Lentiviral Vector Preparation for Efficient Gene and MicroRNA Modulation of Peritoneal Cavity Tissue-Resident Macrophages In Vivo in Mice

摘要

我们展示了一种逐步研究腹膜组织驻留巨噬细胞中基因功能的实验方案 体内，使用慢病毒载体。

摘要

腹膜组织驻留巨噬细胞在维持内环境稳态中具有广泛功能，并参与局部及邻近组织的病理过程。其功能由微环境信号所决定；因此，有必要在原位研究其行为 体内 生理生态位。目前，特异性靶向腹膜巨噬细胞的方法主要依赖于全鼠转基因模型。本文提供一种高效 体内 描述了使用慢病毒颗粒对腹膜巨噬细胞中mRNA和小RNA（如microRNA）表达的调控。慢病毒制备在HEK293T细胞中进行，并通过单层蔗糖梯度纯化。 在体内的 通过腹腔注射慢病毒后的有效性验证显示，感染主要局限于局部组织的巨噬细胞。在稳态条件下以及巯基葡聚糖诱导的腹膜炎模型中，均成功实现了对腹腔巨噬细胞的靶向。本文讨论了该方案的局限性，包括慢病毒腹腔递送可能引发的轻度炎症反应以及后续实验的时间限制。总体而言，本研究提供了一种快速且易于实施的方案，可用于快速评估基因在腹腔巨噬细胞中的功能 体内.

引言

Tissue-resident macrophages (Mφ) are a heterogeneous population of phagocytic immune cells that sense and respond to invading pathogens^1,2. In addition, they play an essential role in tissue development, remodeling, and maintaining homeostasis^1,3. Many tissue Mφ derive from yolk sac progenitors during embryogenesis and persist in the tissue throughout the life^4,5. The phenotype and functions of these cells are dictated by collaborative and hierarchical interactions of specific transcription factors and the local microenvironment^6,7,8,9. A growing understanding of this dependency increases the need for effective in vivo methods for gene manipulation of Mφ within their physiologically relevant niche.

Lentiviral vectors are a frequently employed tool for the manipulation of nucleic acids in specific cell populations in vivo^10,11,12, particularly due to their ability to infect both dividing and non-dividing cells and to stably integrate into host genome^13,14. Over the last two decades, lentivirus delivery technology has been optimized, and alternative envelopes and synthetic promoters have been investigated to increase lineage-specific targeting^8,15. Owing to its broad cell tropism, vesicular stomatitis virus envelop glycoprotein (VSV-G)^16,17 has become the "gold-standard" envelope used in lentivirus technology.

In this protocol¹⁸, VSV-G pseudotyped lentiviral particles are employed to demonstrate targeted and effective delivery of short hairpin RNA (shRNA) and microRNA (miR) to mouse peritoneal Mφ (pMφ) in vivo, at steady state¹⁹. Transgene expression was driven by the spleen focus forming virus (SFFV) promoter. Productive infection of cells was defined by expression of lentivirus-derived enhanced green fluorescent protein (GFP). Utilization of this approach allowed easy readout for in vivo lentivirus experiments to define the optimal dose and the experimental timeframe. Finally, in vivo lentiviral challenge of mice during thioglycolate-induced inflammation revealed the natural propensity for selective pMφ infection.

方案

所有动物实验均按照机构和英国政府内政部的指导原则进行。

注意：所有涉及慢病毒的体内研究均应遵循当地和国家关于实验动物伦理使用的指南，并遵守与使用第二类感染性材料相关的所有规定。动物福利也应根据当地法规进行监测。在本实验步骤中，操作慢病毒颗粒和锐器时需格外小心。

1. 转染前HEK293T细胞的准备

注意：这些步骤需在无菌的组织培养生物安全柜中进行。

1. 通过将450 mL DMEM与10%（v/v）胎牛血清（50 mL）及终浓度为100 U/mL的青霉素/链霉素混合，制备用于HEK293T细胞的完全杜尔贝科改良伊格尔培养基（cDMEM）。
2. 在计划转染前至少一周解冻HEK293T细胞。维持良好的生长条件，并每2-3天使用胰蛋白酶+EDTA将细胞从培养瓶中消化传代一次。
3. 转染前一天，小心吸除细胞中的培养基，并用无菌DPBS轻柔洗涤细胞。向培养瓶中加入1-5 mL胰蛋白酶，于37 °C、5% CO₂培养箱中孵育2-5分钟。
4. 加入5-10 mL cDMEM，以350 × g离心5分钟。弃去上清液，将细胞沉淀重悬于10 mL cDMEM中。计数细胞，并在20 mL cDMEM中每T175培养瓶接种10-11 × 10⁶个活HEK293T细胞。
5. 于37 °C、5% CO₂培养箱中过夜培养，使HEK293T细胞达到70%-80%融合度。
6. 次日，在光学显微镜下确认细胞融合度。
7. 使用25 mL血清移液管小心吸除培养瓶中的培养基，避免扰动细胞单层。
8. 轻柔加入10 mL DPBS，并轻轻晃动培养瓶以洗涤细胞，注意避免扰动细胞单层。
9. 使用25 mL血清移液管吸除DPBS。
10. 每T175培养瓶沿瓶壁加入15 mL新鲜cDMEM，避免扰动细胞单层，然后将培养瓶放回37 °C培养箱中继续培养。

2. 使用非脂质体脂质转染试剂对HEK293T细胞进行转染

1. 在15 mL离心管中配制慢病毒组分：加入2 µg慢病毒质粒、1.5 µg pΔ8.91（pCMV-Δ8.91）和1 µg pMD2.G（pCMV-MD2.G），用转染试剂盒中的EC缓冲液定容至终体积600 µL。
2. 加入36 µL增强剂溶液。使用1 mL移液器反复吸取部分液体并逐滴加回到剩余溶液中，混匀各组分。室温（RT）静置5分钟。
3. 加入120 µL转染试剂，以上述方式轻轻吹打混合约20次。室温孵育10分钟。
4. 加入5.2 mL完全DMEM培养基（cDMEM），用5 mL血清移液管以上述方式混匀。
5. 使用一次性转移移液器将转染混合物逐滴直接加至HEK293T细胞单层表面（避免接触培养瓶壁），并在培养瓶内不同位置分散加入，使混合物均匀分布。
6. 轻轻左右摇动培养瓶以均匀分布质粒。注意避免液体进入瓶盖内。
7. 将培养瓶置于37 °C、5 % CO₂培养箱中孵育48小时。转染后24小时内，在细胞成像荧光显微镜下观察荧光标记物（本实验中为GFP）的表达情况，以确认HEK293T细胞转染效率。
   注意：对于不含荧光标记的构建体，需通过适当技术检测HEK293T细胞中所用标记基因的存在，或目标基因/蛋白表达水平的变化，例如定量PCR（qPCR）。或者，在后续实验阶段通过上述技术在Jurkat细胞上测试慢病毒文库时，可间接验证转染是否成功。
   ​警告：转染后的HEK293T细胞具有感染性，操作时应采取适当的安全防护措施。须遵守当地安全规定，通常包括在二级生物安全柜内操作、佩戴双层手套，并使用适当的去污溶液进行消毒，例如高浓度废液漂白剂（2,000 ppm）或符合机构生物安全指南的等效溶液。所有与慢病毒制备接触过的溶液和塑料制品均应按照机构的生物安全程序进行消毒处理。

3. 慢病毒颗粒的收集

1. 按照机构生物安全指南，在桶中配制去污溶液，即高浓度（2,000 ppm）次氯酸钠（漂白剂）溶液或等效试剂，并将其置于生物安全柜中。
2. 清理生物安全柜，移除多余物品，例如空的离心管架等。
3. 为每个T175 HEK293T细胞培养瓶预先标记一个50 mL离心管，并打开管盖，将离心管放置于稳定的管架中。
4. 从培养箱中取出培养瓶，使用配备488 nm激光的荧光显微镜确认GFP表达（图1A）。信号强度取决于转染效率及所使用的构建体。
5. 将细胞培养基收集至预先标记的50 mL离心管中。倾斜转染后的T175 HEK293T细胞培养瓶，使培养基汇集于瓶底一角。使用25 mL血清移液管小心吸取培养基，避免扰动细胞单层。此时可能观察到少量悬浮细胞。将收集的培养基转移至一个新的50 mL离心管中，并拧紧管盖。
   1. 使用25 mL血清移液管向培养瓶中加入25 mL新鲜、预温的cDMEM培养基。注意将培养基沿瓶壁缓慢加入，避免直接冲击细胞单层。将转染后的HEK293T细胞培养瓶放回培养箱（37 °C，5% CO₂）。
      注意：在完成上述步骤后，可于额外培养24小时后进行第二次慢病毒收集及进一步纯化。
6. 在24小时或48小时慢病毒收集完成后，向培养瓶中加入去污溶液，确保完全覆盖细胞单层。将培养瓶保持水平状态24小时，随后按照适当的II类生物危害物处理规定进行丢弃。

4. 慢病毒的纯化

1. 过滤步骤 3.5 收集的培养基。
   1. 从50 mL注射器中取出活塞，将低蛋白吸附的聚醚砜或聚偏二氟乙烯0.45 µm无菌滤器插入注射器末端。使用25 mL血清移液管，将步骤3.5.1中收集的培养基加入注射器，然后轻柔地将活塞推回原位。
   2. 缓慢推动插头，使液体通过滤器进入一个新的50 mL离心管中。如果流速明显减慢，将带有滤器的注射器朝上放置，并向外拉动活塞，直至液体完全脱离滤膜。
   3. 小心地将注射器上的滤器更换为新的滤器，并将使用过的滤器丢弃至去污染溶液中。继续进行培养基过滤。完成后，将滤器浸入去污染溶液中，并用去污染溶液充满注射器，以对滤器和注射器进行去污染处理。
2. 将超速离心机预冷，设置温度为 4 °C，并关闭离心机盖以使温度达到平衡。
3. 向锥形超速离心管底部加入 3 mL 20 % 蔗糖溶液（20% w/v，超纯水配制，使用 0.22 µm 滤器过滤除菌）。
4. 使用25 mL血清移液管，将过滤后的培养基小心地铺加在蔗糖层上方，注意不要扰动各层。
   1. 使用移液器助吸器的最低速度档位。将锥形超速离心管倾斜至约45°，缓慢将步骤4.1中获得的过滤后含慢病毒的培养基沿管壁加入。确保培养基与蔗糖溶液不混合，各层之间有清晰的分界。图1B随着培养基层体积的增加，缓慢将超速离心管倾斜回直立位置。
5. 如果超速离心管中的总体积（包括蔗糖和培养基）少于29 mL，需用新鲜的cDMEM补足，以防止离心过程中离心管塌陷。对于多次T175培养瓶的收集，将过滤后的培养基混合，并使用多个超速离心管。根据需要，用培养基补足最后一个超速离心管的体积。
6. 确保超速离心机的吊桶清洁，吊桶底部或盖子上无培养基残留。必要时，用约70%的酒精擦拭。在每个吊桶底部放入合适的离心管适配器。图1C）并将超速离心管轻轻放入离心桶中。
7. 将桶盖牢固关闭，并悬挂在外摆转子指定的位置上。
8. 确保各吊桶中蔗糖和培养基的体积相等以保持平衡。使用甩出式转子时，严禁不安装吊桶进行运转，但相对的吊桶可保持空置。²⁰ (图1D).
9. 小心将转子插入超速离心机并开启真空。将超速离心机的加速度和减速度设为最低档，以85,000 x g离心慢病毒制备物 g 4 °C下孵育90分钟。
10. 等待超速离心机达到所需转速（约3-5分钟）后再离开，以确保转子已正确安装且离心过程不会中止。
11. 超速离心机运行期间，应根据二级生物安全要求清理工作区，并为后续步骤做好准备。
12. 离心结束后，关闭真空，小心取出转子，避免扰动样品。
13. 检查超速离心机是否有溢出物，并确认吊桶无泄漏。若发生溢出，应戴双层手套，并使用抗病毒产品对离心机及吊桶外表面进行去污处理。
14. 从超速离心机中取出转子桶，并小心将其转移至II级生物安全柜中。
    注意：慢病毒颗粒会聚集在超速离心管底部，沉淀物肉眼不可见。
15. 将蔗糖和培养基一次性直接倒入含有去污溶液的废液容器中。
16. 保持超速离心管倒置，将其转移至双层纸巾上，静置干燥10分钟。同时，用浸湿的纸巾擦拭离心桶内壁，并倒置晾干。
17. 用纸巾小心擦干超速离心管管口残留的液体，然后将其直立放置。对使用过的纸巾及下方表面进行消毒。
18. 将病毒沉淀物用1 mL无血清培养基或后续实验所需的溶液轻轻吹打重悬。在II级生物安全柜内室温静置15分钟。
19. 使用1 mL移液器在分装前轻轻混匀慢病毒制备液，然后分装至1.5 mL螺口管（例如冻存管）中。将分装好的样品准备好用于后续步骤 体内 工作体积（100 µL）及Jurkat T细胞中的慢病毒滴度测定（1 × 20 µL）（见步骤5）。
20. 避免冻融循环；慢病毒制剂可在 -80 °C 下保存长达 6 个月，而不会对感染活性产生不利影响。

在 Jurkat T 细胞中进行慢病毒生产的滴定

1. 通过在500 mL RPMI-1640培养基中添加10%（v/v）胎牛血清以及终浓度为100 U/mL的青霉素/链霉素，配制用于Jurkat T细胞的完全Roswell Park Memorial Institute 1640培养基（cRPMI-1640）。
2. 为确保Jurkat T细胞处于健康生长状态，在感染前将细胞培养不超过1周。
3. 在慢病毒滴定当天，将活细胞以每孔2 × 10⁵个细胞、每孔200 µL cRPMI-1640的条件接种于24孔板中。
4. 使用 freshly collected 慢病毒，或将含有20 µL的慢病毒冻存管置于冰上解冻，并通过轻柔吹打混匀。
5. 用cRPMI-1640进行系列稀释后，分别加入0.25 µL、0.5 µL、1 µL、2.5 µL、5 µL和10 µL的慢病毒原液感染Jurkat T细胞。轻轻摇动培养板以确保慢病毒均匀分布。未感染的Jurkat T细胞作为阴性对照。
6. 将培养板置于37 °C培养箱中孵育。4小时后，向每孔补充cRPMI-1640至总体积为400 µL，并将培养板放回37 °C培养箱继续培养3天。
7. 感染后48小时，通过荧光成像系统确认GFP表达情况。
8. 感染后第3天，将24孔板中各孔的细胞分别收集至独立的1.5 mL离心管中，在4 °C条件下以350 × g离心5分钟。
9. 弃去上清液，将沉淀重悬于300 µL含2%（w/v）多聚甲醛（PFA）的DPBS溶液中，置于冰上避光孵育15分钟。
10. 在4 °C条件下以350 × g离心5分钟，弃上清，将沉淀重悬于流式细胞术缓冲液（FACS缓冲液，即无菌DPBS + 4% FCS + 1 mM无菌EDTA）中。
11. 通过流式细胞术分析慢病毒感染组及其对照组细胞中GFP的表达频率和平均荧光强度（图2）。

6. 体内 组织驻留型腹腔巨噬细胞的慢病毒感染

1. 在II级生物安全柜中，使用一次性胰岛素针头（为动物福利及避免针头内液体损失，建议使用30 G针头）装载含有所需量慢病毒的无血清培养基，总体积为200 µL。
2. 采用单手 scooping 技术将针头套重新套回针头。保持针头置于冰上，并在30分钟内完成注射。
3. 在动物实验设施中，注射前设置好II级生物安全柜（图1E）。
   1. 铺一张洁净的纸巾。松开装有慢病毒的胰岛素针头的针头套。
   2. 准备一个培养皿，内含小块纸巾和基于氯己定葡萄糖酸盐的消毒剂；另准备一个50 mL离心管，内装去污溶液（2,000 ppm次氯酸钠溶液），以及一个锐器安全收集容器。
4. 通过抓握小鼠颈背部皮肤固定小鼠²¹。正确固定后的小鼠应保持静止不动，这是操作安全的必要条件。
5. 使小鼠腹部朝上，头部略向下倾斜。将慢病毒注射至腹腔右下象限，以避免刺入腹腔内器官。
6. 在释放小鼠之前，用去污溶液填充注射器，并将其安全丢弃至锐器安全盒中。
7. 用浸有消毒剂的纸巾擦拭小鼠腹部的注射部位，然后将动物放回笼具中。
8. 将注射慢病毒的小鼠饲养于II级隔离笼（scantainer）或独立通气笼具（IVC）（配备高效空气过滤系统的隔离笼具）中，注射后至少隔离72小时。在笼具前方放置适当的信息标签卡。
9. 根据当地安全规定，在感染后72小时将小鼠转移至新的I级饲养笼具。从注射日起每日监测小鼠，持续共3天。

7. 收集慢病毒感染小鼠的腹腔细胞

警告：在慢病毒注射后72小时内进行样本收集时，须遵循机构规定的生物安全二级标准。在慢病毒注射后最初72小时内饲养感染动物的垫料及饲养笼盒，必须根据机构规定的生物安全二级标准进行去污处理。

1. 根据机构规定实施小鼠安乐死，例如通过吸入浓度递增的 CO₂，随后以颈椎脱位法确认死亡。
2. 用 70% 异丙醇清洁小鼠腹部，并小心剪开皮肤以暴露腹膜腔膜。
3. 使用 10 mL 注射器和 23 G 针头，以 6 mL 冰冷的 FACS 缓冲液冲洗腹膜腔。注意避免刺穿任何器官。
4. 轻柔按摩腹膜，使细胞脱落进入 FACS 缓冲液中。
5. 用同一注射器和针头收集腹腔灌洗液。
6. 取下针头，将细胞转移至 15 mL 离心管中。
7. 将腹腔灌洗液置于冰上保存。
8. 采集实验所需的其他器官，并根据研究要求妥善保存。
9. 按照当地动物管理和安全指南处理动物尸体。

8. 腹膜细胞染色与分析

1. 将腹腔灌洗液在 4 °C 条件下以 350 × g 离心 5 分钟，弃去上清液至去污溶液中，用 1 mL FACS 缓冲液重悬细胞。
2. 计数收集的细胞，并将每孔 4 × 10⁵ 个细胞接种至 V 型底 96 孔板中。
3. 使用可固定活死细胞染色试剂（例如本实验所用的可固定近红外死细胞染色试剂盒）按照制造商说明书进行活率染色。
4. 如果细胞在最近 72 小时内被感染，则将细胞在冰上用 2% 多聚甲醛（PFA）固定 15 分钟。加入等体积的冷 DPBS，并在 4 °C 条件下以 350 × g 再次离心 5 分钟。
5. 配制封闭缓冲液：在 FACS 缓冲液（用于表面染色）或通透缓冲液（用于细胞内染色）中加入 4 µg/mL 的 2.4G2 抗体和 10%（v/v）大鼠血清。
6. 将每孔含细胞沉淀的样品用 50 µL 封闭缓冲液重悬，并在 4 °C 孵育 15 分钟。
7. 为每个样品配制抗体混合液，每份使用 50 µL FACS 缓冲液（用于表面染色）或通透缓冲液（用于细胞内染色）。每份样品的最终染色体积为 100 µL，其中包括 50 µL 封闭缓冲液。根据此总体积计算相应的抗体浓度（表 1）。
8. 向样品中加入 50 µL 抗体混合液，向对照样品中加入 50 µL 同型对照抗体和对照缓冲液。将样品在冰上避光孵育 30 分钟。根据需要设置未染色细胞和同型对照。
9. 每孔用 100–200 µL 冰冷 DPBS 洗涤，然后在 4 °C 条件下以 350 × g 离心 5 分钟。重复此步骤以去除未结合的抗体。随后在流式细胞仪上分析样品。

9. 从器官中提取细胞

1. 为每个器官准备 1 mL 消化液：将 Hanks 平衡盐溶液（HBSS）、2 mg/mL IV 型胶原酶和 0.03 mg/mL DNase I 混合（肺组织消化需额外加入 1.5 mg/mL 透明质酸酶）。
2. 将收集的器官转移至 1 mL 消化液中，并用剪刀剪碎。
3. 用 40 µm 细胞筛过滤细胞，于 4 °C 下以 350 × g 离心 5 分钟。
4. 若从肺、脾或肝中分离细胞，使用 ACK 裂解缓冲液（150 mM NH₄Cl、10 mM KHCO₃、0.1 mM Na₂EDTA，pH = 7.4）裂解红细胞。用 40 µm 细胞筛过滤细胞，于 4 °C 下以 350 × g 离心 5 分钟。
5. 按照第 8 节所述方法对细胞进行染色和分析。

结果

若完全且正确地执行本方案，每次制备可获得总量为1.5 mL的高质量慢病毒原液，足以用于十二次实验 体内 根据本研究确定的最佳体积进行注射¹⁸转染的成功可在实验方案的早期进行评估。健康的、汇合的HEK293T细胞在质粒转染后48小时，若质粒中含有可检测的标记基因（例如本研究中使用的GFP），应显示出易于检测的标记信号。图1A信号强度低、细胞脱落过多以及实验早期步骤中细胞融合度低，可能表明细胞死亡，将导致慢病毒制备的产量低下。在可选收集步骤II（步骤3.5.1）之前出现一定程度的细胞脱落是可见且正常的。

本实验方案中使用三种质粒来产生慢病毒颗粒：pCMV-ΔR8.91 包装质粒，编码HIV-1结构蛋白（Gag）、辅助蛋白Tat和Rev以及逆转录酶聚合酶（Pol）²²；pMD2.G 质粒，在CMV启动子控制下编码VSV-G包膜蛋白¹³；以及根据需要改造的pHR'SIN-cPPT-SEW质粒（编码增强型GFP标记）¹⁹，用于表达shRNA或microRNA。

由于Jurkat T细胞系具有高感染性，因此常用于慢病毒制剂的滴定²³成功的慢病毒制备可实现超过95%的感染率，且所需剂量低至5 µL（图2A）。随着剂量的增加，感染细胞的平均荧光强度持续上升（图2B,C）。如有需要，可通过实时PCR检测整合的病毒成分（例如SFFV启动子）来测定病毒滴度，其与表达GFP的细胞百分比呈线性相关，与GFP的平均荧光强度（MFI）呈对数相关。图2D）。根据构建体的不同，尤其是插入片段较大的情况²⁴，某些慢病毒制备物在Jurkat T细胞中可能表现出感染效率降低，本研究中所用的Cre-GFP载体即显示出这一现象（图2E,F）。在这种情况下，可将多次制备的慢病毒颗粒合并，并重悬于1 mL中。我们建议对这些制备物的免疫反应进行验证 体内 在实验之前。显然，使用与本实验中VSV-G不同的进入受体的慢病毒制备物，其在Jurkat T细胞系中的感染效率可能有所不同，具体取决于细胞表面相应受体的表达情况。用于滴定的细胞系应选择那些表达慢病毒颗粒进入细胞所依赖的受体、并且最好缺乏或仅低水平表达限制因子的细胞系。²⁵.

通过感染pMφ（定义为CD11b）进一步证实了慢病毒颗粒的成功制备⁺ F4/80⁺ 和 Tim4⁺ 群体¹⁸ (图3A）。我们确定，向腹腔内注射100 µL慢病毒制剂（总体积为200 µL无血清培养基）可在此类细胞中获得最高比例和最强强度的GFP信号（图 3B,C）。注射较高剂量（150 µL 和 200 µL 慢病毒制剂）对腹腔巨噬细胞（pMφ）中 GFP 表达无促进作用。腹腔内（i.p.）注射 100 µL 慢病毒后，在 4 小时、3 天、7 天和 14 天进行的时间过程实验显示，第 3 天和第 7 天有显著比例的 GFP 表达型常驻 pMφ，至第 14 天感染细胞群消失（图3D，E）。有趣的是，表达GFP的pMφ在感染后第14天时基本消失，部分原因是免疫系统对GFP标记物的识别。事实上，在Treg细胞特异性的Foxp3-DTR-eGFP小鼠中，使用携带GFP标记的慢病毒实验可防止感染的定居pMφ被排斥，至少持续至第21天（图 3F对于在Jurkat细胞中效果降低的慢病毒制备物，需要使用更高剂量才能达到预期的感染率 体内然而，如Cre-GFP慢病毒制备所示，根据载体设计的不同，即使在腹腔注射后7天给予300 µL剂量，也可能产生较差的结果（图3G）。我们先前已证明该方案在基因过表达和基因敲低方面具有成功应用。 体内 在小鼠pMφ中，包括慢病毒shRNA介导的 Map3k8 和 Gata6 敲低，以及 Gata6 过表达¹⁹在此，我们证明该方案也可成功用于在常驻腹膜巨噬细胞（pMφ）中通过慢病毒载体介导的shRNA过表达小鼠miR-146b（mmu-miR-146b）以及敲低细胞间黏附分子1（ICAM1, CD54）图3H，I).

感染原代细胞（如巨噬细胞）需要更高的慢病毒输入量，这可能是由于这些细胞中存在限制因子。限制因子是细胞的天然保护机制，可干扰病毒生命周期的某些步骤，例如逆转录或整合，从而抑制载体中基因的表达。

进一步的体内验证实验表明，腹腔注射慢病毒递送方式对腹膜免疫细胞的存活率无显著影响（图4A），并显示出不同驻留型pMφ亚群（根据CD73和Tim4标志物的表达定义）具有差异性的感染效率（图4B、C）。重要的是，慢病毒的有效感染仅局限于注射部位的驻留巨噬细胞，这由挑战后7天时肠系膜淋巴结（mLN）、肺、肝或脾脏巨噬细胞中均未检测到显著的GFP表达所证实（图4D）。鉴于在许多情况下，巨噬细胞的遗传靶向需在炎症条件下进行，我们进一步研究了该方案在经腹腔注射0.1 mL 4%巯基乙酸盐处理的小鼠中的有效性。巯基乙酸盐注射可诱导炎性单核细胞来源的巨噬细胞及单核样细胞大量浸润，这些细胞可被分为5个不同的群体（图4E）。流式细胞术分析显示，单核样细胞（Ly6C^hi群体1和2）对慢病毒感染表现出抵抗性，这与先前在人类细胞中的研究结果一致²⁶。相比之下，驻留型巨噬细胞和单核细胞（群体3–5）仍保持较高的感染易感性（图4F）。

详细的流式细胞术分析检测到GFP表达主要存在于腹腔常驻巨噬细胞（Mφ）以及主要组织相容性复合体（MHC）II类分子阳性（MHCII⁺）的常驻腹腔巨噬细胞（pMφ）（MHCII⁺ F4/80⁺ Tim4⁺）中（注射后第3天最高可达60%）（图5A）。在其他腹腔细胞群体中几乎未检测到GFP信号，包括骨髓来源的腹腔巨噬细胞/树突状细胞（MHCII⁺、CD11b⁺、CD11c⁺）、B细胞（CD19⁺）、T细胞（CD3⁺）、肥大细胞（CD11b^-、FcεR1⁺）、嗜酸性粒细胞（Siglec-F⁺）、自然杀伤细胞（NK细胞，CD19^-、NK1.1⁺）以及中性粒细胞（Ly6G⁺）（图5A、B）。所有细胞群体中GFP表达的持续时间（图5C）与腹腔常驻巨噬细胞的表达持续时间一致（图1D）。在腹腔注射100 µL慢病毒（溶于200 µL无血清培养基中）后4小时，中性粒细胞比例出现短暂升高（图5D），表明受处理动物体内存在早期轻度炎症反应。最后，常驻pMφ在感染后第7至14天期间频率显著下降（图5E），提示最佳实验观察窗口为注射后第3至7天。

图1：在HEK293T细胞中生产慢病毒。 (A) 转染成功48小时后HEK293T细胞的代表性免疫荧光图像（荧光显微镜[488 nm激发峰，510 nm发射峰]，20倍放大，比例尺 = 400 µm）。B) 超速离心锥形管照片，管中含20%蔗糖层（底部，无色）和转染的HEK293T细胞收集的培养基层（顶部，红色）。C) 圆锥形超速离心管正确插入转子吊桶中的照片，包括适配器。D) 显示超速离心机转子正确与不正确平衡的示意图。EII级生物安全柜及材料的最佳配置照片 体内 适用于惯用右手者的注射操作。该图已获 Ipseiz N 等人许可修改。¹⁸. 请点击此处以查看此图的放大版本。

图2：慢病毒在Jurkat T细胞中的滴定。（A）Jurkat T细胞在感染含GFP质粒的慢病毒后72小时，采用递增剂量进行感染，流式细胞术分析代表性结果，显示GFP⁺细胞百分比（GFP⁺）；（B）GFP⁺细胞的平均荧光强度（MFI）；以及（C）GFP表达的代表性直方图。（D）散点图显示MFI（左侧Y轴）和表达GFP的慢病毒感染细胞百分比（右侧Y轴）与每皮克DNA检测到的病毒拷贝数（X轴）之间的关系。（E）Jurkat T细胞感染次优制备的Cre-GFP慢病毒（Cre-GFP LV）与对照GFP慢病毒（GFP LV）的代表性直方图；以及（F）总结数据，显示被Cre-GFP慢病毒感染的Jurkat T细胞中GFP⁺细胞的百分比。本图经Ipseiz N等¹⁸许可修改。请点击此处查看该图的放大版本。

图3常驻腹膜巨噬细胞的感染效率 (A) 组织驻留性巨噬细胞（CD11b）的设门策略⁺，Tim4⁺，F4/80⁺）和 Tim4^-F4/80⁺ 细胞。细胞首先根据单细胞进行设门，随后根据 CD11b 设门⁺. (B代表性散点图，以及（C感染频率（% GFP+ 细胞）和强度（MFI）的总结⁺ 3天后分离的细胞 体内 使用不同量的GFP慢病毒制剂进行感染。 (D代表性散点图，以及（E不同时间点分离的GFP+细胞的感染频率（% GFP+细胞）和感染强度（MFI）汇总 体内 在200 µL无血清培养基中加入100 µL慢病毒进行感染。（F) Foxp3-DTR-eGFP 小鼠经腹腔注射表达 GFP 的慢病毒后第 7、14 和 21 天细胞数量的汇总，显示表达 GFP 的腹膜巨噬细胞（pMφ）以及炎症性巨噬细胞和树突状细胞（InfMØs/DCs [F480^低]).（每组 n = 1–2）。(G代表性散点图显示次优情况 体内 感染 Gata6-敲除^{mye 19} 腹腔注射后第7天，用300 µL Cre-GFP慢病毒转导原位pMφ。H) 经刺激的腹腔常驻巨噬细胞中 mmu-miR-146b-5p 表达的 RT-qPCR 定量分析 体内 使用100 µL编码小鼠microRNA-146b（miR-146b）或对照（C）的慢病毒转导。原位巨噬细胞（白色圆圈）和Tim4^-，F4/80⁺ 细胞（灰色圆圈）。(我成功下调雌性129S6小鼠腹腔巨噬细胞中ICAM1的代表性散点图，该小鼠在注射含靶向shRNA的慢病毒7天后取样。图中显示对照shRNA结果，叠加曲线为同型对照。数据以均值±标准误表示，n≥2只小鼠。本图经Ipseiz N等人许可修改。¹⁸. 请点击此处以查看此图的放大版本。

图4不同驻留型pMφ亚群的感染效率 (A) 接受100 µL无血清培养基（-）或GFP慢病毒（+）腹腔注射后7天，总单个核细胞及驻留巨噬细胞的存活率。B门控策略显示发现的四种主要pMφ群体 体内CD73⁺Tim4⁺CD73^-Tim4^-CD73⁺Tim4^-CD73^-Tim4⁺，以及（C）相应感染频率（% GFP+ 细胞）和感染强度（GFP+ 细胞的 MFI）。D) 腹腔注射100 µL慢病毒后7天，多个器官中GFP+细胞的百分比。缩写：mLN，肠系膜淋巴结。E小鼠经腹腔注射0.1 mL 4%巯基乙酸盐，连续5天，随后进行腹腔注射慢病毒。慢病毒腹腔注射后3天，对腹腔巨噬细胞（pMφ）和单核细胞进行流式设门策略分析。F) GFP+ 单核细胞（Ly6C）的感染频率、MFI 及细胞数量分析⁺）和巨噬细胞（Ly6C^-)。数据以均值 ± 标准误表示，n ≥ 3 只小鼠。本图已获 Ipseiz N 等人许可修改。¹⁸. 请点击此处以查看此图的放大版本。

图5慢病毒注射对腹膜炎症的影响 小鼠被注射 体内 腹腔注射表达GFP的慢病毒。A) 不同体积慢病毒注射（50 µL、100 µL、150 µL 或 200 µL）后腹腔内细胞群体的感染频率。B) 腹腔注射后7天，有 productive 感染的细胞群体中GFP表达强度。C腹腔注射后不同时间点腹腔内细胞群体的感染频率。D）和（E) 腹腔注射后不同时间点的细胞百分比。所有慢病毒注射均使用无血清培养基补足至相同总体积 200 µL。除非另有说明，慢病毒剂量为 100 µL。对照组小鼠（“C”）接受 200 µL 无稀释的无血清培养基。数据以均值 ± 标准误表示，n ≥ 3 只小鼠。本图已获 Ipseiz N 等人许可修改。¹⁸. 请点击此处以查看此图的放大版本。

抗体靶标	荧光染料	克隆号	使用稀释度	终浓度 [μg/mL]
HIV-1 核心抗原	RD1	FH190-1-1	1/100	1
I-A/I-E	PerCpCy5.5	M5/114.15.2	1/400	0.5
Ly6G	PerCpCy5.5	1A8	1/400	0.5
CD3e	PerCpCy5.5	17A2	1/200	1
CD3e	PE/Cy7	500A2	1/400	0.5
CD11c	PE/Cy7	N418	1/800	0.25
CD11c	BV605	N418	1/400	0.5
CD226	AF647	10 E 5	1/400	1.25
Tim4	AF647	RTM4-54	1/600	0.83
CD4	APC	GK1.5	1/400	0.5
CD11b	AF700	M1/70	1/700	0.71
CD11b	PerCpCy5.5	M1/70	1/400	0.5
F4/80	Pacific Blue	BM8	1/700	0.71
F4/80	BV605	BM8	1/400	0.25
F4/80	BV711	BM8	1/400	0.5
CD73	eFluor450	TY/11.8	1/400	2.5
CD19	V450	1D3	1/400	0.5
CD19	APC	1D3	1/400	0.5
CD8a	eFluor450	53-6.7	1/400	0.5
SiglecF	BV421	E50-2440	1/400	0.5
NK1.1	APC/Cy7	PK136	1/400	0.5
FceR1	eFluor450	MAR-1	1/400	0.5
ICAM1	PE	1A29	1/100	2
大鼠 IgG1, κ 同型对照	PE		1/100	2

表1：抗体列表

讨论

Tissue-resident macrophages perform a range of homeostatic and inflammatory tissue-specific functions^1,2 dictated by their physiological environment^6,7,8,9. In this protocol, an effective method¹⁸ for manipulation of peritoneal resident macrophages in vivo using lentivirus particles was introduced to investigate macrophage function in their biological microenvironment.

It is essential for the success of the protocol to use healthy HEK293T cells. It is the best practice to defrost the cells at least a week prior to the start of this protocol to ensure cell recovery and good numbers. Cells should be seeded in an appropriate volume of medium one day before planned transfection and should reach about 80% confluency on the day of transfection. Under- or over-confluent cell preparations will result in reduced lentivirus yield. We recommend transfecting HEK293T cells with the transfection reagent according to the manufacturer's instructions for the best results. Essential steps of the transfection include appropriate mixing of the plasmids and reagents and dropwise addition of the mix directly to the HEK293T cell monolayer. Calcium phosphate transfection of HEK293T cells^27,28 could be employed in this protocol. However, the user should be aware that the effectiveness of this method can vary, and it can result in diminished transfection efficiency.

Safety precautions should be considered in the protocol from the day of HEK293T cell transfection. These include working in a category II safety cabinet, wearing double gloves when handling contaminated material, and appropriate bleaching of the contaminated material (with decontamination solution, for example, 2,000 ppm bleach solution) for minimum 4 h. Users should refer to their institutional regulations regarding work with category II pathogens and waste.

In this protocol, the lentivirus preparation is first purified using a 0.45 µm filter to remove HEK293T cell debris. The use of smaller filters (0.22 µm) and cellulose ester membranes should be avoided as it will result in the loss of lentivirus particles. It is recommended to use low protein binding polyether sulfone or polyvinylidene fluoride filters²⁹. The second purification step is performed on the single 20% sucrose layer in an ultracentrifuge to remove remaining impurities, which is particularly important for the consequent in vivo administration of the lentivirus preparation. In the institutions where an ultracentrifuge is not available, others³⁰ have described sucrose-based lentivirus purification using a standard laboratory centrifuge. This could be implemented in this protocol as an alternative. Lentivirus preparation is titrated in Jurkat T cells on the expression of the marker signal (e.g., GFP used in this protocol). For constructs without markers, physical lentivirus particles could be evaluated by quantification of HIV-1 p24gag protein by ELISA kit³¹, flow cytometry analysis of HIV-1 core antigen¹⁸, or measurement of the changes to the targeted gene (preferentially using the methods allowing measurement of changes in individual cells, e.g., flow cytometry or microscopy). If titration of the control and lentivirus differ significantly in Jurkat T cells, the volumes used for the in vivo studies can be adjusted to reach the most comparable infection between lentivirus preparations.

The major limitation of the protocol is the observed disappearance of GFP⁺ resident peritoneal Mφ within 14 days of i.p lentivirus injection. For long-term studies, mouse lines with stable genetic alteration in a specific cell type or tissues should be considered³². For example, as peritoneal macrophages do not express Foxp3 (a T-Reg protein), we utilized Foxp3-DTR-eGFP mice³³ and confirmed that expression of GFP is maintained in peritoneal Mφ at 21 days post-infection (Figure 3F). However, it is important to note that the lentiviruses contain other foreign components, and this extension in the persistence of infected cells in the Foxp3-DTR-GFP mice may not be permanent. An additional weakness of this method is a low level of inflammation that can be observed in the peritoneal cavity following lentivirus injection, as witnessed by influx of neutrophils at 4 h post injection (Figure 5D), which may mean repeated infections would accelerate the inflammation-associated loss of GFP-expressing resident peritoneal Mφ. Although, we have not detected type I interferons (IFNs) in the peritoneal cavity, VSV-G pseudotyped lentivirus particles were previously demonstrated to induce some of the IFN-stimulated genes in human Mφ in the absence of detectable IFNs³⁴. This should be considered when using this protocol for experiments investigating antiviral immune responses. The occurrence of acute and sustained inflammation after i.p injection of lentivirus preparation might indicate contamination of the preparation.

Areas of troubleshooting include: 1) for low lentivirus titer, ensure the health of HEK293T cells and effective transfection (e.g., marker expression, if present, in HEK293T cells). If the infection rate remains low, consider the size of the construct. Constructs with larger inserts or more complex secondary structures can affect the final lentivirus titer and infectivity²⁴. Therefore, each construct should be tested independently and in parallel to its respective control vector; 2) If a high amount of the lentivirus is required, it is recommended to prepare multiple T175 flasks of HEK293T cells and to scale up the production accordingly. To avoid variation of the lentivirus preparations, it is the best practice to merge the final collections prior to aliquoting and storage. For such larger production, plasmids mix (section 2) should be prepared in 50 mL tubes to ensure effective mixing of the components.

Despite its broad tropism, VSV-G pseudotyped lentiviral particles predominantly target tissue macrophages as demonstrated previously for alveolar³⁵, and here¹⁸ for pMФ when administered by the respective routes. Alterations to the envelope on lentivirus particles can, in some cases, result in diminished transduction of macrophages in vivo³⁶ and are unnecessary for this protocol. Compared to other viral approaches for in vivo gene manipulation in macrophages (reviewed in³⁷), the use of lentiviral vectors offers stable integration of the transgene in tissue macrophages³⁵, efficient transgene expression, and the largest vector size limit (approximately 8 Kb).

Peritoneal Mφ play an important role in the prevention, onset, progression, and resolution of various diseases, including abdominal cancers, pancreatitis, and peritonitis³⁸. This protocol describes an effective tool for gene modification in murine pMφ, allowing investigation of the biological processes behind these pathologies within a physiologically relevant microenvironment. While lentiviral vectors themselves are becoming a tool of interest for clinical interventions³⁹, due to the origin from the immunodeficiency virus and a stable genome integration, the safety concerns impede their therapeutic implementation. Further understanding of the macrophage responses to lentiviral gene modulation could advance the application of this highly effective tool in a clinical setting.

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
0.05% 胰蛋白酶-EDTA (1x) (胰蛋白酶 500 mg/L 或 0.02 mM)	Thermo Fisher Scientific	25300054
0.22 μm 无菌 millex GP 滤器	Merck	SLGS033SS
0.45 μm 无菌 millex GP 滤器	Merck	SLHP033RS
0.5 mL U-100 胰岛素注射器（带针头，0.33 mm × 12.7 mm (29 G)）	BD	324892
1 升锐器盒	N/A	N/A
2.4G2 抗体 (TruStain FcX 抗小鼠 CD16/32)	Biolegend	101320
40 μm 细胞筛	Thermo Fisher Scientific	22363547
AimV 培养基（研究级），AlbuMax 补充剂	Thermo Fisher Scientific	31035025
封闭缓冲液	实验室自制
Brewer 巯基乙酸盐培养基	Sigma-Aldrich	B2551	4% 储存液以水配制，经高压灭菌后冷冻保存
CD11b	Biolegend	101222	稀释比例和浓度请参见表 1
CD11b	BD	550993	稀释比例和浓度请参见表 1
CD11c	Biolegend	117317	稀释比例和浓度请参见表 1
CD11c	Biolegend	117333	稀释比例和浓度请参见表 1
CD19	BD	560375	稀释比例和浓度请参见表 1
CD19	Biolegend	152410	稀释比例和浓度请参见表 1
CD226	Biolegend	128808	稀释比例和浓度请参见表 1
CD3e	BD	560527	稀释比例和浓度请参见表 1
CD3e	Biolegend	152313	稀释比例和浓度请参见表 1
CD4	Biolegend	100412	稀释比例和浓度请参见表 1
CD73	eBioscience	16-0731-82	稀释比例和浓度请参见表 1
CD8a	eBioscience	48-0081-82	稀释比例和浓度请参见表 1
细胞培养瓶 (T175 培养瓶，175 cm2，550 mL)	Greiner Bio One	658175
离心管，锥底管 (25 mm × 89 mm)	Beckman Coulter	358126
离心机	Beckman Coulter		超速离心机和 TC 离心机
IV 型胶原酶	Sigma-Aldrich	C5138
锥形离心管 (15 mL 和 50 mL)	Greiner Bio One	11512303 & 11849650
冻存管	Greiner Bio One	123277	或冻存管
DMEM 培养基 (1x) + 4.5 g/L D-葡萄糖，400 µM L-谷氨酰胺	Thermo Fisher Scientific	41965-062
DNase I	Sigma-Aldrich	11284932001
Effectene 转染试剂	Qiagen	301425
F4/80	Biolegend	123123	稀释比例和浓度请参见表 1
F4/80	Biolegend	123133	稀释比例和浓度请参见表 1
F4/80	Biolegend	123147	稀释比例和浓度请参见表 1
FceR1	eBioscience	48-5898-80	稀释比例和浓度请参见表 1
胎牛血清 (FCS)	Thermo Fisher Scientific	10270-106	56 °C 水浴 30 分钟灭活，经 0.22 μm 滤器无菌过滤
流式细胞仪	Thermo Fisher Scientific	Attune NxT
流式细胞术 (FACS) 缓冲液	实验室自制
荧光细胞培养显微镜	Thermo Fisher Scientific	EVOS FL
镊子	N/A	N/A	用户自选
Hank's 平衡盐溶液 (HBSS)	Gibco, Life Technologies	14175-053
HEK293T 细胞系			转染前至少培养一周，无支原体污染
HIV-1 核心抗原	Beckman Coulter	6604667
透明质酸酶	Sigma-Aldrich	H3506
Hydrex 外科洗手液，含 4% w/v 葡萄糖酸氯己定皮肤清洁剂	Ecolab	3037170
I-A/I-E	Biolegend	107625	稀释比例和浓度请参见表 1
ICAM1	Becton Dickinson	554970	稀释比例和浓度请参见表 1
Jurkat T 细胞系			使用前至少培养一周，无支原体污染
LIVE/DEAD 可固定近红外死细胞染色试剂盒	Thermo Fisher Scientific	L34975
Ly6G	Biolegend	127615	稀释比例和浓度请参见表 1
小鼠			此处使用 8–12 周龄 C57BL/6 雌性小鼠（Charles Rivers），除非另有说明
微量移液器（体积范围 0.5–1,000 μL）	Fisher Scientific & Starlab	11963466 & 11943466 & 11973466 & S1111-3700
NK1.1	Biolegend	108724	稀释比例和浓度请参见表 1
多聚甲醛	Sigma-Aldrich	P6148-500G	以 PBS 配制成 2% w/v 溶液
pCMV-ΔR8.91 包装质粒		Zuffrey, R., et al. 1997	编码由巨细胞病毒启动子驱动的 Gag-Pol HIV 蛋白，具有氨苄青霉素抗性
青霉素/链霉素 (100x, 10,000 U/mL)	Thermo Fisher Scientific	15140122
培养皿	Greiner Bio One	664160
pHR'SIN-cPPT-SEW 质粒		Rosas, M. et al. 2014	经改造用于 shRNA 和 miR 表达研究，编码位于 SFFV 启动子下游和土拨鼠肝炎病毒增强子上游的 EGFP 标记基因，具有氨苄青霉素抗性
pMD2.G 质粒		Naldini, L. et al. 1996	编码水疱性口炎病毒糖蛋白 (VSV-G) 包膜蛋白，具有氨苄青霉素抗性
大鼠 IgG1, κ 同型对照	Becton Dickinson	550617	稀释比例和浓度请参见表 1
大鼠血清	Sigma-Aldrich	R9759-10ML
红细胞 ACK 裂解缓冲液	实验室自制
RPMI 1640 培养基 (1x) + 400 uM L-谷氨酰胺	Thermo Fisher Scientific	21875-091
皂苷	Sigma-Aldrich	S4521
SiglecF	BD	562681	稀释比例和浓度请参见表 1
次氯酸钠片剂（漂白剂，2,000 ppm）	Guest Medical	H8818
无菌 24 孔细胞培养板	Greiner Bio One	662160
无菌杜氏磷酸盐缓冲液 (DPBS) (1x) Mg++ 和 Ca2+ 无	Thermo Fisher Scientific	14190144
无菌 EDTA	Thermo Fisher Scientific	15575020
无菌 VWR 一次性移液管 (23.0 mL, 30 cm)	VWR	612-4515
蔗糖	Thermo Fisher Scientific	15503022
手术剪	N/A	N/A	用户自选
注射器 (50 mL 和 10 mL)	Fisher Scientific	10084450 & 768160
Tim4	Biolegend	130007	稀释比例和浓度请参见表 1
U 型底 96 孔细胞培养板	Greiner Bio One	650180