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方法文章

日本脑炎疫苗接种儿童中淋巴细胞检测的流式细胞仪跨实验室标准化

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DOI：

10.3791/64949

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2023年2月10日

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1Center of Excellence (Beijing), Becton Dickinson Medical Devices (Shanghai) Co Ltd, 2Beijing Key Laboratory of Pediatric Respiratory Infectious Diseases, Key Laboratory of Major Diseases in Children, Ministry of Education, National Clinical Research Center for Respiratory Diseases, Laboratory of Infection and Virology, Beijing Pediatric Research Institute, Beijing Children's Hospital, Capital Medical University, National Center for Children's Health, 3Research Unit of Critical Infection in Children, 2019RU016, Chinese Academy of Medical Sciences

* These authors contributed equally

本文内容

摘要

本研究建立了一种方法，用于在两个实验室的两台流式细胞仪之间转移实验设置和分析模板，以检测日本脑炎疫苗接种儿童中的淋巴细胞。该流式细胞仪实验的标准化方法将有助于在多个研究中心有效地开展科研项目。

摘要

越来越多的实验室需要从多台流式细胞仪中收集数据，尤其是在多个研究中心之间开展的研究项目中。在不同实验室使用两台流式细胞仪所面临的挑战包括缺乏标准化材料、软件兼容性问题、仪器设置不一致，以及不同流式细胞仪采用不同配置等问题。为了建立标准化的流式细胞术实验，实现跨多个研究中心实验结果的一致性和可比性，已建立了一种快速且可行的标准化方法，用于在不同流式细胞仪之间转移实验参数。

本研究建立的方法实现了在不同实验室的两台流式细胞仪之间转移实验设置和分析模板，用于检测日本脑炎（JE）疫苗接种儿童中的淋巴细胞。通过使用荧光标准微球建立细胞仪设置，两台细胞仪之间获得了稳定的荧光强度。在配备不同类型仪器的两个实验室中获得了可比的结果。利用该方法，我们能够在不同实验室和不同仪器条件下对JE疫苗接种儿童的免疫功能评估进行标准化分析，减少多中心流式细胞仪之间数据和结果的差异，并为实验室结果的相互认可提供可行的途径。流式细胞仪实验的标准化方法将确保多中心研究项目的有效实施。

引言

流式细胞术的标准化有助于不同实验室和研究中心使用不同流式细胞仪所获得结果之间的可比性，并促进结果的相互认可，从而提高工作效率。越来越多的应用场景需要实现标准化。在药物研发过程中，流式细胞术的标准化尤为重要，因为经过开发和验证的检测方法将支持从临床前到临床分析的整个药物研发过程。流式细胞术方法经常在制药行业与合作实验室之间进行转移1。此外，在多中心临床研究中获得可比数据也至关重要。例如，在系统性自身免疫性疾病多中心临床研究项目中，已建立标准化工作流程，以实现多中心流式细胞术数据的可比性2。

流式细胞术方法的标准化具有挑战性。不同实验室面临的问题主要归因于缺乏标准化材料、软件兼容性问题、仪器设置不一致，以及不同流式细胞仪之间的配置差异和各中心之间不同的设门策略3,4。因此，实验室之间开展差距分析至关重要。必须对样本获取、质量体系、人员资质和仪器配置进行审查，以确保满足相关要求。

目前，接种日本脑炎（JE）疫苗的儿童，其日本脑炎发病率显著降低5监测外周血免疫细胞有助于了解接种疫苗后细胞介导的适应性免疫的变化，以及外周血淋巴细胞亚群变化与疫苗接种效果之间的相关性。由于全血样本的稳定性有限，疫苗效力的评估通常在多个中心进行。在本项分析中，我们定义了初始型CD8+ 或 CD4+ T细胞作为CD27+ CD45RA+，中央记忆性T细胞（TCM）作为 CD27+ CD45RA-，效应记忆T细胞（T电子显微镜）作为 CD27- CD45RA-, 以及终末分化的效应记忆T细胞（TEMRA）作为 CD27- CD45RA+CD19+ B细胞可根据其是否表达CD27与IgD分为不同亚群6,7，初始B细胞表达CD27，而记忆B细胞（mBCs）可根据IgD的表达情况进行鉴定6，调节性T细胞（Tregs）可被鉴定为CD4+CD25++CD127低 8为建立标准化的流式细胞术实验，以实现多中心实验结果的一致性和可比性，本研究建立了一种快速且可行的标准化方法，便于在不同流式细胞仪之间转移检测乙脑疫苗接种儿童全血中淋巴细胞的实验方案。研究招募了6名来自首都医科大学附属北京儿童医院的健康儿童（2岁），这些儿童在不到6个月前已完成减毒活乙脑SA14-14-2疫苗的初免和加强免疫，随后采集其外周血样本。在标准化操作流程下，不同仪器获得了高度可比的数据，有助于开展多中心评估。

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方案

本研究经首都医科大学附属北京儿童医院伦理委员会批准（批准号：2020-k-85）。由于本研究仅使用临床检测后剩余的样本，因此豁免了受试者的知情同意。本研究涉及两个实验室。其中，转移实验室是使用一台流式细胞仪建立标准化方法的实验室，该实验室的细胞仪以下简称细胞仪A；测试方法实验室是接收该方法并使用另一台流式细胞仪进行检测的实验室，该实验室的细胞仪以下简称细胞仪B。

1. 外周血样本采集与细胞制备

  1. 采用标准静脉穿刺法，从接种过乙型脑炎疫苗的儿童和未接种疫苗的儿童中采集外周血样本（2 mL），置于含EDTA-K2抗凝剂的试管中。
  2. 通过将试管倒置10次混匀全血样本。取100 µL全血加入一支12 mm × 75 mm的试管中。每个样本设两个复孔。
  3. 向一支12 mm × 75 mm的试管中加入10 µL Brilliant染色缓冲液（BV缓冲液）。加入每种抗体各5 µL（CD45、CD3、CD4、CD8、CD127、CD27、CD19、IgD；稀释倍数：1:20），以及20 µL抗体（CD25、CD45RA；稀释倍数：1:5），加入BV缓冲液中。轻轻涡旋混匀。
    注：抗体试剂的体积及信息见表1。
  4. 将抗体混合液加入含有全血样本的试管中。轻轻涡旋混匀，并在室温避光孵育15分钟。
  5. 用蒸馏水将10倍裂解液按1:10稀释，配制1倍裂解液。向血液样本中加入2 mL 1倍裂解液以裂解细胞。轻轻涡旋混匀，在室温避光孵育10分钟。
  6. 以300 × g离心5分钟，弃去上清液。
  7. 用2 mL 1倍PBS重悬沉淀，以300 × g离心5分钟，弃去上清液。
  8. 用0.5 mL 1倍PBS重悬沉淀，并充分混匀。储存于2 °C至8 °C，并将样本送至两个实验室进行流式细胞术分析。
    ​注：阴性对照样本和单色染色细胞对照必须同时处理。

2. 准备补偿微珠和单染对照

  1. 标记V500-抗CD45单染、APC-H7-抗CD3单染、FITC-抗CD4单染、R718-抗CD8单染、BV605-抗CD27单染、APC-抗CD45RA单染、PE-抗CD25单染、BV421-抗CD127单染、BB700-抗CD19单染以及PE-CY7-抗IgD单染管。
  2. 向一个5 mL圆底聚苯乙烯试管中加入100 µL含1%胎牛血清（FBS）的1×杜氏磷酸盐缓冲液（DPBS）缓冲液。
  3. 向每管中加入50 µL阴性微珠和50 µL抗小鼠Igκ微珠，涡旋混匀。
  4. 向每根单染管中加入2 µL标记的各抗体（CD45、CD3、CD4、CD8、CD25、CD127、CD45RA、CD27、CD19、IgD），轻轻涡旋混匀，并在室温（20 °C至25 °C）避光孵育15分钟。
  5. 用2 mL 1× PBS重悬微珠，以300 × g离心5分钟，弃去上清液。
  6. 用0.5 mL 1× PBS重悬微珠并充分混匀。储存于2 °C至8 °C。

3. 在两个实验室的不同流式细胞仪上使用相同的配置名称

  1. 在细胞仪A的软件中创建一个新配置。点击细胞仪按钮，选择查看配置以显示配置窗口。
  2. 在配置列表中，右键单击基础配置文件夹，选择新建文件夹，并重命名该文件夹。
  3. 右键单击基础配置，选择复制。
  4. 右键单击新文件夹，粘贴基础配置以创建新配置。将新配置重命名为"标准化方法转移"。
  5. 从参数列表中将参数名称（例如FITC）拖动到相应的检测器（530/30）上。
  6. 向新配置中添加其他参数（PE、BB700、PE-CY7、APC、R718、APC-H7、BV421、V500和BV605）。
  7. 使用相同的名称"标准化方法转移"，按照此方法在另一种型号的流式细胞仪上创建新配置。确保该配置为每个检测器包含相同的参数。
    注意：为在两种不同型号的流式细胞仪上成功识别实验模板，请确保名称保持一致。
  8. 在细胞仪配置下，使用细胞仪设置与追踪（CST）微球定义细胞仪基线并追踪其性能。点击细胞仪按钮，选择CST以显示细胞仪设置与追踪工作区。
  9. 将三滴（150 µL）设置微球加入至5 mL圆底聚苯乙烯试管中的0.5 mL 1x PBS中。将微球管置于细胞仪上。
  10. 在设置对照窗口中，选择定义基线，然后点击运行。

4. 使用转移实验室中的流式细胞仪 A 标准化实验

  1. 使用细胞仪设置和追踪微球进行性能检查，以确认细胞仪运行状态良好。
  2. 在软件浏览器窗口中，右键单击细胞仪 设置，然后选择 应用设置 以创建工作表。
  3. 使用未染色样本，调整 前向散射光（FSC）、侧向散射光（SSC） 以及所有 荧光参数 的 光电倍增管（PMT）电压。FSC：260；SSC：460；FITC：490；PE：575；BB700：620；PE-CY7：640；APC：600；R718：620；APC-H7：620；BV421：466；V500：420；BV605：505。
  4. 右键单击实验用细胞仪的 设置，然后选择 应用设置 以保存该设置。
  5. 单击 实验 按钮，选择 补偿设置 菜单，然后选择 创建补偿对照 以自动添加补偿对照。
  6. 记录所有补偿对照微球的数据。
  7. 单击 实验 并选择 补偿设置，然后自动计算补偿值。
  8. 记录单染细胞对照样本的数据。
  9. 使用 CD45RA APC 调整 R718 的补偿值至 15% APC；使用 CD19 BB700 调整 APC-H7 的补偿值至 14% BB700；使用 CD8 R718 调整 APC-H7 的补偿值至 60% R718。
  10. 记录 CST 微球的数据。
  11. 为 CST 高亮度微球创建目标值模板的全局工作表。
  12. 使用 FSC/SSC 图，绘制 CST 高亮度微球的多边形门控。获取 CST 高亮度微球在 10 个荧光通道的直方图：FITC、PE、BB700、PE-Cy7、APC、R718、APC-H7、BV421、V500 和 BV605。在直方图中创建区间门控。通过显示区间门控的中位数创建统计视图。
  13. 在流式细胞仪上运行样本，共收集 25,000 个淋巴细胞。
  14. 为样本创建分析模板的全局工作表。
  15. 使用以下样本门控策略：
    1. 使用 CD45/侧向散射光-面积（SSC-A）散点图，绘制多边形门控以识别完整淋巴细胞群体，同时排除碎片。
    2. 使用 CD3/CD19 散点图，绘制矩形门控以选择 CD3+ T 细胞和 CD19+ B 细胞。
    3. 使用 CD4/CD8 散点图，绘制四象限门控以选择 CD4+ 或 CD8+ T 细胞（分别对应这些标志物高荧光信号的细胞）。
    4. 使用 CD45RA/CD27 散点图，绘制四象限门控将 CD8+ 或 CD4+ T 细胞进一步划分为初始型（naïve，CD27+CD45RA+）、中央记忆型 T 细胞（TCM，CD27+ CD45RA-）、效应记忆型 T 细胞（TEM，CD27-CD45RA-）和效应记忆再表达 RA 型 T 细胞（TEMRA，CD27-CD45RA+）。
    5. 使用 CD25/CD127 散点图，绘制四象限门控将 CD4+ T 细胞划分为调节性 T 细胞（Treg，CD4+CD25++CD127low）。
    6. 使用 CD27/IgD 散点图，绘制四象限门控将 CD19+ B 细胞划分为初始 B 细胞（CD27-IgD+）和记忆 B 细胞（CD27+IgD-）。
  16. 将实验模板保存在 细胞仪 A 上。
  17. 使用光盘（CD-ROM）导出实验模板。

5. 在测试方法实验室中将实验模板转移至细胞仪B

注意：实验模板包括仪器设置、分析模板以及中位荧光强度（MFI）的目标值模板。

  1. 使用CST微球进行性能检查，以确认流式细胞仪运行状态良好。
  2. 导入实验模板，并使用该模板为流式细胞仪B创建实验。
  3. 使用同一批次的CST微球调整每个荧光通道的荧光参数电压，使其与先前仪器的MFI值相匹配。
    注意：MFI值在±5%范围内波动（转移前后亮微球的MFI值见表2）。
  4. 如有需要，使用未染色样本调整FSC的电压。
  5. 右键单击实验用细胞仪设置，选择应用设置以保存应用设置。
  6. 使用CD45RA APC将R718对APC的补偿值调整为15%；使用CD19 BB700将APC-H7对BB700的补偿值调整为24%；使用CD8 R718将APC-H7对R718的补偿值调整为60%。
  7. 在流式细胞仪上运行样本，共收集25,000个淋巴细胞。

6. 两种流式细胞仪获得的实验结果之间的一致性

  1. 使用单因素方差分析（one-way ANOVA）评估不同仪器间淋巴细胞亚群的差异（p < 0.05）。

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结果

图1 展示了CST亮珠目标值模板的全局工作表。通过FSC/SSC图，绘制多边形门以选择CST亮珠。获得了CST亮珠在10个荧光通道的直方图：FITC、PE、BB700、PE-Cy7、APC、R718、APC-H7、BV421、V500和BV605。每个参数的目标值在表2中通过直方图门控内的中位数显示。细胞仪A和细胞仪B软件中模板及参数设置的截图见补充图S1。

图2 显示了仪器标准化后，两台仪器对同一样本的散点图结果。数据表明，使用自动分析模板可在不同仪器之间获得一致的结果。在表3中，比较了两种不同型号仪器对六个样本的检测结果。两个实验室测得的15种淋巴细胞亚群百分比均无显著差异。这些结果表明，采用标准化方法可获得高度可比的数据。不同仪器检测的15种淋巴细胞亚群百分比详见补充表S1。

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讨论

外周血淋巴细胞亚群的免疫表型分析有助于了解儿童接种疫苗后细胞介导的适应性免疫变化。在临床应用中，常会出现一些意外情况，例如未能及时检测样本或流式细胞仪被更换；因此，亟需能够促进不同实验室间流式细胞仪转移的快速标准化方法9,10,11。本文介绍了一种快速标准化方法，以确保不同仪器之间获得一致的结果。该标准化方法已用于监测儿童接种疫苗后外周血中的免疫细胞，并在两个实验室中获得了高度一致的结果。该标准化方法建立于BD Canto与LSRFortessa之间，同样适用于FACSCelesta、FACSymphony A5和FACSAria II。与其他标准化方法2,3相比，本方法无需借助第三方软件即可实现数据一致性，仅利用Diva软件的特性创建包含目标值位置和自动分析功能的模板模块，从而实现不同仪器间的转移，并降低数据分析的难度。该方法节省时间...

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披露

作者声明无利益冲突。

致谢

RW 受中国北京自然科学基金（编号：7222059）和国家自然科学基金（编号：82002130）资助，XZ 受中国医学科学院医学科学创新基金（编号：2019-I2M-5-026）资助。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
BD CompBeads Anti-Mouse Ig，κ/阴性对照补偿微粒试剂盒BD552843补偿
BD FACSCantoBDFACSCanto转接实验室中的流式细胞仪A
BD FACSDiva CS&T 研究用微球BD655051定义流式细胞仪基线并追踪仪器性能
BD Horizon BV421 小鼠抗人 CD127BD562436荧光抗体 
BD Horizon BV605 小鼠抗人 CD27BD562656荧光抗体 
BD Horizon V500 小鼠抗人 CD45BD560777荧光抗体 
BD LSRFortessaBDLSRFortessa检测方法实验室中的流式细胞仪B
BD OptiBuild BB700 小鼠抗人 CD19BD745907荧光抗体 
BD OptiBuild R718 小鼠抗人 CD8BD751953荧光抗体 
BD Pharmingen APC 小鼠抗人 CD45RABD550855荧光抗体 
BD Pharmingen APC-H7 小鼠抗人 CD3BD560176荧光抗体 
BD Pharmingen FITC 小鼠抗人 CD4BD566320荧光抗体 
BD Pharmingen PE 小鼠抗人 CD25BD555432荧光抗体 
BD Pharmingen PE-Cy7 小鼠抗人 IgDBD561314荧光抗体 
Brilliant 染色缓冲液 PlusBD566385染色缓冲液
离心机Eppendorf5810细胞离心
离心管BD FalconBD-3520971515 mL 离心管
CS&T IVD 微球BD662414用于在不同流式细胞仪中设定仪器参数的标准微球
溶血液 10 倍浓缩液BD349202裂解红细胞
磷酸盐缓冲液（PBS）Gibco10010-023PBS
圆底试管BD Falcon3522355 mL 试管

参考文献

  1. Cabanski, M., et al. Flow cytometric method transfer: Recommendations for best practice. Cytometry Part B. Clinical Cytometry. 100 (1), 52-62 (2021).
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  7. Zhang, L., et al. Detection of polyfunctional T cells in children vaccinated with Japanese encephalitis vaccine via the flow cytometry technique. Journal of Visualized Experiments. (187), e64671(2022).
  8. Yu, N., et al. CD4(+) CD25 (+) CD127 (low/-) T cells: a more specific Treg population in human peripheral blood. Inflammation. 35 (6), 1773-1180 (2012).
  9. Kalina, T. Reproducibility of flow cytometry through standardization: opportunities and challenges. Cytometry Part A. 97 (2), 137-147 (2020).
  10. Sommer, U., et al. Implementation of highly sophisticated flow cytometry assays in multicenter clinical studies: considerations and guidance. Bioanalysis. 7 (10), 1299-1311 (2015).
  11. Glier, H., et al. Comments on EuroFlow standard operating procedures for instrument setup and compensation for BD FACS Canto II, Navios and BD FACS Lyric instruments. Journal of Immunological Methods. 475, 112680(2019).

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