在过去的十年中，人们对将相干拉曼显微镜（CRM）应用于细胞和组织成像的兴趣激增1,2。CRM 是一种功能强大的化学成像技术，具有两种流行的变体：相干反斯托克斯拉曼散射 （CARS） 显微镜和受激拉曼散射 （SRS） 显微镜。与 CARS 相比，SRS 越来越受欢迎，因为它受非拉曼背景干扰的影响较小，并且对浓度3 具有线性依赖性。CRM 获取的分子振动信息类似于拉曼光谱，但显着提高了采集速度4。这是通过一对具有高峰值强度的脉冲激光器进行相干振动激励来实现的。由于CRM以高空间和时间分辨率提供空间分辨的化学图谱，因此它在癌症诊断，脂质代谢，细胞代谢，药物运输等许多方面都有重要的应用5,6,7,8。然而，阻碍该技术广泛采用的一个主要瓶颈是其技术复杂性和缺乏标准化协议。尽管商业激光器和显微镜已经可用，但目前该领域使用的几乎所有系统都涉及激光、光学、显微镜和探测器的不同级别的定制，这为有兴趣进入该领域或采用该技术的研究人员设置了重大障碍。缺乏可及性进一步阻碍了生物应用。本方法集合的目的是提供有关仪器、新成像方法以及体外/体内细胞或组织成像应用的详细示例和指导。我们收录了该领域专家的七篇出版物，总结如下。
Clark等人在灵敏度、空间分辨率和光谱分辨率方面对高光谱SRS和CARS进行了并排比较9。这两种技术都是通过飞秒激光器的光谱聚焦来实现的，这是一种常用的方法，它使用光谱啁啾宽带飞秒激光器来实现窄带拉曼分辨率。通过直接比较，可以评估检测差异，并为不同的化学成像应用优化选择模式。
De la Cadena 等人发表了一种新的多路复用 SRS 方法，可以快速获取宽带 SRS 图像10。该技术基于定制的差分多通道锁相放大器检测，可同时检测多达 32 个通道。此外，还展示了详细的噪声表征，并演示了一种消除激光噪声的平衡检测方法。该协议为有兴趣构建多路复用SRS系统的用户提供了实用指导。
Shi等人展示了在SRS成像中使用高度多重拉曼染料11。通过预共振增强，他们证明 SRS 可以提供与标准免疫荧光相当的灵敏度。该方法规避了传统免疫荧光中光谱可分辨通道的限制，并允许同时监测许多蛋白质并研究它们的相互作用。提供了有关样品处理和拉曼染料染色的详细指导，以促进采用这种强大的方法。
Miao等人提出了肿胀组织的振动成像和分析（VISTA），这是一种将SRS与膨胀显微镜相结合的超分辨率成像技术12。VISTA 规避了与荧光成像相关的障碍，并在空间分辨率低至 78 nm 的生物样品中实现无标记的超分辨率体积成像。他们进一步利用深度学习算法来实现多组分分割，包括细胞和脑组织中的蛋白质聚集体。
Espinoza等人介绍了蛋白质和脂质的实时双色SRS成像在组织诊断应用中的应用13。双色 SRS 成像可以生成用于病理学应用的 H&E 等效图像。该协议描述了为同步双色SRS成像实现正交调制技术和光谱聚焦的细节。还用小鼠脑组织演示了双色 SRS 图像到伪 H&E 图像的转换，以说明组织诊断应用。
Yuan 等人发表了一种用于活细胞长期 SRS 成像的柔性腔室系统14.大多数现有的活细胞观察室都是为明场和荧光成像而设计的。由于需要高数值孔径物镜和聚光镜，它们与SRS检测不兼容。作者展示了使用柔性腔室进行 24 小时延时 SRS 成像，该室保持恒温、CO2 和湿度恒定。
最后，Wu等人同时展示了 体内 双光子荧光（TPEF）和SRS成像15。两个独立的激光系统相结合，为两种成像模式实现最佳灵敏度，以提供互补信息。 体内 组织的SRS成像具有独特的挑战，因为需要对去偏振、反向散射光进行外射检测。该协议讨论了TPEF-SRS显微镜的最佳设置的详细信息，以及如何将其用于小鼠脊髓的 体内 成像。
这套出版物代表了当前 CRM 工具和技术进步的最新技术。对方法开发和应用感兴趣的研究人员会发现，该集合有助于比较设置并建立基准（灵敏度、分辨率等），以构建或优化自己的系统。这些协议中提供的指南和最佳实践将为现有和未来的 体外 和 体内 应用提供信息。CRM 技术的大规模采用仍有待关键和创新应用以及完整 CRM 解决方案的商业化。尽管如此，成像方法和基准的标准化对于确保可重复性和可靠性以及促进 CRM16 的更广泛实施至关重要。
CRM 领域正在快速发展。推动灵敏度、特异性和分辨率极限的技术发展正在继续推动该技术进入新的领域。例如，SRS的空间分辨率开始超过衍射极限17,18。电子预共振 SRS 的灵敏度现在接近荧光19。与荧光相比，CRM 具有明显的优势。例如，氘示踪的使用首次允许在亚细胞分辨率下对小分子的代谢动力学进行体内研究20。使用小标签，可以对24个或更多标记的目标21进行高度多重拉曼检测。人工智能的进步通过利用其高信息含量和分子特异性特征来分割和分类具有细微空间和光谱特征差异的对象，从而为 CRM 提供了新功能22。共同，CRM 的这些技术进步有望加速和扩大生物和生物医学成像的应用。