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方法文章

用于高效调控腹腔组织基因与微小RNA的慢病毒载体制备-组织驻留巨噬细胞 体内 在小鼠中

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DOI：

10.3791/64926

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2024年2月16日

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Systems Immunity Research Institute, Division of Infection and Immunity, Cardiff University, 2Biomedical Sciences Unit, Faculty of Medicine, Health and Life Science, Swansea University, 3UK Dementia Research Institute

本文内容

摘要

我们展示了一种逐步研究腹膜组织驻留巨噬细胞中基因功能的实验方案 体内，使用慢病毒载体。

摘要

腹膜组织驻留巨噬细胞在维持内环境稳态中具有广泛功能，并参与局部及邻近组织的病理过程。其功能由微环境信号所决定；因此，有必要在原位研究其行为 体内 生理生态位。目前，特异性靶向腹膜巨噬细胞的方法主要依赖于全鼠转基因模型。本文提供一种高效 体内 描述了使用慢病毒颗粒对腹膜巨噬细胞中mRNA和小RNA（如microRNA）表达的调控。慢病毒制备在HEK293T细胞中进行，并通过单层蔗糖梯度纯化。 在体内的 通过腹腔注射慢病毒后的有效性验证显示，感染主要局限于局部组织的巨噬细胞。在稳态条件下以及巯基葡聚糖诱导的腹膜炎模型中，均成功实现了对腹腔巨噬细胞的靶向。本文讨论了该方案的局限性，包括慢病毒腹腔递送可能引发的轻度炎症反应以及后续实验的时间限制。总体而言，本研究提供了一种快速且易于实施的方案，可用于快速评估基因在腹腔巨噬细胞中的功能 体内.

引言

组织驻留巨噬细胞（Mφ）是一类异质性的吞噬性免疫细胞，能够感知并响应入侵的病原体1,2。此外，它们在组织发育、重塑以及维持稳态中发挥着关键作用1,3。许多组织中的Mφ起源于胚胎发生过程中的卵黄囊前体细胞，并可在组织中持续终生4,5。这些细胞的表型和功能由特定的转录因子与局部微环境之间的协同和层级相互作用共同决定6,7,8,9。随着对这种依赖性认识的不断深入，迫切需要建立高效且适用于生理微环境中的Mφ基因操作的in vivo方法。

慢病毒载体是体内特定细胞群核酸操作中常用的工具in vivo10,11,12，这主要归因于其能够感染分裂和非分裂细胞，并可稳定整合到宿主基因组中13,14。在过去的二十年中，慢病毒递送技术不断优化，研究人员已探索使用不同的包膜蛋白和合成启动子以提高谱系特异性靶向能力8,15。由于具有广泛的细胞嗜性，水疱性口炎病毒包膜糖蛋白（VSV-G）16,17已成为慢病毒技术中使用的“金标准”包膜蛋白。

在此方案中18，采用VSV-G假型慢病毒颗粒来演示将短发夹RNA（shRNA）和微小RNA（miR）靶向且高效地递送至小鼠腹腔巨噬细胞Mφ 腹膜组织驻留巨噬细胞φ) 在体内， 稳态下19转基因表达由脾灶形成病毒（SFFV）启动子驱动。细胞的有效感染通过慢病毒编码的增强型绿色荧光蛋白（GFP）的表达来确定。该方法的应用实现了对 在体内 慢病毒实验以确定最佳剂量和实验时间框架。最后， 体内 小鼠在巯基葡萄糖诱导的炎症期间接受慢病毒攻击，揭示了对选择性腹膜巨噬细胞（pM）的天然趋向性φ 感染

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方案

所有动物实验均按照机构和英国政府内政部的指导原则进行。

注意：所有涉及慢病毒的体内研究均应遵循当地和国家关于实验动物伦理使用的指南，并遵守与使用第二类感染性材料相关的所有规定。动物福利也应根据当地法规进行监测。在本实验步骤中，操作慢病毒颗粒和锐器时需格外小心。

1. 转染前HEK293T细胞的准备

注意：这些步骤需在无菌的组织培养生物安全柜中进行。

  1. 通过将450 mL DMEM与10%（v/v）胎牛血清（50 mL）及终浓度为100 U/mL的青霉素/链霉素混合，制备用于HEK293T细胞的完全杜尔贝科改良伊格尔培养基（cDMEM）。
  2. 在计划转染前至少一周解冻HEK293T细胞。维持良好的生长条件，并每2-3天使用胰蛋白酶+EDTA将细胞从培养瓶中消化传代一次。
  3. 转染前一天，小心吸除细胞中的培养基，并用无菌DPBS轻柔洗涤细胞。向培养瓶中加入1-5 mL胰蛋白酶，于37 °C、5% CO2培养箱中孵育2-5分钟。
  4. 加入5-10 mL cDMEM，以350 × g离心5分钟。弃去上清液，将细胞沉淀重悬于10 mL cDMEM中。计数细胞，并在20 mL cDMEM中每T175培养瓶接种10-11 × 106个活HEK293T细胞。
  5. 于37 °C、5% CO2培养箱中过夜培养，使HEK293T细胞达到70%-80%融合度。
  6. 次日，在光学显微镜下确认细胞融合度。
  7. 使用25 mL血清移液管小心吸除培养瓶中的培养基，避免扰动细胞单层。
  8. 轻柔加入10 mL DPBS，并轻轻晃动培养瓶以洗涤细胞，注意避免扰动细胞单层。
  9. 使用25 mL血清移液管吸除DPBS。
  10. 每T175培养瓶沿瓶壁加入15 mL新鲜cDMEM，避免扰动细胞单层，然后将培养瓶放回37 °C培养箱中继续培养。

2. 使用非脂质体脂质转染试剂对HEK293T细胞进行转染

  1. 在15 mL离心管中配制慢病毒组分：加入2 µg慢病毒质粒、1.5 µg pΔ8.91（pCMV-Δ8.91）和1 µg pMD2.G（pCMV-MD2.G），用转染试剂盒中的EC缓冲液定容至终体积600 µL。
  2. 加入36 µL增强剂溶液。使用1 mL移液器反复吸取部分液体并逐滴加回到剩余溶液中，混匀各组分。室温（RT）静置5分钟。
  3. 加入120 µL转染试剂，以上述方式轻轻吹打混合约20次。室温孵育10分钟。
  4. 加入5.2 mL完全DMEM培养基（cDMEM），用5 mL血清移液管以上述方式混匀。
  5. 使用一次性转移移液器将转染混合物逐滴直接加至HEK293T细胞单层表面（避免接触培养瓶壁），并在培养瓶内不同位置分散加入，使混合物均匀分布。
  6. 轻轻左右摇动培养瓶以均匀分布质粒。注意避免液体进入瓶盖内。
  7. 将培养瓶置于37 °C、5 % CO2培养箱中孵育48小时。转染后24小时内，在细胞成像荧光显微镜下观察荧光标记物（本实验中为GFP）的表达情况，以确认HEK293T细胞转染效率。
    注意：对于不含荧光标记的构建体，需通过适当技术检测HEK293T细胞中所用标记基因的存在，或目标基因/蛋白表达水平的变化，例如定量PCR（qPCR）。或者，在后续实验阶段通过上述技术在Jurkat细胞上测试慢病毒文库时，可间接验证转染是否成功。
    ​警告：转染后的HEK293T细胞具有感染性，操作时应采取适当的安全防护措施。须遵守当地安全规定，通常包括在二级生物安全柜内操作、佩戴双层手套，并使用适当的去污溶液进行消毒，例如高浓度废液漂白剂（2,000 ppm）或符合机构生物安全指南的等效溶液。所有与慢病毒制备接触过的溶液和塑料制品均应按照机构的生物安全程序进行消毒处理。

3. 慢病毒颗粒的收集

  1. 按照机构生物安全指南，在桶中配制去污溶液，即高浓度（2,000 ppm）次氯酸钠（漂白剂）溶液或等效试剂，并将其置于生物安全柜中。
  2. 清理生物安全柜，移除多余物品，例如空的离心管架等。
  3. 为每个T175 HEK293T细胞培养瓶预先标记一个50 mL离心管，并打开管盖，将离心管放置于稳定的管架中。
  4. 从培养箱中取出培养瓶，使用配备488 nm激光的荧光显微镜确认GFP表达（图1A）。信号强度取决于转染效率及所使用的构建体。
  5. 将细胞培养基收集至预先标记的50 mL离心管中。倾斜转染后的T175 HEK293T细胞培养瓶，使培养基汇集于瓶底一角。使用25 mL血清移液管小心吸取培养基，避免扰动细胞单层。此时可能观察到少量悬浮细胞。将收集的培养基转移至一个新的50 mL离心管中，并拧紧管盖。
    1. 使用25 mL血清移液管向培养瓶中加入25 mL新鲜、预温的cDMEM培养基。注意将培养基沿瓶壁缓慢加入，避免直接冲击细胞单层。将转染后的HEK293T细胞培养瓶放回培养箱（37 °C，5% CO2）。
      注意：在完成上述步骤后，可于额外培养24小时后进行第二次慢病毒收集及进一步纯化。
  6. 在24小时或48小时慢病毒收集完成后，向培养瓶中加入去污溶液，确保完全覆盖细胞单层。将培养瓶保持水平状态24小时，随后按照适当的II类生物危害物处理规定进行丢弃。

4. 慢病毒的纯化

  1. 过滤步骤 3.5 收集的培养基。
    1. 从50 mL注射器中取出活塞，将低蛋白吸附的聚醚砜或聚偏二氟乙烯0.45 µm无菌滤器插入注射器末端。使用25 mL血清移液管，将步骤3.5.1中收集的培养基加入注射器，然后轻柔地将活塞推回原位。
    2. 缓慢推动插头，使液体通过滤器进入一个新的50 mL离心管中。如果流速明显减慢，将带有滤器的注射器朝上放置，并向外拉动活塞，直至液体完全脱离滤膜。
    3. 小心地将注射器上的滤器更换为新的滤器，并将使用过的滤器丢弃至去污染溶液中。继续进行培养基过滤。完成后，将滤器浸入去污染溶液中，并用去污染溶液充满注射器，以对滤器和注射器进行去污染处理。
  2. 将超速离心机预冷，设置温度为 4 °C，并关闭离心机盖以使温度达到平衡。
  3. 向锥形超速离心管底部加入 3 mL 20 % 蔗糖溶液（20% w/v，超纯水配制，使用 0.22 µm 滤器过滤除菌）。
  4. 使用25 mL血清移液管，将过滤后的培养基小心地铺加在蔗糖层上方，注意不要扰动各层。
    1. 使用移液器助吸器的最低速度档位。将锥形超速离心管倾斜至约45°，缓慢将步骤4.1中获得的过滤后含慢病毒的培养基沿管壁加入。确保培养基与蔗糖溶液不混合，各层之间有清晰的分界。图1B随着培养基层体积的增加，缓慢将超速离心管倾斜回直立位置。
  5. 如果超速离心管中的总体积（包括蔗糖和培养基）少于29 mL，需用新鲜的cDMEM补足，以防止离心过程中离心管塌陷。对于多次T175培养瓶的收集，将过滤后的培养基混合，并使用多个超速离心管。根据需要，用培养基补足最后一个超速离心管的体积。
  6. 确保超速离心机的吊桶清洁，吊桶底部或盖子上无培养基残留。必要时，用约70%的酒精擦拭。在每个吊桶底部放入合适的离心管适配器。图1C）并将超速离心管轻轻放入离心桶中。
  7. 将桶盖牢固关闭，并悬挂在外摆转子指定的位置上。
  8. 确保各吊桶中蔗糖和培养基的体积相等以保持平衡。使用甩出式转子时，严禁不安装吊桶进行运转，但相对的吊桶可保持空置。20 (图1D).
  9. 小心将转子插入超速离心机并开启真空。将超速离心机的加速度和减速度设为最低档，以85,000 x g离心慢病毒制备物 g 4 °C下孵育90分钟。
  10. 等待超速离心机达到所需转速（约3-5分钟）后再离开，以确保转子已正确安装且离心过程不会中止。
  11. 超速离心机运行期间，应根据二级生物安全要求清理工作区，并为后续步骤做好准备。
  12. 离心结束后，关闭真空，小心取出转子，避免扰动样品。
  13. 检查超速离心机是否有溢出物，并确认吊桶无泄漏。若发生溢出，应戴双层手套，并使用抗病毒产品对离心机及吊桶外表面进行去污处理。
  14. 从超速离心机中取出转子桶，并小心将其转移至II级生物安全柜中。
    注意：慢病毒颗粒会聚集在超速离心管底部，沉淀物肉眼不可见。
  15. 将蔗糖和培养基一次性直接倒入含有去污溶液的废液容器中。
  16. 保持超速离心管倒置，将其转移至双层纸巾上，静置干燥10分钟。同时，用浸湿的纸巾擦拭离心桶内壁，并倒置晾干。
  17. 用纸巾小心擦干超速离心管管口残留的液体，然后将其直立放置。对使用过的纸巾及下方表面进行消毒。
  18. 将病毒沉淀物用1 mL无血清培养基或后续实验所需的溶液轻轻吹打重悬。在II级生物安全柜内室温静置15分钟。
  19. 使用1 mL移液器在分装前轻轻混匀慢病毒制备液，然后分装至1.5 mL螺口管（例如冻存管）中。将分装好的样品准备好用于后续步骤 体内 工作体积（100 µL）及Jurkat T细胞中的慢病毒滴度测定（1 × 20 µL）（见步骤5）。
  20. 避免冻融循环；慢病毒制剂可在 -80 °C 下保存长达 6 个月，而不会对感染活性产生不利影响。

在 Jurkat T 细胞中进行慢病毒生产的滴定

  1. 通过在500 mL RPMI-1640培养基中添加10%（v/v）胎牛血清以及终浓度为100 U/mL的青霉素/链霉素，配制用于Jurkat T细胞的完全Roswell Park Memorial Institute 1640培养基（cRPMI-1640）。
  2. 为确保Jurkat T细胞处于健康生长状态，在感染前将细胞培养不超过1周。
  3. 在慢病毒滴定当天，将活细胞以每孔2 × 105个细胞、每孔200 µL cRPMI-1640的条件接种于24孔板中。
  4. 使用 freshly collected 慢病毒，或将含有20 µL的慢病毒冻存管置于冰上解冻，并通过轻柔吹打混匀。
  5. 用cRPMI-1640进行系列稀释后，分别加入0.25 µL、0.5 µL、1 µL、2.5 µL、5 µL和10 µL的慢病毒原液感染Jurkat T细胞。轻轻摇动培养板以确保慢病毒均匀分布。未感染的Jurkat T细胞作为阴性对照。
  6. 将培养板置于37 °C培养箱中孵育。4小时后，向每孔补充cRPMI-1640至总体积为400 µL，并将培养板放回37 °C培养箱继续培养3天。
  7. 感染后48小时，通过荧光成像系统确认GFP表达情况。
  8. 感染后第3天，将24孔板中各孔的细胞分别收集至独立的1.5 mL离心管中，在4 °C条件下以350 × g离心5分钟。
  9. 弃去上清液，将沉淀重悬于300 µL含2%（w/v）多聚甲醛（PFA）的DPBS溶液中，置于冰上避光孵育15分钟。
  10. 在4 °C条件下以350 × g离心5分钟，弃上清，将沉淀重悬于流式细胞术缓冲液（FACS缓冲液，即无菌DPBS + 4% FCS + 1 mM无菌EDTA）中。
  11. 通过流式细胞术分析慢病毒感染组及其对照组细胞中GFP的表达频率和平均荧光强度（图2）。

6. 体内 组织驻留型腹腔巨噬细胞的慢病毒感染

  1. 在II级生物安全柜中，使用一次性胰岛素针头（为动物福利及避免针头内液体损失，建议使用30 G针头）装载含有所需量慢病毒的无血清培养基，总体积为200 µL。
  2. 采用单手 scooping 技术将针头套重新套回针头。保持针头置于冰上，并在30分钟内完成注射。
  3. 在动物实验设施中，注射前设置好II级生物安全柜（图1E）。
    1. 铺一张洁净的纸巾。松开装有慢病毒的胰岛素针头的针头套。
    2. 准备一个培养皿，内含小块纸巾和基于氯己定葡萄糖酸盐的消毒剂；另准备一个50 mL离心管，内装去污溶液（2,000 ppm次氯酸钠溶液），以及一个锐器安全收集容器。
  4. 通过抓握小鼠颈背部皮肤固定小鼠21。正确固定后的小鼠应保持静止不动，这是操作安全的必要条件。
  5. 使小鼠腹部朝上，头部略向下倾斜。将慢病毒注射至腹腔右下象限，以避免刺入腹腔内器官。
  6. 在释放小鼠之前，用去污溶液填充注射器，并将其安全丢弃至锐器安全盒中。
  7. 用浸有消毒剂的纸巾擦拭小鼠腹部的注射部位，然后将动物放回笼具中。
  8. 将注射慢病毒的小鼠饲养于II级隔离笼（scantainer）或独立通气笼具（IVC）（配备高效空气过滤系统的隔离笼具）中，注射后至少隔离72小时。在笼具前方放置适当的信息标签卡。
  9. 根据当地安全规定，在感染后72小时将小鼠转移至新的I级饲养笼具。从注射日起每日监测小鼠，持续共3天。

7. 收集慢病毒感染小鼠的腹腔细胞

警告：在慢病毒注射后72小时内进行样本收集时，须遵循机构规定的生物安全二级标准。在慢病毒注射后最初72小时内饲养感染动物的垫料及饲养笼盒，必须根据机构规定的生物安全二级标准进行去污处理。

  1. 根据机构规定实施小鼠安乐死，例如通过吸入浓度递增的 CO2，随后以颈椎脱位法确认死亡。
  2. 用 70% 异丙醇清洁小鼠腹部，并小心剪开皮肤以暴露腹膜腔膜。
  3. 使用 10 mL 注射器和 23 G 针头，以 6 mL 冰冷的 FACS 缓冲液冲洗腹膜腔。注意避免刺穿任何器官。
  4. 轻柔按摩腹膜，使细胞脱落进入 FACS 缓冲液中。
  5. 用同一注射器和针头收集腹腔灌洗液。
  6. 取下针头，将细胞转移至 15 mL 离心管中。
  7. 将腹腔灌洗液置于冰上保存。
  8. 采集实验所需的其他器官，并根据研究要求妥善保存。
  9. 按照当地动物管理和安全指南处理动物尸体。

8. 腹膜细胞染色与分析

  1. 将腹腔灌洗液在 4 °C 条件下以 350 × g 离心 5 分钟，弃去上清液至去污溶液中，用 1 mL FACS 缓冲液重悬细胞。
  2. 计数收集的细胞，并将每孔 4 × 105 个细胞接种至 V 型底 96 孔板中。
  3. 使用可固定活死细胞染色试剂（例如本实验所用的可固定近红外死细胞染色试剂盒）按照制造商说明书进行活率染色。
  4. 如果细胞在最近 72 小时内被感染，则将细胞在冰上用 2% 多聚甲醛（PFA）固定 15 分钟。加入等体积的冷 DPBS，并在 4 °C 条件下以 350 × g 再次离心 5 分钟。
  5. 配制封闭缓冲液：在 FACS 缓冲液（用于表面染色）或通透缓冲液（用于细胞内染色）中加入 4 µg/mL 的 2.4G2 抗体和 10%（v/v）大鼠血清。
  6. 将每孔含细胞沉淀的样品用 50 µL 封闭缓冲液重悬，并在 4 °C 孵育 15 分钟。
  7. 为每个样品配制抗体混合液，每份使用 50 µL FACS 缓冲液（用于表面染色）或通透缓冲液（用于细胞内染色）。每份样品的最终染色体积为 100 µL，其中包括 50 µL 封闭缓冲液。根据此总体积计算相应的抗体浓度（表 1）。
  8. 向样品中加入 50 µL 抗体混合液，向对照样品中加入 50 µL 同型对照抗体和对照缓冲液。将样品在冰上避光孵育 30 分钟。根据需要设置未染色细胞和同型对照。
  9. 每孔用 100–200 µL 冰冷 DPBS 洗涤，然后在 4 °C 条件下以 350 × g 离心 5 分钟。重复此步骤以去除未结合的抗体。随后在流式细胞仪上分析样品。

9. 从器官中提取细胞

  1. 为每个器官准备 1 mL 消化液：将 Hanks 平衡盐溶液（HBSS）、2 mg/mL IV 型胶原酶和 0.03 mg/mL DNase I 混合（肺组织消化需额外加入 1.5 mg/mL 透明质酸酶）。
  2. 将收集的器官转移至 1 mL 消化液中，并用剪刀剪碎。
  3. 用 40 µm 细胞筛过滤细胞，于 4 °C 下以 350 × g 离心 5 分钟。
  4. 若从肺、脾或肝中分离细胞，使用 ACK 裂解缓冲液（150 mM NH4Cl、10 mM KHCO3、0.1 mM Na2EDTA，pH = 7.4）裂解红细胞。用 40 µm 细胞筛过滤细胞，于 4 °C 下以 350 × g 离心 5 分钟。
  5. 按照第 8 节所述方法对细胞进行染色和分析。

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结果

当完全且正确地执行本方案时，每次制备可获得总量为1.5 mL的高质量慢病毒原液，足以用于十二次实验 体内 根据本研究确定的最佳体积进行注射18转染的成功可在实验方案的早期进行评估。健康的、汇合的HEK293T细胞在转染质粒48小时后，若质粒中含有可检测的标记基因（例如本研究中使用的GFP），应显示出易于检测的标记信号。图1A信号强度低、细胞过度脱落以及实验早期步骤中细胞融合度低，可能表明细胞死亡，将导致慢病毒制备的产量降低。在可选收集步骤II（步骤3.5.1）之前出现一定程度的细胞脱落是可见且正常的。

本实验方案中使用三种质粒以产生慢病毒颗粒：pCMV-ΔR8.91 包装质粒，编码HIV-1结构蛋白（Gag）、辅助蛋白Tat和Rev以及逆转录酶聚合酶（Pol）22；pMD2.G 质粒，在CMV启动子驱动下编码VSV-G包膜蛋白13；以及根据需要改造的pHR'SIN...

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讨论

组织驻留型巨噬细胞执行多种维持稳态及炎症相关的组织特异性功能1,2 由其生理环境决定6,7,8,9在本方案中，一种高效的方法18 用于操控腹膜组织驻留巨噬细胞 在体内 利用慢病毒颗粒研究巨噬细胞在其生物学微环境中的功能。

使用健康的 HEK293T 细胞对于本方案的成功至关重要。建议至少在开始本方案前一周复苏细胞，以确保细胞充分恢复并达到理想数量。应在计划转染的前一天，将细胞以适当体积的培养基接种，使其在转染当天达到约 80% 的融合度。细胞密度过低或过高均会导致慢病毒产量降低。为获得最佳结果，建议按照转染试剂生产商的说明对 HEK293T 细胞进...

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披露

作者无任何利益冲突需要披露。

致谢

本研究全部或部分由惠康信托调查员奖 [107964/Z/15/Z] 资助。P.R.T 还得到了支持 英国痴呆症研究所。M.A.C. 获得生物技术和生物科学研究理事会发现研究员项目（Biotechnology and Biological Sciences Research Council Discovery Fellowship）的支持。BB/T009543/1）。为开放获取的目的，作者已对由此投稿产生的任何作者接受稿版本应用了CC BY公共版权许可。L.C.D 是斯旺西大学的讲师，同时也是卡迪夫大学的荣誉研究员。本工作得到了Ipseiz等人2020年所开展工作的支持。18.

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
0.05% 胰蛋白酶-EDTA (1x) (胰蛋白酶 500 mg/L 或 0.02 mM)Thermo Fisher Scientific25300054
0.22 μm 无菌 millex GP 滤器MerckSLGS033SS
0.45 μm 无菌 millex GP 滤器MerckSLHP033RS
0.5 mL U-100 胰岛素注射器（带针头，0.33 mm × 12.7 mm (29 G)）BD324892
1 升锐器盒N/AN/A
2.4G2 抗体 (TruStain FcX 抗小鼠 CD16/32)Biolegend101320
40 μm 细胞筛Thermo Fisher Scientific22363547
AimV 培养基（研究级），AlbuMax 补充剂Thermo Fisher Scientific31035025
封闭缓冲液实验室自制
Brewer 巯基乙酸盐培养基Sigma-AldrichB25514% 储存液以水配制，经高压灭菌后冷冻保存
CD11bBiolegend101222稀释比例和浓度请参见表 1
CD11bBD550993稀释比例和浓度请参见表 1
CD11cBiolegend117317稀释比例和浓度请参见表 1
CD11cBiolegend117333稀释比例和浓度请参见表 1
CD19BD560375稀释比例和浓度请参见表 1
CD19Biolegend152410稀释比例和浓度请参见表 1
CD226Biolegend128808稀释比例和浓度请参见表 1
CD3eBD560527稀释比例和浓度请参见表 1
CD3eBiolegend152313稀释比例和浓度请参见表 1
CD4Biolegend100412稀释比例和浓度请参见表 1
CD73eBioscience16-0731-82稀释比例和浓度请参见表 1
CD8aeBioscience48-0081-82稀释比例和浓度请参见表 1
细胞培养瓶 (T175 培养瓶，175 cm2，550 mL)Greiner Bio One658175
离心管，锥底管 (25 mm × 89 mm)Beckman Coulter358126
离心机Beckman Coulter超速离心机和 TC 离心机
IV 型胶原酶Sigma-AldrichC5138
锥形离心管 (15 mL 和 50 mL)Greiner Bio One11512303 & 11849650
冻存管Greiner Bio One123277或冻存管
DMEM 培养基 (1x) + 4.5 g/L D-葡萄糖，400 µM L-谷氨酰胺Thermo Fisher Scientific41965-062
DNase ISigma-Aldrich11284932001
Effectene 转染试剂Qiagen301425
F4/80Biolegend123123稀释比例和浓度请参见表 1
F4/80Biolegend123133稀释比例和浓度请参见表 1
F4/80Biolegend123147稀释比例和浓度请参见表 1
FceR1eBioscience48-5898-80稀释比例和浓度请参见表 1
胎牛血清 (FCS) Thermo Fisher Scientific10270-10656 °C 水浴 30 分钟灭活，经 0.22 μm 滤器无菌过滤
流式细胞仪Thermo Fisher Scientific Attune NxT
流式细胞术 (FACS) 缓冲液实验室自制
荧光细胞培养显微镜Thermo Fisher ScientificEVOS FL
镊子N/AN/A用户自选
Hank's 平衡盐溶液 (HBSS)Gibco, Life Technologies14175-053
HEK293T 细胞系转染前至少培养一周，无支原体污染
HIV-1 核心抗原Beckman Coulter6604667
透明质酸酶Sigma-AldrichH3506
Hydrex 外科洗手液，含 4% w/v 葡萄糖酸氯己定皮肤清洁剂Ecolab3037170
I-A/I-EBiolegend107625稀释比例和浓度请参见表 1
ICAM1Becton Dickinson554970稀释比例和浓度请参见表 1
Jurkat T 细胞系使用前至少培养一周，无支原体污染
LIVE/DEAD 可固定近红外死细胞染色试剂盒Thermo Fisher ScientificL34975
Ly6GBiolegend127615稀释比例和浓度请参见表 1
小鼠此处使用 8–12 周龄 C57BL/6 雌性小鼠（Charles Rivers），除非另有说明
微量移液器（体积范围 0.5–1,000 μL）Fisher Scientific & Starlab11963466 & 11943466 & 11973466 & S1111-3700
NK1.1Biolegend108724稀释比例和浓度请参见表 1
多聚甲醛Sigma-AldrichP6148-500G以 PBS 配制成 2% w/v 溶液
pCMV-ΔR8.91 包装质粒Zuffrey, R., et al. 1997编码由巨细胞病毒启动子驱动的 Gag-Pol HIV 蛋白，具有氨苄青霉素抗性
青霉素/链霉素 (100x, 10,000 U/mL)Thermo Fisher Scientific15140122
培养皿Greiner Bio One664160
pHR'SIN-cPPT-SEW 质粒Rosas, M. et al. 2014经改造用于 shRNA 和 miR 表达研究，编码位于 SFFV 启动子下游和土拨鼠肝炎病毒增强子上游的 EGFP 标记基因，具有氨苄青霉素抗性
pMD2.G 质粒Naldini, L. et al. 1996编码水疱性口炎病毒糖蛋白 (VSV-G) 包膜蛋白，具有氨苄青霉素抗性
大鼠 IgG1, κ 同型对照Becton Dickinson550617稀释比例和浓度请参见表 1
大鼠血清Sigma-AldrichR9759-10ML
红细胞 ACK 裂解缓冲液实验室自制
RPMI 1640 培养基 (1x) + 400 uM L-谷氨酰胺Thermo Fisher Scientific21875-091
皂苷Sigma-AldrichS4521
SiglecFBD562681稀释比例和浓度请参见表 1
次氯酸钠片剂（漂白剂，2,000 ppm）Guest MedicalH8818
无菌 24 孔细胞培养板Greiner Bio One662160
无菌杜氏磷酸盐缓冲液 (DPBS) (1x) Mg++ 和 Ca2+ 无Thermo Fisher Scientific14190144
无菌 EDTAThermo Fisher Scientific15575020
无菌 VWR 一次性移液管 (23.0 mL, 30 cm)VWR612-4515
蔗糖Thermo Fisher Scientific15503022
手术剪N/AN/A用户自选
注射器 (50 mL 和 10 mL)Fisher Scientific10084450 & 768160
Tim4Biolegend130007稀释比例和浓度请参见表 1
U 型底 96 孔细胞培养板Greiner Bio One650180

参考文献

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