我们展示了一种逐步研究腹膜组织驻留巨噬细胞中基因功能的实验方案 体内，使用慢病毒载体。
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本文内容
摘要
摘要
腹膜组织驻留巨噬细胞在维持内环境稳态中具有广泛功能，并参与局部及邻近组织的病理过程。其功能由微环境信号所决定；因此，有必要在原位研究其行为 体内 生理生态位。目前，特异性靶向腹膜巨噬细胞的方法主要依赖于全鼠转基因模型。本文提供一种高效 体内 描述了使用慢病毒颗粒对腹膜巨噬细胞中mRNA和小RNA（如microRNA）表达的调控。慢病毒制备在HEK293T细胞中进行，并通过单层蔗糖梯度纯化。 在体内的 通过腹腔注射慢病毒后的有效性验证显示，感染主要局限于局部组织的巨噬细胞。在稳态条件下以及巯基葡聚糖诱导的腹膜炎模型中，均成功实现了对腹腔巨噬细胞的靶向。本文讨论了该方案的局限性，包括慢病毒腹腔递送可能引发的轻度炎症反应以及后续实验的时间限制。总体而言，本研究提供了一种快速且易于实施的方案，可用于快速评估基因在腹腔巨噬细胞中的功能 体内.
引言
组织驻留巨噬细胞（Mφ）是一类异质性的吞噬性免疫细胞，能够感知并响应入侵的病原体1,2。此外，它们在组织发育、重塑以及维持稳态中发挥着关键作用1,3。许多组织中的Mφ起源于胚胎发生过程中的卵黄囊前体细胞，并可在组织中持续终生4,5。这些细胞的表型和功能由特定的转录因子与局部微环境之间的协同和层级相互作用共同决定6,7,8,9。随着对这种依赖性认识的不断深入，迫切需要建立高效且适用于生理微环境中的Mφ基因操作的in vivo方法。
慢病毒载体是体内特定细胞群核酸操作中常用的工具in vivo10,11,<....
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方案
所有动物实验均按照机构和英国政府内政部的指导原则进行。
注意：所有涉及慢病毒的体内研究均应遵循当地和国家关于实验动物伦理使用的指南，并遵守与使用第二类感染性材料相关的所有规定。动物福利也应根据当地法规进行监测。在本实验步骤中，操作慢病毒颗粒和锐器时需格外小心。
1. 转染前HEK293T细胞的准备
注意：这些步骤需在无菌的组织培养生物安全柜中进行。
- 通过将450 mL DMEM与10%（v/v）胎牛血清（50 mL）及终浓度为100 U/mL的青霉素/链霉素混合，制备用于HEK293T细胞的完全杜尔贝科改良伊格尔培养基（cDMEM）。
- 在计划转染前至少一周解冻HEK293T细胞。维持良好的生长条件，并每2-3天使用胰蛋白酶+EDTA将细胞从培养瓶中消化传代一次。
- 转染前一天，小心吸除细胞中的培养基，并用无菌DPBS轻柔洗涤细胞。向培养瓶中加入1-5 mL胰蛋白酶，于37 °C、5% CO2培养箱中孵育2-5分钟。
- 加入5-10 mL cDMEM，以350 × g离心5分钟。弃去上清液，将细胞沉淀重悬于10 mL cDMEM中。计数细胞，并在20 mL cDMEM中每T175培养瓶接种10-11....
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结果
当完全且正确地执行本方案时，每次制备可获得总量为1.5 mL的高质量慢病毒原液，足以用于十二次实验 体内 根据本研究确定的最佳体积进行注射18转染的成功可在实验方案的早期进行评估。健康的、汇合的HEK293T细胞在转染质粒48小时后，若质粒中含有可检测的标记基因（例如本研究中使用的GFP），应显示出易于检测的标记信号。图1A信号强度低、细胞过度脱落以及实验早期步骤中细胞融合度低，可能表明细胞死亡，将导致慢病毒制备的产量降低。在可选收集步骤II（步骤3.5.1）之前出现一定程度的细胞脱落是可见且正常的。
本实验方案中使用三种质粒以产生慢病毒颗粒：pCMV-ΔR8.91 包装质粒，编码HIV-1结构蛋白（Gag）、辅助蛋白Tat和Rev以及逆转录酶聚合酶（Pol）22；pMD2.G 质粒，在CMV启动子驱动下编码VSV-G包膜蛋白13；以及根据需要改造的pHR'SIN.......
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讨论
组织驻留型巨噬细胞执行多种维持稳态及炎症相关的组织特异性功能1,2 由其生理环境决定6,7,8,9在本方案中，一种高效的方法18 用于操控腹膜组织驻留巨噬细胞 在体内 利用慢病毒颗粒研究巨噬细胞在其生物学微环境中的功能。
使用健康的 HEK293T 细胞对于本方案的成功至关重要。建议至少在开始本方案前一周复苏细胞，以确保细胞充分恢复并达到理想数量。应在计划转染的前一天，将细胞以适当体积的培养基接种，使其在转染当天达到约 80% 的融合度。细胞密度过低或过高均会导致慢病毒产量降低。为获得最佳结果，建议按照转染试剂生产商的说明对 HEK293T 细胞进.......
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披露
作者无任何利益冲突需要披露。
致谢
本研究全部或部分由惠康信托调查员奖 [107964/Z/15/Z] 资助。P.R.T 还得到了支持 英国痴呆症研究所。M.A.C. 获得生物技术和生物科学研究理事会发现研究员项目（Biotechnology and Biological Sciences Research Council Discovery Fellowship）的支持。BB/T009543/1）。为开放获取的目的，作者已对由此投稿产生的任何作者接受稿版本应用了CC BY公共版权许可。L.C.D 是斯旺西大学的讲师，同时也是卡迪夫大学的荣誉研究员。本工作得到了Ipseiz等人2020年所开展工作的支持。18.
....访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。
材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 0.05% 胰蛋白酶-EDTA (1x) (胰蛋白酶 500 mg/L 或 0.02 mM) | Thermo Fisher Scientific | 25300054 | |
| 0.22 μm 无菌 millex GP 滤器 | Merck | SLGS033SS | |
| 0.45 μm 无菌 millex GP 滤器 | Merck | SLHP033RS | |
| 0.5 mL U-100 胰岛素注射器（带针头，0.33 mm × 12.7 mm (29 G)） | BD | 324892 | |
| 1 升锐器盒 | N/A | N/A | |
| 2.4G2 抗体 (TruStain FcX 抗小鼠 CD16/32) | Biolegend | 101320 | |
| 40 μm 细胞筛 | Thermo Fisher Scientific | 22363547 | |
| AimV 培养基（研究级），AlbuMax 补充剂 | Thermo Fisher Scientific | 31035025 | |
| 封闭缓冲液 | 实验室自制 | ||
| Brewer 巯基乙酸盐培养基 | Sigma-Aldrich | B2551 | 4% 储存液以水配制，经高压灭菌后冷冻保存 |
| CD11b | Biolegend | 101222 | 稀释比例和浓度请参见表 1 |
| CD11b | BD | 550993 | 稀释比例和浓度请参见表 1 |
| CD11c | Biolegend | 117317 | 稀释比例和浓度请参见表 1 |
| CD11c | Biolegend | 117333 | 稀释比例和浓度请参见表 1 |
| CD19 | BD | 560375 | 稀释比例和浓度请参见表 1 |
| CD19 | Biolegend | 152410 | 稀释比例和浓度请参见表 1 |
| CD226 | Biolegend | 128808 | 稀释比例和浓度请参见表 1 |
| CD3e | BD | 560527 | 稀释比例和浓度请参见表 1 |
| CD3e | Biolegend | 152313 | 稀释比例和浓度请参见表 1 |
| CD4 | Biolegend | 100412 | 稀释比例和浓度请参见表 1 |
| CD73 | eBioscience | 16-0731-82 | 稀释比例和浓度请参见表 1 |
| CD8a | eBioscience | 48-0081-82 | 稀释比例和浓度请参见表 1 |
| 细胞培养瓶 (T175 培养瓶，175 cm2，550 mL) | Greiner Bio One | 658175 | |
| 离心管，锥底管 (25 mm × 89 mm) | Beckman Coulter | 358126 | |
| 离心机 | Beckman Coulter | 超速离心机和 TC 离心机 | |
| IV 型胶原酶 | Sigma-Aldrich | C5138 | |
| 锥形离心管 (15 mL 和 50 mL) | Greiner Bio One | 11512303 & 11849650 | |
| 冻存管 | Greiner Bio One | 123277 | 或冻存管 |
| DMEM 培养基 (1x) + 4.5 g/L D-葡萄糖，400 µM L-谷氨酰胺 | Thermo Fisher Scientific | 41965-062 | |
| DNase I | Sigma-Aldrich | 11284932001 | |
| Effectene 转染试剂 | Qiagen | 301425 | |
| F4/80 | Biolegend | 123123 | 稀释比例和浓度请参见表 1 |
| F4/80 | Biolegend | 123133 | 稀释比例和浓度请参见表 1 |
| F4/80 | Biolegend | 123147 | 稀释比例和浓度请参见表 1 |
| FceR1 | eBioscience | 48-5898-80 | 稀释比例和浓度请参见表 1 |
| 胎牛血清 (FCS) | Thermo Fisher Scientific | 10270-106 | 56 °C 水浴 30 分钟灭活，经 0.22 μm 滤器无菌过滤 |
| 流式细胞仪 | Thermo Fisher Scientific | Attune NxT | |
| 流式细胞术 (FACS) 缓冲液 | 实验室自制 | ||
| 荧光细胞培养显微镜 | Thermo Fisher Scientific | EVOS FL | |
| 镊子 | N/A | N/A | 用户自选 |
| Hank's 平衡盐溶液 (HBSS) | Gibco, Life Technologies | 14175-053 | |
| HEK293T 细胞系 | 转染前至少培养一周，无支原体污染 | ||
| HIV-1 核心抗原 | Beckman Coulter | 6604667 | |
| 透明质酸酶 | Sigma-Aldrich | H3506 | |
| Hydrex 外科洗手液，含 4% w/v 葡萄糖酸氯己定皮肤清洁剂 | Ecolab | 3037170 | |
| I-A/I-E | Biolegend | 107625 | 稀释比例和浓度请参见表 1 |
| ICAM1 | Becton Dickinson | 554970 | 稀释比例和浓度请参见表 1 |
| Jurkat T 细胞系 | 使用前至少培养一周，无支原体污染 | ||
| LIVE/DEAD 可固定近红外死细胞染色试剂盒 | Thermo Fisher Scientific | L34975 | |
| Ly6G | Biolegend | 127615 | 稀释比例和浓度请参见表 1 |
| 小鼠 | 此处使用 8–12 周龄 C57BL/6 雌性小鼠（Charles Rivers），除非另有说明 | ||
| 微量移液器（体积范围 0.5–1,000 μL） | Fisher Scientific & Starlab | 11963466 & 11943466 & 11973466 & S1111-3700 | |
| NK1.1 | Biolegend | 108724 | 稀释比例和浓度请参见表 1 |
| 多聚甲醛 | Sigma-Aldrich | P6148-500G | 以 PBS 配制成 2% w/v 溶液 |
| pCMV-ΔR8.91 包装质粒 | Zuffrey, R., et al. 1997 | 编码由巨细胞病毒启动子驱动的 Gag-Pol HIV 蛋白，具有氨苄青霉素抗性 | |
| 青霉素/链霉素 (100x, 10,000 U/mL) | Thermo Fisher Scientific | 15140122 | |
| 培养皿 | Greiner Bio One | 664160 | |
| pHR'SIN-cPPT-SEW 质粒 | Rosas, M. et al. 2014 | 经改造用于 shRNA 和 miR 表达研究，编码位于 SFFV 启动子下游和土拨鼠肝炎病毒增强子上游的 EGFP 标记基因，具有氨苄青霉素抗性 | |
| pMD2.G 质粒 | Naldini, L. et al. 1996 | 编码水疱性口炎病毒糖蛋白 (VSV-G) 包膜蛋白，具有氨苄青霉素抗性 | |
| 大鼠 IgG1, κ 同型对照 | Becton Dickinson | 550617 | 稀释比例和浓度请参见表 1 |
| 大鼠血清 | Sigma-Aldrich | R9759-10ML | |
| 红细胞 ACK 裂解缓冲液 | 实验室自制 | ||
| RPMI 1640 培养基 (1x) + 400 uM L-谷氨酰胺 | Thermo Fisher Scientific | 21875-091 | |
| 皂苷 | Sigma-Aldrich | S4521 | |
| SiglecF | BD | 562681 | 稀释比例和浓度请参见表 1 |
| 次氯酸钠片剂（漂白剂，2,000 ppm） | Guest Medical | H8818 | |
| 无菌 24 孔细胞培养板 | Greiner Bio One | 662160 | |
| 无菌杜氏磷酸盐缓冲液 (DPBS) (1x) Mg++ 和 Ca2+ 无 | Thermo Fisher Scientific | 14190144 | |
| 无菌 EDTA | Thermo Fisher Scientific | 15575020 | |
| 无菌 VWR 一次性移液管 (23.0 mL, 30 cm) | VWR | 612-4515 | |
| 蔗糖 | Thermo Fisher Scientific | 15503022 | |
| 手术剪 | N/A | N/A | 用户自选 |
| 注射器 (50 mL 和 10 mL) | Fisher Scientific | 10084450 & 768160 | |
| Tim4 | Biolegend | 130007 | 稀释比例和浓度请参见表 1 |
| U 型底 96 孔细胞培养板 | Greiner Bio One | 650180 |
参考文献
- Wynn, T. A., Chawla, A., Pollard, J. W. Macrophage biology in development, homeostasis and disease. Nature. 496 (7446), 445-455 (2013).
- Jantsch, J., Binger, K. J., Muller, D. N., Titze, J. Macrophages in homeostatic immune function. Front Physiol. 5, 146(2014).
- Wynn, T. A., Vannel....
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