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通过切片上相关联的光学-电子显微镜对内源性LC3进行超微结构定位

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DOI：

10.3791/65067

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2023年3月31日

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1Center for Molecular Medicine-Cell Biology, University Medical Center Utrecht, Utrecht University

本文内容

摘要

本文介绍了一种基于内源性荧光标记的优化切片上相关光镜-电镜联用技术方案，用于研究稀有蛋白质相对于细胞超微结构的定位。该方法的优势通过在未使用巴佛洛霉素处理的饥饿细胞中实现内源性LC3蛋白的超微结构定位得以展示。

摘要

通过电子显微镜（EM）在超微结构水平上观察自噬细胞器，对于确定其身份并揭示理解自噬过程所必需的细节至关重要。然而，EM 方法通常缺乏分子信息，阻碍了将电子显微镜获得的超微结构信息与基于荧光显微镜的特定自噬蛋白定位结果进行关联。此外，在未改变的细胞条件下，自噬体较为稀少，这给需要高倍放大的电子显微镜观察带来了困难，因而其视野范围有限。

为应对上述两项挑战，采用了一种基于荧光标记的切片内相关光镜-电镜（CLEM）方法，将常见的自噬体标志物 LC3 与电镜超微结构进行关联。该方法首先通过荧光显微镜快速筛选细胞中 LC3 标记及其他相关标志物的共定位情况；随后，利用 CLEM 鉴定选定 LC3 标记位点所对应的超微结构特征。该方法应用于未添加溶酶体酸化抑制剂的饥饿处理细胞。

在这些条件下，LC3 主要存在于自噬体上，而在自噬溶酶体中则很少见，因为 LC3 在自噬溶酶体中会迅速降解。这些数据表明该方法具有可行性和高灵敏度，证明了在天然条件下（无需药物处理或基因改造）利用关联显微技术（CLEM）可获得关于 LC3 介导的自噬的超微结构信息。总体而言，该方法通过将光学显微镜与电镜数据相整合，为自噬相关蛋白及其他稀有抗原的超微结构定位研究提供了一种有价值的工具。

引言

自噬是清除和回收细胞质蛋白及细胞器的关键过程。大自噬（以下简称自噬）过程涉及双层膜细胞器——自噬体的形成，使细胞能够包裹细胞质分子和细胞器，进而通过溶酶体降解。大多数细胞中均存在基础水平的自噬，且在饥饿或细胞应激等条件下该过程会被上调。自噬可特异性地靶向特定结构或蛋白进行降解，也可作为非选择性的整体过程，包裹部分细胞质。在选择性自噬中，自噬体通过Atg8家族蛋白（微管相关蛋白1A/B轻链3A/B/C [LC3] 和GABARAPs）与来自回收内体、高尔基体和/或内质网（ER）的膜结构共价结合而形成。1LC3 在细胞质中直接识别自噬货物 通过 选择性自噬接头蛋白（如 P62/SQSTM）。新的自噬膜可与 LC3 发生共价结合，随后延伸并融合，形成包裹 cargo 的完整双层膜结构——即自噬体。自噬体进一步成熟，最终与内体或溶酶体融合，其中的自噬 cargo 及接头蛋白被降解。2.

关于自噬体形成、成熟及融合的研究通常采用光学显微技术。在不同条件下，一般通过LC3的荧光显微镜观察来评估自噬体的数量及其在细胞内的定位。此外，通过将LC3与对pH敏感的GFP和对pH稳定的RFP连接，构建成所谓的串联探针，可在活细胞中通过GFP荧光的减弱来测定整体自噬流3。这些方法为研究人员理解不同条件下自噬的作用及其机制提供了有价值的工具。另一种不可或缺的工具是电子显微镜（EM），它能够揭示自噬细胞器在自噬不同阶段的超微结构4,5,6,7,8。迄今为止，EM仍是通过形态学区分不同自噬膜结构以精确识别自噬体形成各阶段的首选方法：吞噬泡（未完全闭合的双层膜）、自噬体（包裹胞质内容物的闭合双层膜）以及自噬溶酶体（内层自噬膜发生[部分]消失）。然而，仅依赖形态学而缺乏分子信息，可能容易导致误判或不确定性。免疫电子显微镜（Immuno-EM）是实现自噬细胞器分子特征与形态分类同步分析的最全面方法。例如，对解冻的冷冻超薄切片进行LC3的免疫胶体金标记，可实现LC3的超微结构定位，并精确识别被LC3标记的细胞器9。

透射电镜（EM）的一个缺点是，为了观察自噬膜的精细超微结构，以及在免疫电镜（immuno-EM）中定位标记目标蛋白的标签，需要高倍放大，而这会带来视野较小的问题。由于自噬体数量稀少且蛋白表达水平较低，这通常会阻碍对自噬体进行定量的电镜分析。为了增加自噬体的数量，细胞常通过饥饿处理并使用Bafilomycin A1（BafA1）进行干预，后者是一种溶酶体酸化和降解的抑制剂。若不使用BafA1处理，由于这些细胞器数量极少，通过电镜寻找自噬体将非常耗时。本论文所介绍的方法通过在冷冻切片解冻后，先在荧光显微镜下对内源性LC3进行荧光标记和成像，再进行后续电镜制样，从而解决这一问题。荧光图像可指导在电镜中寻找标记LC3的结构。采集电镜图像后，将其与荧光图像进行关联，从而将分子信息——即LC3的存在——添加到细胞的超微结构中。这种“切片上关联显微术”（on-section CLEM）方法显著提高了在未经处理条件下寻找LC3标记结构的能力，便于后续通过电镜进行鉴定与分类。

该方法应用于饥饿处理的肝母细胞瘤来源的HEPG210细胞，以在未改变条件（即未使用BafA1）下检测自噬体。仅观察到少量荧光斑点（在90 nm切片中每个细胞轮廓少于一个），这与LC3的高周转率相符11。LC3斑点的稀疏性凸显了CLEM的价值；通过选择含有多个荧光斑点的区域进行电镜成像，能够更高效地发现并表征LC3阳性细胞器，相较于传统的免疫电镜方法更具优势。结果显示，大多数LC3阳性细胞器为自噬体，其判断依据为其形态学特征，这与经BafA1处理的细胞结果形成对比——在后者中自噬溶酶体更为常见9。这些数据表明，通过切片上直接进行的CLEM技术，可在无需抑制自噬流的情况下，在超微结构水平研究自噬过程。

方案

1. 工具与试剂的准备

注意：有关所需试剂、缓冲液和溶液的详细信息，请参见补充文件1或12。有关本实验方案中使用的所有材料、试剂、设备和软件的详细信息，请参见材料表。

  1. 固定剂
    1. 配制 0.2 M 磷酸盐缓冲液（PB）或 0.2 M PIPES、HEPES、EGTA、MgSO₄4 (PHEM) 缓冲液，如文中所述 补充文件 1，用作固定剂溶液的基础成分。
      注意：固定剂通常用 0.1 M PB 或 PHEM 缓冲液配制，以缓冲醛类与生物材料反应引起的酸化。
    2. 由于多聚甲醛（PFA）的质量对样本超微结构的可靠固定至关重要，应使用电镜级PFA。按照本方案操作时，需使用由高质量PFA粉末配制而成的16%储备液（参见 补充文件 1).
      警告：多聚甲醛是一种危险化学品（危险说明 H228、H301、H302、H311、H314、H315、H317、H318、H331、H332、H335、H341、H350）。操作多聚甲醛时，应佩戴防护装备（手套、实验服和护目镜），并在化学通风橱中进行操作。含有多聚甲醛的废弃物应按照各机构的指南和规定收集并妥善处理。
    3. 将10 mL 0.2 M磷酸盐缓冲液、5 mL 16%多聚甲醛（溶于去离子水[dH₂O]中）和35 mL去离子水混合。2O])，以及 5 mL 的 dH₂O2O 配制 4% PFA 固定液。
    4. 可选：向步骤 1.1.3 的固定液中添加 0.02%–0.5% 戊二醛（GA） 可改善超微结构的保存，但会降低样本对多种抗体的抗原性。
      注意：如需使用戊二醛（GA）固定，应选用合适供应商提供的电镜级戊二醛。
      警告：戊二醛是一种危险化学品（危险说明 H301、H302、H314、H317、H330、H332、H334、H335、H400、H411）。操作戊二醛（GA）时应在化学通风橱中进行，并穿戴防护装备（手套、实验服和护目镜）。含GA的废弃物应按照各机构的指南和规定收集并妥善处理。
  2. 工具与材料
    1. 刮擦铝制样品台针表面，并在乙醇中超声处理 3 次，每次 10 分钟，以去除金属残留物，确保明胶包埋的细胞块在针上固定时具有最佳黏附性。
    2. 使用适合在液氮（LN₂）中储存带有样品的铝制样品台针的储存罐2).
    3. 用指甲油将一根毛发或睫毛固定在木签末端，制成一个操作器。
    4. 制作接种环。将一根直径为0.3 mm的不锈钢丝缠绕在直径3 mm的圆棒上，将末端拧在一起，形成一端的环状结构。将拧紧的末端插入移液器吸头中。从另一端插入一根木质细棒，并用胶水或树脂固定。
      注意：也可购买获得接种环（参见 材料表).
    5. 制备网格干燥环时，遵循与制作拾取环相同的步骤：将不锈钢丝弯成4 mm的环状，并用胶水或树脂固定在大号移液器吸头末端。
    6. 使用薄层支撑膜（如火棉胶，方案见 补充文件 1）。使用前，用一层薄碳膜覆盖载网。
      注意：即用型载网可从商业渠道获得（参见 材料表). 甲酸盐膜载网可在室温下长期储存；碳膜载网可在室温下储存数月。
    7. 准备干净的玻璃载玻片和大型盖玻片（24 mm × 24 mm 为宜，搭配 25 mm 宽的玻璃载玻片），如 13.

2. 固定与样品制备

  1. 固定
    1. 使用步骤 1.1.3 中配制的固定液（0.1 M 磷酸盐缓冲液中的 4% 多聚甲醛）。对于贴壁细胞系，将 1–5 × 106 个细胞培养于 6 cm 培养皿中。以 1:1 的比例将固定液加入培养基中，在室温下孵育 5 分钟。随后，弃去培养基与固定液的混合液，仅加入新鲜固定液，并在室温下继续孵育 2 小时。
      NOTE: 确切的细胞数量、融合度和培养条件可能因所使用的模型系统而异。
    2. 将样品在 4 °C 条件下，于含 0.5% 多聚甲醛的 0.1 M 磷酸盐缓冲液中保存过夜，或最多保存 3–4 周。
      ​NOTE: 可在固定液中添加戊二醛（见步骤 1.1.4），并调整固定时间，以在形态保存与抗原性保留之间达到最佳平衡，该平衡因样本类型和标记方法而异。更多信息请参见14。
  2. 样品包埋
    1. 在室温下，用 PBS 洗涤含固定后细胞的培养皿 3 次。然后更换为含 0.15% 甘氨酸的 PBS，在室温下孵育 10 分钟。
    2. 将含 0.15% 甘氨酸的 PBS 替换为预热至 37 °C 的含 1% 明胶的 PBS，用细胞刮刀刮下细胞，并将细胞转移至 1% 明胶溶液中，随后转移至微量离心管中。在微量离心机中，于室温下以 6,000 × g 离心 1 分钟，使细胞沉淀。小心移除上清中的 1% 明胶，避免扰动沉淀，然后加入预热至 37 °C 的 12% 明胶。使用预热至 37 °C 的移液器吸头或玻璃巴斯德吸管，轻轻吹打重悬细胞沉淀。
    3. 在 37 °C 下孵育 10 分钟；随后以 6,000 × g 在室温下离心 1 分钟。将明胶包埋的样品置于冰上固化 30 分钟。
    4. 为将明胶包埋的细胞从离心管中取出，使用剃刀片将含有沉淀的管底部分从管体其余部分切下。然后，垂直于第一次切割的方向，将带有细胞沉淀的管底部分切成两半。
    5. 将含有明胶包埋细胞沉淀的两个管底半片置于 2.3 M 蔗糖溶液中，在 4 °C 下孵育 10 分钟。此步骤可使明胶包埋的细胞沉淀略微收缩，并从塑料管壁上脱落。
      NOTE: 在操作过程中，应尽可能将明胶包埋的细胞沉淀保持在 4 °C 或冰上，以防止 2.3 M 蔗糖变得过于黏稠以及明胶过度软化。在后续步骤中处理明胶包埋样品时，应一次仅操作一个样品，其余样品保持在冰上，或在低温（约 4 °C）环境中操作。避免阳光、高温显微镜灯或其他热源导致明胶包埋样品过热。
    6. 从 2.3 M 蔗糖溶液中取出含有明胶包埋细胞沉淀的管底半片，用镊子将明胶包埋的细胞沉淀从塑料管半片上取下。使用剃刀片手动将沉淀切割成适当大小的块状（约 1 mm3）。切割过程中可使用体视解剖显微镜进行放大观察。
    7. 将明胶包埋的细胞块在 2.3 M 蔗糖溶液中浸润 3–16 小时，在 4 °C 条件下于旋转仪上进行端对端翻转。
    8. 将一块明胶包埋的细胞块置于铝制样品支架针上（见步骤 1.2.1）。在细胞块边缘保留适量 2.3 M 蔗糖，使其在细胞块与支架针之间形成一层薄“环”。避免过多 2.3 M 蔗糖覆盖在细胞块顶部。迅速冷冻后，保存于液氮（LN2）中。

3. 切片

  1. 修块（另见12）
    1. 从液氮（LN2）储存中取出带有明胶包埋细胞的样品钉，放入设定为 -80 °C 的冷冻超薄切片机中。
    2. 修平样品块前端表面，以获得约 250 nm 厚的切片。将 3 mm 的捞取环浸入捞取液（1:1 混合的 2.3 M 蔗糖和 2% 甲基纤维素），将环插入切片机的冷冻腔内，等待液滴中开始形成冰晶（通常为 5–7 秒）。随后立即通过快速而轻柔地将液滴压向切片来捞取切片。将环从冷冻腔中取出，待液滴完全融化后，将液滴压在载玻片上。
    3. 通过甲苯胺蓝染色检查切片中的细胞取向。
      1. 在载玻片上的切片上滴加一滴甲苯胺蓝溶液（参见 补充文件 1），并在 80 °C 加热板上干燥，直至液滴边缘变干。
      2. 将载玻片从加热板上取下，用去离子水（dH2O）轻轻冲洗掉甲苯胺蓝染液，并将废液收集至适当的废液容器中。
      3. 干燥载玻片，并通过普通的台式光学显微镜检查切片中细胞的取向。
    4. 使用刀片角对样品块面侧面切削 50–100 µm 进行侧边修块。每修完一侧后，将样品台旋转 90°，依次修整样品块面的四个侧面，形成一个突出的约 250 µm × 375 µm 的矩形区域。根据上一步确定的细胞取向选择该突出区域。
  2. 切片与捞取
    1. 将冷冻超薄切片机冷却至 -100 °C。从突出的矩形区域切出切片条带，切片厚度为 70–90 nm，呈现银金色光泽。使用粘在细棒上的毛发（见第 1.2.3 节）将切片从金刚石刀刃处引导开，形成一条长 2–5 mm 的切片条带。
    2. 当形成合适的切片条带后，停止切片以进行捞取操作。将 3 mm 捞取环浸入 1:1 混合的 2.3 M 蔗糖和 2% 甲基纤维素溶液中，将环插入切片机的冷冻腔内，等待液滴开始冻结（通常为 5–7 秒）。随后立即通过快速而轻柔地将液滴压向切片来捞取切片。将环从冷冻腔中取出，待液滴完全融化后，将液滴压在已准备好的载网上（见第 1.2.6 步）。
      注：带有切片的载网可在 4 °C 下保存数月。

4. 标记与光学显微镜观察

  1. 标记
    1. 将带有切片的载网（图1A）切片面朝下放置于小培养皿或多孔板中约1 mL PBS液滴上，37 °C孵育30分钟。
      注意：此步骤可去除细胞间存在的明胶；切片完成后明胶已无必要，且会干扰后续实验流程。
    2. 将载网切片面朝下置于Parafilm膜上的约75 µL液滴中进行处理（见图1B）。室温下先用含0.15%甘氨酸的PBS洗涤3次，每次2分钟。随后，以含0.1%牛血清白蛋白（BSA-c）和0.5%鱼皮明胶（FSG）的PBS溶液作为封闭液，室温孵育10分钟。将一抗用含0.1% BSA-c和0.5% FSG的PBS溶液稀释，将载网置于约10 µL该溶液的液滴上，室温孵育1小时（图1C）。
    3. 用含0.1% BSA的PBS溶液在室温下洗涤载网5次。然后将二抗和4',6-二脒基-2-苯基吲哚（DAPI；10 µg/mL）溶于含0.1% BSA-c和0.5% FSG的PBS溶液中，将载网置于约10 µL该溶液的液滴上，室温孵育30分钟以上（图1C）。最后在室温下用PBS洗涤5次。
      注意：可选地，可使用与蛋白A（PAG）偶联的5、10、15或20 nm胶体金颗粒标记二抗，以实现目标蛋白在电镜下的定位。如需此步骤，应在步骤4.1.3之后，将载网在室温下与PAG孵育20分钟，随后在室温下用PBS洗涤5次。应避免同时使用多种一抗，并注意PAG对不同物种IgG的反应性，以防发生非特异性交叉反应。更多信息参见12。
  2. 光学显微镜样品封片
    1. 将载网浸入含50%甘油的dH2O溶液中，室温下处理2次，每次5分钟。将载网夹在载玻片与盖玻片之间，每张盖玻片放置一个载网，切片面朝向盖玻片，封片介质为50%甘油（图1D）。
      注意：载网在50%甘油中封片超过30分钟后，标记质量可能下降。因此建议每次封片并成像2至3个载网，其余载网保留在二抗标记液中。
  3. 光学显微镜观察
    1. 将夹有载网的载玻片置于配备自动载物台的宽场显微镜下，选择高倍油镜（63x或100x），对切片条带（部分）进行图像拼接（图1E）。
      注意：某些二抗可能在载网上形成荧光聚集体，尤其在切片褶皱或撕裂处周围。此外，某些细胞类型和组织含有自发荧光结构。若预计存在此类问题，建议设置未加一抗的阴性对照载网。
  4. 去封片及电镜反差染色
    1. 在载玻片-盖玻片夹层的一侧加入10 µL dH2O，等待毛细作用使水渗入载玻片与盖玻片之间的界面。小心移除盖玻片，避免浸油混入甘油中。用镊子取出载网，在室温下用dH2O洗涤3次，以去除50%甘油。
      注意：油类物质可能干扰醋酸铀染色，降低电镜反差。
    2. 用无绒纸小心擦干载网背面。
      注意：若样品已用胶体金颗粒标记，请执行以下步骤：将载网切片面朝下置于PBS液滴上，室温洗涤2次。用1%戊二醛（GA）后固定5分钟（参见1.1.4中的注意事项）。在室温下用PBS洗涤2次。
    3. 将载网切片面朝下置于dH2O液滴上，在室温下洗涤8次。
    4. 为增强电镜下的反差，将载网与pH 7的醋酸铀（UA）溶液在室温下孵育5分钟（图1F）。
    5. 在放置载网前，将pH 4的UA:甲基纤维素溶液滴加于冰上金属板的Parafilm膜上，进行预冷。随后，用预冷的pH 4 UA:甲基纤维素溶液洗涤载网2次，并在冰上孵育10分钟（图1F）。
      警告：醋酸铀为危险化学品（危险说明H300、H330、H373、H411）。凡涉及UA的操作均应在通风橱中进行，并穿戴防护装备（实验服、手套和护目镜）。含UA的废液应按照机构的指南和规定收集并妥善处置。
    6. 使用载网干燥环，将其插入UA:甲基纤维素液滴下方的载网底部，轻轻上提，直至载网脱离液滴12。将干燥环以约60°角（切片面朝下）轻触无绒滤纸（见材料表），缓慢拖动直至不再吸收多余液体。随后将带载网的干燥环置于合适的支架中，室温下干燥>10分钟（图1G）。

5. 透射电子显微镜（EM）

  1. 利用光学显微镜获得的概览图像定位透射电子显微镜（TEM；图1H）成像的兴趣区域（ROI）。在光学显微镜数据集中标注该兴趣区域。选定区域后，在透射电子显微镜中以20,000倍至50,000倍的放大倍数获取图像瓦片集。在后期处理软件中重建该图像瓦片集15,16。

6. 相关性与分析

  1. 在合适的图像处理软件中加载光学显微镜和电镜数据集，例如 ImageJ/Fiji17、Icy 中的 ec-CLEM 插件18 或 Photoshop。对光学显微镜数据集进行裁剪和旋转，使其与电镜图块集对齐。
    1. 基于荧光图像中的 DAPI 信号以及电镜图像中的细胞核轮廓进行关联（图 1I）。移动图像以实现精确叠加，并准确完成手动关联。为提高关联精度，可通过 Icy 中的 ec-CLEM 插件或 ImageJ 中的 BigWarp 插件，采用基于标志点的关联方法，手动选择对应点进行图像配准。已有详细的分步操作流程介绍如何使用 ec-CLEM 进行图像关联19。
      注意：该方法也可与双模态标记探针（bimodal fiducial probes）结合使用，效果良好20,21。
  2. 在合适的程序（例如 ImageJ）中，根据荧光信号选择感兴趣区域（ROI）以分析已关联的图像。进行定量分析时，需为所有标记的细胞器建立一组 ROI。随后，在电镜超微结构中检查各个 ROI 对应的区域，并根据形态学特征对其进行分类。

结果

De Maziere 等人最近发表了一种优化的免疫电镜方案，用于在超薄冷冻切片上对 LC3 进行免疫金标记。9本研究包括无BafA1的饥饿条件，在此条件下LC3存在但相对稀少，难以通过电镜观察。另一项研究引入了一种切片上CLEM方法，该方法利用荧光标记的灵敏性来可视化相对稀少且低表达的内源性蛋白，并将其与电镜超微结构相关联14此处通过将优化的LC3标记方案作为CLEM方法的一部分，结合了上述两种技术。

HepG2 细胞是一种肝脏来源的细胞，具有相对较高水平的基础自噬活性22，在固定前使用最低限度培养基（Earle's 平衡盐溶液 [EBSS]）饥饿处理 2 小时，随后用 4% 多聚甲醛固定。接着采用 Tokuyasu 法进行超薄冷冻切片制备（步骤 1–3；参见 Slot 和 Geuze12），该方法与切片上关联显微技术（CLEM）高度兼容14,23。解冻后的冷冻切片使用小鼠抗 LC3 一抗9进行荧光标记（实验方案第 4 部分及图 1）。此外，使用兔抗 LAMP1 抗体标记内体-溶酶体结构，随后使用抗小鼠 AlexaFluor488 和抗兔 AlexaFluor568 二抗进行孵育。将载网夹在盖玻片与载玻片之间，在室温下使用宽场显微镜（100 倍、数值孔径 1.47 的油镜，sCMOS 相机）进行成像。

与传统的全细胞免疫荧光（IF）相比，超薄切片荧光标记的一个优势在于Z轴方向分辨率更高，因为切片的物理厚度仅为60–90 nm。得益于这种改善的Z轴分辨率，LC3与LAMP1在超薄切片上的荧光标记显示两者共定位极少（图2A）。在使用溶酶体抑制剂（如BafA1）处理的细胞中，由于被溶酶体包裹的LC3未被降解，因此会出现高度共定位9。而在未处理的细胞中，LC3一旦接触到具有酶活性且表达LAMP1的溶酶体便会迅速降解，因此在这些条件下共定位现象极为罕见。通常情况下，每细胞切面观察到的LC3点状结构少于一个。这表明即使在饥饿条件下，自噬小体的 turnover 速度仍然很快，使其数量维持在较低水平。这也凸显了利用CLEM技术结合光学显微镜提供的大视野来发现这些稀有LC3标记结构的重要性。此外，与胶体金标记相比，荧光标记具有更高的灵敏度，能够识别出比传统免疫电镜更多的LC3阳性细胞器，从而进一步促进对其特征的分析。

在获取连续切片带的完整图块集后，将载网从显微镜中取出，并使用醋酸铀（UA）和“拉出法”进行透射电镜的后染色（操作步骤 4.4–4.6； 图 1F、G）。这种“拉出法”可确保在载网上保留一层薄薄的醋酸铀-甲基纤维素溶液，从而在电镜下获得理想的对比度。该液层的厚度取决于将醋酸铀-甲基纤维素溶液从滤纸上吸除时的速度和角度。若拉动环状工具过快，会导致过多的醋酸铀-甲基纤维素残留在载网上，使电镜下的切片颜色过深；而拉动过慢则会带走过多染液，导致染色不足、形态结构不佳，并增加载网从环中脱落的风险。干燥载网上出现类似“油膜”的虹彩（图 1G）表明醋酸铀-甲基纤维素层的厚度适宜。

环出并干燥后，在荧光标记选定的感兴趣区域（ROI）使用透射电子显微镜（TEM）对载网进行成像。通过将DAPI信号与电镜图像中可见的细胞核轮廓叠加，对免疫荧光（IF）和电镜（EM）数据集进行关联，生成包含两种模态信息的整合图像。

在免疫荧光（IF）中选定的区域与电镜（EM）中的对应区域进行匹配可能具有挑战性。因此，建议在电镜下搜索时，随身保留免疫荧光图像拼接图的概览图像。用户应寻找两种模态图像中均可识别的特征，例如切片的褶皱或撕裂、网格条、或细胞核的排列方式。还需注意，样品在电镜图像中可能出现旋转或镜像。可使用带有特定识别特征的“定位网格”（finder grids）来辅助关联定位（见 材料表）。

LC3阳性细胞器与电镜超微结构的相关性分析显示，不同的点状结构代表自噬的不同阶段（图2B）。尽管在冷冻超薄切片中自噬体超微结构的保存较为困难，但仍经常观察到含有胞质内容物和双层膜的细胞器（图2C，细胞器1-5中的箭头；补充图 S1），这些是自噬体的典型形态学特征。有趣的是，一些荧光信号较弱的点状结构经电镜鉴定为LC3阳性的自噬溶酶体（图2C，细胞器6；自噬内容物以*标记），其特征为致密的内容物和腔内小泡。这表明在超薄冷冻切片的免疫荧光中，即使LC3含量极低也可被检测到，并提示尽管处于降解性环境，稳态下的自噬溶酶体中仍可检测到少量LC3。然而，大多数LC3阳性点状结构为自噬体，而自噬溶酶体极为罕见。这与经BafA1处理的细胞形成对比，后者主要积累自噬溶酶体而非自噬体9。

综上所述，本实验方案描述了一种切片上的关联显微成像技术（CLEM），用于将荧光显微镜获得的分子信息与电镜的超微结构相对应。该方法通过仅使用荧光染料进行标记（通常比电镜探针产生更强的信号）提高了免疫电镜的灵敏度。该方法特别适用于超薄冷冻切片，在此类切片中可获得高特异性荧光信号和极低背景染色。通过荧光成像筛选稀有结构或事件，并将选定的兴趣区域（ROI）与电镜图像相关联，可显著缩短电镜操作时间并降低相关成本。本方法的灵敏度和可行性通过在未处理和饥饿处理的细胞中对LC3的可视化得以验证，结果显示在此类条件下LC3主要与自噬小体相关，而在自噬溶酶体中仅可见极低水平的LC3。

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图1原位相关光电子显微镜的示意图概览 (A明胶包埋的细胞冷冻切片收集于聚乙烯醇膜覆盖的铜网上。B) 网格需在适当溶液的液滴中以切面朝下的方式处理。C) 载网使用一抗和荧光标记的二抗进行孵育标记。D) 载网夹在盖玻片和载玻片之间，置于50%甘油中。E在宽场显微镜下采集荧光图像。F将载网从玻片上取出，经铀染色后用于透射电镜观察。G干燥后，可使用透射电子显微镜对载网进行成像。H从荧光数据选定的区域获取高倍透射电子显微镜图像拼接图。I荧光显微镜和电子显微镜的图像进行关联并叠加。 请点击此处以查看此图的放大版本。

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图2：饥饿处理的HEPG2细胞中LC3和LAMP1的CLEM分析。 HEPG2细胞在4% PFA中固定前，先在EBSS中饥饿处理2小时。(A) 对切片进行LC3（绿色）和LAMP1（红色）的免疫荧光成像，结果显示LC3点状结构较少，且与LAMP1的共定位程度较低。(B) 通过基于DAPI和细胞核轮廓（右侧面板中的虚线）叠加荧光成像（左侧面板）与电镜获得的超微结构信息（中间面板），将分子信息与超微结构信息关联起来。右侧面板中框1所示的单个LC3标记区室的超微结构在C中展示。(C) LC3阳性区室的超微结构。左侧显示CLEM图像，右侧为伪彩色（米色）电镜图像（未着色的电镜图像见补充图S1）。自噬体的内膜和外膜分别由白色和黑色箭头指示。示例6中自噬溶酶体内所含的自噬内容物用*标示。比例尺 = 10 µm (A)，1 µm (B)，200 nm (C)。 请点击此处查看该图的放大版本。

补充图 S1：LC3 阳性细胞器的未染色电镜图像。（A-F）对应于图 2C中伪彩色示例 1-6 的未染色电镜图像。细胞器根据 LC3 荧光信号进行选择，选择方法如图 2所述。自噬体的内膜和外膜分别由白色和黑色箭头指示。示例 6 中自噬溶酶体内自噬内容物由 * 标示。比例尺 = 200 nm。缩写：AL = 自噬溶酶体；AP = 自噬体；M = 线粒体。请点击此处下载该文件。

补充文件 1：本研究中使用的缓冲液和溶液。 本补充文件包含制备本研究中所用缓冲液和溶液所需的配方与操作步骤。请点击此处下载该文件。

讨论

本文所述方法利用了基于冷冻切片的切片上关联光镜与电镜技术（on-section CLEM）的最新进展——免疫荧光标记的高灵敏度，以及光镜与电镜之间精确（<100 nm 误差）的图像关联14,24。该方法因而具备对稀有内源性蛋白进行荧光标记的灵敏度，并能将其信号高精度地叠加至电镜超微结构图像上。因此，该方法避免了外源性标记蛋白的（过）表达以及灵敏度较低的电镜标记物的使用。本文通过在未使用溶酶体抑制剂的情况下，对饥饿细胞中内源性 LC3 蛋白进行关联光镜与电镜分析的实例，验证了该方法的可行性。

采用Tokuyasu方法制备的解冻冷冻切片是免疫电镜的理想样品，因为与树脂切片不同，它们对抗体具有通透性。结合温和的固定和染色处理，该方法通常能实现优于其他方法的标记效率，同时不破坏精细的超微结构，并可极好地显示细胞膜12,25,26。此外，冷冻切片与荧光显微镜高度兼容，使其成为关联光镜与电镜（CLEM）的优良基底。经典的免疫胶体金标记和在冷冻切片上进行的CLEM 均已为理解亚细胞结构组织提供了开创性的见解14,27,28,29,30。

目前，随着技术的持续发展和优化14,20,24,31,32,33,34，冷冻切片解冻后进行CLEM的应用正变得越来越普遍，这些改进提高了该方法的质量、适用性和准确性。如今，通过精确关联大范围的IF和EM图像拼接图集，该技术有助于对荧光标记的内源性细胞组分的超微结构进行筛选14,32,33。这相较于传统的免疫电镜具有优势，因为在传统免疫电镜中，寻找金标记结构通常需要高倍放大，因而更加费力且耗时。正因如此，LC3在超微结构上的定位极大地受益于CLEM技术。当自噬清除受阻时（例如细胞经BafA1或升高pH的试剂处理后），LC3阳性的细胞器较为常见；而在未处理或饥饿状态的细胞中，自噬细胞器会迅速被清除，导致稳态水平极低。在此类情况下，使用传统免疫电镜寻找LC3标记的细胞器具有挑战性，而CLEM则展现出明显优势。

此前，针对树脂切片的CLEM研究曾应用于异位表达LC3-GFP或LC3-GFP-RFP串联探针的实验中35,36,37,38,39。在这些研究中，荧光成像在包埋前或直接在丙烯酸树脂切片上进行40，随后通过透射电镜对样品进行筛选。树脂包埋具有多项优势：自噬体的超微结构通常能得到良好保存，尤其是当样品经过高压冷冻处理时效果更佳40。此外，经重金属染色的树脂包埋样品的对比度通常优于经铀酸染色的冷冻切片。树脂包埋切片适用于体积电子显微镜技术，例如阵列断层成像、聚焦离子束扫描电镜（FIB-SEM）或连续块面扫描电镜（serial blockface SEM），而冷冻切片则不适用。在包埋前进行成像的方法中，活细胞成像是一种可行的选择41，而基于冷冻切片的CLEM则无法实现该功能。相比之下，基于冷冻切片的CLEM的关键优势在于其高强度的免疫荧光信号，能够在无需膜通透处理或蛋白过表达的情况下实现稀有蛋白的免疫定位。这种方法避免了可能发生的膜成分提取、过表达带来的假象42以及对研究对象进行遗传修饰，再结合可在大范围区域内实现免疫荧光与电镜图像相关联的可能性，使其成为研究LC3及自噬过程的优异工具。

本研究中，对饥饿处理的 HEPG2 细胞进行切片内 CLEM 分析发现，LC3 主要定位于被鉴定为自噬体的结构中。此外，在自噬溶酶体中也检测到少量弱荧光信号点。这与经 BafA19 处理的细胞结果形成直接对比，反映出自噬体与溶酶体融合后，自噬体相关蛋白会迅速降解。总体而言，实验结果表明，对解冻后的冷冻切片进行 CLEM 分析，能够在接近天然条件下揭示 LC3 介导的自噬过程。数据还凸显了该技术的高灵敏度，因为即使在仅含有极低水平完整 LC3 抗原表位的自噬溶酶体中，仍可检测到 LC3 信号。通过在不同模型和条件下对 LC3 进行成像，进一步应用该技术将有助于加深我们对自噬以及其他 LC3 介导的生物学过程（如 LC3 相关性吞噬作用或 ATG8 与单层膜的结合）的理解。

除了自噬之外，切片内关联显微技术（on-section CLEM）还可应用于其他罕见事件或结构的研究，例如细胞分裂、感染过程、组织中的稀有细胞类型、动粒、初级纤毛或细胞类型特异性的细胞器。通过免疫荧光（IF）有效筛选目标结构，可极大促进对这些稀有事件的超微结构研究。此外，已有研究14表明，该技术在蛋白质定位方面比传统的免疫电镜更为灵敏。通过调整固定时间，可进一步提高其灵敏度，从而实现对丰度极低或抗原性较差的蛋白质进行超微结构定位。最后，切片内 CLEM 方法有助于快速选取定量数量的细胞器，从而促进对特定蛋白质超微结构分布的更可靠分析。

冷冻切片上的关联显微成像（CLEM）需要具备冷冻切片所需的设备和技术专长。对于拥有这些工具（例如冷冻切片机）的研究团队而言，切片上 CLEM 的实施较为直接，仅需配备一台自动化的宽场显微镜，而大多数实验室均已具备此类设备。此外，该方法在全球范围内的电镜平台中均可获得。由于切片上 CLEM 结合了成熟的免疫荧光（IF）与电镜（EM）技术，因此易于采用，并可与其他技术联用，例如断层扫描20,33,43、有限数量切片的连续切片体积电镜44，或超分辨率显微镜技术45。该方法的多功能性使其适用于广泛的生命科学问题研究。

披露

作者声明不存在利益冲突。

致谢

我们感谢乌得勒支大学医学中心分子医学中心的同事们在讨论和反馈中提供的帮助。我们感谢Klumperman实验室过去和现在的同事们，他们持续改进了我们的显微镜技术。本研究所使用的电镜设施是荷兰研究理事会（NWO）资助的国家大型研究基础设施路线图项目（NEMI）的一部分，项目编号为184.034.014，授予JK。

材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
化学试剂与试剂
驴抗小鼠 Alexa Fluor 488 抗体Life Technologies#A21202使用稀释比例 1:250
驴抗兔 Alexa Fluor 568 抗体Life TechnologiesA#10042使用稀释比例 1:250
小鼠抗 LC3 抗体Cosmo BioCTB-LC3-2-IC使用稀释比例 1:100
兔抗 LAMP1 抗体Cell Signaling9091使用稀释比例 1:250
牛血清白蛋白，第五组分Sigma-AldrichA-9647
BSA-cAurion900.099
BSA 偶联金颗粒Cell Microscopy Core, UMC UtrechtBSAG 5 nm
无水氯仿Merck1.02447.0500
DAPIInvitrogen10184322终浓度为 10 µg/ml
EGTASigma-AldrichE4378
鱼皮明胶Sigma-AldrichG7765
食品级明胶MerckG1890
Formvar, Vinylec ESPI02492-RA
戊二醛Serva23115.01参见注意事项
甘油BoomMBAK 7044.1000
甘氨酸Merck1042010250
HEPESSigma-AldrichH3375
甲基纤维素，25 厘泊Sigma-AldrichM-6385
MgSO4Riedel-de Haen12142
Na2HPO4（磷酸缓冲液组分 A）Merck106580-0500
NaBH4Merck806373
NaH2PO4（磷酸缓冲液组分 B）Merck106346
NH4OHSigma-Aldrich221228-0025
草酸Merck100495
多聚甲醛颗粒Sigma-Aldrich441244参见注意事项
PIPESMerck110220
蛋白 A 偶联金颗粒Cell Microscopy Core, UMC UtrechtPAG 5、10、15 或 20 nm
蔗糖 D(+)VWR27483294
醋酸铀SPI020624-AB参见注意事项
工具与耗材
挑取环Electron Microscopy Sciences70944
滤纸，定性，中速LLG6.242 668
定位网格Ted PellaG100F1
载网Cell Microscopy Core, UMC UtrechtCU 100 目
显微镜
Leica Thunder 宽场显微镜Leica组件：100x，1.47 NA TIRF 物镜；Photometrics prime 95B sCMOS 相机；LAS X 软件
Leica UC7 超薄切片冷冻切片机Leica
Tecnai T12FEI组件：Veleta VEL-FEI-TEC12-TEM 相机；SerialEM 软件
软件
ec-CLEM in icy开源Paul-Gilloteaux 等，2017
Fiji开源Schindelin 等，2012
IMOD开源Mastronarde 等，2017
PhotoshopAdobe
SerialEM开源Mastronarde 等，2018

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LC3 定位自噬细胞器荧光显微镜自噬体免疫胶体金标记自噬溶酶体蛋白质超微结构定位透射电子显微镜
通过切片上相关联的光学-电子显微镜对内源性LC3进行超微结构定位
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