修饰型自体富血小板血清的制备 离体 小鼠角膜上皮愈合潜能的评估

摘要

本文介绍了一种简化自体富集血清（autologous conditioned serum, ACS）制备流程并降低其成本的实验方案。该方法无需使用特殊注射器或表面包被的玻璃珠。此外，改良型ACS（mACS）在小鼠眼部角膜伤口愈合方面较传统自体血清具有竞争优势。 离体.

摘要

近年来，人源血液衍生的局部治疗手段为临床医生带来了显著益处。自体血清（AS）和富血小板血浆（PRP）富含对角膜伤口愈合至关重要的上皮趋向性生长因子。与AS不同，PRP基于差速离心系统制备，可获得更高浓度的血小板源性生长因子。自体条件化血清（ACS）不仅保留了AS和PRP的制备优势，还特别强调其免疫调节特性，这在炎症性疾病中具有重要意义。

缺乏标准化的操作流程以及高昂的制备成本，限制了自体条件血清（ACS）在临床中的应用。本视频实验展示了一种制备改良型自体条件血清（mACS）滴眼液的标准操作流程。首先，在肝素化注射器中加入甘油，作为低氧孵育期间的血细胞稳定剂。为激活血细胞，将血液样本在37 °C条件下孵育4小时。随后，将血液样本在室温下以3,500 × g 离心10分钟。上清液经0.22 µm滤膜过滤后，即完成mACS滴眼液的制备。

mACS治疗效果的初步试验表明，其在角膜伤口愈合方面可能较传统AS具有竞争优势 离体 小鼠眼睛。本研究中使用的AS是根据已发表的研究以及我院的临床实践配制的。因此，未来研究可通过以下方式评估mACS对眼表疾病的效果 体内 动物研究和临床试验

引言

自体血清（AS）在干眼病中的治疗作用最早由Fox等人于1980年代报道¹。人们认为，自体血清具有润滑特性，并含有多种重要的上皮营养性生化成分，可模拟天然泪液，促进角膜上皮细胞的增殖。在过去几十年中，基于这一理论已开展了多项研究。其中的营养成分包括表皮生长因子（EGF）、维生素A、转化生长因子β（TGF-β）以及其他细胞因子。有趣的是，血清富含TGF-β和维生素A，这些成分被认为在表皮增殖过程中发挥关键作用^2,3,4,5。此外，在治疗眼表疾病患者时，多项研究显示，自体血清滴眼液在患者自述症状改善、其他客观干眼参数^6,7以及显微镜下发现（如细胞密度）等方面具有一定优势⁸。荟萃分析研究表明，使用自体血清滴眼液治疗可能有助于改善患者的症状，但仍缺乏长期疗效和观察数据^9,10。

与自体血清（AS）不同，富血....

方案

研究在方案部分开始时遵循了机构指南。所有实验方案和操作均按照《赫尔辛基宣言》进行，并经过长庚纪念医院机构审查委员会的审查和批准。所有志愿者均被告知本研究的性质，并在参与前签署了知情同意书。整个实验过程所需的耗材见图1和图2，以及材料表中。

1. 制备mACS滴眼液所需材料

1. 准备 250 mL 的 10% 甘油溶液，并备好一个 21 G 蝴蝶翼型输液套管、一个不带针头的 3 mL 注射器，以及六支含有 158 USP 单位肝素的 10 mL 真空采血管（图 1）。
2. 将 21 G 血液采集针连接至 3 mL 注射器，并将 3 mL 的 10% 甘油溶液抽入已准备好的注射器中。
   注意：在插入针头前，所有材料必须经过灭菌处理。
3. 按顺序将 10% 甘油溶液分装至各真空采血管中，每管约 0.5 mL（图 3A）。
   ​注意：由于试管内存在负压，针头插入后必须立即拔出，以确保将 3 mL 甘油溶液均匀分配至六个试管中。
4. 用 75% 酒精无菌棉签对患者的皮肤进行消毒。使....

结果

图1 和图2展示了实验所需的材料，图3展示了mACS制备过程中的各个步骤及成功的中间产物。首先，向每支10 mL无菌试管中加入0.5 mL的10%甘油溶液（图3A）。然后，从患者体内采集60–70 mL静脉血，并将10 mL血液注入每支试管中（图3B）。在制备前，必须对患者的血液进行彻底且常规的实验室检查，以确保血液质量符合标准。最常见的低质量血液产物是由血脂异常引起的，离心后血清上层呈现浑浊，难以去除，此时无法继续进行滴眼液的后续制备（图5A）。

然后将密封的试管置于37 °C的培养箱中孵育4 h（图3C）。孵育结束后进行离心，样品可分离为上层液体，含有mA.......

讨论

本研究描述了一种制备mACS的方案，并进一步展示了mACS滴眼液在动物模型伤口愈合中的益处。该mACS方案的关键改进是在每个试管中加入约0.5 mL的10%甘油溶液，从而在37 °C孵育4小时期间创造适宜的低氧条件。该条件可对前房液施加适当的应激，促使细胞分泌有助于伤口愈合的必要生长因子。使用0.22 µm滤膜可去除大分子蛋白、血细胞和杂质，从而使最终产物更纯净且黏附性更低。

血液在37 °C下孵育4小时，随后进行进一步的离心和过滤。在最终产品制备过程中严格保持无菌操作，并在适当温度下储存，同样至关重要。最终血清产品中富含营养成分，极易成为细菌的良好培养基。因此，储存不当或制备过程中发生污染均可能导致滴眼液变质。受污染的自体血清滴眼液可能引发结膜炎或感染性角膜炎等疾病。

患者的血液质量同样重要，因此在制备mACS前需要进行实验室检测，以确保血液制品的安全性。在采集及操作患者血液样本过程中，操作人员应注意溶血现象。制备过程中任何压力均可能引发溶血，因此采血时应缓慢抽拉和推动注射器。还应控制缺氧条件，以获得高浓度的生长因子和抗炎性.......

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
96孔培养板	Merck KGaA, Germany	CLS3997
Barraquer眼睑撑开器	katena	K1-5355	15 mm
Barraquer持针钳	Katena	K6-3310	无锁扣
Barron真空环钻 8.0 mm	katena	K20-2108	用于切割滤纸
BD 10.0 mL 真空采血管（含肝素158 USP单位）	Becton,Dickinson and Company, US	367880	至少6管，用于采集后续实验所需血液并防止血液凝集
BD 21 G 蝶翼式输液套件	Becton,Dickinson and Company, US	367281	用于甘油溶液的均匀分布
C57BL/6小鼠	国家实验动物中心	RMRC11005	用于小鼠模型
Castroviejo镊子 0.12 mm	katena	K5-2500
离心机	Eppendorf, Germany	5811000428	3,500 x g 离心10分钟
成毅 10.0 mL 无菌滴眼瓶	成毅化学，中国台湾	CP405141	必须无菌，用作最终产品的储存容器
角膜锈环去除器（带0.5 mm钻头）	Algerbrush IITM; Alger Equipment Co., Inc. Lago Vista, TX	CHI-675	用于角膜上皮清创
杜尔贝科改良最低必需培养基	Merck KGaA, Germany	D6429
滤纸	Toyo Roshi Kaisha,Ltd.	1.11
荧光素钠眼科试纸 U.S.P	OPTITECH	OPTFL100	用于角膜上皮缺损染色
培养箱	Firstek, 中国台湾	S300S	37 °C 培养4小时
Kanam无菌手套	Kanam Latex Industries, India	EN455	用于无菌操作
Merck 0.22 µm 滤器	Merck KGaA, Germany	PR05359	至少2个滤器，用于mACS过滤
南光 250 mL 10% 甘油溶液	南光制药，中国台湾	19496	为血细胞提供适宜的膜稳定作用和细胞外渗透压
生理盐水	台湾生物技术有限公司	100-120-1101
皮肤活检穿孔器 2 mm	STIEFEL	22650
体视显微镜	Carl Zeiss Meditec, Dublin, CA	SV11	手术用显微镜
Terumo 18 G 针头	Terumo, 中国台湾	SMACF0120-18BX	3.0 mL 注射器配18 G 针头，用于离心后吸取上清液
Terumo 20.0 mL 注射器	Terumo, 中国台湾	MDSS20ES	可用于初次离心后收集血清，并用于二次离心。
Terumo 3.0 mL 注射器配23 G 针头	Terumo, 中国台湾	MDSS03S2325	3.0 mL 注射器用于离心后吸取上清液，然后连接滤器和23 G 针头，注入滴眼瓶中。
Westcott 断腱剪 中号	katena	K4-3004