通过多转染技术快速构建细胞状态识别回路

摘要

复杂的基因回路设计、测试和优化耗时较长。为了促进这一过程，可通过转染哺乳动物细胞，使单个孔内即可测试回路组分的多种化学计量比。本方案概述了实验规划、转染及数据分析的各个步骤。

摘要

哺乳动物基因线路已展现出感知和治疗多种疾病状态的潜力，但优化线路组分的表达水平仍具有挑战性且耗时耗力。为加速这一过程，本实验室开发了多转染技术（poly-transfection），这是传统哺乳动物转染方法的一种高通量扩展。在多转染中，转染群体中的每个细胞实质上都在执行不同的实验，通过测试不同DNA拷贝数下线路的行为，使用户能够在单一体系反应中分析大量不同的化学计量比。迄今为止，已实现在单个细胞孔中优化三组分线路的比例；原则上，该方法也可用于构建更复杂的基因线路。多转染的结果可直接应用于寻找瞬时表达线路中共转染DNA的最佳比例，或用于选择稳定细胞系中各线路组分的表达水平。

在此，我们演示了如何利用多组分转染（poly-transfection）来优化一个三组分基因线路。本实验方案首先介绍实验设计的基本原则，并阐述多组分转染如何在 传统共转染方法的基础上进行改进。接着，对细胞进行多组分转染操作，并在数天后进行流式细胞术检测。最后，通过分析单细胞流式细胞术数据中对应于特定组分比例细胞亚群的切片来完成数据分析。在实验室中，多组分转染已被用于优化细胞分类器、反馈与前馈控制器、双稳态模体以及其他多种系统。这一简单而强大的方法显著加快了哺乳动物细胞中复杂基因线路的设计周期。

引言

哺乳动物合成生物学领域已迅速发展，从在培养的细胞系中开发简单的感知-响应元件，到优化复杂的基因网络以应对诊断和治疗中的实际挑战¹。这些复杂的基因回路能够感知来自微小RNA谱、细胞因子乃至小分子药物的生物输入信号，并实现包括晶体管、带通滤波器、双稳态开关和振荡器在内的逻辑处理功能。这些回路在癌症、关节炎、糖尿病等多种疾病的动物模型中也已展现出令人鼓舞的效果^1,2,3,4,5。然而，随着回路复杂性的增加，优化其各个组分表达水平的难度也日益加大。

一种特别有用的基因回路类型是细胞分类器，它可以被编程以感知并响应特定的细胞状态。在特定细胞状态下选择性地产生蛋白质或RNA输出，是指导和编程细胞及类器官分化、识别并清除病变细胞和/或不良细胞类型，以及调控治疗性细胞功能的强大工具^1,2,3,

方案

注意：表1 和 表2 是本实验方案的重要参考。表1 显示了反应中试剂的缩放比例，表2 显示了本方案中所述多质粒共转染示例（上半部分）以及可能的后续实验（下半部分）的DNA比例计算方法。

1. 转染前细胞的准备

1. 在开始实验方案前，确保人胚胎肾（HEK293）细胞培养物融合度达到60%–80%。为此，于2天前在100 mm × 15 mm的组织培养培养皿中接种1 × 10⁶个细胞，并在37 °C、5% CO₂条件下孵育。
   注意： 尽管本方案以HEK293细胞为重点，但也可替换为其他类型的细胞。
2. 按以下说明准备用于转染的培养基和细胞。
   1. 将至少20 mL含10%胎牛血清（FBS）和1%非必需氨基酸（NEAA；参见材料表）的杜氏改良伊格尔培养基（DMEM）预热至37 °C。同时将至少2.4 mL胰蛋白酶和2.4 mL磷酸盐缓冲液（PBS）预热至37 °C。将低血清培养基预热至约16 °C。
      注意：所有组织培养操作均应在生物安全柜中谨慎进行。
3. 按以下说明用DMEM溶液重悬细胞。
   ....

结果

在图1中，我们比较了共转染与多转染。在共转染中，所有质粒被包含在同一转染混合物中递送，导致单个细胞接收到的每种质粒的量之间具有高度相关性（图1A）。尽管递送到每个细胞的总质粒数量存在显著差异，但群体中各个细胞内两种报告蛋白的荧光信号高度相关，表明这两种质粒以相对恒定的比例共同递送。转染细胞可能摄取较少或较多的转染复合物，但由于每个复合物中各质粒的含量呈相关关系，共转染仅在两种质粒的浓度空间中探索了一条狭窄的对角区域。相比之下，在多转染中，质粒被分配到多个不同的转染复合物中递送，导致不同转染混合物中的质粒递送相互去相关（图1B）。转染细胞摄取不同组合的复合物，从而产生包含不同剂量质粒的细胞，这些细胞可能不含任何复合物、仅含一种复合物，或同时含有两种复合物。

图2 展示了一个典型的多转染实验流程。通常，一个多转染实验包括以下步骤：明确问题、.......

讨论

计算机辅助设计（CAD）、原型电路板搭建和3D打印等快速原型技术已彻底改变了机械、电气和土木工程领域。能够快速筛选针对特定挑战的多种可能解决方案，极大地加快了各领域的进步。我们认为，多转染（poly-transfection）是一种类似的生物工程技术，可实现遗传回路的快速原型构建。此外，其他快速原型技术通常需要手动依次迭代多个可能方案，而多转染则能够同时探索多种解决方案。多转染技术可在单个孔中测试大量不同比例的遗传回路组件组合，并已被用于优化多个已发表的遗传回路^10,11,13。该实验方案是对标准共转染（co-transfection）方法的简单扩展，因此可被众多哺乳动物细胞研究人员轻松采用。通常情况下，多转染与共转染的结果具有高度一致性¹⁰（示例见图4）。因此，在大多数需要在共转染混合物中滴定质粒比例并以单细胞水平测量输出的实验场景中，均可使用.......

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
15 mL Corning Falcon 圆锥形离心管	ThermoFisher Scientific	14-959-53A
24 孔培养皿	任选公司		（无热原、无菌、无 RNase、无 DNase、无 DNA、无热原）
牛血清白蛋白	NEB	B9000S
离心机	任选公司		能够对 15 mL Falcon 管施加 300 rcf 的离心力
Countess 3 自动细胞计数仪	ThermoFisher Scientific	AMQAX2000
Countess 细胞计数板载玻片	ThermoFisher Scientific	C10228
Cytoflow	非商业软件包		https://cytoflow.readthedocs.io/en/stable/#
DMEM	VWR	10-013-CV	使用适合您细胞类型的培养基
EDTA	ThermoFisher Scientific	03690-100ML
胎牛血清	Sigma Aldrich	F4135
HEK 细胞	ATCC	CRL-1573	使用与实验相关的细胞类型。HEK 细胞通常转染效率很高。
HeLa 细胞	ATCC	CRL-12401	使用与实验相关的细胞类型。
Lipofectamine 3000 及 P3000 增强剂	ThermoFisher Scientific	L3000001	使用适合您细胞类型的正确试剂；转染试剂及增强剂
LSRFortessa 流式细胞仪	BD Biosciences	N/A
MEM 非必需氨基酸溶液	Gibco	11140050
微量离心管，1.5 mL	任选公司
Opti-MEM	ThermoFisher Scientific	31985070	低血清培养基
磷酸盐缓冲液	ThermoFisher Scientific	70011044
Rainbow 校准微球	Spherotech	URCP-100-2H
叠氮化钠	Sigma Aldrich	S2002
胰蛋白酶	VWR	25-053-CI