南14执行。在开始实验前，所有大鼠均饲养于本机构的动物护理设施中，可自由获取水和食物。除本论文范围之外的其他研究外，截至目前我们共使用了148只雄性Sprague Dawley大鼠，年龄为7至10周，体重介于250 g至400 g之间。
1. 仪器装置的构建
注意：所有部件及其相应制造商均列于材料表中。
- 为固定每件设备，构建一个定制的支架结构，以便于灵活配置并整合新设备（图1）。使用十字夹具将铝制杆（长度1至2英尺，直径1厘米，可在任何五金店购买）相互连接，形成一个三维支架结构，并将其放置在塑料托盘（30英寸×21英寸）上，以防止液体溢出。
- 将压力传感器安装至与肺部等高的位置，并将其连接至肺动脉（PA）、肺静脉（PV）以及通气管路。
注：这些传感器将数据传输至连接到数据采集系统（DAQ）及其软件的相应生物放大器。 - 不使用市....
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结果
在稳定10分钟并记录基线数据后，我们将第一组10只雄性Sprague Dawley大鼠随机分为五个小组：分别进行5、7.5、8、9或10分钟（每组n = 2）的全局限流性缺血，随后进行再灌注；这些有限的初步剂量探索实验旨在确定在气道压力急剧且不可逆升高以及肺水肿形成之前，仍能维持足够通气和再灌注的最长缺血时间。重要的是，在缺血期间，我们并未停止通气，而是将通气频率从60次/分钟降低至20次/分钟-1，以防止离体肺发生萎陷和不可逆的肺不张。ex situ肺采用恒定呼气末正压（PEEP）可能达到相同目的，这类似于临床实践中在吸气后夹闭待移植肺的气管17。图4表明，在这些条件下，仍能维持150分钟再灌注的最长缺血时间为8分钟。
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讨论
我们实验室已使用该装置成功完成了100多项实验。该定制装置的模块化设计为实验需求的潜在变更提供了极大的灵活性。而其他装置则采用脱氧器18 以模拟恒定的氧气消耗和CO2 由靶器官产生，该简化模型未采用此特性，因其重点在于研究不同气体成分对肺血管张力的影响。该方法中，CO2 仅由吸入气体浓度控制，也允许对CO进行差异性调节2 与每分通气量无关。
采用闭路循环系统（图1）以重新循环改良的Krebs缓冲液（表1），从而减少牛血清白蛋白（BSA）的浪费，这一步骤对控制成本至关重要。通过恒定流速灌注以模拟恒定的心输出量，可在不伴随心输出量变化的情况下，研究不同剂量药物对肺血管张力的影响，避免了体内实验（in vivo）中因心输出量波动带来的干扰。该系统亦可轻松改造为恒压灌注模式，只需在回路中加入一个高度可调的压力柱，并相应调节泵速即可实现；此时流量成为因变量而非压力，因此.......
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披露
作者声明不存在任何经济或其他方面的利益冲突。
致谢
部分支持来自美国退伍军人事务部生物医学实验室研究的优异奖评审（101 BX003482）&D 服务、美国国立卫生研究院资助（5R01 HL123227）、美国心脏协会变革性项目奖（962204）以及授予瑞斯博士的机构资金。巴尔泽博士获得了德国研究基金会（Deutsche Forschungsgemeinschaft, DFG）的独立资助，项目编号为 BA 6287/1-1。作者谨此感谢 Matthew D. Olsen、Chun Zhou、Zhu Li 和 Rebecca C. Riess 为本研究作出的宝贵贡献。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 1,000 mL 玻璃烧杯 | Pyrex, Chicago, IL | ||
| 1,500 mL 玻璃烧杯 | Pyrex, Chicago, IL | ||
| 空气捕集顺应性腔室 | Radnoti | 130149 | |
| 生物放大器 | CWE Inc | BPM-832 | |
| 夹具 | Fisher Scientific | S02626 | |
| DAQ（数据采集系统） | National Instruments, Austin, TX | NI USB-6343 | |
| 气体混合器 | CWE Inc, Ardmore, PA | GSM-4 | |
| 加热线圈 | Radnoti, Covina, CA | 158822 | |
| 加热板 | Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA | 11-100-49SH | |
| 肝素 | Pfizer | W63422 | |
| LabVIEW 完整开发系统 2014 | National Instruments | ||
| 戊巴比妥 | Diamondback Drugs | G2270-0235-50 | |
| pH700 探针 | OAKTON, Vernon Hills, IL | EW-35419-10 | |
| Polystat 水浴槽 | Cole-Parmer | EW-12121-02 | |
| 啮齿类动物呼吸机 | Harvard Apparatus, Holliston, MA | Model 683 | |
| 蠕动泵 | Cole-Parmer, Wertheim, Germany | Ismatec REGLO Digital MS 2/8 | |
| 斯普拉格-道利大鼠 | Charles River, Wilmington, MA | 品系编号 001 | |
| VetScan i-STAT 血气分析仪 | Abraxis, Chicago, IL | i-STAT 1 |
参考文献
- Uhlig, S., Taylor, A. E. Methods in Pulmonary Research. , Birkhäuser. (1998).
- Ghaidan, H., et al. Ten year follow-up of lung transplantations using initially rejected donor lungs after reconditioning using ex vivo lung perfusion. Journal of Cardiothor....
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重印与许可
