本方案描述了在大鼠中成功实施子宫移植（UTx）的全部关键步骤。大鼠模型已被证实适用于推动UTx的临床应用；然而，大鼠UTx是一项高度复杂的手术，需要细致的操作指导。
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本文内容
摘要
摘要
子宫移植（UTx）是一种治疗绝对性子宫因素不孕症（AUFI）女性的新方法。据估计，有3%至5%的女性患有AUFI。在子宫移植技术出现之前，这些女性无法实现生育子女的愿望。UTx的临床应用得益于动物实验研究的推动，首例成功的子宫移植是在大鼠中实现的。由于大鼠在生理学、免疫学、遗传学和生殖特性方面与人类具有可比性，因此是此类移植研究的合适模型系统。特别是其较短的妊娠周期具有明显优势，因为实验性UTx通常以成功妊娠并活产作为主要终点指标。目前大鼠模型面临的最大挑战是其解剖结构微小，这需要高超的显微外科技术和丰富经验。尽管在临床中已通过UTx实现妊娠，但该技术尚未成熟，仍需持续进行实验优化。本文提供了一套详细的实验操作方案，包含大鼠UTx的关键步骤及常见问题的解决方案，旨在帮助尚未具备此类显微外科经验的研究人员更易于掌握整个操作流程。
引言
子宫移植（UTx）是治疗绝对性子宫因素不孕症（AUFI）的一种新型疗法。AUFI由子宫缺失（先天性或后天性）或子宫畸形引起，影响全球约3%至5%的女性1。由于伦理、法律或宗教原因，许多渴望成为母亲但患有AUFI的女性无法选择收养或代孕2。对于这些女性而言，子宫移植仍是实现生育、组建自己家庭的唯一选择。尽管子宫移植已应用于临床，但结果尚不一致；该手术技术难度高，仍需不断改进以实现临床广泛应用。
2014年，瑞典Brännström团队首次成功实施了来自活体供体（LD）的子宫移植，并实现了成功妊娠3。2016年，巴西报道了首例来自死亡供体（DD）的子宫移植后成功分娩的病例4。截至2021年，全球已开展超过80例子宫移植手术，但总体成功率约为50%，且大多数移植物来自活体供体1。
尽管子宫移植（UTx）并非挽救生命所必需，但它正成为一种越来越受欢迎的手术，以满足患者拥有自己后代的愿望。因此，对移植器官的需求日益增加，使得尸体捐赠（DD）成为未来关注的重点。然而，由于尸体捐赠的器官经历了明显更长的冷缺血时间（在心脏死亡的情况下还包括热缺血时间），导致移植物功能障碍和排斥反应的风险升高5,6。手术技术、配型相容性要求以及相关的免疫抑制治疗仍是影响子宫移植效果的关键问题7。
为了在临床中管理上述风险，需要建立合适的动物模型来研究缺血和免疫抑制。对于动物模型而言，最具临床相关性的终点指标仍是成功分娩；迄今为止，实验性子宫移植（UTx）后的妊娠已在小鼠、大鼠、绵羊、兔子和食蟹猴中实现8。虽然大型动物更适合获取和优化外科技术，但啮齿类动物具有妊娠周期短的显著优势。因此，在实际操作性、经济性和伦理考量方面，啮齿类动物模型更具优势9。然而，小鼠子宫移植的主要挑战在于其解剖结构微小，手术难度极高，导致小鼠UTx的可重复性较低10。相比之下，大鼠在手术操作上更为便利，同时仍保留妊娠周期短的优点。因此，大鼠已成为子宫移植研究的首选模型9。Wranning 等人于2008年首次建立了大鼠原位UTx模型，并利用该模型实现了子宫移植后自然交配并产下活胎的首例报道11,12,13。后续研究对该技术在人类中的应用起到了关键推动作用9。
尽管如此，大鼠子宫移植（UTx）仍具有挑战性，迄今为止只有少数研究团队掌握了该手术技术。限制大鼠UTx在研究人员中推广的一个重要障碍是缺乏对各个显微外科步骤、常见问题及其相应解决措施的精确描述14。本方案旨在为这一高度复杂的显微外科手术提供详细的操作指南，以促进该动物模型在未来研究中的应用。
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方案
所有动物实验均遵循瑞士联邦动物管理条例，并由苏黎世兽医办公室批准（编号° 225/2019），确保符合人道关怀标准。选用雌性未交配的Lewis大鼠（体重170–200 g）和雌性未交配的Brown Norway大鼠（体重170–200 g）作为子宫供体/受体，雄性Lewis大鼠（体重300–320 g）用于交配。大鼠年龄为12–15个月。动物来源于商业供应商（见 材料表) 并在受控环境和丰富化环境中饲养，可自由获取水和标准饲料。
1. 子宫获取
注意：有关该操作步骤的详细信息，请参见先前已发表的报告12,13,15。
- 在封闭的有机玻璃容器（14 cm × 25 cm × 13 cm）中使用异氟烷和氧气诱导麻醉，持续1-2分钟（5 vol%异氟烷与O₂混合）2).
- 术前30分钟，在预定腹部切口区域皮下注射布托啡诺（0.05 mg/kg）和布比卡因（0.5%，8 mg/kg）。
- 用电剃须刀剃除大鼠腹部全部的毛发。
- 使用胶带将动物固定在加热板上以进行手术。在双眼涂抹眼药膏。
- 手术过程中通过小型鼻罩持续给予2-4 vol%异氟烷与氧气混合气体以维持麻醉。
- 通过临床参数监测麻醉深度，无需使用专用工具（呼吸频率约为 70-120 次/分钟，麻醉期间呼吸频率下降 50% 属可接受范围；通过夹捏脚趾检测麻醉深度；黏膜颜色应呈粉红色，而非蓝色或灰色）16，并根据需要调整异氟烷浓度。
注：可选：在助手协助下，术中可频繁监测呼吸。 - 通过夹捏足趾确认麻醉深度。
- 清洁 以圆形动作用三种交替的消毒液棉签和70%酒精对腹部皮肤进行消毒。待其自然干燥。
- 放置无菌铺巾（参见 材料表) 在动物腹部开窗。
- 行正中腹切开术。
- 打开腹腔 通过 从剑突下方0.5 cm处开始，沿中线向耻骨上区做一条6-8 cm长的切口。皮肤切口使用10号手术刀，白线切口使用小型锐利剪刀。注意避免损伤肝脏或膀胱。
- 使用棉签将肠管移出腹腔外，并覆盖 用无菌生理盐水浸湿的纱布轻轻擦拭它们， 并保护 用无菌塑料袋包裹以提供更好的保温。
- 插入拉钩或夹子（参见 材料表用夹子/拉钩固定在左右腹壁褶处，以将腹膜和肌肉牵开并保持腹腔开放，从而充分暴露子宫及其相关血管，获得最佳的手术入路和视野。用胶带固定夹子/拉钩。
- 使用预热的生理盐水保持手术区域和肠道湿润，避免内脏干燥。
- 获取右侧子宫角，包括共同子宫腔、宫颈及血管蒂，其中包含右侧子宫动脉、髂内动脉和髂总动脉。
- 结扎（4/0 聚乳酸羟基乙酸；参见 材料表），电凝并切断左侧子宫角与共同子宫腔分支部位相邻的组织。
- 去除子宫和阴道周围多余的脂肪。
注意：保留子宫-血管系统周围的脂肪。 - 用烧灼法分离膀胱与宫颈的连接处，并烧灼所有引流和供血的膀胱血管。在烧灼过程中，需保持宫颈与阴道之间有足够的距离，以避免对这两个结构造成不必要的烧灼，否则会增加移植物坏死的风险。
注意：大多数外科操作应避免影响膀胱。使用血管钳向尾侧牵拉或牵引膀胱以进行暴露。 夹钳（参见 材料表) 以更好地观察膀胱子宫陷凹。 - 在尽可能远离宫颈的位置，于输尿管水平电凝并切断子宫降支血管。
注意：在分离过程中应尽可能保持阴道和宫颈周围的微循环。 - 将未来移植物的宫颈/阴道部分与直肠附着处以及阴道旁和宫颈旁韧带分离。
注意：移植物阴道部位禁止任何电灼操作。 - 仔细分离阴道 通过 电凝 子宫颈尾侧约2-3毫米处。
注意：阴道腔内未见绒毛（宫颈）。 - 在子宫动脉和静脉的起始处进行定位。结扎（8/0 聚酰胺；参见 材料表），电凝并切断臀部血管及子宫血管尾侧的所有血管。
注意：通常可直接结扎子宫静脉尾侧的髂总静脉。 - 通过钝性分离，游离 从主动脉和下腔静脉分叉处开始，向下至子宫血管分叉处，分离每侧的髂总血管。
注意：通过切除一个或两个相邻的淋巴结，可获得更佳的手术入路。 - 在与输卵管相同水平处电凝子宫-卵巢蒂后，从输卵管起始处近端3 mm切除右侧子宫角。此举可实现移植子宫角与受体子宫角上段的吻合。
- 在腹主动脉和下腔静脉分叉近端，将结扎线（8/0聚酰胺）直接环绕右侧髂总动脉和静脉。在靠近分叉处的右侧髂总动脉上做一个小切口（0.5–1 mm），将弯曲钝化的30 G针头或直型钝化25 G针头插入管腔（用于灌注），并用结扎线（6/0聚酰胺）固定。
注意：另一种选择是使用血管夹进一步固定，以避免针头和/或血管移位。 - 在右侧髂总静脉结扎线的远端解剖髂总静脉，以在灌注期间保证流出通畅。
- 按照以下步骤冲洗移植物。
- 使用3 mL注射器，以6 mL/min的流速，将约9 mL的冷林格溶液（RHX：含50 IU/mL肝素和0.4 mg/mL赛拉嗪的林格液）手动冲洗子宫。随后再用6 mL添加肝素（50 IU/mL）和赛拉嗪（0.4 mg/mL）的器官保存液进行冲洗（参见 材料表).
注意：避免高压灌注，并确保针头位置正确。 - 当子宫组织变为苍白时，取出移植器官。在腹主动脉分叉处的结扎线尾侧切断髂总动脉。
- 使用3 mL注射器，以6 mL/min的流速，将约9 mL的冷林格溶液（RHX：含50 IU/mL肝素和0.4 mg/mL赛拉嗪的林格液）手动冲洗子宫。随后再用6 mL添加肝素（50 IU/mL）和赛拉嗪（0.4 mg/mL）的器官保存液进行冲洗（参见 材料表).
- 将移植器官置于冷藏的器官保存液（4℃）中 °C）用于移植前的台面准备和保存。
- 移除移植物后，先将异氟烷设置调至最大，随后诱导双侧气胸并进行放血，以处死动物。17.
2. 同基因型子宫移植
注意：有关该操作的详细信息，请参见先前发表的报告12,13,15。
- 按照步骤1.1所述，诱导麻醉并准备动物。
- 手术前30分钟，给予有效镇痛（如步骤1.1.1所述）和200 IU/kg高分子量肝素。
- 行正中开腹术。
- 打开腹腔 通过 从剑突下方0.5 cm处开始，沿中线向耻骨上区做一条6-8 cm长的切口。皮肤切口使用10号手术刀，白线切口使用小型锐利剪刀。注意避免损伤肝脏和膀胱。
- 使用棉签将小肠移出腹腔，用无菌湿纱布包裹，并以无菌塑料袋覆盖以更好地保温。
- 在左右腹壁褶皱处放置拉钩或夹子，以撑开腹膜肌肉并保持腹腔开放，从而获得对子宫及附属血管的最佳通路和视野。使用胶带固定夹子/拉钩。
- 使用预热的生理盐水润湿手术区域和肠道，以保持湿润，防止内脏干燥。
- 切除子宫，并分离和游离阴道上三分之一与直肠及膀胱之间的组织。
- 电凝子宫、宫颈及阴道周围的微血管。在靠近器官的位置切断并分离子宫，以保护子宫左侧的微循环。
- 去除周围脂肪组织。
- 通过电灼切除左侧子宫角。在右侧，保留7-8 mm的子宫上段组织，用于后续与子宫移植物进行吻合。
- 进行子宫移植。
- 从子宫血管起始处至腹主动脉/下腔静脉分叉处，游离并分离右侧髂总血管。
- 将移植物置于腹腔内。用浸有冷器官保存液的纱布包裹移植物。
注意：吻合过程中需要保持移植物低温。 - 在右侧髂总静脉的未来吻合口两侧放置无创血管夹，以框定吻合部位。
注意：将麻醉剂浓度降低至 1-1.5 vol% 异氟烷，以适应因心脏前负荷突然减少所导致的低血压。 - 在髂总静脉上切开一个略大于移植物静脉开口的切口。
- 放置移植物静脉。
- 放置一根固定缝线（10/0 聚酰胺；参见 材料表)至右侧髂总静脉切口的每个角。
注意：将缝合结置于尾侧角并保持松散，以便更好地调整，并防止产生荷包样效应。 - 手术过程中定期用冷却的RHX冲洗吻合区域，以防止血栓形成。
- 用连续缝合线以6到8个环路将移植物的一侧静脉与受体的静脉吻合图1).
注意：从颅侧固定缝线（10/0 聚酰胺）开始，首先吻合血管的流入段。 - 以相同方式吻合血管的另一侧，此次从外侧开始。
- 在完成双侧吻合后，依次在头侧固定缝线和尾侧固定缝线（10/0 聚酰胺）打结。
注意：连续缝合时仅需收紧至防止抽袋效应即可。 - 将无创血管夹置于右侧髂总动脉两侧，以夹住即将进行吻合的部位。
- 进行动脉吻合（右髂总动脉 [RCIA]） 通过 使用间断缝合（10/0聚酰胺）缝合8-10针。
注意：间断缝合比连续缝合更容易控制（可选） "鱼口状" 技术18手术过程中持续用冷却的RHX冲洗吻合区域有助于预防血栓形成。使用连续缝合时，此步骤参照静脉吻合的方法进行。
- 进行移植物再灌注。
- 当两个吻合部位均显示通畅且所有出血均已停止时，松开移植血管上的血管夹（图2).
- 检查移植物是否有再灌注迹象，例如颜色变红、静脉充盈或移植物动脉搏动。
- 使用6至7个腔内（6/0聚乳酸羟基乙酸）间断缝合线将移植子宫的阴道残端与受体的阴道穹窿连接。
注意：首先在12点钟位置放置单个缝线，然后在10点和1点钟位置放置下一根缝线。前排缝线完成后，再打结9点和3点钟位置的两根缝线19,20. - 使用5至7针间断缝合（7/0聚酰胺），将移植子宫角与受体子宫残存的头侧子宫段行端对端吻合。
注意：不要穿过管腔进行缝合。
- 用连续缝合关闭腹腔。肌层使用4/0聚乳酸羟基乙酸缝线缝合，皮肤使用6/0聚酰胺缝线或外科伤口夹闭合。
- 移植完成后，将动物置于加温的笼中使其恢复。在动物恢复胸卧位能力前需持续看护，并在完全恢复前保持单笼饲养。通过皮下注射给予术后镇痛治疗。 给予布托啡诺（0.05 mg/kg）和适当的非甾体抗炎药（NSAID），但须在首次麻醉给药后4-8小时之内避免使用。提供持续的 术后通过饮水给予布托啡诺（1 mg/kg，口服，160 mL 饮用水中加入 5 mL 布托啡诺（0.3 mg/mL）），持续三天。
- 皮肤 缝线于术后10-14天拆除 手术
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结果
展示了两组大鼠的实验结果。在方案调整前（第1组，n = 8）和调整后（第2组，n = 8）分别进行了UTx手术（表1），以展示我们所做修改的效果（有关修改内容的解释，请参见讨论部分）12,15,21。
大鼠子宫移植（UTx）的结果与三个关键阶段相关。第一阶段是成功从子宫移植手术中恢复，通常受体应在术后前两天内恢复。第二阶段涉及术后2周移植物的健康状况，该状况决定是否进入交配流程（表2）。第三阶段包括自然交配以及成功分娩，作为生育能力的证据。
两组动物术后均恢复顺利。在第二阶段，第一组有4只动物被排除，第二组有2只动物被排除。排除原因为再次剖腹探查时发现移植物血栓形成和脓肿（第一组n=4，第二组n=2），以及子宫-子宫吻合口狭窄或畸形（另见第一...
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讨论
本文提供的实验方案详细介绍了大鼠子宫移植手术的外科操作方法。该方案经过优化，旨在提高子宫移植（UTx）及后续交配后活产仔鼠的概率。本方案最初借鉴自Brännström团队12,13，并受到Akouri等人10在小鼠研究工作的启发，结合作者近年来的实践经验进行了改进。因此，这些改进源于实际经验的积累，反映了从移植失败到实现可重复结果的技术发展历程。
可能起决定性作用的关键改进包括：（1）在器官获取和吻合过程中，将赛拉嗪加入灌注液，以促进血管扩张，从而降低血栓形成的风险。（2）采用间断缝合法进行动脉端侧吻合。间断缝合不仅可提高对血管通畅性的手术控制，避免荷包缝合效应，还可便于后续扩大吻合区域，增加子宫动脉的血流量。（3）子宫角吻合采用间断且不可吸收缝线，且缝合仅限于浆膜层；该改进可防止子宫壁狭窄，避免影响后续受精。（4）阴道吻合使用可吸收缝合材料，可降低阴道狭窄风险，从而提高活产几率。（5）所有外科操作应尽可能远离阴道和宫...
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披露
作者声明不存在任何竞争利益。
致谢
本研究由瑞士国家科学基金会（项目资助编号 310030_192736）资助。我们感谢苏黎世大学兽医病理学研究所的 Dr. Frauke Seehusen 在组织病理学方面提供的支持。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 5 mm 角度转向侧向剪刀 | F.S.T | 15008-08 | |
| 大号回形针 | 无特定要求 | 用作牵开器 | |
| 钝弯针 G30 | Unimed S.A. | ||
| 布比卡因 0.5% | Sintetica | ||
| 布托啡诺 0.3 mg/mL | 丁丙诺啡 | ||
| Dosiernadel G25 | H.SIGRIST&和 PARTNER AG | ||
| Dumont #5SF 镊子 | F.S.T | 11252-00 | |
| Ethilon 10/0 | Ethicon | 2810G | |
| Ethilon 6/0 | Ethicon | 667H | |
| Ethilon 7/0 | Ethicon | EH7446H | |
| Ethilon 8/0 | Ethicon | 2808G | |
| 雌性Brown Norway大鼠（150–170 g） | 一月 | ||
| 雌性Lewis大鼠（150-170 g） | 查尔斯河德国分公司 | ||
| 精细剪刀 - 锐利 | F.S.T | 14060-09 | 其他任何小型剪刀也可使用 |
| 哈尔西显微持针器 | F.S.T | 12500-12 | 其他任何小型持针器也可使用 |
| 肝素钠 25000 IU/5 mL | B. Braun | ||
| Institute Georges Lopez 灌注液 (IGL) | 乔治·洛佩兹研究所 | 器官保存液 | |
| 雄性Lewis大鼠（300-320 g） | 查尔斯河德国分公司 | ||
| 微型Serrefines 13 mm | F.S.T | 18055-04 | |
| Micro Serrefines 16 mm 弯型 | F.S.T | 18055-06 | |
| 带锁止装置的微型Serrefine钳夹施加器 | F.S.T | 18056-14 | |
| Mölnlyncke Op Towel | Mölnlyncke | 800300 | 无菌铺巾 |
| NaCl 0.9% | B.Braun | ||
| Octenisept | Schülke | ||
| 纸质胶带 | Tesa | 用于固定动物 | |
| 飞利浦新安怡快速奶瓶ärmer SCF358/02 | 飞利浦 | 12824216 | |
| 林格氏液 | B.Braun | ||
| Rompun 2% | 拜耳 | 赛拉嗪 | |
| 圆柄持针钳 | F.S.T | 12075-12 | |
| 圆柄持针钳 | F.S.T | 12075-12 | |
| S&T 血管扩张钳 - 45° 角度° | F.S.T | 00276-13 | |
| Sacryl Naht | KRUUSE | 152575 | |
| 10号手术刀 | Swann Morton | 201 | |
| 小型组织容器 | 任何小型组织储存容器均可用于移植物的冷藏 | ||
| 小型塑料袋 | 任何透明塑料袋均可 | ||
| 无菌棉签 | Lohmann-Rauscher | 任何无菌棉签均可 | |
| 无菌纱布 | Lohmann-Rauscher | 任何无菌纱布均可 | |
| 直剪 8mm | F.S.T | 15024-10 | |
| 手术显微镜 – SZX9 | Olympus | OLY-SZX9-B | |
| Sutter 防粘连 GLISS 0.4 mm | Sutter | 78 01 69 SLS | |
| 缝合打结钳 | F.S.T | 00272-13 | |
| ThermoLux 加热垫 | ThermoLux | ||
| 皮肤组织镊 | 任何组织镊均可 | ||
| 血管扩张钳 | F.S.T | 00125-11 | |
| Vicryl 4/0加号 | Ethicon | VCP292H |
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