日本脑炎疫苗接种儿童中淋巴细胞检测的流式细胞仪跨实验室标准化

摘要

本研究建立了一种方法，用于在两个实验室的两台流式细胞仪之间转移实验设置和分析模板，以检测日本脑炎疫苗接种儿童中的淋巴细胞。该流式细胞仪实验的标准化方法将有助于在多个研究中心有效地开展科研项目。

摘要

越来越多的实验室需要从多台流式细胞仪中收集数据，尤其是在多个研究中心之间开展的研究项目中。在不同实验室使用两台流式细胞仪所面临的挑战包括缺乏标准化材料、软件兼容性问题、仪器设置不一致，以及不同流式细胞仪采用不同配置等问题。为了建立标准化的流式细胞术实验，实现跨多个研究中心实验结果的一致性和可比性，已建立了一种快速且可行的标准化方法，用于在不同流式细胞仪之间转移实验参数。

本研究建立的方法实现了在不同实验室的两台流式细胞仪之间转移实验设置和分析模板，用于检测日本脑炎（JE）疫苗接种儿童中的淋巴细胞。通过使用荧光标准微球建立细胞仪设置，两台细胞仪之间获得了稳定的荧光强度。在配备不同类型仪器的两个实验室中获得了可比的结果。利用该方法，我们能够在不同实验室和不同仪器条件下对JE疫苗接种儿童的免疫功能评估进行标准化分析，减少多中心流式细胞仪之间数据和结果的差异，并为实验室结果的相互认可提供可行的途径。流式细胞仪实验的标准化方法将确保多中心研究项目的有效实施。

引言

流式细胞术的标准化有助于不同实验室和研究中心使用不同流式细胞仪所获得结果之间的可比性，并促进结果的相互认可，从而提高工作效率。越来越多的应用场景需要实现标准化。在药物研发过程中，流式细胞术的标准化尤为重要，因为经过开发和验证的检测方法将支持从临床前到临床分析的整个药物研发过程。流式细胞术方法经常在制药行业与合作实验室之间进行转移¹。此外，在多中心临床研究中获得可比数据也至关重要。例如，在系统性自身免疫性疾病多中心临床研究项目中，已建立标准化工作流程，以实现多中心流式细胞术数据的可比性²。

流式细胞术方法的标准化具有挑战性。不同实验室面临的问题主要归因于缺乏标准化材料、软件兼容性问题、仪器设置不一致，以及不同流式细胞仪之间的配置差异和各中心之间不同的设门策略^3,4。因此，实验室之间开展差距分析至关重要。必须对样本获取、质量体系、人员资质和仪器配置进行审查，以确保满足相关要求。

目前，接种日本脑炎（JE）疫苗的儿童，其日本脑炎发病率显著降低⁵监测外周血免疫细胞有助于了解接种疫苗后细胞介导的适应性免疫的变化，以及外周血淋巴细胞亚群变化与疫苗接种效果之间的相关性。由于全血....

方案

本研究经首都医科大学附属北京儿童医院伦理委员会批准（批准号：2020-k-85）。由于本研究仅使用临床检测后剩余的样本，因此豁免了受试者的知情同意。本研究涉及两个实验室。其中，转移实验室是使用一台流式细胞仪建立标准化方法的实验室，该实验室的细胞仪以下简称细胞仪A；测试方法实验室是接收该方法并使用另一台流式细胞仪进行检测的实验室，该实验室的细胞仪以下简称细胞仪B。

1. 外周血样本采集与细胞制备

1. 采用标准静脉穿刺法，从接种过乙型脑炎疫苗的儿童和未接种疫苗的儿童中采集外周血样本（2 mL），置于含EDTA-K₂抗凝剂的试管中。
2. 通过将试管倒置10次混匀全血样本。取100 µL全血加入一支12 mm × 75 mm的试管中。每个样本设两个复孔。
3. 向一支12 mm × 75 mm的试管中加入10 µL Brilliant染色缓冲液（BV缓冲液）。加入每种抗体各5 µL（CD45、CD3、CD4、CD8、CD127、CD27、CD19、IgD；稀释倍数：1:20），以及20 µL抗体（CD25、CD45RA；稀释倍数：1:5），加入BV缓冲液中。轻轻涡旋混匀。
   注：抗体试剂的体积及信息见表1

结果

图1 展示了CST亮珠目标值模板的全局工作表。通过FSC/SSC图，绘制多边形门以选择CST亮珠。获得了CST亮珠在10个荧光通道的直方图：FITC、PE、BB700、PE-Cy7、APC、R718、APC-H7、BV421、V500和BV605。每个参数的目标值在表2中通过直方图门控内的中位数显示。细胞仪A和细胞仪B软件中模板及参数设置的截图见补充图S1。

图2 显示了仪器标准化后，两台仪器对同一样本的散点图结果。数据表明，使用自动分析模板可在不同仪器之间获得一致的结果。在表3中，比较了两种不同型号仪器对六个样本的检测结果。两个实验室测得的15种淋巴细胞亚群百分比均无显著差异。这些结果表明，采用标准化方法可获得高度可比的数据。不同仪器检测的15种淋巴细胞亚群百分比详见补充表S1。

讨论

外周血淋巴细胞亚群的免疫表型分析有助于了解儿童接种疫苗后细胞介导的适应性免疫变化。在临床应用中，常会出现一些意外情况，例如未能及时检测样本或流式细胞仪被更换；因此，亟需能够促进不同实验室间流式细胞仪转移的快速标准化方法^9,10,11。本文介绍了一种快速标准化方法，以确保不同仪器之间获得一致的结果。该标准化方法已用于监测儿童接种疫苗后外周血中的免疫细胞，并在两个实验室中获得了高度一致的结果。该标准化方法建立于BD Canto与LSRFortessa之间，同样适用于FACSCelesta、FACSymphony A5和FACSAria II。与其他标准化方法^2,3相比，本方法无需借助第三方软件即可实现数据一致性，仅利用Diva软件的特性创建包含目标值位置和自动分析功能的模板模块，从而实现不同仪器间的转移，并降低数据分析的难度。该方法节省时间.......

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
BD CompBeads Anti-Mouse Ig，κ/阴性对照补偿微粒试剂盒	BD	552843	补偿
BD FACSCanto	BD	FACSCanto	转接实验室中的流式细胞仪A
BD FACSDiva CS&T 研究用微球	BD	655051	定义流式细胞仪基线并追踪仪器性能
BD Horizon BV421 小鼠抗人 CD127	BD	562436	荧光抗体
BD Horizon BV605 小鼠抗人 CD27	BD	562656	荧光抗体
BD Horizon V500 小鼠抗人 CD45	BD	560777	荧光抗体
BD LSRFortessa	BD	LSRFortessa	检测方法实验室中的流式细胞仪B
BD OptiBuild BB700 小鼠抗人 CD19	BD	745907	荧光抗体
BD OptiBuild R718 小鼠抗人 CD8	BD	751953	荧光抗体
BD Pharmingen APC 小鼠抗人 CD45RA	BD	550855	荧光抗体
BD Pharmingen APC-H7 小鼠抗人 CD3	BD	560176	荧光抗体
BD Pharmingen FITC 小鼠抗人 CD4	BD	566320	荧光抗体
BD Pharmingen PE 小鼠抗人 CD25	BD	555432	荧光抗体
BD Pharmingen PE-Cy7 小鼠抗人 IgD	BD	561314	荧光抗体
Brilliant 染色缓冲液 Plus	BD	566385	染色缓冲液
离心机	Eppendorf	5810	细胞离心
离心管	BD Falcon	BD-35209715	15 mL 离心管
CS&T IVD 微球	BD	662414	用于在不同流式细胞仪中设定仪器参数的标准微球
溶血液 10 倍浓缩液	BD	349202	裂解红细胞
磷酸盐缓冲液（PBS）	Gibco	10010-023	PBS
圆底试管	BD Falcon	352235	5 mL 试管