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利用低强度聚焦超声在大鼠模型中破坏血-脊髓屏障

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DOI：

10.3791/65113

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2023年3月10日

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1Department of Neurosurgery, Johns Hopkins University School of Medicine, 2Department of Biomedical Engineering, Johns Hopkins University, 3HEPIUS Innovation Laboratory, Johns Hopkins University School of Medicine, 4Department of Electrical Engineering and Computer Science, Johns Hopkins University, 5Department of Mechanical Engineering, Johns Hopkins University, 6Department of Anesthesiology and Critical Care Medicine, Johns Hopkins University

本文内容

摘要

通过静脉注射微泡并应用低强度聚焦超声（LIFU），可成功破坏血-脊髓屏障（BSCB）。本方案详细描述了在啮齿类动物模型中使用LIFU开放血-脊髓屏障的操作步骤，包括设备设置、微泡注射、靶点定位以及血-脊髓屏障破坏效果的可视化。

摘要

低强度聚焦超声（LIFU）采用比常规超声更低强度的超声脉冲，正被测试作为一种可逆且精确的神经调控技术。尽管LIFU介导的血脑屏障（BBB）开放已被深入研究，但迄今为止，尚未建立标准化的血脊髓屏障（BSCB）开放技术。因此，本方案介绍了一种在大鼠模型中利用LIFU辐照成功破坏BSCB的方法，包括动物准备、微泡给药、靶点选择 与定位，以及BSCB破坏的可视化与验证。本研究所报告的方法特别适用于需要快速且经济高效地在小动物模型中使用聚焦超声换能器测试并确认靶点定位和精确BSCB破坏的研究人员，也适用于评估超声参数对BSCB开放效果的影响，或探索LIFU在脊髓部位的应用，如药物递送、免疫调节和神经调控。建议根据具体需求优化本方案，尤其为推进未来的临床前、临床及转化研究提供支持。

引言

与血脑屏障（BBB）类似，血脊髓屏障（BSCB）可调控循环溶质、细胞和血浆成分进入脊髓实质1。这一保护性特征源于脊髓毛细血管内壁由紧密连接且无窗孔的内皮细胞构成的特殊系统2。通常，只有低分子量、脂溶性且带正电荷的分子才能穿过这两道屏障3。尽管有研究表明BSCB的通透性略高于BBB，但两者均限制了治疗药物向中枢神经系统的递送4。目前已开发出多种策略以增强药物穿越BSCB的转运能力，包括提高脊髓毛细血管内渗透压的技术、作用于缓激肽受体的药物研发，以及功能化纳米颗粒的构建5。

通过静脉注射微泡（MBs）后结合低强度聚焦超声（LIFU）辐照，也可实现血脊髓屏障（BSCB）的破坏6。超声换能器产生的声场引起微泡振荡，进而对血管内皮壁施加应力，导致紧密连接松解7。紧密连接的松解在毛细血管中形成短暂的间隙，使治疗药物得以进入脊髓实质（图1）。该过程还可产生跨内皮细胞窗孔、增强转胞吞作用，并下调ATP结合盒转运蛋白（如P-糖蛋白）的表达8,9。该技术的一个关键优势在于，可通过将超声辐照焦点精准定位至脊髓特定区域，从而最大限度减少对非靶区的影响。目前已有多个临床试验评估了LIFU介导的血脑屏障（BBB）开放在治疗中枢神经系统疾病（包括胶质瘤、肌萎缩侧索硬化症、阿尔茨海默病和帕金森病）中的有效性。尽管相较于LIFU介导的BBB破坏，LIFU介导的BSCB破坏尚未被充分表征，但已有多个研究团队在啮齿类、兔类和猪类模型中成功实现了BSCB的破坏10,11,12。总体而言，该技术正受到日益广泛的关注，尤其被视为一种具有可行性的药物递送途径。

本方案描述了一种在大鼠模型中利用低强度聚焦超声（LIFU）介导血-脊髓屏障（BSCB）破坏的技术。该操作流程包括动物准备、LIFU设备设置、微泡（MB）给药、靶点定位以及脊髓组织提取的详细说明。通过伊文思蓝染料（EBD）在脊髓中的外渗情况来评估靶点定位的准确性及BSCB的破坏效果。EBD是一种无毒化合物，可与血清白蛋白结合，其深蓝色可通过肉眼观察识别，且在显微镜下呈现红色自发荧光13。

此处列出的步骤为传统的超声（US）或磁共振（MR）引导的LIFU系统提供了一种快速且低成本的替代方案。因此，该方法适用于希望在购置额外设备和材料之前，或在开展脊髓部位的LIFU应用（如药物递送、免疫调节和神经调节）之前，快速测试并验证其LIFU换能器的靶向能力和血脊髓屏障（BSCB）破坏效果的研究人员。

方案

所有动物实验均经约翰斯·霍普金斯大学机构动物护理和使用委员会（IACUC RA20M223）批准，并遵循其规定进行。本研究仅使用成年斯普拉格-多利雌性大鼠（平均体重：250 g；年龄：11周）。

1. 低强度聚焦超声装置的组装与设置

  1. 获取具有足够技术参数的聚焦超声换能器系统，以实现大鼠血脊髓屏障（BSCB）的开放。文献建议的参数包括：中心频率在0.25–4 MHz之间，且能够产生0.2–2.1 MPa的峰值压力。 10,14,15,16,17确保系统包含驱动/控制设备，至少包括波形/信号发生器、射频（RF）驱动/功率放大器和匹配网络。图2A).
    注意：此处所述装置采用一种 commercially available 多元阵换能器，中心频率为 250 kHz，直径为 64 mm（图2B).
  2. 将3D打印的探头支架和水锥安装到换能器上（图 2C确保锥体与换能器之间形成防水密封。
    注意：本实验所用的换能器配备了一个定制的锥形件和探头固定装置。锥形件和探头固定装置通过配套提供的螺丝固定在换能器上。
  3. 将一片厚度为50 µm的声学透明聚酯膜灭菌，并用橡皮筋将其固定在水锥底部。
  4. 使用进水和出水管路，将脱气去离子水注入水锥中。注意避免水锥内部产生气泡，因为气泡可能干扰换能器与靶组织之间的声学耦合。聚酯膜应略微膨胀。
    注意：向锥形容器注水时，应通过进水阀注水，并引导气泡从出水阀排出，以去除锥形容器中的气泡。若存在大量小气泡，可关闭所有阀门并旋转锥形容器，直至仅剩一个大气泡。将此大气泡引导至出水阀后，继续注水填充锥形容器。
  5. 将驱动设备（包括波形发生器和射频驱动放大器）连接至换能器。换能器电缆应连接至匹配网络的输出端，信号发生器/功率放大器则连接至匹配网络的输入端。电缆应连接至对应的通道编号图2D- G).
    注意：在本研究使用的商用系统中，波形发生器和射频驱动放大器是换能器功率输出（TPO）的组成部分图 2D).
  6. 将探头支架连接至立体定位臂，再将立体定位臂固定到固定板组件上。这可确保换能器在超声处理期间精确定位于啮齿类动物的上方。

2. 动物准备与手术椎板切除术

  1. 在连接活性炭过滤罐的诱导室中，使用异氟烷与医用空气的混合气体对大鼠进行麻醉。设置气体流速为400 mL/min，异氟烷蒸发器浓度为1.5%–2.5%，用于诱导麻醉。大鼠在诱导室内至完全镇静所需时间因个体而异，通常为3–6分钟。
  2. 记录麻醉大鼠的体重，并进行足趾夹捏测试。若观察到夹捏时出现抽动或运动反应，将大鼠放回诱导室中额外麻醉1分钟，然后重复足趾夹捏测试。根据需要重复此操作，以确保大鼠完全麻醉并维持麻醉状态。
  3. 将加热垫和无菌吸水垫放置在固定板上。将大鼠置于吸水垫上，涂抹眼药膏，并插入直肠温度计以监测体温。
    注意：在手术过程中，应持续监测大鼠的体温和心率（理想情况下，心率应维持在330-480次/分钟，体温应保持在35.9-37.5 °C之间）18,19根据需要调整异氟烷浓度或加热垫，以防止动物过早死亡。加热垫温度可设置为约37 °C，并应根据需要开启或关闭，以维持动物最佳体温。
  4. 触诊大鼠最后一根肋骨，该肋骨在第13椎骨处与脊柱相连th 胸椎（T13）。使用电动剃须刀剃除最后肋骨至颈部之间背侧表面的毛发。用浸有10%聚维酮碘的纱布擦拭暴露的皮肤。
  5. 使用虹膜剪做正中切口，分离筋膜直至暴露棘突和椎板。使用偏头咬骨钳和斜面虹膜剪去除骨质，直至暴露脊髓。20椎板切除和切口的长度取决于需要进行超声消融的目标区域数量。本研究中，采用3 cm切口进行三个节段的椎板切除。
    注意：去除骨骼时应避免触碰或压迫脊髓，以防造成损伤。如果在椎板切除过程中大鼠后肢出现抽动，则表明对脊髓或神经根施加了过大的力量。
  6. 用夹子固定椎板切除部位附近的棘突，将大鼠固定在固定板上。在锁紧夹子前，轻轻拉直脊柱以尽量减少弯曲。

3. 使用激光引导进行靶点定位

  1. 使用立体定位臂调整换能器的位置，直至其精确地位于椎板切除部位的正上方（图3A）。该支架可在x、y和z轴方向上移动，并可在垂直平面内旋转180°，在水平平面内旋转360°。
  2. 将激光装置固定在水锥底部并向下移动，直至可见激光点。调整换能器的侧向位置，使激光点位于目标血脊髓屏障（BSCB）破坏区域的正上方（图3B、C）。
    注：激光装置的计算机辅助设计（CAD）文件包含在补充材料中（补充图1）。
  3. 移除激光装置，并在水锥与脊髓之间填充脱气的超声耦合凝胶（图3D）。为实现最佳耦合，确保凝胶中无气泡存在。
    注：在本研究中，将带有固定水锥的换能器下放至距脊髓1 cm的位置。由于水锥长度为30 mm，因此换能器到脊髓的总距离为40 mm。水锥与脊髓保持1 cm的距离，是因为大鼠切口两侧的皮肤、筋膜和肌肉组织会阻碍水锥尖端与脊髓的直接接触。使用立体定位臂y轴上的刻度有助于记录水锥距离脊髓1 cm时的垂直位置，尤其是在凝胶会影响对水锥与脊髓间距进行目视确认的情况下。
  4. 在TPO上设置超声照射参数。可采用一系列参数值以成功实现BSCB破坏。为获得最大功率，应将超声频率设置为接近换能器的中心频率。本研究中使用的参数列于表1。
    注：此处列出的参数借鉴了先前关于低强度聚焦超声（LIFU）的研究，其中心频率为500 kHz，脉冲持续时间为500 µs，占空比为50%，超声照射时间为5或10分钟，可安全地对啮齿类动物脊髓进行神经调节21。根据成功实现BSCB破坏的相关研究，其他可采用的参数包括：中心频率在500 kHz至1 MHz之间，声压为0.2–2.1 MPa，脉冲长度为10–25 ms，超声照射时间为2–5分钟6,10,11,22。
参数数值
频率 (kHz)250
聚焦距离 (mm)40
声学峰值压力 (MPa)0.47
占空比40%
脉冲长度 (ms)400
周期 (s)1
超声处理时间 (min)5

表1： 用于破坏血脊髓屏障（BSCB）的超声处理参数。

4. 微泡给药

  1. 根据制造商提供的说明制备微泡（MB）溶液。避免将空气引入溶液中。
    注意：微泡较为脆弱，若静置数分钟，会聚集在瓶/注射器顶部。需定期摇动瓶子和注射器，以防止微泡分布不均。微泡寿命较短，请查阅制造商指南以确定其有效期。
  2. 插入22 G尾静脉导管，并用0.2 mL肝素化生理盐水（500 IU/mL）冲洗23。为提高尾静脉插管成功率，可将尾巴浸入温水中，并在尾根部绑扎止血带，以增大静脉直径。
    注意：尾静脉插管可在动物进行椎板切除术、定位和靶向操作之前完成，以节省实验时间。
  3. 通过导管注射1 mL/kg的3%伊文思蓝染料（EBD），随后用0.2 mL肝素化生理盐水冲洗。大鼠的四肢和眼睛将变为蓝色。通过观察大鼠背侧脊髓静脉是否出现蓝色变化，确认尾静脉插管成功（图4）。
    注意：EBD可在微泡注射前较早时间给予，且不会影响超声辐照效果。此外，由于美国食品药品监督管理局（FDA）目前尚未批准在体内已有药物的情况下进行超声辐照，EBD也可在超声辐照后给予。这将导致染料摄取减少，但可能更具临床相关性。
  4. 向导管内注射0.2 mL微泡团注液，并用0.2 mL肝素化生理盐水冲洗。在注射微泡后1-2分钟开始超声辐照。本实验所用装置不采集实时超声反馈信号。
    ​注意：针对血脊髓屏障（BSCB）破坏的研究通常使用的微泡浓度高于诊断成像所推荐的浓度。在大鼠模型中用于血脑屏障（BBB）和血脊髓屏障（BSCB）破坏的一些常用微泡品牌的浓度包括0.02–0.2 mL/kg以及200 µL团注剂量10,15,24,25。

5. 脊髓提取与组织处理

  1. 超声处理结束后，用 100 mL 冷磷酸盐缓冲盐水（PBS）对大鼠进行心脏灌流，直至血液完全澄清。由于染料的存在，肝脏原本呈深蓝色，此时应逐渐褪为浅棕蓝色26。
    注意：灌流的目的是清除脊髓血管系统中的过量血液。由于伊文思蓝（EBD）与白蛋白结合，此步骤同时可去除多余的 EBD。这可确保在脊髓中通过肉眼观察或荧光显微镜检测到的任何 EBD 均来源于染料渗出至脊髓实质。
  2. 用 100 mL 冷的 4% 多聚甲醛（PFA）进行心脏灌流。若固定充分，大鼠的四肢在此过程中会出现抽搐。该 PFA 灌流步骤可使大鼠安乐死。
  3. 取出脊髓并置于 4% PFA 中，4 °C 下固定过夜。次日将 PFA 更换为 PBS。

6. BSCB 屏障破坏的可视化观察

  1. 使用剃刀切取聚焦超声处理部位周围2 cm的组织区域，沿中线切开，并用切片机将组织切成10 µm厚的切片。如需进行明场观察，使用苏木精-伊红（H&E）染色。
    注：本研究中展示的H&E染色脊髓样本经苏木精染色3分钟，伊红染色1分钟27。
  2. 进行荧光显微镜观察时，对载有脊髓切片的玻片进行脱蜡处理，并加入25 µL含4′,6-二脒基-2-苯基吲哚（DAPI）的封片介质（0.5 µg/mL）进行复染。在4 °C孵育至少10分钟，避免光照以防止荧光淬灭。
    注：脱蜡步骤可用冷冻切片机获取冷冻切片的方法替代。
  3. 使用荧光显微镜对所有玻片进行成像。EBD的自发荧光（激发波长：470 nm和540 nm；发射波长：680 nm）在红色通道可见，而DAPI信号位于蓝色通道。使用光学显微镜对H&E染色玻片进行成像。
    注：尽管本方案描述的是非存活性操作，但也可采用存活性手术技术进行。对于存活性手术，术前切口部位需使用碘伏连续消毒三次（交替进行），并在术前皮下注射布托啡诺（0.05 mg/kg）。术后至少连续3天每12小时皮下给予布托啡诺一次，若大鼠出现疼痛症状，应延长给药时间。若发生脊髓损伤，大鼠可能出现尿潴留或步态异常，表现为后肢拖行或运动迟缓，或可触及膀胱充盈肿大。一旦出现上述情况，应将大鼠饲养在含有营养强化水凝胶的环境中以保障食物与水分摄入，并每日人工排尿两次，直至反射性排尿功能恢复。若出现后肢完全瘫痪或难以控制的疼痛，应实施安乐死。

结果

本文证明，同时应用低强度聚焦超声（LIFU）声波与微泡（MB）给药是一种有效的局部血-脊髓屏障（BSCB）开放技术。BSCB的开放通过伊文思蓝（EBD）外渗进入脊髓实质来指示。这些变化在肉眼观察和荧光显微镜下均清晰可见。椎板切除术后，脊髓脉管系统清晰可见，显示出脊髓后静脉及其向两侧辐射的多个较小血管。图 4A）。通过尾静脉导管注射伊文思蓝染料，可使该血管系统富含蓝色染料。图 4B）。这是检查椎板切除术是否导致任何脊髓血管破裂的合适时机，因为血管破裂会导致蓝色血液在脊髓表面积聚。超声处理后，目标位置上方应出现蓝色斑点，表明由于血脊髓屏障破坏，伊文思蓝染料已外渗至白质实质中。图 4C该斑块的大小取决于多种因素，包括换能器焦区尺寸以及超声辐照后的时间间隔。为增加观察到伊文思蓝染料外渗的可能性，应延长超声辐照与脊髓取材之间的时间间隔。

虽然PFA灌注并非在提取脊髓及后续组织分析前必须进行的步骤，但它能去除样本中的血液，并增强白色脊髓实质与蓝色EBD染色区域之间的对比度。所有接受微泡注射和低强度聚焦超声处理的实验大鼠均显示EBD明显外渗至脊髓，而仅接受微泡和EBD注射但未进行低强度聚焦超声处理的阴性对照组则未出现此现象。代表性图像如下所示。 图 5组织矢状切面显示，EBD 外渗不仅存在于浅表区域，还深入脊髓内部。这一现象符合预期，因为本研究所用换能器的聚焦区域大于大鼠脊髓直径。在矢状切面上有时可见少量出血，这可能由椎板切除术或超声辐照引起。若出血位置靠近脊髓背侧外周，则更可能源于椎板切除术。

为进一步评估伊文思蓝（EBD）外渗情况，对矢状位脊髓切片进行了DAPI（细胞核标记物）染色，并使用荧光显微镜成像。所有接受低强度聚焦超声（LIFU）处理的脊髓样本（n = 3）均显示出显著更强的EBD自发荧光强度。p = 0.016），而未接受超声处理的脐带中则无此现象，且两者DAPI荧光强度相似。图6）。H&进一步分析显示，声波处理部位未出现神经元损伤、出血或空洞性病变，这支持了该操作的安全性。作为对比，图中展示了因手术操作不当和高功率声波处理导致的脊髓损伤示例。出血、组织损伤、空洞性病变及可能的空泡化现象均已标注。尽管高功率声波处理示例未显示出血，但文献报道超声破坏效应也可能导致出血。

此外，对接受微泡、伊文思蓝染料及低频超声辐照的大鼠进行了行为学分析。尽管该方法无法完全排除组织损伤，但可检验此操作是否导致运动功能缺损。连续5天内每日记录大鼠在笼中行走5分钟，并依据Basso Beattie Bresnahan运动功能量表对其运动功能进行分级。补充视频文件 1所有大鼠（n = 5）在超声处理前、超声处理后以及存活期的每一天均获得了最高评分。图 7).

最后，使用两个 离体 大鼠脊髓样本，以及一根尖端精细的数字温度计探针插入脊髓中。  脊髓样本的温度在超声处理前、处理期间及处理后共监测了15分钟（各阶段5分钟）。观察到温度变化极小。事实上， ≤1.3 °两个样本中均未观察到因超声处理导致的 C 值变化，从而降低了超声处理引发热损伤的可能性。图 8).

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图 1低强度聚焦超声介导的血-脊髓屏障开放机制。 (A) 大鼠脊髓低强度聚焦超声（LIFU）声辐射示意图。B) 低强度聚焦超声（LIFU）联合静脉微泡（MBs）开放血-脊髓屏障（BSCB）的机制。微泡响应LIFU发生振荡，导致内皮细胞间紧密连接增宽。BSCB的这种破坏使得纳米颗粒、治疗药物或伊文思蓝染料得以外渗。 请点击此处查看此图的放大版本。

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图 2低强度聚焦超声实验台设置与连接。 (A) 显示典型聚焦超声组件的示意图。B聚焦超声设备概览图，包括：1. 换能器功率输出（TPO），2. 匹配网络，3. 低强度聚焦超声（LIFU）换能器，4. 立体定位仪，5. 移动夹具。C) 换能器，包括：1. 探头支架，2. 环形换能器，3. 水锥，4. 进水软管，5. 出水软管，6. 用橡皮筋固定的薄膜。D) 总功率输出器正面，包括：1. 射频屏蔽外壳，2. 带可调菜单的触敏前显示面板，3. 用于参数调节的旋转旋钮，4. 启动/停止输出开关。E) TPO 设备背面，包括：1. 通道输出连接器，2. 接地端，3. 用于软件控制的 USB 输入端口，4. 内部触发器，5. 同步输出连接器，6. 电源输入插孔与电源，7. 电源开关。F) 匹配网络输出，导线与通道编号对应。G) 匹配网络 XDR 输入，导线与通道编号对应 请点击此处查看此图的放大版本。

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图 3目标定位与激光引导。 (A) 可在三个轴向进行全方位运动并具备旋转功能的立体定位臂。其固定于下方的固定板。B) 用于识别焦区的激光装置。激光器位于换能器尖端，并与焦区对齐。(C) 示意图显示激光照射于暴露的脊髓，指示换能器位置'其聚焦区域现已指向该位置。D) 将换能器向下移动，直至锥形尖端位于脊髓上方1厘米处，并用凝胶填充间隙以确保最佳耦合。换能器至脊髓的距离为40毫米（焦距）。 请点击此处查看此图的放大版本。

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图 4超声处理后脊髓中的伊文思蓝染料外渗。 (A) T9-T11 大鼠椎板切除切口照片，暴露的脊髓及背侧后静脉清晰可见。B) 静脉注射伊文思蓝染料 (EBD) 后，周围组织及脊髓血管系统呈现蓝色。C) 超声处理部位脊髓实质内出现伊文思蓝染料外渗，表明血-脊髓屏障已发生破坏。 请点击此处查看此图的放大版本。

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图 5脊髓提取与灌注后血脊髓屏障开放的可视化。 (A) 未经低强度聚焦超声处理的对照组大鼠离体脊髓。该大鼠仅接受微泡与伊文思蓝染料注射。插图所示为石蜡包埋脊髓的矢状正中切片，未见伊文思蓝染料外渗。B) 经低强度聚焦超声处理的大鼠离体脊髓。该大鼠亦接受了微泡与伊文思蓝注射。伊文思蓝外渗柱清晰可见，且局限于超声辐照区域。插图所示为石蜡包埋脊髓的中矢状切片，箭头指向超声辐照区域内可见的伊文思蓝聚集处。  请点击此处查看此图的放大版本。

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图 6血脑屏障开放检测与评估。 (A) 脊髓经 DAPI（细胞核标记物，蓝色）染色。可见微弱的 EBD 自发荧光（红色）。该大鼠未接受 LIFU 处理。B) 脊髓经 DAPI（细胞核标记物，蓝色）染色。可见声波作用靶位点处存在局部 EBD 自发荧光（红色）。该大鼠接受了 LIFU 与 MBs 处理。C) 未接受低强度聚焦超声处理的大鼠脊髓，经苏木精（核酸染色剂）和伊红（非特异性蛋白染色剂）（H&E). 未见神经元损伤、出血或空洞性病变。D) 经 H 染色的大鼠脊髓（LIFU）&E. 未见神经元损伤、出血或空洞性病变。E) 大鼠手术损伤脊髓的 H 染色&E. 箭头指向大量出血与组织损伤。F) 经大功率超声处理导致损伤的大鼠脊髓，采用 H 染色。&箭头指向腔隙性病变，插图显示可能的空泡化。G柱状图显示经低强度聚焦超声（LIFU）处理与未经处理的脊髓中DAPI和伊文思蓝（EBD）的荧光强度。与阴性对照组相比，经LIFU处理的脊髓中EBD强度显著更高。p = 0.016），尽管 DAPI 荧光强度相似p > 0.05). 请点击此处查看此图的放大版本。

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图 7超声处理前后的行为学检测。 (A) Basso、Beattie、Bresnahan 装置设置，从下方记录大鼠行走 5 分钟。B) 视频录制中的静态画面。该视频用于对大鼠进行评分'运动协调性与步态评估采用 Basso、Beattie、Bresnahan 量表进行。C) 箱线图（n = 5）显示，在接受微泡和低强度聚焦超声治疗的大鼠中，其运动评分在超声处理前、超声处理后以及5天存活期内均无变化。p > 0.05). 请点击此处查看此图的放大版本。

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图 8温度分析 离体 脊髓。 图表描绘了两个样本的温度变化 离体 脊髓样本在超声处理前、处理中及处理后各持续5分钟。超声处理所用参数列于 表 1对于样本1，超声处理前、处理期间和处理后的平均温度分别为21.9 °C ± 0.1 °C，22.1 °C ± 0.1 °C，以及 22.0 °C ± 0.1 °C，分别。对于样品2，超声处理前、处理期间和处理后的温度分别为21.9 °C ± 0.1 °C, 22.5 °C ± 0.3 °C，以及 22.4 °C ± 0.2 °C。 请点击此处查看此图的放大版本。

补充图 1：激光靶向装置的 CAD 文件。 (A) 从下方观察激光装置。任何激光器均可置于中央孔洞内。B) 激光装置的侧视图。C) 激光装置尺寸，单位为英寸。 请点击此处下载此文件。

补充视频文件1：大鼠在Basso、Beattie、Bresnahan装置中行走的视频。 请点击此处下载此文件。

讨论

本文描述了使用低强度聚焦超声（LIFU）联合微泡（MB）给药实现高效且靶向性血脊髓屏障（BSCB）开放所需的设备与操作步骤。该方案具有良好的灵活性，可根据不同规格的换能器进行个性化优化。目前其他基于LIFU的BSCB开放技术通常依赖磁共振成像（MRI）引导系统进行靶区定位，此类设备成本高昂16。本文所述技术的优势在于可通过开放式的操作方式实现BSCB开放的快速实时可视化验证，并便于靶向定位。此外，激光装置结构简单，易于使用和搭建，补充部分中提供了相应的CAD文件。因此，希望在小型动物模型中初步测试其LIFU换能器靶向能力的研究人员，可利用本方案快速确认焦点区域是否准确定位于目标位置。对于正着手研究LIFU临床应用（如药物递送）的实验室而言，在投入更复杂的引导系统（如超声或磁共振系统）之前，也可采用本技术作为前期探索工具。目前，与磁共振系统相比，超声引导方式展现出更具前景且成本更低的发展路径，尽管现有文献中仍以磁共振系统报道居多。

在该操作过程中，有几个关键步骤必须谨慎执行，以确保血脊髓屏障（BSCB）成功破坏。在进行手术椎板切除时，必须避免对脊髓施加不必要的压力。对脊髓过度的物理操作会增加BSCB受损的风险。受损部位在组织取出后表现为脊髓内部出现深棕色斑点，这是由于出血和伊文思蓝染料（EBD）外渗增加所致。此外，必须确保换能器与暴露的脊髓之间达到最大程度的耦合。因此，需仔细清除水锥和超声耦合凝胶中的气泡。水锥底部与脊髓之间不应存在任何间隙，以保证声波的完全传递。在尾静脉插管过程中，应避免将空气随肝素化生理盐水、EBD或微泡（MB）溶液一同注入。注入空气会显著增加发生肺栓塞的风险，导致实验动物在操作结束前死亡28。

在本操作过程中可能遇到的一个常见问题是EBD注射失败。对于尾静脉插管经验较少的操作者，建议在动物进行椎板切除术、体位固定或靶向定位之前完成此步骤，以节省时间。EBD也可在微泡（MB）注射前较早注入，且不会影响超声辐照效果。采用本方案中推荐的止血带和温水浴有助于扩张尾静脉，提高操作成功率。此外，大鼠脱水会降低导管正确置入的可能性，因此在尾静脉插管前10–15分钟给予腹腔生理盐水注射可能有所帮助。在插管过程中，应从尾端末端上方约2英寸处开始，沿尾部向头部方向（由尾侧向头侧）推进。反向操作会因静脉塌陷或出血的风险增加而降低成功率。

另一个常见问题是尽管进行了超声处理，但未出现伊文思蓝（EBD）外渗。这可能表明所使用的超声参数不足以破坏血脊髓屏障（BSCB）。例如，若超声频率设置值与换能器的中心频率相差较大，则超声功率将过低，无法有效振荡微泡（MBs）并导致紧密连接松动。此外，换能器与导线之间的界面越多（如水锥、膜、凝胶、水/凝胶中的气泡），靶点处的实际超声强度就越低。尽量减少这些界面，例如使用脱气凝胶并彻底清除水锥内的气泡，有助于充分传递超声能量。本方案还建议延长超声处理与灌注之间的时间间隔，以允许更多时间让EBD外渗进入脊髓实质。尽管BSCB的破坏是暂时性的，但其形成的间隙可在数小时内持续存在。等待时间较长会增加异氟烷暴露时间，但也会导致脊髓中更显著的EBD外渗。另外，即使未进行LIFU超声处理，也可能出现EBD外渗。为排查此问题，在进行椎板切除术时必须格外小心，以防止对BSCB造成意外损伤。可能的解决方案包括在夹持时抬高大鼠脊柱，以增加椎板与脊髓之间的空间，以及缩短椎板切除范围。充分的PFA灌注还可通过清除脊髓血管内富含EBD的血液来降低背景染色。在经心灌注过程中，必须注意避免心脏意外破裂，否则可能导致PBS或PFA泄漏。

需要注意的是，本研究仅代表单中心在LIFU介导的BSCB破坏方面的经验。此外，本方案并未测试或优化各种超声能量参数和微泡浓度。因此，研究人员在实施该技术时，应探索不同的参数和浓度，以针对其特定研究需求优化靶向定位和BSCB破坏效果，尤其是在初始结果出现任何不良反应时。例如，若研究团队希望避免温度变化，可尝试不同参数组合，直至找到满足该条件并实现充分BSCB破坏的参数设置。此外，还可开展进一步实验以验证该技术的安全性。例如，可增加样本量、延长存活时间，并进行肌电图/步态分析研究。对于较长的存活期，需注意某些研究表明高剂量EBD有时可能导致慢性全身毒性，因此采用较低剂量可能更为谨慎29。

该方案的另一个局限性在于椎板切除术的侵入性（由于超声无法穿透骨骼，因此任何使用LIFU打开BSCB的技术均需进行椎板切除术）。通过缩短椎板切除的长度，可以降低该操作的侵入性。在较短且较薄的上胸椎部位进行椎板切除，可将手术时间缩短至10分钟以内。由于微泡（MBs）本身较为脆弱且半衰期短，本方案的操作时间十分有限。微泡注射应在LIFU处理前1-2分钟进行；若需进行多次LIFU照射，则每次超声处理前均应重新给予新的微泡。对于涉及多只大鼠BSCB破坏的实验，可能需要准备多个微泡试剂瓶。由于微泡成本较高，建议优化手术流程，尽量缩短各次超声处理之间的间隔时间，以减少微泡的使用数量。

本文所述技术主要作为研究方案使用。尽管激光定位装置不会在所有临床环境中取代传统的定位方法，但在其他情况下可能具有应用价值。对于非侵入性手术，可可靠地采用传统磁共振成像（MRI）方法进行定位30。对于需实施椎板切除术的侵入性手术，本方案中描述的激光点装置可用于快速定位特定区域（例如肿瘤或脊髓损伤部位）上聚焦超声作用区的中心位置，从而辅助药物递送或免疫调节治疗，同时可补充正在进行的任何磁共振引导操作。

总体而言，本方案描述了一种有效且成功的BSCB破坏技术，并提供了多种在实时和后期处理中确认BSCB开放的方法。由于BSCB作为进入脊髓实质的屏障，破坏BSCB可能是提高治疗药物递送效率的一种可行方法。例如，Weber-Adrian等人使用频率为1.114 MHz、脉冲长度为10 ms的LIFU介导基因递送至颈椎部位6。类似地，Smith等人表明，在脑膜转移瘤的啮齿类动物模型中，使用频率为580 kHz、平均声学峰值压力约为0.46 MPa、脉冲长度为10 ms的LIFU可促进单克隆抗体曲妥珠单抗（trastuzumab）向脊髓的递送10。  大多数研究集中于使用LIFU而非HIFU，原因是LIFU能够在避免对深层组织造成损伤的同时，实现BSCB的短暂通透化。通常，LIFU使用的强度范围为0.125–3 W/cm2，而HIFU使用的强度则为100–10,000 W/cm2或更高31。因此，HIFU主要通过加热组织发挥作用，而LIFU在联合使用微泡（MBs）时，则主要通过机械性空化效应起作用。治疗药物与微泡共同给药可增强药物向脊髓实质的外渗，同时也有望将药物负载于微泡中，并通过超声破裂微泡以实现靶向药物递送。

本研究中的超声参数、微泡浓度以及所用换能器的类型可根据实验需求进行调整。例如，在需要对局部靶向进行更精确控制的实验中，可选用焦域较小的换能器；而在需要在较短时间内实现较强破坏效果的实验中，则可使用功率较高的换能器。由于本方案具有良好的灵活性，因此在临床前研究、临床研究及转化研究中均具有广阔的应用前景。

披露

作者声明，本研究在不存在任何可能被解释为潜在利益冲突的商业或财务关系的情况下进行。Amir Manbachi 为 BK Medical（GE Healthcare）、Neurosonics Medical 提供教学和咨询服务，并拥有多项正在申请专利的聚焦超声（FUS）技术的发明权。Betty Tyler 获得美国国立卫生研究院（NIH）的研究资助，是 Accelerating Combination Therapies 公司的共同所有人（包括股权或期权）。Ashvattha Therapeutics 公司已获得她的一项专利授权，且其本人为 Peabody Pharmaceuticals 公司的股东。 Nicholas Theodore 从 Globus Medical 获得专利使用费并持有该公司股票。他担任 Globus Medical 的顾问，并曾在 Globus Medical 的科学咨询委员会或其他职务任职。其余作者无任何利益冲突需要披露。

致谢

由 T32GM136577（D.R.）；N660012024075（N.T.、N.V.T.、A.M.、K.K.L.）；R01 HL139158-01A1 和 R01 HL071568-15（N.V.T.）；约翰斯·霍普金斯大学 ICTR 临床研究学者项目（KL2）（A.M）提供支持。部分图示使用 BioRender.com 制作。

材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
0.9% 肝素化氯化钠BaxterFKB0953G用肝素化生理盐水冲洗尾静脉导管，以防止凝血。
100 mL 带鲁尔锁头端的注射器（2 个）Wilburn MedicalWUSA/120一个注射器可用于注射 PBS，另一个用于注射 PFA（经心灌注期间）
1× 磷酸盐缓冲液（PBS）Thermo Scientific 10010001用于经心灌注。
22 G 导管Med Vet International50-209-1694用于放置尾静脉导管。
97% 异氟烷Thermo Scientific Chemicals247-897-7大鼠处于异氟烷麻醉状态时，注意不要给予过量。高剂量可能导致大鼠安乐死。
7.5% 聚维酮碘Purdue Products4677
A 级透明螺口玻璃小瓶Fisherbrand14-955-314用于储存脊髓提取物。
数字电子天平Kent ScientificSCL-4000
电动剃毛器Wahl Home Products79449-200手术前剃除切口部位皮肤上的毛发
伊红-Y 与品红Epredia71304
伊文思蓝染料MP Biomedicals02151108-CF尽管该染料无毒，但若直接接触皮肤会导致皮肤染成蓝色。
带 0.5 mm 镊子的固定板组件PSI Impactors7001-2将立体定位臂固定在该支架上
纱布Fisherbrand13-761-52 
加热垫 Kent ScientificRT-0515
苏木精Epredia7211
带弯头刀片的虹膜剪ProDentUSA12-15315
异氟烷诱导系统  Kent ScientificSOMNO-RATKIT
激光定位装置NAcustom补充部分提供 CAD 设计文件。只需将激光器放入根据该文件制作的装置中即可。 
润滑眼膏SystaneN/A
鲁尔锁三通阀SigmaSAS7521-10EA可通过入口阀用于填充水囊锥形探头
Lumason 微泡试剂盒Bracco0270-7099-16
显微镜盖玻片Fisherbrand12-545J
显微镜载玻片Fisherbrand12-550-15 
切片机Epredia23-900-671 
含 4',6-二脒基-2-苯基吲哚（DAPI）的封片剂Vector LaboratoriesH-2000-2
聚酯膜（Mylar 膜）Chemplex3016若膜过大，可裁剪至适合锥形探头的尺寸
NeuroFUS 2.52" 直径 250 kHz 换能器Sonic ConceptsCTX-250换能器系统包括定制水囊锥形探头和探头支架
NeuroFUS PRO v2.0 系统Sonic ConceptsNFS102v2包括换能器功率输出模块、匹配网络及配套电缆
偏移式骨剪Fine Science Tools16101-10用于切除棘突和椎板以进行椎板切除术
石蜡Polysciences24364-1 可将脊髓样本包埋于石蜡中，以便切片进行组织学分析。
4% 多聚甲醛Thermo Scientific J61899-AK用于经心灌注。
大鼠手术器械包Kent ScientificINSRATKIT包含 #5 镊子、持针器、McPherson-Vannas 剪刀、虹膜剪、ALM 自持式牵开器、虹膜镊和钝头探针。这些器械足以完成椎板切除术。
刀片Fisherbrand12-640用于将脊髓提取物切割至所需长度，并沿中线切开组织块。
直肠温度计Kent ScientificRET-2维持大鼠体温在 35.9–37.5 °C 范围内
橡胶圈Fisherbrand50-205-1983
单动物麻醉蒸发器单元Kent ScientificSF-01
立体定位臂Kopf InstrumentsModel 963
无菌吸收垫McKesson4033-CS150在椎板切除术前，将大鼠置于无菌吸收垫上，垫位于加热垫和固定板之上
超声耦合剂AquasonicPLI 01-34应尽可能确保耦合剂中无气泡。

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