我们介绍了一种用于培养高可重复性类球体并通过图像采集和蛋白质组学进行表型表征的实验方案。
本文内容
摘要
摘要
本文介绍了一种使用独立式旋转培养箱（clinostat incubator）进行三维细胞培养的生长、处理与监测的实验方案，阐述了其特性与优势。该旋转培养箱可模拟一种使细胞在低剪切力和主动营养扩散条件下组装成高度可重复的球状体的环境。我们证明，无论是癌变还是非癌变的肝细胞（HepG2/C3A 和 THLE-3 细胞系），均需培养约3周才能获得与肝细胞相似的功能特性。本方案突出了将配备摄像头的培养箱用于三维细胞培养的便利性，可在处理过程中定时拍摄图像，以对球状体进行计数和测量。我们对 THLE-3 与 HepG2/C3A 细胞系进行了比较，展示了非癌变细胞系与永生化癌细胞一样，均可成功培养成球。我们演示并说明了如何仅从少量球状体开展蛋白质组学实验，且球状体可在不干扰细胞信号通路（即无需胰酶消化）的情况下被收集。我们进一步表明，蛋白质组学分析可用于监测肝脏典型表型，如呼吸链代谢以及参与金属解毒相关蛋白的表达，并介绍了一种用于对球状体面积进行计数和测量的半自动化系统。总体而言，该方案提供了一套综合工具箱，包含通过图像采集进行表型表征以及利用蛋白质组学流程对三维细胞培养模型开展实验研究的方法。
引言
体外 细胞培养已被证实对于建立生物学基本知识至关重要且不可或缺。生物学尤其是癌症研究中的大量科学认知均源于二维（2D）培养系统。 即细胞在单层中生长。尽管二维培养一直是主导的细胞培养体系，但它存在许多可能阻碍生物学进一步发展的缺点。例如，二维培养缺乏细胞间相互作用，而这些相互作用对于细胞信号传导和增殖至关重要1迄今为止，三维培养系统已被证明能更有效地模拟分化、药物反应、肿瘤侵袭和生物学行为2,3,4,5恶性癌症的三维建模尤为重要，这主要是由于人口老龄化加剧以及癌症死亡率上升。肝细胞癌（HCC）是全球癌症相关死亡的主要原因之一，且预后通常极差。6肝细胞癌（HCC）以治愈率低、药物反应差和复发率高而著称。6,7,8已开发出多种模拟正常肝脏和肝细胞癌（HCC）生理特征的3D模型 体内 正常与恶性肝组织9,10.
目前的一些3D系统包括液体覆盖层、生物反应器、水凝胶、支架以及3D打印结构。在生物反应器中生成的类球体具有独特优势，因其可模拟肿瘤内部的营养暴露分布、气体交换以及细胞增殖/静止状态。11生物反应器特别适用于癌症模型，因其使用简便、可扩展性大、营养物质扩散性好且易于操作。11此外，生物反应器可实现高通量实验，提高可重复性，并减少人为误差。本研究中使用的生物反应器具有独特性，因其可模拟微重力环境，从而最大限度降低传统生物反应器中常见的干扰性剪切力，有助于提升实验的可重复性。12全方位重力环境及剪切力的降低使得细胞能够以更接近生理状态的方式生长发育。例如，采用该方法培养的HepG2/C3A细胞会形成能够产生物质的球形细胞器 体内 ATP、腺苷酸激酶、尿素和胆固醇水平13,14此外，与二维培养相比，该三维系统中的药物处理更为先进且自动化程度更高。在二维培养中，由于需要胰酶消化并维持细胞活性，药物处理通常必须在较短时间内完成。然而，在本研究中，我们能够对类球体进行长期药物处理，而无需破坏细胞的结构和生理状态。因此，从二维培养转向三维培养对于更准确地建模是必要的 体内 生物现象及进一步的科学发展。
本文介绍了一种可高度重复的类球体培养方法（图1 和 图2），并展示了一种用于对三维结构进行表型表征的半自动化系统（图3）。在图像层面，我们提供了类球体数量统计及其面积测量的相关信息（图3）。通过质谱技术，我们展示了如何利用蛋白质组学评估特定的生物学功能（图4）。通过收集和分析这些数据，我们希望增进对三维细胞培养系统背后生物学机制的理解。
方案
1. 缓冲液与试剂
- 用于HepG2/C3A细胞的培养基：配制含10%胎牛血清（FBS）、非必需氨基酸（1% v/v）、L-谷氨酰胺（1% v/v）和青霉素/链霉素（0.5% v/v）的Dulbecco改良Eagle培养基（DMEM，4.5 g/L葡萄糖）。将培养基储存在4 °C。
- 用于THLE-3细胞的培养基：配制支气管上皮细胞生长培养基[BEGM]，加入其补充剂（牛垂体提取物[BPE]、氢化可的松、人表皮生长因子[hEGF]、肾上腺素、转铁蛋白、胰岛素、视黄酸、三碘甲腺原氨酸、硫酸庆大霉素-两性霉素[GA]），以及10% FBS、5 ng/mL hEGF和70 ng/mL磷酸乙醇胺。
- 500 mM DL-二硫苏糖醇（DTT）：取0.771 g DTT溶于10 mL高效液相色谱级水中，配制成10 mL溶液。分装为100 µL每份，于-20 °C保存。
- 200 mM 碘乙酰胺：取36 mg碘乙酰胺溶于1 mL 50 mM碳酸氢铵溶液中，配制成1 mL溶液。溶解后的碘乙酰胺不得储存。
- 5% 十二烷基硫酸钠（SDS）：取2.5 g SDS溶于50 mL 50 mM碳酸氢铵溶液中，配制成50 mL溶液。4 °C保存。
- 12% 磷酸：取14.1 mL 85%磷酸，用85.9 mL高效液相色谱级水稀释，配制成100 mL溶液。室温（RT）下储存在玻璃瓶中。
- 结合缓冲液：取900 mL浓甲醇加入100 mL 10 mM碳酸氢铵或TEAB溶液中，配制成1 L溶液。
- 0.1% 三氟乙酸（TFA）溶液：取1 mL浓TFA加入999 mL高效液相色谱级水中。4 °C保存。
- 60%乙腈/0.1% TFA溶液：取600 mL高效液相色谱级乙腈（60% v/v）加入399 mL高效液相色谱级水中，再加入1 mL浓TFA，混匀后于4 °C保存。
- 流动相A（MPA）—0.1%甲酸：取1 mL浓甲酸加入999 mL高效液相色谱级水中，充分混匀。
- 流动相B（MPB）—80%高效液相色谱级乙腈 + 0.1%甲酸：取800 mL高效液相色谱级乙腈加入199 mL高效液相色谱级水中，再加入1 mL浓甲酸，混匀。
2. 类球体的制备
注意：图1A 展示了从细胞系制备和培养3D球状体的初始步骤。
- 解冻冻存的 HepG2/C3A 和 THLE-3 细胞，并在组织培养瓶或培养皿中使用标准培养基以单层培养方式培养，直至细胞融合度达到约 80%。
注意：当细胞达到融合状态时，应使用显微镜检查细胞的一般形态和生长模式。不建议使用高代次的细胞。 - 用 Hank's 平衡盐溶液（HBSS）洗涤细胞两次（T75 cm2 培养瓶或 10 cm 培养皿使用 5 mL）。
- 加入 5 mL 用 HBSS 稀释的 0.05% 胰蛋白酶-EDTA（1:2 稀释），在 37 °C、5% CO2 条件下孵育 5 分钟。使用显微镜观察细胞脱落情况，并加入 3 mL 胎牛血清（FBS）或含 10% FBS 的完全培养基以中和胰蛋白酶反应。
- 将细胞悬液转移至 15 mL 离心管中，在室温下以 270 × g 离心 5 分钟。
- 吸除上清液，用 5 mL 完全培养基重悬细胞。
注意：若细胞数量过多，计数前应先稀释细胞悬液。 - 计数细胞数量，并用完全培养基将细胞悬液稀释至最终体积不超过 1.5 mL，细胞密度为 1 × 106 个细胞。
- 平衡含有微孔的超低吸附 24 孔圆底板。
- 用 0.5 mL 培养基洗涤各孔。
- 将培养板在 3,000 × g 条件下离心 5 分钟（以去除孔表面的气泡）。
- 将步骤 1.4 中制备的细胞悬液加入培养板中，并在 120 × g 条件下离心 3 分钟。
注意：细胞悬液体积可能因细胞数量而异，但应控制在 1.5 mL 以内。 - 将培养板置于 37 °C、5% CO2 条件下孵育 24 小时，以启动类球体形成。
3. 类球体在生物反应器中的培养 (图2)
注意：为保持类球体的结构，在操作3D球体时应使用宽口吸头。
- 在将类球体转移至生物反应器前24小时，通过向湿度室加入25 mL无菌水、向细胞室加入9 mL培养基来平衡生物反应器（图2A）。填充湿度室和细胞室时，务必使用连接长针头的10 mL注射器。
- 将生物反应器置于3D培养箱中，在37 °C、5% CO2条件下以15 rpm转速旋转培养24小时（图2D、F）。
- 使用1 mL宽口吸头，轻轻吹打使类球体从超低吸附培养板上脱离，并将其转移至组织培养皿中。
- 用0.5 mL预温的培养基冲洗超低吸附培养板，以回收残留的类球体，并将其转移至步骤3.3中的同一培养皿中。
- 在光学显微镜下（4倍放大）评估类球体的大小、致密性和圆整度，选择形态充分形成的类球体。
注意：当类球体结构致密且在操作过程中不发生解体时，表明其已充分形成。此外，类球体应为单一独立结构，而非聚集在一起。转移至生物反应器时，优选类球体直径在100–200 µm之间。 - 将类球体转移至已平衡并装有5 mL新鲜培养基的生物反应器中。转移后，用新鲜培养基完全充满生物反应器，并注意在加液过程中避免产生气泡。
- 将生物反应器放入3D培养箱中，并通过控制单元调节旋转速度（图2C）。对于HepG2/C3A类球体，设定转速为10–11 rpm；对于THLE-3类球体，设定转速为11–12 rpm。
注意：当类球体均匀分布在生物反应器中心且未接触器壁时，表明旋转速度设置正确。图2E 显示了一个正在旋转的生物反应器。 - 每2–3天更换一次培养基，移除10 mL旧培养基并补充10 mL新鲜培养基；换液时务必避免将类球体一并移除（图2B）。
注意：建议制定规律的换液周期（例如48 h/48 h/72 h），并详细记录每次操作。 - 每次更换培养基时均需调整旋转速度。随着类球体体积和数量的增加，逐步提高转速。
- 培养15天后，将类球体分种至两个新的生物反应器中。
注意：根据细胞系及生长速率的不同，所需时间可能有所差异，应针对具体条件进行优化。 - 培养20天后，类球体即可用于收集。
4. 类球体的图像采集与计数
注意：类球体计数的简化流程如图3A所示。在进行类球体计数和面积测定（第5节）时，评估三维结构的致密性至关重要。这将有助于增强颜色对比度，从而确保该方法的准确性。
- 打开平板电脑上安装的 3D 应用程序。
- 选择生物反应器并截取快照。
注意：也可以拍摄照片。应考虑以下参数。- 在生物反应器后方放置黑色背景（生物反应器盒中提供黑色支架）。
- 确保细胞腔室表面无光线反射。
- 尽可能靠近生物反应器拍摄照片。
- 在 FIJI（ImageJ）中打开一张图片。
- 准备图片以进行分析：
- 选择 椭圆 工具，在凝胶塞周围画一个圆。
- 按键盘上的 删除 键，使圆圈内部全部变为黑色。在细胞腔室周围画一个圆，确保所有类球体均位于圆内。
- 运行宏以计数类球体：
- 点击 插件 > 宏 > 记录。将 补充文件 1 中的宏代码复制到记录器中。
- 点击 创建，将打开一个新窗口。点击 运行 以分析已打开的图片。
- 将打开一个显示结果的新窗口（数量、总面积、平均大小和面积百分比）。
- 关闭图像，并对每个需要类球体计数的图像重复步骤 4.4 和 4.5。为便于更快处理，可保存宏文件，然后通过点击 插件 > 宏 > 运行 并选择已保存的宏来执行。
5. 类球体面积的平面测量法测定
注意：用于测定球状体面积的简化流程如图3B所示。
- 按照所述方法拍摄图像 步骤 3.5
- 开始之前，设置全局尺度以测量球状体的面积。
- 在 FIJI 中打开一张带有比例尺且放大倍数符合需求的图片。选择线条工具，沿比例尺绘制一条直线（线条长度需与比例尺长度相等）。
- 开放 分析 > 设定比例尺. 输入已知距离（线条的长度将自动填入） 像素距离. 确保勾选 全球.
- 按压 好的现在已为待分析的图像设置了比例尺。
- 开始进行平面测定前，运行宏（补充文件2）。
- 点击 过程 > 批次 > 大体. 选择包含待分析图片的文件夹。该文件夹将作为 输入.
- 选择在步骤 5.3.1 中创建的文件夹作为 输出. 按压 过程.
- 作为质量控制，评估所测量的球状体面积是否与原始图像相符。
注意：该宏会排除边缘处仅能测量到部分球体的类球体。
6. 类球体的收集
注意：强烈建议使用宽孔吸头收集球状体，以保持其三维结构。可通过生物反应器前端的插件进行收集（图2A）。
收集时类球体的大小可能因细胞系、起始细胞数量以及传代过程（培养天数、每个生物反应器中的类球体数量和传代比例）而有所不同。
- 收集球体时，使用连接长针的注射器从生物反应器顶部端口移除5 mL培养基。确保让球体沉降到生物反应器底部中央（靠近底部端口）。
- 打开前端端口，使用1 mL宽口吸头收集球体，并将球体置于微量离心管中。在500 × g 条件下离心5分钟，弃去培养基。
- 用200 µL HBSS洗涤球体以去除FBS。在500 × g 条件下离心5分钟，弃去上清液。
- 用液氮速冻球体沉淀物，并在-80 °C下保存直至后续处理。
7. 类球体的活力检测
注意：类球体的活力通过检测受损细胞释放的腺苷酸激酶（AK）活性来确定（图4A）。由于扩散梯度的影响，当类球体直径小于900 µm时，AK检测效率较高12。如果类球体体积较大，或对活力检测结果存在疑问，可进行ATP检测15。
- 收集球状体上清液，取 20 µL 转移至 96 孔白色壁板（平底透明）。每孔加入 100 µL 腺苷酸激酶检测试剂，轻轻吹打混匀。
- 在真空离心机中以室温离心 2 分钟以去除气泡。于室温孵育 20 分钟。
- 将板放入化学发光仪（酶标仪，化学发光模式）并启动程序。根据试剂盒制造商的说明设置参数。
注意：在生物发光活力检测中，化学发光仪的直接光输出值（通常为 RLUs）可用于计算细胞反应。由于腺苷酸激酶仅在细胞膜完整性受损的细胞中才会释放，因此可通过使用裂解试剂获得总腺苷酸激酶对照值。
8. 蛋白质提取
注：图1B 表示类球体处理与蛋白质提取的工作流程。
- 在第36天收集类球体（第6节）。将类球体重悬于25 µL的5% SDS溶液中以裂解细胞。
- 加入5% SDS后，通过移液上下吹打使沉淀重悬均质。若某些情况下类球体难以裂解，可使用小型研磨杵。
- 将样品与20 mM DTT在37 °C孵育1小时以还原蛋白质。通过移液上下吹打混匀。
- 将样品与40 mM碘乙酰胺在避光条件下孵育30分钟以烷基化蛋白质。通过移液上下吹打混匀。
- 向样品中加入12%磷酸溶液（10倍浓缩液），使其终浓度为1.2%。
- 用六倍体积的结合缓冲液稀释样品，并轻轻混匀。
- 将样品加载至S-Trap过滤板中，在500 x g离心30秒。
注意：若步骤8.4中样品总体积超过柱容量，应分批上样，并重复步骤8.6 ，直至所有样品均通过色谱柱。 - 用150 µL结合缓冲液洗涤样品两次。每次洗涤后，在500 x g离心30秒，并弃去穿流液。
- 将样品与1 µg测序级胰蛋白酶（溶于50 mM碳酸氢铵中）在37 °C过夜孵育。
注意：建议起始蛋白量至少为20 µg，以用于全面的蛋白质组分析。在此条件下，1 µg胰蛋白酶是实现高效消化的理想用量。确保缓冲液与柱床之间无气泡残留。 - 用40 µL的50 mM碳酸氢铵洗脱肽段，并收集至同一收集管中。
- 在500 x g离心30秒。用40 µL的0.1% TFA洗脱肽段，并收集至同一收集管中。
- 在500 x g离心30秒。用40 µL含60%乙腈和0.1% TFA的溶液洗脱肽段，并收集至同一收集管中。
- 在500 x g离心30秒。将合并的洗脱液在真空浓缩仪中干燥，并将样品储存于-80 °C，待后续处理。
9. 样品纯化
注意：在进行蛋白质组学分析之前，必须去除样品中存在的盐分。盐类在电喷雾过程中会发生离子化，抑制肽段信号，从而干扰高效液相色谱-质谱联用（HPLC-MS）分析。本研究中所用的脱盐操作步骤此前已由 Joseph-Chowdhury 及其同事16报道。
- 开始前，确保准备一个干净的96孔收集板，用于在后续步骤中收集穿流液。在磁力搅拌器上混合C18树脂（50 mg/mL，溶于100%乙腈中）。
- 向96孔滤板的每孔中加入70 µL C18树脂悬浮液，操作应迅速，以避免C18树脂在移液管底部聚集。
- 轻柔开启真空泵，防止溅出。弃去96孔收集板中收集的穿流液。
- 用100 µL 0.1% TFA洗涤树脂。轻柔开启真空泵，防止溅出和样品混合，并弃去穿流液。
- 将每个样品重悬于100 µL 0.1% TFA中。检查并确保pH值在2–3之间。
- 将每个样品加入滤板的对应孔中。轻柔开启真空泵，防止溅出和样品混合，并弃去穿流液。
- 用100 µL 0.1% TFA洗涤。轻柔开启真空泵，防止溅出和样品混合。弃去穿流液。
- 将96孔收集板更换为新的96孔板，用于收集脱盐后的样品。
- 每孔加入60 µL乙腈/0.1% TFA。为从C18树脂中洗脱样品，轻柔开启真空泵以防止溅出。
- 收集穿流液，并在室温下用真空浓缩仪干燥。随后进行LC-MS/MS分析，或在-80 °C保存板子，待后续处理样品时使用。
10. 通过液相色谱-质谱联用进行蛋白质组学分析
注意：为生成本文手稿的数据，使用了配备双柱系统的纳升液相色谱-串联质谱（nLC-MS/MS）系统，其中包含一根内径300 µm × 长0.5 cm的C18捕获柱，以及一根自制填充的内径75 µm × 长25 cm的C18-AQ（3 µm）分析型纳米柱。
- 制备用于高效液相色谱（HPLC）的流动相：
流动相A（MPA）：HPLC级水中含0.1%甲酸
流动相B（MPB）：含0.1%甲酸的HPLC级乙腈 - 程序设置如下：4%–34% MPB 在 120 分钟内线性梯度洗脱，34%–90% MPB 在 5 分钟内线性梯度洗脱，等度洗脱 90% MPB 持续 5 分钟；流速：300 nL/min。
- 设置质谱采集方法，采用数据非依赖性采集（DIA）模式，以生成所检测到的肽段信号的MS/MS谱图。
- 将1 µg样品用10 µL含0.1% TFA的溶液重悬，然后置于nLC自动进样器中。
- 按照常规蛋白质组学采集的预设程序运行纳升液相色谱-质谱（nLC-MS）方法：
- 在轨道阱中设置全扫描质谱范围为300-1100 m/z，分辨率设为120,000（在200 m/z处），自动增益控制（AGC）目标值设为125。
- 在轨道阱中设置MS/MS，采用50 m/z的连续隔离窗口，AGC目标值为400 和一个 30的高能碰撞解离（HCD）能量
11. 数据分析
- 将nLC-MS/MS原始数据文件导入与所用质谱平台兼容的峰检测软件中。
- 选择合适的数据库（如人源、小鼠等）。
- 设置N端乙酰化为可变修饰，半胱氨酸的羧氨甲基化为固定修饰。
- 指定胰蛋白酶为消化酶，并允许最多两个漏切位点。
- 根据用于谱图采集的质量分析器设置相应的质量容差。
- 将分析结果导出为电子表格，并根据需要进一步处理数据。
结果
在本方案中，我们描述了一种创新的无应力三维细胞培养箱的特性，该系统专为三维球状体的培养而设计（图2）。我们优化了THLE-3和HepG2/C3A细胞系的三维培养方案。此处所述方案操作简便，可实现细胞培养的可重复性和低成本扩增 > 每个生物反应器中放入100个球状体。一旦进入生物反应器，球状体的处理方式与二维培养中维持的细胞相似。通过每周更换培养基两到三次，可达到最佳生长条件。图2B）并根据类球体的生长情况和大小调整旋转速度（图2C）。该系统将三维球状体在旋转生物反应器中进行培养（图2E,F），通过使球状体暴露于均匀且极低的剪切力，为三维结构提供了最佳生长环境。
我们此前已展示过类球体可用于染色质修饰的分析16。本文中，我们详细演示了如何获得肝类球体，并如何开展蛋白质组学实验以分析其完整蛋白质组（图1）。简言之，该实验方案起始于使用THLE-3或HepG2/C3A贴壁细胞，待培养至80%融合度时进行后续操作。为将细胞培养成类球体，将约2,000个细胞接种于含有微孔的超低吸附培养板中，使其自发聚集形成类球体，随后将形成的类球体转移至生物反应器中（图1A）。尽管如先前研究所示，类球体在培养3周后即具有功能活性17，但本方案中展示的是培养36天后收集的类球体结果。收集后，通过离心沉淀类球体，分别保存沉淀物和上清液用于后续分析。通过上清液评估细胞活力，定量受损细胞释放的腺苷酸激酶，方法如前所述17。从细胞沉淀物中提取细胞总蛋白，并利用高分辨率质谱技术分析其完整蛋白质组（图1B）。
本方案还展示了一种使用公共图像处理程序FIJI（Fiji Is Just ImageJ）18对类球体进行半自动化计数的方法（图3A）。应拍摄高质量的类球体图像用于分析，并需考虑第5节中提到的一些参数。随后，在完成图像的分析前准备后，使用一个宏脚本（补充文件1）对类球体进行计数。该宏脚本首先在存放类球体图像的文件夹内创建一个名为“FIJI Spheroids counting”的文件夹，所有分析结果将保存在此文件夹中，包括已计数类球体的图像，每种类球体上均标有ID编号。此外，还包括一个名为“spheroid counting”的Excel文件，其中包含每个已计数类球体的像素面积和ID编号。每个分析图像对应的数据分别保存在该文件的不同工作表中，工作表的标签名称与所分析图像的名称一致。由于类球体大小可能受到多种因素影响，例如容器内结构的数量和药物处理，因此监测其表面积（平面测量）也十分重要。此处提供的宏脚本（补充文件2）通过测量图像中对应于类球体的黑色区域来实现测量（图3B）。输出结果汇总于一个名为“planimetry.xlsx”的文件中，该文件包含每个类球体的测量面积、周长和直径。其中还包含一种称为Feret的测量值，用于计算直径：Feret表示可能的最长直径，minFeret表示最短直径，而直径值为这两个值的平均值。在输出文件夹中，除planimetry.xlsx文件外，还包含一张已测量类球体的图像。
在进行蛋白质组分析之前，评估了类球体在培养期间的活力。腺苷酸激酶（AK）水平在第17天达到峰值，细胞死亡率约为7%，随后下降至5%以下（图4A），该结果与先前发表的研究一致17。本方案还展示了通过全蛋白质组分析来监测细胞表型的方法。首先，比较了THLE-3和HepG2/C3A贴壁细胞与类球体的蛋白质组。通过分析第一主成分（PC1），可以明显看出类球体样本与贴壁细胞培养物之间存在严格分离，而细胞类型（THLE-3和HepG2/C3A）的相关性似乎并不显著（图4B）。尽管THLE-3和HepG2/C3A类球体并未聚类在一起，但它们表现出与肝脏功能一致的相似表达谱型。本方案以金属硫蛋白为例进行说明，这类蛋白参与肝脏介导的金属解毒过程。蛋白质组学分析鉴定出在类球体中相较于贴壁细胞显著高表达的两种同工型（MT1E和MT1X）（图4C）。我们还展示了以类球体形式培养的两种细胞系的基因本体（GO）富集结果。碳水化合物代谢过程，包括三羧酸循环（TCA循环）、电子传递链（细胞呼吸）和丙酮酸代谢，在HepG2/C3A和THLE-3类球体中均为常见且显著富集的术语（图4D、E）。细胞解毒、脂肪酸和胆固醇代谢是两种类球体中均富集的其他功能。这些功能共同构成了肝脏功能的关键组成部分。
图1：类球体培养与样品制备的工作流程。（A）3D细胞培养实验方法。将处于理想汇合度的贴壁细胞经胰酶消化后接种于含有微孔的超低吸附24孔板中，细胞在微孔中自组装形成类球体。24小时后，将类球体转移至生物反应器中继续培养，直至可用于分析。（B）收集类球体后，通过离心获得沉淀，分别保存沉淀和培养上清液，待后续处理。提取组蛋白16和非组蛋白蛋白，将其酶解为肽段，并通过高分辨率质谱进行分析。质谱获得的原始数据文件与人类蛋白质数据库进行比对，随后对数据进行进一步处理。请点击此处查看该图的放大版本。
图23D细胞培养系统 (A生物反应器部件。该生物反应器由一个气体交换与加湿室组成，室内含有水珠，以及一个可开启的细胞培养室，后者带有两个用于培养基更换和类球体收集的塞口。B) 生物反应器培养基更换。使用带针头的注射器向生物反应器中加入10 mL培养基。C) 系统控制应用程序。可通过控制单元调节转速、CO2浓度、温度、报警日志及其他功能。D) 将生物反应器放入3D培养箱中。每个生物反应器均配备一个相应的电机，可使生物反应器缓慢旋转。E) 生物反应器在运动中，其转速（rpm）由（C) 平板。转速（rpm）根据类球体的大小进行调整。F3D 培养箱内的生物反应器。该 3D 培养箱最多可容纳 6 个独立控制的生物反应器。照片由 Jason Torres 摄影提供。 请点击此处以查看此图的放大版本。
图3：通过图像采集对类球体进行表型表征。（A）半自动类球体计数。在获取生物反应器中类球体的快照后，将图像导入FIJI进行分析准备。对每个类球体进行计数，并为其分配一个ID编号。使用宏程序进行分析，结果显示了被计数类球体的ID、标签（所分析图像的名称）以及面积（类球体中计数的像素数量）。（B）类球体面积的平面测定法。利用宏程序测定特定类球体的面积、周长和直径。请点击此处查看该图的放大版本。
图 4：肝类器官的蛋白质组分析。（A）类器官的活力根据培养上清液中腺苷酸激酶（AK）的释放量计算得出。结果为两个重复数据点的平均值 ± 标准差（SD）。（B）通过主成分分析（PCA）比较 THLE-3 和 HepG2/C3A 平面培养细胞与类器官的蛋白质组。（C）金属硫蛋白的相对丰度，该类蛋白由人肝脏表达。数据以平均值 ± 标准误（SEM）表示。（D）功能分组网络显示 HepG2/C3A 类器官的 GO 富集结果，以及（E）THLE-3 类器官的 GO 富集结果，其中每组仅显示最显著术语的标签。该网络使用 ClueGo19 构建，节点大小代表术语富集的显著性。请点击此处查看该图的放大版本。
补充文件1：用于类球体计数的宏脚本。 请点击此处下载该文件。
补充文件2：用于类球体平面测定的宏。 请点击此处下载该文件。
讨论
理解三维（3D）细胞结构背后的生物学机制对于更全面地认识其功能至关重要。目前，利用3D模型研究复杂生物学过程并进行毒性筛选正受到越来越多的关注。在培养3D细胞时，需要考虑诸多因素，包括模型系统的表型评估。表型是指某一特定生物体可观察到的一组特征，例如形态、行为以及生理和生化特性20。
在本实验方案中，我们展示了如何利用少量类球体进行蛋白质组学实验，并用于监测典型的肝脏表型。质谱技术已成为用于三维细胞表征的广泛应用方法，可用来研究多种生物学问题12,16,21,22。进行全面的蛋白质组分析时，建议起始材料至少使用20 µg蛋白质，其中1 µg注入质谱仪。需要特别指出的是，样品量过少可能导致灵敏度下降，而过多则会逐渐降低色谱质量，最终导致色谱柱堵塞。在本研究中，我们发现HepG2/C3A和THLE-3类球体富含糖酵解和三羧酸循环中的关键蛋白质，这些是肝脏特有的代谢通路，对维持血糖水平和能量生成至关重要23,24。实际上，质谱分析不仅可提供蛋白质水平的信息，还能用于研究蛋白质的翻译后修饰，我们课题组此前已对此有所报道16。
在三维表型研究中需要考虑的另一个方面是类球体的数量和大小。除了提高实验的可重复性之外，计数类球体数量并测定其大小对于确定何时将培养物分至多个生物反应器中至关重要，因为容器内三维结构的数量可能会影响类球体的大小及其代谢活性水平。然而，需要强调的是，类球体的数量和大小取决于细胞系、起始细胞数量、传代过程以及收集时间。Fey、Korzeniowska 和 Wrzesinski25 提供了 HepG2/C3A 类球体培养的相关细节，例如每个类球体的细胞数量、蛋白含量以及大小随培养时间的变化情况。为了使用本文所述半自动化方法进行准确且成功的分析，最关键的步骤是获得高质量的类球体图像。为简便起见，图像可使用手机或平板设备拍摄，但应尽可能保持高分辨率。由于图像采集速度快，该方法可用于大规模筛选实验，以可视化特定表型特征或研究药物处理后的反应。因此，随着基于细胞的检测方法日益增多，过去十年中已开发出多种用于图像分析的开源软件26。在本方案中，我们描述了一种使用软件 FIJI18 对类球体数量和大小进行半自动化分析的系统。我们提供了脚本（简单的编程指令），用于定义可应用于图像集合的一系列算法操作，从而使分析过程变得简便快捷。然而，根据类球体的具体特性，有时仍需采用手动测量方法。例如，当类球体过于透明时，FIJI 脚本的测量结果将不够精确。此外，该方法成功实施最重要的条件之一是类球体的致密性。这一特性有助于增强类球体与背景之间的颜色对比度，而良好的对比度是确保该方法准确性的必要条件。
总之，除了介绍一种可高度重复的类球体培养方法外，本文还描述了一个半自动化系统，该系统结合了通过图像采集和蛋白质组学进行的表型表征。我们期望随着全自动图像分析软件和新一代质谱仪的应用，这一用于分析三维细胞的工具箱将变得更加完善。
披露
Helle Sedighi Frandsen 任职于 CelVivo ApS 公司，担任研究科学家，该公司为 ClinoStar 系统的生产商。Karoline Mikkelsen 是一名企业资助的博士生，受雇于 CelVivo ApS，并在丹麦欧登塞的南丹麦大学（SDU）开展其博士研究工作。其余所有作者均无竞争性经济利益。
致谢
Sidoli 实验室衷心感谢白血病研究基金会（Hollis Brownstein 新研究者研究资助）、AFAR（Sagol 网络老年组学奖）、Deerfield（Xseed 奖）、Relay Therapeutics、默克公司以及美国国立卫生研究院院长办公室（1S10OD030286-01）的支持。
材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 1.5 mL 微量离心管 | Bio-Rad | 2239480 | |
| 10 mL 注射器 | Fisher Scientific | 1481754 | 鲁尔锁扣尖端，刻度至 12 mL |
| 1000 µL 宽口移液器吸头 | Fisher Scientific | 14222703 | |
| 200 µL 宽口移液器吸头 | Fisher Scientific | 14222730 | |
| 96 孔 Orochem 滤板 | Orochem | OF1100 | |
| 96 孔裙边板 | Axygen | PCR-96-FS-C | |
| 96 孔真空 manifold | Millipore | MAVM0960R | |
| 碳酸氢铵 | Sigma | A6141-25G | |
| 支气管上皮细胞生长培养基 (BEGM) | Lonza | CC-3170 | |
| 细胞培养级水 | Corning | 25-055-CV | |
| ClinoReactor | CelVivo | N/A | 用于 3D 细胞培养的生物反应器 |
| ClinoStar 培养箱 | CelVivo | N/A | 用于 3D 细胞培养的 CO2 培养箱 |
| DTT | Sigma | D0632-5G | |
| 杜尔贝科改良伊格尔培养基 (DMEM) | Fisher Scientific | MT17205CV | |
| 含微孔的 Elplasia 24 孔圆底超低吸附板 | Corning | 4441 | |
| 胎牛血清 | Fisher Scientific | MT35010CV | |
| 甲酸 | Thermo | 28905 | |
| 汉克平衡盐溶液 (HBSS) | Fisher Scientific | MT21022CV | |
| hEGF | Corning | 354052 | |
| HERAcell vios 160i | Thermo | 51033557 | 用于 2D 细胞培养的 CO2 培养箱 |
| 高效液相色谱级乙腈 | Fisher Scientific | A955-4 | |
| 高效液相色谱级甲醇 | Fisher Scientific | A452-1 | |
| 高效液相色谱级水 | Fisher Scientific | W5-4 | |
| 碘乙酰胺 | Sigma | I1149-5G | |
| L-谷氨酰胺 | Fisher Scientific | MT25015CI | |
| 非必需氨基酸 | Fisher Scientific | MT25025CI | |
| Oasis HLB 树脂 30 µm | Waters | 186007549 | |
| Orbitrap Fusion Lumos Tribrid 质谱仪 | Thermo | IQLAAEGAAPFADBMBHQ | 高分辨率质谱仪 |
| PAULA 显微镜 | Leica | ||
| 青霉素-链霉素 | Fisher Scientific | MT3002CI | |
| PerkinElmer Victor X2 多功能微孔板读数仪 | PerkinElmer | ||
| pH 试纸 | Hydrion | 93 | |
| 磷酸乙醇胺 | Sigma | P0503 | |
| 磷酸 | Fisher Scientific | A260-500 | |
| 移液枪 | Eppendorf | Z666467 (Milipore Sigma) | |
| 冷冻离心机 | Thermo | 75-217-420 | |
| Reprosil-Pur 树脂 | MSWIL | R13.AQ.003 | 120 Å 孔径，C18-AQ 相，3 μm 微球粒径 |
| SDS | Bio-Rad | 1610301 | |
| 测序级修饰胰蛋白酶 | Promega | V511A | |
| 真空浓缩仪（适用于 96 孔板） | Thermo | 15308325 | Savant SPD1010 |
| 无菌操作台 | Thermo | 1375 | |
| 无菌移液管 | Fisher Scientific | 1367549 | |
| S-trap | Protifi | C02-micro-80 | |
| 注射器针头（18 G） | Fisher Scientific | 14817100 | 3" 长度，0.05" 直径 |
| 三氟乙酸 (TFA) | Thermo | 28904 | |
| 胰蛋白酶-EDTA | Gibco | 25300-054 | |
| 涡旋振荡器 | Sigma | Z258415 | |
| 水浴锅 | Fisher Scientific | FSGPD10 |
参考文献
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