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方法文章

通过多转染技术快速构建细胞状态识别回路

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⸱

DOI：

10.3791/64793

⸱

2023年2月24日

 ,  ,  , 
1Department of Biological Engineering, Massachusetts Institute of Technology, 2School of Biological Engineering, University of British Columbia, 3Department of Electrical Engineering and Computer Science, Massachusetts Institute of Technology

本文内容

摘要

复杂的基因回路设计、测试和优化耗时较长。为了促进这一过程，可通过转染哺乳动物细胞，使单个孔内即可测试回路组分的多种化学计量比。本方案概述了实验规划、转染及数据分析的各个步骤。

摘要

哺乳动物基因线路已展现出感知和治疗多种疾病状态的潜力，但优化线路组分的表达水平仍具有挑战性且耗时耗力。为加速这一过程，本实验室开发了多转染技术（poly-transfection），这是传统哺乳动物转染方法的一种高通量扩展。在多转染中，转染群体中的每个细胞实质上都在执行不同的实验，通过测试不同DNA拷贝数下线路的行为，使用户能够在单一体系反应中分析大量不同的化学计量比。迄今为止，已实现在单个细胞孔中优化三组分线路的比例；原则上，该方法也可用于构建更复杂的基因线路。多转染的结果可直接应用于寻找瞬时表达线路中共转染DNA的最佳比例，或用于选择稳定细胞系中各线路组分的表达水平。

在此，我们演示了如何利用多组分转染（poly-transfection）来优化一个三组分基因线路。本实验方案首先介绍实验设计的基本原则，并阐述多组分转染如何在 传统共转染方法的基础上进行改进。接着，对细胞进行多组分转染操作，并在数天后进行流式细胞术检测。最后，通过分析单细胞流式细胞术数据中对应于特定组分比例细胞亚群的切片来完成数据分析。在实验室中，多组分转染已被用于优化细胞分类器、反馈与前馈控制器、双稳态模体以及其他多种系统。这一简单而强大的方法显著加快了哺乳动物细胞中复杂基因线路的设计周期。

引言

哺乳动物合成生物学领域已迅速发展，从在培养的细胞系中开发简单的感知-响应元件，到优化复杂的基因网络以应对诊断和治疗中的实际挑战1。这些复杂的基因回路能够感知来自微小RNA谱、细胞因子乃至小分子药物的生物输入信号，并实现包括晶体管、带通滤波器、双稳态开关和振荡器在内的逻辑处理功能。这些回路在癌症、关节炎、糖尿病等多种疾病的动物模型中也已展现出令人鼓舞的效果1,2,3,4,5。然而，随着回路复杂性的增加，优化其各个组分表达水平的难度也日益加大。

一种特别有用的基因回路类型是细胞分类器，它可以被编程以感知并响应特定的细胞状态。在特定细胞状态下选择性地产生蛋白质或RNA输出，是指导和编程细胞及类器官分化、识别并清除病变细胞和/或不良细胞类型，以及调控治疗性细胞功能的强大工具1,2,3,4,5。然而，构建能够在哺乳动物细胞中准确识别多种细胞RNA和/或蛋白质种类所定义的细胞状态的基因回路，仍面临巨大挑战。

在构建细胞分类回路的过程中，最耗时的步骤之一是优化回路中各个组分基因（如传感器和处理因子）之间的相对表达水平。为了加快回路优化速度，并实现更复杂回路的构建，近期研究采用了对细胞分类回路及其组分的数学建模方法，以预测最优的组分组合和拓扑结构6,7。尽管该方法迄今已展现出强大的效果，但数学分析受限于必须系统表征回路中各组分基因的输入-输出行为，而这一过程十分耗时。此外，在复杂的基因回路中可能会出现大量依赖于上下文的问题，导致整个回路的行为无法通过单个元件的表征结果进行准确预测8,9。

为了更快速地开发和测试复杂的哺乳动物细胞回路（例如细胞状态分类器），我们实验室开发了一种称为多重复转染（poly-transfection）10 的技术，该技术是对质粒共转染（co-transfection）方案的进一步发展。在共转染中，多种质粒DNA分子与带正电荷的脂质或聚合物试剂共同形成复合物，并以相关联的方式递送至细胞（图1A）。而在多重复转染中，各个质粒分别与试剂形成独立的复合物，从而使每种转染复合物中的DNA以非关联的方式递送至细胞（图1B）。利用该方法，转染群体中的细胞会暴露于携带不同回路元件的两种或多种DNA负载物的大量比例组合之中。

为了测量递送至每个细胞的回路组分比例，多重组转染复合物中包含一个组成型表达的荧光报告基因，用以指示细胞对复合物的摄取情况。通过使用在哺乳动物细胞内无任何活性元件的填充DNA，可调节单个转染复合物中荧光报告基因与回路组分的相对递送量，填充DNA的具体作用将在讨论部分进一步阐述。Weiss实验室所用填充DNA的一个实例是含有终止子序列但不含启动子、编码序列等其他元件的质粒。通过比较含有不同回路组分比例的细胞，可确定实现基因回路功能的最佳比例。这进而为在将回路组分整合至单一载体（如慢病毒、转座子或着陆平台）进行遗传整合时，选择启动子及其他回路元件以实现最佳基因表达水平提供有价值的预测依据。因此，该方法避免了仅依赖直觉或 通过 一种耗时的试错过程，多转染技术可在单一体系反应中评估遗传元件间的多种化学计量比。

在我们的实验室中，多质粒转染技术已成功用于优化多种基因线路，包括细胞分类器、反馈与前馈控制器以及双稳态基序。这种简单而强大的方法显著加快了哺乳动物细胞中复杂基因线路的设计周期。此后，多质粒转染已被用于表征多个基因线路，以高分辨率揭示其多维的输入-输出传递函数10，优化用于细胞状态分类的替代电路拓扑结构11，并加速了多项已发表12,13及正在进行的研究项目。

本文描述并图示了利用多转染技术快速优化基因线路的工作流程（图2）。该方案展示了如何生成高质量的多转染数据，并避免多转染实验流程及数据分析中的若干常见错误（图3）。随后，本文演示了如何利用多转染技术表征简单的电路元件，并在此过程中将多转染结果与共转染结果进行对比评估（图4）。最后，多转染实验结果展示了对癌症分类器线路的优化效果（图5）。

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方案

注意：表1 和 表2 是本实验方案的重要参考。表1 显示了反应中试剂的缩放比例，表2 显示了本方案中所述多质粒共转染示例（上半部分）以及可能的后续实验（下半部分）的DNA比例计算方法。

1. 转染前细胞的准备

  1. 在开始实验方案前，确保人胚胎肾（HEK293）细胞培养物融合度达到60%–80%。为此，于2天前在100 mm × 15 mm的组织培养培养皿中接种1 × 106个细胞，并在37 °C、5% CO2条件下孵育。
    注意： 尽管本方案以HEK293细胞为重点，但也可替换为其他类型的细胞。
  2. 按以下说明准备用于转染的培养基和细胞。
    1. 将至少20 mL含10%胎牛血清（FBS）和1%非必需氨基酸（NEAA；参见材料表）的杜氏改良伊格尔培养基（DMEM）预热至37 °C。同时将至少2.4 mL胰蛋白酶和2.4 mL磷酸盐缓冲液（PBS）预热至37 °C。将低血清培养基预热至约16 °C。
      注意：所有组织培养操作均应在生物安全柜中谨慎进行。
  3. 按以下说明用DMEM溶液重悬细胞。
    1. 吸除并弃去现有培养基。向HEK293细胞培养物中加入2 mL PBS以洗涤细胞。随后吸除并弃去PBS。
    2. 向HEK293细胞培养物中加入2 mL胰蛋白酶。将培养皿置于37 °C孵育箱中孵育3分钟，或直至细胞不再贴壁。将培养皿移回生物安全柜，并通过向培养皿中加入8 mL DMEM溶液稀释细胞悬液。
    3. 通过轻柔吹打数次混匀溶液。吸出全部培养基并转移至15 mL锥形管中。
  4. 以300 × g离心3分钟使细胞沉淀。小心吸除上清液（避免吸出细胞），弃去。用5 mL DMEM溶液重悬细胞，通过轻柔吹打混匀。
  5. 使用自动细胞计数仪（见材料表）估算 当前细胞浓度。在此示例中，向24孔板中接种六个孔，每孔接种1 × 105个细胞（接种密度为50,000个细胞/cm2）。
  6. 先向各孔加入DMEM溶液至总体积达500 µL（先向孔中加入DMEM溶液），然后将每种处理对应的孔分别标记为：无荧光对照、mKO2对照、TagBFP对照、NeonGreen对照、全荧光对照和多转染1。 TagBFP、mKO2和NeonGreen对照孔为多转染中所包含的所有荧光蛋白的单色对照。

2. 进行转染

  1. 为每种DNA聚集体准备离心管。准备若干1.5 mL微量离心管，并标记为：无荧光对照、mKO2对照、TagBFP对照、NeonGreen对照、全荧光对照、多转染混合液1和多转染混合液2。
    1. 向无荧光对照、mKO2对照、TagBFP对照、NeonGreen对照以及全荧光对照管中各加入36 µL低血清培养基。向多转染混合液1和多转染混合液2管中各加入18 µL低血清培养基。
      注：质粒浓度假设为150 ng/µL。
    2. 向无荧光对照管中加入600 ng填充质粒。向mKO2荧光对照管中加入300 ng mKO2和300 ng填充质粒。向TagBFP荧光对照管中加入300 ng TagBFP和300 ng填充质粒。
    3. 向NeonGreen荧光对照管中加入300 ng组成型表达NeonGreen质粒和300 ng填充质粒。向全荧光对照管中加入mKO2、TagBFP和组成型表达NeonGreen质粒各100 ng，以及300 ng填充质粒。
    4. 向多转染混合液1管中加入150 ng mKO2。向多转染混合液1管中加入75 ng报告基因NeonGreen质粒和75 ng填充质粒。
    5. 向多转染混合液2管中加入150 ng TagBFP。向多转染混合液2管中加入75 ng L7ae质粒和75 ng填充质粒。
  2. 在1.5 mL微量离心管中配制转染主混合液，将216 µL低血清培养基与9.48 µL转染试剂混合（试剂比例和反应体系缩放参见表1）。通过反复吹打充分混匀，置于一旁备用。
  3. 向无荧光对照、单荧光对照和全荧光对照管中各加入1.58 µL增强试剂。向每个多转染混合液管中加入79 µL增强试剂。每管单独剧烈吹打混匀。
  4. 将转染主混合液加入各含DNA的离心管中。
    1. 向无荧光对照、单荧光对照和全荧光对照管中各加入37.58 µL转染主混合液。每管单独剧烈吹打混匀。
    2. 向每个多转染混合液管中各加入18.79 µL转染主混合液。每管单独剧烈吹打混匀。
  5. 将转染混合液分配至各孔中。
    1. 将无荧光、单荧光和全荧光对照的转染混合液各65.97 µL移入相应孔中。
    2. 将32.98 µL多转染混合液1加入多转染孔中，并在平面上快速而轻柔地以紧密的“8”字形旋转培养板，以有效分散复合物。随后，将32.98 µL多转染混合液2加入同一多转染孔中，并以相同方式旋转培养板。
  6. 将培养板置于37 °C、5% CO2条件下孵育48小时，避免振荡。
    注：为提高细胞存活率，可在转染后每6小时更换一次培养基（但并非总是必要；对于HEK293细胞及其衍生细胞系，更换培养基时需小心避免细胞从培养板上脱落）。
试剂用量比例换算
DNA混合用低血清培养基每对照管36 μL，每多转染管18 μL 每管0.05 μL低血清培养基/ng DNA，并额外增加10-20%体积以补偿移液损耗
DNA每管300-600 ng
P3000每对照管1.58 μL，每多转染管0.79 μL每管0.0022 μL P3000/ng DNA，额外增加10-20%
脂质体主混合液用低血清培养基每对照管36 μL，每多转染管18 μL每管总DNA使用0.05 μL低血清培养基/ng，额外增加10-20%体积以补偿移液损耗
转染与增强试剂每对照管1.58 μL，每多转染管0.79 μL每管0.0022 μL Lipofectamine 3000/ng DNA，额外增加10-20%

表1： 转染试剂用量比例。 本表列出了针对单孔中所用DNA量所需的正确试剂比例。可用于有效放大反应体系并配制总反应混合液。试剂用量已按20%过量进行调整。

3. 流式细胞术的细胞准备

  1. 将至少 4.2 mL 的 DMEM 溶液预热至 37 °C。将至少 4.2 mL 的胰蛋白酶和 4.2 mL 的 PBS 预热至 37 °C。FACS 缓冲液（荧光激活细胞分选缓冲液）在使用前保持在 4 °C。
  2. 按照以下步骤，将细胞重悬于 FACS 缓冲液（PBS 添加 1% BSA、5 mM 乙二胺四乙酸 [EDTA] 和 0.1% 叠氮化钠 [NaN3]，以减少细胞聚集；参见 材料表）中。
    1. 吸除并弃去每个孔中的现有培养基。向每个孔中加入 5 mL PBS 以洗涤细胞。吸除并弃去 PBS。
    2. 向每个孔中加入 5 mL 胰蛋白酶。将培养板置于 37 °C 培养箱中孵育 3 分钟，或直至细胞不再贴壁。将培养板移回生物安全柜中，并向每个孔中加入 5 mL DMEM 溶液以稀释细胞悬液。
    3. 对每个孔，通过轻柔吹打数次混匀溶液。将每个孔中的全部培养基吸出，转移至 15 mL 圆锥形离心管中。
  3. 以 300 × g 离心 3 分钟，使细胞沉淀。小心吸除上清液（避免吸出细胞），弃去。每管中加入 5 mL FACS 缓冲液，通过轻柔吹打重悬细胞并混匀。
  4. 将每份细胞悬液通过滤网过滤（以去除团块），分别收集至流式细胞术专用圆锥形离心管中。将这些管置于冰上，存放时间不超过 1 小时，并尽快进行流式细胞术分析。

4. 进行流式细胞术

注意：操作流式细胞仪需要经过适当的培训并掌握必要的操作知识。由于软件和设备可能有所不同，用户应接受一般性培训，本节介绍的是执行过程中有用的具体操作步骤。

  1. 首先，观察转染了填充质粒对照（无颜色对照）的细胞，以筛选出具有代表性的细胞特征并排除异常情况（包括细胞聚集体、碎片等）。尽管存在多种参数组合可用于区分细胞，以下三种通用选项可有效呈现细胞的鉴别特征。
    1. 观察侧向散射面积（根据偏好或细胞类型选择对数或线性刻度）与前向散射面积（线性刻度）的关系。
    2. 观察侧向散射高度（对数尺度）与侧向散射宽度（线性尺度）的关系。
    3. 观察前向散射宽度（线性刻度）与前向散射高度（线性刻度）的关系。
  2. 接下来，观察单色对照。使用全色对照调节仪器电压，使每种荧光蛋白的信号均一化至等效的任意荧光单位（a.u.）。随后，运行每种荧光蛋白的单色对照，用于设定补偿矩阵，以实现荧光渗漏校正。
    注意：理想情况下，应能清晰显示荧光值的完整动态范围。可对荧光蛋白信号进行进一步归一化处理 通过 转换为标准化单位（例如，荧光素分子当量 [MEFLs；参见 Beal 等人]15]). 为在分析过程中实现MEFL转换，需运行rainbow校准微球。此类校准还有助于减少仪器间及每日之间的信号变异。16.
  3. 运行多转染样品管。
    注意：在条件允许的情况下，建议使用 1,000 × 10^ (^ = 混合) 个细胞进行实验，因为高维度的多转染在分析时需要划分为更多的分组，而每个分组都需要足够数量的细胞（理想情况下 >10）以进行具有统计学意义的比较。

5. 进行实验后分析

  1. 首先，利用对照组（以及适用情况下的微珠）数据以确保结果的准确性。使用一种可用的软件工具进行活细胞设门（采用上述定义的设门策略）、补偿调节和自发荧光校正。
    注意：我们通常使用自定义的 MATLAB 代码（例如 https://github.com/jonesr18/MATLAB_Flow_Analysis）或 Cytoflow17，这些工具均具备图形用户界面和适用于预处理阶段及多转染分析的 Python 库。
方法复合物荧光标记物（ng）L7ae（ng，比例）报告基因（ng，比例）填充DNA（ng，比例）总量（ng）
多重复合转染 1600
→115075（½）75（½）300
→215075（½）75（½）300
多重复合转染 2600
→115025（1/6）125（5/6）300
→2150125（5/6）25（1/6）300

表2： 本方案中展示的多质粒共转染所用DNA量，以及一个调整质粒比例的后续实验示例。 表格上半部分显示了简单多质粒共转染实验中所用质粒的组成。下半部分显示了一个优化实验的组成，该实验调整了质粒比例，以更好地对假定的浓度空间进行子采样，其中基因表达调节因子相对于其报告基因的比例更优化为1:5，从而获得更多的转染细胞用于该比例附近的采样分析。

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结果

在图1中，我们比较了共转染与多转染。在共转染中，所有质粒被包含在同一转染混合物中递送，导致单个细胞接收到的每种质粒的量之间具有高度相关性（图1A）。尽管递送到每个细胞的总质粒数量存在显著差异，但群体中各个细胞内两种报告蛋白的荧光信号高度相关，表明这两种质粒以相对恒定的比例共同递送。转染细胞可能摄取较少或较多的转染复合物，但由于每个复合物中各质粒的含量呈相关关系，共转染仅在两种质粒的浓度空间中探索了一条狭窄的对角区域。相比之下，在多转染中，质粒被分配到多个不同的转染复合物中递送，导致不同转染混合物中的质粒递送相互去相关（图1B）。转染细胞摄取不同组合的复合物，从而产生包含不同剂量质粒的细胞，这些细胞可能不含任何复合物、仅含一种复合物，或同时含有两种复合物。

图2 展示了一个典型的多转染实验流程。通常，一个多转染实验包括以下步骤：明确问题、...

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讨论

计算机辅助设计（CAD）、原型电路板搭建和3D打印等快速原型技术已彻底改变了机械、电气和土木工程领域。能够快速筛选针对特定挑战的多种可能解决方案，极大地加快了各领域的进步。我们认为，多转染（poly-transfection）是一种类似的生物工程技术，可实现遗传回路的快速原型构建。此外，其他快速原型技术通常需要手动依次迭代多个可能方案，而多转染则能够同时探索多种解决方案。多转染技术可在单个孔中测试大量不同比例的遗传回路组件组合，并已被用于优化多个已发表的遗传回路10,11,13。该实验方案是对标准共转染（co-transfection）方法的简单扩展，因此可被众多哺乳动物细胞研究人员轻松采用。通常情况下，多转染与共转染的结果具有高度一致性10（示例见图4）。因此，在大多数需要在共转染混合物中滴定质粒比例并以单细胞水平测量输出的实验场景中，均可使用...

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披露

R.W. 是 Strand Therapeutics 和 Replay Bio 的联合创始人；R.W. 与 R.J. 提交了一项与细胞类型分类器相关的临时专利。

致谢

我们感谢曾领导或参与开发多转染方法及其在细胞分类器中应用的Weiss实验室前成员：Jeremy Gam、Bre DiAndreth和Jin Huh；感谢其他Weiss实验室成员在方法进一步开发与优化方面的贡献：Wenlong Xu、Lei Wang和Christian Cuba-Samaniego；感谢Josh Leonard教授及其团队成员，包括Patrick Donahue和Hailey Edelstein，对多转染方法进行测试并提供反馈；感谢Nika Shakiba教授邀请撰写本文并提供宝贵意见。我们还要感谢美国国立卫生研究院[R01CA173712、R01CA207029、P50GM098792]、美国国家科学基金会[1745645]、美国国家癌症研究所癌症中心支持（核心）基金[P30CCA14051，部分资助]以及美国国立卫生研究院[P50GM098792]对本研究的资助。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
15 mL Corning Falcon 圆锥形离心管ThermoFisher Scientific14-959-53A
24 孔培养皿任选公司（无热原、无菌、无 RNase、无 DNase、无 DNA、无热原）
牛血清白蛋白NEBB9000S
离心机任选公司能够对 15 mL Falcon 管施加 300 rcf 的离心力
Countess 3 自动细胞计数仪ThermoFisher ScientificAMQAX2000
Countess 细胞计数板载玻片ThermoFisher ScientificC10228
Cytoflow非商业软件包https://cytoflow.readthedocs.io/en/stable/# 
DMEMVWR10-013-CV使用适合您细胞类型的培养基
EDTA ThermoFisher Scientific03690-100ML
胎牛血清Sigma AldrichF4135
HEK 细胞ATCCCRL-1573使用与实验相关的细胞类型。HEK 细胞通常转染效率很高。
HeLa 细胞ATCCCRL-12401使用与实验相关的细胞类型。
Lipofectamine 3000 及 P3000 增强剂ThermoFisher ScientificL3000001使用适合您细胞类型的正确试剂；转染试剂及增强剂
LSRFortessa 流式细胞仪BD BiosciencesN/A
MEM 非必需氨基酸溶液Gibco11140050
微量离心管，1.5 mL任选公司
Opti-MEMThermoFisher Scientific31985070低血清培养基
磷酸盐缓冲液ThermoFisher Scientific70011044
Rainbow 校准微球SpherotechURCP-100-2H
叠氮化钠Sigma AldrichS2002
胰蛋白酶VWR25-053-CI

参考文献

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