利用低强度聚焦超声在大鼠模型中破坏血-脊髓屏障

摘要

通过静脉注射微泡并应用低强度聚焦超声（LIFU），可成功破坏血-脊髓屏障（BSCB）。本方案详细描述了在啮齿类动物模型中使用LIFU开放血-脊髓屏障的操作步骤，包括设备设置、微泡注射、靶点定位以及血-脊髓屏障破坏效果的可视化。

摘要

低强度聚焦超声（LIFU）采用比常规超声更低强度的超声脉冲，正被测试作为一种可逆且精确的神经调控技术。尽管LIFU介导的血脑屏障（BBB）开放已被深入研究，但迄今为止，尚未建立标准化的血脊髓屏障（BSCB）开放技术。因此，本方案介绍了一种在大鼠模型中利用LIFU辐照成功破坏BSCB的方法，包括动物准备、微泡给药、靶点选择 与定位，以及BSCB破坏的可视化与验证。本研究所报告的方法特别适用于需要快速且经济高效地在小动物模型中使用聚焦超声换能器测试并确认靶点定位和精确BSCB破坏的研究人员，也适用于评估超声参数对BSCB开放效果的影响，或探索LIFU在脊髓部位的应用，如药物递送、免疫调节和神经调控。建议根据具体需求优化本方案，尤其为推进未来的临床前、临床及转化研究提供支持。

引言

与血脑屏障（BBB）类似，血脊髓屏障（BSCB）可调控循环溶质、细胞和血浆成分进入脊髓实质¹。这一保护性特征源于脊髓毛细血管内壁由紧密连接且无窗孔的内皮细胞构成的特殊系统²。通常，只有低分子量、脂溶性且带正电荷的分子才能穿过这两道屏障³。尽管有研究表明BSCB的通透性略高于BBB，但两者均限制了治疗药物向中枢神经系统的递送⁴。目前已开发出多种策略以增强药物穿越BSCB的转运能力，包括提高脊髓毛细血管内渗透压的技术、作用于缓激肽受体的药物研发，以及功能化纳米颗粒的构建⁵。

通过静脉注射微泡（MBs）后结合低强度聚焦超声（LIFU）辐照，也可实现血脊髓屏障（BSCB）的破坏⁶。超声换能器产生的声场引起微泡振荡，进而对血管内皮壁施加应力，导致紧密连接松解⁷。紧密连接的松解在毛细血管中形成短暂的间隙，使治疗药物得以进入脊髓实质（图1）。该过程还可产生跨内皮细胞窗孔、增强转胞吞作用，并下调ATP结合盒转运蛋白（如P-糖蛋白）的表达^8,9。该技术的一个关键优势在于，可通过将超声辐照焦点精准定位至脊髓特定区域，从而最大限度减少对非靶区的影响。目前已有多个临床试验评估了LIFU介导的血脑屏障（BBB）开放在治疗中枢神经系统疾病（包括胶质瘤、肌萎缩侧索硬化症、阿尔茨海默病和帕金森病）中的有效性。尽管相较于LIFU介导的BBB破坏，LIFU介导的BSCB破坏尚未被充分表征，但已有多个研究团队在啮齿类、兔类和猪类模型中成功实现了BSCB的破坏^10,11,12。总体而言，该技术正受到日益广泛的关注，尤其被视为一种具有可行性的药物递送途径。

本方案描述了一种在大鼠模型中利用低强度聚焦超声（LIFU）介导血-脊髓屏障（BSCB）破坏的技术。该操作流程包括动物准备、LIFU设备设置、微泡（MB）给药、靶点定位以及脊髓组织提取的详细说明。通过伊文思蓝染料（EBD）在脊髓中的外渗情况来评估靶点定位的准确性及BSCB的破坏效果。EBD是一种无毒化合物，可与血清白蛋白结合，其深蓝色可通过肉眼观察识别，且在显微镜下呈现红色自发荧光¹³。

此处列出的步骤为传统的超声（US）或磁共振（MR）引导的LIFU系统提供了一种快速且低成本的替代方案。因此，该方法适用于希望在购置额外设备和材料之前，或在开展脊髓部位的LIFU应用（如药物递送、免疫调节和神经调节）之前，快速测试并验证其LIFU换能器的靶向能力和血脊髓屏障（BSCB）破坏效果的研究人员。

方案

所有动物实验均经约翰斯·霍普金斯大学机构动物护理和使用委员会（IACUC RA20M223）批准，并遵循其规定进行。本研究仅使用成年斯普拉格-多利雌性大鼠（平均体重：250 g；年龄：11周）。

1. 低强度聚焦超声装置的组装与设置

1. 获取具有足够技术参数的聚焦超声换能器系统，以实现大鼠血脊髓屏障（BSCB）的开放。文献建议的参数包括：中心频率在0.25–4 MHz之间，且能够产生0.2–2.1 MPa的峰值压力。 ^{10,14,15,16,17}确保系统包含驱动/控制设备，至少包括波形/信号发生器、射频（RF）驱动/功率放大器和匹配网络。图2A).
   注意：此处所述装置采用一种 commercially available 多元阵换能器，中心频率为 250 kHz，直径为 64 mm（图2B).
2. 将3D打印的探头支架和水锥安装到换能器上（图 2C确保锥体与换能器之间形成防水密封。
   注意：本实验所用的换能器配备了一个定制的锥形件和探头固定装置。锥形件和探头固定装置通过配套提供的螺丝固定在换能器上。
3. 将一片厚度为50 µm的声学透明聚酯膜灭菌，并用橡皮筋将其固定在水锥底部。
4. 使用进水和出水管路，将脱气去离子水注入水锥中。注意避免水锥内部产生气泡，因为气泡可能干扰换能器与靶组织之间的声学耦合。聚酯膜应略微膨胀。
   注意：向锥形容器注水时，应通过进水阀注水，并引导气泡从出水阀排出，以去除锥形容器中的气泡。若存在大量小气泡，可关闭所有阀门并旋转锥形容器，直至仅剩一个大气泡。将此大气泡引导至出水阀后，继续注水填充锥形容器。
5. 将驱动设备（包括波形发生器和射频驱动放大器）连接至换能器。换能器电缆应连接至匹配网络的输出端，信号发生器/功率放大器则连接至匹配网络的输入端。电缆应连接至对应的通道编号图2D- G).
   注意：在本研究使用的商用系统中，波形发生器和射频驱动放大器是换能器功率输出（TPO）的组成部分图 2D).
6. 将探头支架连接至立体定位臂，再将立体定位臂固定到固定板组件上。这可确保换能器在超声处理期间精确定位于啮齿类动物的上方。

2. 动物准备与手术椎板切除术

1. 在连接活性炭过滤罐的诱导室中，使用异氟烷与医用空气的混合气体对大鼠进行麻醉。设置气体流速为400 mL/min，异氟烷蒸发器浓度为1.5%–2.5%，用于诱导麻醉。大鼠在诱导室内至完全镇静所需时间因个体而异，通常为3–6分钟。
2. 记录麻醉大鼠的体重，并进行足趾夹捏测试。若观察到夹捏时出现抽动或运动反应，将大鼠放回诱导室中额外麻醉1分钟，然后重复足趾夹捏测试。根据需要重复此操作，以确保大鼠完全麻醉并维持麻醉状态。
3. 将加热垫和无菌吸水垫放置在固定板上。将大鼠置于吸水垫上，涂抹眼药膏，并插入直肠温度计以监测体温。
   注意：在手术过程中，应持续监测大鼠的体温和心率（理想情况下，心率应维持在330-480次/分钟，体温应保持在35.9-37.5 °C之间）^18,19根据需要调整异氟烷浓度或加热垫，以防止动物过早死亡。加热垫温度可设置为约37 °C，并应根据需要开启或关闭，以维持动物最佳体温。
4. 触诊大鼠最后一根肋骨，该肋骨在第13椎骨处与脊柱相连^th 胸椎（T13）。使用电动剃须刀剃除最后肋骨至颈部之间背侧表面的毛发。用浸有10%聚维酮碘的纱布擦拭暴露的皮肤。
5. 使用虹膜剪做正中切口，分离筋膜直至暴露棘突和椎板。使用偏头咬骨钳和斜面虹膜剪去除骨质，直至暴露脊髓。²⁰椎板切除和切口的长度取决于需要进行超声消融的目标区域数量。本研究中，采用3 cm切口进行三个节段的椎板切除。
   注意：去除骨骼时应避免触碰或压迫脊髓，以防造成损伤。如果在椎板切除过程中大鼠后肢出现抽动，则表明对脊髓或神经根施加了过大的力量。
6. 用夹子固定椎板切除部位附近的棘突，将大鼠固定在固定板上。在锁紧夹子前，轻轻拉直脊柱以尽量减少弯曲。

3. 使用激光引导进行靶点定位

1. 使用立体定位臂调整换能器的位置，直至其精确地位于椎板切除部位的正上方（图3A）。该支架可在x、y和z轴方向上移动，并可在垂直平面内旋转180°，在水平平面内旋转360°。
2. 将激光装置固定在水锥底部并向下移动，直至可见激光点。调整换能器的侧向位置，使激光点位于目标血脊髓屏障（BSCB）破坏区域的正上方（图3B、C）。
   注：激光装置的计算机辅助设计（CAD）文件包含在补充材料中（补充图1）。
3. 移除激光装置，并在水锥与脊髓之间填充脱气的超声耦合凝胶（图3D）。为实现最佳耦合，确保凝胶中无气泡存在。
   注：在本研究中，将带有固定水锥的换能器下放至距脊髓1 cm的位置。由于水锥长度为30 mm，因此换能器到脊髓的总距离为40 mm。水锥与脊髓保持1 cm的距离，是因为大鼠切口两侧的皮肤、筋膜和肌肉组织会阻碍水锥尖端与脊髓的直接接触。使用立体定位臂y轴上的刻度有助于记录水锥距离脊髓1 cm时的垂直位置，尤其是在凝胶会影响对水锥与脊髓间距进行目视确认的情况下。
4. 在TPO上设置超声照射参数。可采用一系列参数值以成功实现BSCB破坏。为获得最大功率，应将超声频率设置为接近换能器的中心频率。本研究中使用的参数列于表1。
   注：此处列出的参数借鉴了先前关于低强度聚焦超声（LIFU）的研究，其中心频率为500 kHz，脉冲持续时间为500 µs，占空比为50%，超声照射时间为5或10分钟，可安全地对啮齿类动物脊髓进行神经调节²¹。根据成功实现BSCB破坏的相关研究，其他可采用的参数包括：中心频率在500 kHz至1 MHz之间，声压为0.2–2.1 MPa，脉冲长度为10–25 ms，超声照射时间为2–5分钟^6,10,11,22。

参数	数值
频率 (kHz)	250
聚焦距离 (mm)	40
声学峰值压力 (MPa)	0.47
占空比	40%
脉冲长度 (ms)	400
周期 (s)	1
超声处理时间 (min)	5

表1： 用于破坏血脊髓屏障（BSCB）的超声处理参数。

4. 微泡给药

1. 根据制造商提供的说明制备微泡（MB）溶液。避免将空气引入溶液中。
   注意：微泡较为脆弱，若静置数分钟，会聚集在瓶/注射器顶部。需定期摇动瓶子和注射器，以防止微泡分布不均。微泡寿命较短，请查阅制造商指南以确定其有效期。
2. 插入22 G尾静脉导管，并用0.2 mL肝素化生理盐水（500 IU/mL）冲洗²³。为提高尾静脉插管成功率，可将尾巴浸入温水中，并在尾根部绑扎止血带，以增大静脉直径。
   注意：尾静脉插管可在动物进行椎板切除术、定位和靶向操作之前完成，以节省实验时间。
3. 通过导管注射1 mL/kg的3%伊文思蓝染料（EBD），随后用0.2 mL肝素化生理盐水冲洗。大鼠的四肢和眼睛将变为蓝色。通过观察大鼠背侧脊髓静脉是否出现蓝色变化，确认尾静脉插管成功（图4）。
   注意：EBD可在微泡注射前较早时间给予，且不会影响超声辐照效果。此外，由于美国食品药品监督管理局（FDA）目前尚未批准在体内已有药物的情况下进行超声辐照，EBD也可在超声辐照后给予。这将导致染料摄取减少，但可能更具临床相关性。
4. 向导管内注射0.2 mL微泡团注液，并用0.2 mL肝素化生理盐水冲洗。在注射微泡后1-2分钟开始超声辐照。本实验所用装置不采集实时超声反馈信号。
   ​注意：针对血脊髓屏障（BSCB）破坏的研究通常使用的微泡浓度高于诊断成像所推荐的浓度。在大鼠模型中用于血脑屏障（BBB）和血脊髓屏障（BSCB）破坏的一些常用微泡品牌的浓度包括0.02–0.2 mL/kg以及200 µL团注剂量^10,15,24,25。

5. 脊髓提取与组织处理

1. 超声处理结束后，用 100 mL 冷磷酸盐缓冲盐水（PBS）对大鼠进行心脏灌流，直至血液完全澄清。由于染料的存在，肝脏原本呈深蓝色，此时应逐渐褪为浅棕蓝色²⁶。
   注意：灌流的目的是清除脊髓血管系统中的过量血液。由于伊文思蓝（EBD）与白蛋白结合，此步骤同时可去除多余的 EBD。这可确保在脊髓中通过肉眼观察或荧光显微镜检测到的任何 EBD 均来源于染料渗出至脊髓实质。
2. 用 100 mL 冷的 4% 多聚甲醛（PFA）进行心脏灌流。若固定充分，大鼠的四肢在此过程中会出现抽搐。该 PFA 灌流步骤可使大鼠安乐死。
3. 取出脊髓并置于 4% PFA 中，4 °C 下固定过夜。次日将 PFA 更换为 PBS。

6. BSCB 屏障破坏的可视化观察

1. 使用剃刀切取聚焦超声处理部位周围2 cm的组织区域，沿中线切开，并用切片机将组织切成10 µm厚的切片。如需进行明场观察，使用苏木精-伊红（H&E）染色。
   注：本研究中展示的H&E染色脊髓样本经苏木精染色3分钟，伊红染色1分钟²⁷。
2. 进行荧光显微镜观察时，对载有脊髓切片的玻片进行脱蜡处理，并加入25 µL含4′,6-二脒基-2-苯基吲哚（DAPI）的封片介质（0.5 µg/mL）进行复染。在4 °C孵育至少10分钟，避免光照以防止荧光淬灭。
   注：脱蜡步骤可用冷冻切片机获取冷冻切片的方法替代。
3. 使用荧光显微镜对所有玻片进行成像。EBD的自发荧光（激发波长：470 nm和540 nm；发射波长：680 nm）在红色通道可见，而DAPI信号位于蓝色通道。使用光学显微镜对H&E染色玻片进行成像。
   注：尽管本方案描述的是非存活性操作，但也可采用存活性手术技术进行。对于存活性手术，术前切口部位需使用碘伏连续消毒三次（交替进行），并在术前皮下注射布托啡诺（0.05 mg/kg）。术后至少连续3天每12小时皮下给予布托啡诺一次，若大鼠出现疼痛症状，应延长给药时间。若发生脊髓损伤，大鼠可能出现尿潴留或步态异常，表现为后肢拖行或运动迟缓，或可触及膀胱充盈肿大。一旦出现上述情况，应将大鼠饲养在含有营养强化水凝胶的环境中以保障食物与水分摄入，并每日人工排尿两次，直至反射性排尿功能恢复。若出现后肢完全瘫痪或难以控制的疼痛，应实施安乐死。

结果

本文证明了同时应用LIFU超声辐照和微泡（MB）给药是一种有效的局部血-脊髓屏障（BSCB）开放技术。BSCB的开放可通过伊文思蓝（EBD）渗出至脊髓实质中得以证实。这种变化在肉眼观察和荧光显微镜下均清晰可见。在椎板切除术后可观察到脊髓血管结构，其中后脊静脉及其向侧方辐射的多个较小血管清晰可见（图4A）。通过尾静脉导管静脉注射EBD后，该血管系统被蓝色染料充分填充（图4B）。此步骤是验证椎板切除术是否导致脊髓血管破裂的良好时机，因为若发生破裂，将会出现蓝色血液在脊髓表面积聚的现象。超声辐照后，在靶向区域应可见一蓝色斑点，表明由于BSCB被破坏，EBD已渗入白色实质组织（图4C）。该斑点的大小受多种因素影响，包括换能器焦点区域的大小以及超声辐照后至组织取材的时间间隔。为提高观察到EBD渗出的可能性，应延长超声辐照与脊髓组织提取之间的时间间隔。

尽管在脊髓组织提取及后续分析之前进行PFA灌注并非必要步骤，但该操作可清除样本中的血液，从而增强白色脊髓实质与蓝色EBD染色区域之间的对比度。所有接受微泡（MB）注射并进行LIFU超声处理的大鼠均表现出EBD明显外渗至脊髓组织内，而仅接受微泡和EBD但未接受LIFU超声处理的阴性对照组则无此现象。代表性图像见图5。组织的矢状切面显示，EBD的外渗不仅局限于表层，而且深入脊髓内部。这一结果符合预期，因为本研究所用换能器的聚焦区域大于大鼠脊髓的直径。有时在矢状切面上可观察到少量出血，这可能由椎板切除术或超声辐照引起。若出血部位靠近脊髓背侧外围，则更可能由椎板切除术所致。

为了进一步评估EBD的外渗情况，对脊髓的矢状切面进行了DAPI（核标记物）染色，并使用荧光显微镜进行成像。所有接受LIFU超声处理的脊髓样本（n = 3）均显示出显著更强的EBD自发荧光强度（p = 0.016），相较于未接受超声处理的样本，而两组之间的DAPI荧光强度相似（图6）。H&E染色分析进一步显示，在接受超声处理的区域未见神经元损伤、出血或空腔样病变，表明该操作具有良好的安全性。文中同时展示了因手术操作不当及高功率超声处理导致脊髓损伤的示例作为对比，其中标注了出血、组织损伤、空腔样病变以及可能的空泡化现象。尽管该高功率超声示例中未观察到出血，但已有文献报道超声破坏可导致出血效应。

此外，对接受微泡（MBs）、伊文思蓝-白蛋白复合物（EBD）和低强度聚焦超声（LIFU）辐照的大鼠进行了行为学分析。尽管该方法无法完全排除组织损伤的可能性，但可检测该操作是否导致运动功能缺陷。在为期5天的时间内，每天记录大鼠在笼内行走5分钟，根据Basso Beattie Bresnahan运动功能评分标准对运动功能进行评级（补充视频文件1）。所有大鼠（n = 5）在辐照前、辐照后以及存活期的每一天均获得最高评分（图7）。

最后，本研究中使用的超声参数的热效应通过两种方法进行了测量 离体 大鼠脊髓样本及带有细尖端的数字温度计探头插入脊髓中。在超声处理前、处理中和处理后持续监测脊髓样本温度，共15分钟，其中每个阶段各5分钟。温度变化极小，事实上，两个样本因超声处理导致的温度变化均不超过1.3 °C，表明由超声引起的高温损伤可能性极低。图8).

图1：低强度聚焦超声介导的血脊髓屏障开放机制。（A）大鼠脊髓低强度聚焦超声（LIFU）辐照的示意图概述。（B）通过LIFU辐照静脉注射微泡（MBs）实现血脊髓屏障（BSCB）开放的作用机制。MBs在LIFU作用下发生振荡，导致血管内皮细胞间紧密连接增宽。BSCB的这种破坏使得纳米颗粒、治疗药物或伊文思蓝染料得以外渗。请点击此处查看该图的放大版本。

图 2：低强度聚焦超声台式装置及其连接方式。（A）典型聚焦超声组件的示意图。（B）聚焦超声装置的整体图，包括：1. 换能器功率输出（TPO），2. 匹配网络，3. LIFU 换能器，4. 立体定位仪，5. 移动夹具。（C）换能器，包括：1. 探头支架，2. 环形换能器，3. 水锥，4. 进水管，5. 出水管，6. 用橡胶圈固定的膜。（D）TPO 前面板，包括：1. 射频屏蔽外壳，2. 带可调菜单的触摸式前面板显示屏，3. 用于参数调节的旋转旋钮，4. 启动/停止输出开关。（E）TPO 背面板，包括：1. 通道输出连接器，2. 接地端，3. 用于软件控制的 USB 输入端口，4. 内部触发器，5. 同步输出连接器，6. 电源输入插孔及电源，7. 电源开关。（F）匹配网络输出端，导线与通道编号对应。（G）匹配网络 XDR 输入端，导线与通道编号对应 请点击此处查看该图的放大版本。

图3：通过激光引导进行靶区定位。 （A）立体定位臂，可在三个轴向上自由移动并具备旋转功能，固定于下方的固定板上。（B）用于识别焦点区域的激光装置。激光器安装在换能器顶端，并与焦点区域对齐。（C）示意图显示激光照射在暴露的脊髓上，表明换能器的焦点区域现已对准该位置。（D）将换能器下移，直至锥形尖端位于脊髓上方1 cm处，并用凝胶填充间隙以确保最大程度的耦合。换能器到脊髓的距离为40 mm（焦距）。请点击此处查看该图的放大版本。

图4：超声处理后脊髓中伊文思蓝染料的外渗。（A）T9-T11节段大鼠椎板切除切口图像，暴露的脊髓及背侧后静脉清晰可见。（B）静脉注射伊文思蓝染料（EBD）后，周围组织和脊髓血管呈现蓝色。（C）在超声处理部位，EBD渗入脊髓实质，表明血-脊髓屏障（BSCB）已被破坏。请点击此处查看该图的放大版本。

图5：脊髓取出及灌注后血-脊髓屏障（BSCB）开放的可视化。（A）未经LIFU处理的对照组大鼠所取出的脊髓。该大鼠仅接受了微泡（MBs）和伊文思蓝染料（EBD）。插图为包埋在石蜡中的脊髓中矢状切片，未见EBD外渗。（B）接受LIFU处理的大鼠所取出的脊髓。该大鼠同样接受了微泡（MBs）和伊文思蓝染料（EBD）。可见EBD外渗形成的条带，且局限于超声辐照区域。插图为包埋在石蜡中的脊髓中矢状切片，箭头指向超声辐照区域内可见的EBD聚集部位。请点击此处查看该图的放大版本。

图 6：BSCB 开放的检测与评估。（A）使用 DAPI（细胞核标记物，蓝色）染色的脊髓组织。可见极少的 EBD 自发荧光（红色）。该大鼠未接受 LIFU 处理。（B）使用 DAPI（细胞核标记物，蓝色）染色的脊髓组织。在超声靶区可见局部 EBD 自发荧光（红色）。该大鼠接受了 LIFU 和微泡（MBs）处理。（C）未接受 LIFU 处理的大鼠脊髓组织经苏木精（核酸染料）和伊红（非特异性蛋白染料）染色（H&E）。未见神经元损伤、出血或空腔样病变。（D）接受 LIFU 处理的大鼠脊髓组织经 H&E 染色。未见神经元损伤、出血或空腔样病变。（E）因手术损伤的大鼠脊髓组织经 H&E 染色。箭头指示明显的出血和组织损伤。（F）因高强度超声造成损伤的大鼠脊髓组织经 H&E 染色。箭头指示空腔样病变，插图显示可能的空泡化。（G）柱状图显示接受与未接受 LIFU 超声处理的大鼠脊髓中 DAPI 和 EBD 荧光强度。与阴性对照组相比，LIFU 处理组的 EBD 荧光强度显著更高（p = 0.016），而 DAPI 荧光强度相似（p > 0.05）。请点击此处查看该图的放大版本。

图7：超声处理前后的行为学检测。（A）Basso、Beattie、Bresnahan装置示意图，从下方记录大鼠行走5分钟的过程。（B）录制视频中的静态图像。该视频用于根据Basso、Beattie、Bresnahan评分标准评估大鼠的运动协调性和步态。（C）箱形图（n = 5）显示，在接受微泡（MBs）和低强度聚焦超声（LIFU）处理的大鼠中，超声处理前、处理后以及5天存活期内的运动评分均无显著变化（p > 0.05）。请点击此处查看该图的放大版本。

图8：使用温度分析 离体 脊髓 显示两种情况下温度变化的图表 离体 脊髓样本在超声处理前、处理中和处理后各取5分钟的样本。超声处理所用参数列于 表1样品1在超声处理前、中、后的平均温度分别为21.9 °C ± 0.1 °C、22.1 °C ± 0.1 °C和22.0 °C ± 0.1 °C。样品2在超声处理前、中、后的温度分别为21.9 °C ± 0.1 °C、22.5 °C ± 0.3 °C和22.4 °C ± 0.2 °C。 请点击此处以查看此图的放大版本。

补充图1：激光定位装置的CAD文件。（A）从下方观察的激光装置视图。任何激光器均可放置于中央的孔洞中。（B）激光装置的侧视图。（C）激光装置的尺寸，单位为英寸。请点击此处下载该文件。

补充视频文件1：大鼠在Basso、Beattie、Bresnahan装置中行走的视频。 请点击此处下载该文件。

讨论

本文描述了使用低强度聚焦超声（LIFU）联合微泡（MB）给药实现高效且靶向性血脊髓屏障（BSCB）开放所需的设备与操作步骤。该方案具有良好的灵活性，可根据不同规格的换能器进行个性化优化。目前其他基于LIFU的BSCB开放技术通常依赖磁共振成像（MRI）引导系统进行靶区定位，此类设备成本高昂¹⁶。本文所述技术的优势在于可通过开放式的操作方式实现BSCB开放的快速实时可视化验证，并便于靶向定位。此外，激光装置结构简单，易于使用和搭建，补充部分中提供了相应的CAD文件。因此，希望在小型动物模型中初步测试其LIFU换能器靶向能力的研究人员，可利用本方案快速确认焦点区域是否准确定位于目标位置。对于正着手研究LIFU临床应用（如药物递送）的实验室而言，在投入更复杂的引导系统（如超声或磁共振系统）之前，也可采用本技术作为前期探索工具。目前，与磁共振系统相比，超声引导方式展现出更具前景且成本更低的发展路径，尽管现有文献中仍以磁共振系统报道居多。

在该操作过程中，有几个关键步骤必须谨慎执行，以确保血脊髓屏障（BSCB）成功破坏。在进行手术椎板切除时，必须避免对脊髓施加不必要的压力。对脊髓过度的物理操作会增加BSCB受损的风险。受损部位在组织取出后表现为脊髓内部出现深棕色斑点，这是由于出血和伊文思蓝染料（EBD）外渗增加所致。此外，必须确保换能器与暴露的脊髓之间达到最大程度的耦合。因此，需仔细清除水锥和超声耦合凝胶中的气泡。水锥底部与脊髓之间不应存在任何间隙，以保证声波的完全传递。在尾静脉插管过程中，应避免将空气随肝素化生理盐水、EBD或微泡（MB）溶液一同注入。注入空气会显著增加发生肺栓塞的风险，导致实验动物在操作结束前死亡²⁸。

在本操作过程中可能遇到的一个常见问题是EBD注射失败。对于尾静脉插管经验较少的操作者，建议在动物进行椎板切除术、体位固定或靶向定位之前完成此步骤，以节省时间。EBD也可在微泡（MB）注射前较早注入，且不会影响超声辐照效果。采用本方案中推荐的止血带和温水浴有助于扩张尾静脉，提高操作成功率。此外，大鼠脱水会降低导管正确置入的可能性，因此在尾静脉插管前10–15分钟给予腹腔生理盐水注射可能有所帮助。在插管过程中，应从尾端末端上方约2英寸处开始，沿尾部向头部方向（由尾侧向头侧）推进。反向操作会因静脉塌陷或出血的风险增加而降低成功率。

另一个常见问题是尽管进行了超声处理，但未出现伊文思蓝（EBD）外渗。这可能表明所使用的超声参数不足以破坏血脊髓屏障（BSCB）。例如，若超声频率设置值与换能器的中心频率相差较大，则超声功率将过低，无法有效振荡微泡（MBs）并导致紧密连接松动。此外，换能器与导线之间的界面越多（如水锥、膜、凝胶、水/凝胶中的气泡），靶点处的实际超声强度就越低。尽量减少这些界面，例如使用脱气凝胶并彻底清除水锥内的气泡，有助于充分传递超声能量。本方案还建议延长超声处理与灌注之间的时间间隔，以允许更多时间让EBD外渗进入脊髓实质。尽管BSCB的破坏是暂时性的，但其形成的间隙可在数小时内持续存在。等待时间较长会增加异氟烷暴露时间，但也会导致脊髓中更显著的EBD外渗。另外，即使未进行LIFU超声处理，也可能出现EBD外渗。为排查此问题，在进行椎板切除术时必须格外小心，以防止对BSCB造成意外损伤。可能的解决方案包括在夹持时抬高大鼠脊柱，以增加椎板与脊髓之间的空间，以及缩短椎板切除范围。充分的PFA灌注还可通过清除脊髓血管内富含EBD的血液来降低背景染色。在经心灌注过程中，必须注意避免心脏意外破裂，否则可能导致PBS或PFA泄漏。

需要注意的是，本研究仅代表单中心在LIFU介导的BSCB破坏方面的经验。此外，本方案并未测试或优化各种超声能量参数和微泡浓度。因此，研究人员在实施该技术时，应探索不同的参数和浓度，以针对其特定研究需求优化靶向定位和BSCB破坏效果，尤其是在初始结果出现任何不良反应时。例如，若研究团队希望避免温度变化，可尝试不同参数组合，直至找到满足该条件并实现充分BSCB破坏的参数设置。此外，还可开展进一步实验以验证该技术的安全性。例如，可增加样本量、延长存活时间，并进行肌电图/步态分析研究。对于较长的存活期，需注意某些研究表明高剂量EBD有时可能导致慢性全身毒性，因此采用较低剂量可能更为谨慎²⁹。

该方案的另一个局限性在于椎板切除术的侵入性（由于超声无法穿透骨骼，因此任何使用LIFU打开BSCB的技术均需进行椎板切除术）。通过缩短椎板切除的长度，可以降低该操作的侵入性。在较短且较薄的上胸椎部位进行椎板切除，可将手术时间缩短至10分钟以内。由于微泡（MBs）本身较为脆弱且半衰期短，本方案的操作时间十分有限。微泡注射应在LIFU处理前1-2分钟进行；若需进行多次LIFU照射，则每次超声处理前均应重新给予新的微泡。对于涉及多只大鼠BSCB破坏的实验，可能需要准备多个微泡试剂瓶。由于微泡成本较高，建议优化手术流程，尽量缩短各次超声处理之间的间隔时间，以减少微泡的使用数量。

本文所述技术主要作为研究方案使用。尽管激光定位装置不会在所有临床环境中取代传统的定位方法，但在其他情况下可能具有应用价值。对于非侵入性手术，可可靠地采用传统磁共振成像（MRI）方法进行定位³⁰。对于需实施椎板切除术的侵入性手术，本方案中描述的激光点装置可用于快速定位特定区域（例如肿瘤或脊髓损伤部位）上聚焦超声作用区的中心位置，从而辅助药物递送或免疫调节治疗，同时可补充正在进行的任何磁共振引导操作。

总体而言，本方案描述了一种有效且成功的BSCB破坏技术，并提供了多种在实时和后期处理中确认BSCB开放的方法。由于BSCB作为进入脊髓实质的屏障，破坏BSCB可能是提高治疗药物递送效率的一种可行方法。例如，Weber-Adrian等人使用频率为1.114 MHz、脉冲长度为10 ms的LIFU介导基因递送至颈椎部位⁶。类似地，Smith等人表明，在脑膜转移瘤的啮齿类动物模型中，使用频率为580 kHz、平均声学峰值压力约为0.46 MPa、脉冲长度为10 ms的LIFU可促进单克隆抗体曲妥珠单抗（trastuzumab）向脊髓的递送¹⁰。  大多数研究集中于使用LIFU而非HIFU，原因是LIFU能够在避免对深层组织造成损伤的同时，实现BSCB的短暂通透化。通常，LIFU使用的强度范围为0.125–3 W/cm²，而HIFU使用的强度则为100–10,000 W/cm²或更高³¹。因此，HIFU主要通过加热组织发挥作用，而LIFU在联合使用微泡（MBs）时，则主要通过机械性空化效应起作用。治疗药物与微泡共同给药可增强药物向脊髓实质的外渗，同时也有望将药物负载于微泡中，并通过超声破裂微泡以实现靶向药物递送。

本研究中的超声参数、微泡浓度以及所用换能器的类型可根据实验需求进行调整。例如，在需要对局部靶向进行更精确控制的实验中，可选用焦域较小的换能器；而在需要在较短时间内实现较强破坏效果的实验中，则可使用功率较高的换能器。由于本方案具有良好的灵活性，因此在临床前研究、临床研究及转化研究中均具有广阔的应用前景。

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
0.9% 肝素化氯化钠	Baxter	FKB0953G	用肝素化生理盐水冲洗尾静脉导管，以防止凝血。
100 mL 带鲁尔锁头端的注射器（2 个）	Wilburn Medical	WUSA/120	一个注射器可用于注射 PBS，另一个用于注射 PFA（经心灌注期间）
1× 磷酸盐缓冲液（PBS）	Thermo Scientific	10010001	用于经心灌注。
22 G 导管	Med Vet International	50-209-1694	用于放置尾静脉导管。
97% 异氟烷	Thermo Scientific Chemicals	247-897-7	大鼠处于异氟烷麻醉状态时，注意不要给予过量。高剂量可能导致大鼠安乐死。
7.5% 聚维酮碘	Purdue Products	4677
A 级透明螺口玻璃小瓶	Fisherbrand	14-955-314	用于储存脊髓提取物。
数字电子天平	Kent Scientific	SCL-4000
电动剃毛器	Wahl Home Products	79449-200	手术前剃除切口部位皮肤上的毛发
伊红-Y 与品红	Epredia	71304
伊文思蓝染料	MP Biomedicals	02151108-CF	尽管该染料无毒，但若直接接触皮肤会导致皮肤染成蓝色。
带 0.5 mm 镊子的固定板组件	PSI Impactors	7001-2	将立体定位臂固定在该支架上
纱布	Fisherbrand	13-761-52
加热垫	Kent Scientific	RT-0515
苏木精	Epredia	7211
带弯头刀片的虹膜剪	ProDentUSA	12-15315
异氟烷诱导系统	Kent Scientific	SOMNO-RATKIT
激光定位装置	NA	custom	补充部分提供 CAD 设计文件。只需将激光器放入根据该文件制作的装置中即可。
润滑眼膏	Systane	N/A
鲁尔锁三通阀	Sigma	SAS7521-10EA	可通过入口阀用于填充水囊锥形探头
Lumason 微泡试剂盒	Bracco	0270-7099-16
显微镜盖玻片	Fisherbrand	12-545J
显微镜载玻片	Fisherbrand	12-550-15
切片机	Epredia	23-900-671
含 4',6-二脒基-2-苯基吲哚（DAPI）的封片剂	Vector Laboratories	H-2000-2
聚酯膜（Mylar 膜）	Chemplex	3016	若膜过大，可裁剪至适合锥形探头的尺寸
NeuroFUS 2.52" 直径 250 kHz 换能器	Sonic Concepts	CTX-250	换能器系统包括定制水囊锥形探头和探头支架
NeuroFUS PRO v2.0 系统	Sonic Concepts	NFS102v2	包括换能器功率输出模块、匹配网络及配套电缆
偏移式骨剪	Fine Science Tools	16101-10	用于切除棘突和椎板以进行椎板切除术
石蜡	Polysciences	24364-1	可将脊髓样本包埋于石蜡中，以便切片进行组织学分析。
4% 多聚甲醛	Thermo Scientific	J61899-AK	用于经心灌注。
大鼠手术器械包	Kent Scientific	INSRATKIT	包含 #5 镊子、持针器、McPherson-Vannas 剪刀、虹膜剪、ALM 自持式牵开器、虹膜镊和钝头探针。这些器械足以完成椎板切除术。
刀片	Fisherbrand	12-640	用于将脊髓提取物切割至所需长度，并沿中线切开组织块。
直肠温度计	Kent Scientific	RET-2	维持大鼠体温在 35.9–37.5 °C 范围内
橡胶圈	Fisherbrand	50-205-1983
单动物麻醉蒸发器单元	Kent Scientific	SF-01
立体定位臂	Kopf Instruments	Model 963
无菌吸收垫	McKesson	4033-CS150	在椎板切除术前，将大鼠置于无菌吸收垫上，垫位于加热垫和固定板之上
超声耦合剂	Aquasonic	PLI 01-34	应尽可能确保耦合剂中无气泡。