方法文章

人诱导性多能干细胞向具有成熟免疫表型的脑微血管内皮样细胞的分化

DOI：

10.3791/65134

⸱

2023年5月19日

 ,  , 
1Graduate School of Medicine, Yamaguchi University, 2Theodor Kocher Institute, University of Bern, 3Department of Neurotherapeutics, Yamaguchi University of Medicine

本文内容

摘要

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

在此，我们介绍一种扩展的内皮细胞培养方法（EECM），该方法可诱导多能干细胞分化为脑微血管内皮细胞（BMEC）样细胞。这些细胞表达内皮细胞黏附分子，因此可作为研究免疫细胞相互作用的人源血脑屏障模型。 体外

摘要

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

血脑屏障（BBB）功能障碍是影响中枢神经系统（CNS）的多种神经退行性和神经炎症性疾病的病理学特征。由于与疾病相关的BBB样本获取有限，目前尚不明确BBB功能异常是疾病发展的致病因素，还是神经炎症或神经退行性过程的继发结果。因此，人诱导性多能干细胞（hiPSCs）为建立来自健康供体和患者的体外（in vitro）BBB模型提供了新的机会，从而能够研究来自个体患者的疾病特异性BBB特征。目前已建立了多种分化方案，用于从hiPSCs诱导生成脑微血管内皮细胞（BMEC）样细胞。针对具体研究问题的选择，对于正确选用相应的BMEC分化方案至关重要。本文中，我们描述了一种扩展的内皮细胞培养方法（EECM），该方法经过优化，可将hiPSCs分化为具有成熟免疫表型的BMEC样细胞，从而可用于研究免疫细胞与BBB之间的相互作用。在该方案中，首先通过激活Wnt/β-catenin信号通路将hiPSCs分化为内皮祖细胞（EPCs）。所得培养物包含平滑肌样细胞（SMLCs），随后通过连续传代提高内皮细胞（ECs）的纯度，并诱导其获得BBB特异性特性。将EECM-BMECs与这些SMLCs共培养，或使用SMLCs的条件培养基，可实现内皮细胞黏附分子的可重复、组成性及细胞因子调控性表达。重要的是，EECM-BMEC样细胞所形成的屏障特性可与原代人BMECs相媲美；并且由于其表达所有内皮细胞黏附分子，EECM-BMEC样细胞不同于其他由hiPSCs衍生的体外（in vitro）BBB模型。因此，EECM-BMEC样细胞是研究疾病过程在BBB水平上可能影响的理想模型，尤其适用于以个体化方式探究其对免疫细胞相互作用的影响。

引言

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中枢神经系统（CNS）中的神经血管单元（NVU）由高度特化的微血管内皮细胞（ECs）、嵌入内皮基底膜以及实质基底膜中的周细胞，以及星形胶质细胞终足共同组成1。在NVU中，脑微血管内皮细胞（BMECs）是构成血脑屏障（BBB）的关键组分。BMECs形成复杂且连续的紧密连接，与外周器官的微血管ECs相比，其胞饮活性极低，从而使BBB能够抑制水溶性分子通过细胞旁路自由扩散进入CNS。BMECs表达特定的内流转运蛋白和外排泵，分别确保营养物质的摄取和有害分子从CNS的排出2。此外，BBB通过低水平表达对免疫细胞进入CNS至关重要的内皮黏附分子，严格调控免疫细胞向CNS的迁移3。在生理条件下，BMECs表面黏附分子（如细胞间黏附分子-1（ICAM-1）和血管细胞黏附分子-1（VCAM-1））的表达水平较低，但在某些神经系统疾病中这些分子的表达水平会上调2。在多种神经系统疾病中已报道存在BBB的结构和功能破坏，例如脑卒中4、多发性硬化症（MS）5以及多种神经退行性疾病6,7,8。深入研究BMECs在生理和病理条件下的细胞与分子特征，是发现靶向BBB的新型治疗策略的重要途径。

直到最近，研究人员仍主要使用原代培养或永生化的人源及啮齿类动物脑微血管内皮细胞（BMECs）来研究血脑屏障（BBB）。然而，基于动物模型得出的结论是否可直接适用于人源血脑屏障尚不明确，因为人类与啮齿类动物在多种重要分子（包括黏附分子和溶质载体蛋白）的表达上存在差异9,10。尽管hCMEC/D3等人类BMEC细胞系能够表达适当水平的黏附分子11，但这些永生化的BMECs通常缺乏复杂的紧密连接结构和强大的屏障特性12。原代人源BMECs可用于研究屏障功能13，但并非所有研究人员都能方便获取。此外，患者来源的原代BMECs也难以获得，因为它们必须通过脑活检或手术采集，而此类操作仅在特定临床条件下才会进行。

干细胞技术的最新进展使得源自干细胞（如人诱导多能干细胞，hiPSCs）的各种人类细胞类型得以分化。利用患者来源样本建立的hiPSC衍生模型，使我们能够构建病理生理学模型。多种hiPSC衍生的细胞类型可被联合使用，以建立更能模拟生理条件的自体共培养体系或类器官。已有若干广泛使用的方法14,15,16,17,18,19可用于分化出具有强扩散屏障特性、表达血脑屏障特异性转运蛋白和外排泵的hiPSC来源类脑微血管内皮细胞（BMEC-like cells），这些模型有助于研究小分子的旁细胞扩散、分子转运机制以及向大脑递送药物的过程20,21。然而，先前研究表明，目前广泛使用的hiPSC来源类BMEC细胞缺乏关键内皮黏附分子的表达，包括VCAM-1、选择素和ICAM-2，而这些分子在介导免疫细胞与血脑屏障相互作用中起重要作用22。此外，已有报道指出，此前的hiPSC来源BMECs在转录水平上表现出混合的内皮和上皮特性23。因此，我们开发了扩展性内皮细胞培养法（EECM），这是一种新型方案，可将hiPSC分化为在形态、屏障特性及内皮黏附分子表达方面均类似于原代人脑微血管内皮细胞（BMECs）的类BMEC细胞。本方案详细描述了将hiPSC分化为具有成熟免疫表型的类BMEC细胞的具体方法步骤。

方案

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

hiPSC 分化过程示意图；EC 诱导、MACS、SMLCs、内皮细胞、检测步骤。
图 1：实验方案概览。 本文提供了一种将 hiPSCs 分化为 EECM-BMEC 样细胞的逐步操作方案。右侧示意图展示了各步骤中的细胞群体。请点击此处查看该图的放大版本。

hiPSC 细胞系 HPS1006 由日本文部科学省/日本医疗研究开发机构（MEXT/AMED）国家生物资源项目下的理化学研究所生物资源研究中心（RIKEN BRC）提供。

1. 诱导hiPSC分化为内皮祖细胞（EPCs）

  1. 细胞外基质（ECM）包被的培养板与试剂
    1. 通过将2.5 mg基底膜基质凝胶分装至50 mL离心管中，于-20 °C保存不超过6个月，制备包被基底膜基质的12孔板。向管中加入30 mL已冷藏（4 °C）的冷Dulbecco改良Eagle培养基/F-12营养混合物（DMEM/F12）。用移液器轻轻吹打混匀，直至凝胶完全解冻，然后向每孔12孔板中加入500 µL该溶液。将培养板置于培养箱（37 °C，5% CO2）中孵育至少1小时。
      注意：基底膜基质凝胶对温度敏感，应按照制造商说明进行分装和包被操作。不同批次间细胞外基质蛋白浓度可能存在差异。为确保准确性，应根据具体批次的批号查阅质量证书以确认确切浓度。例如，若确切浓度为10.0 mg/mL，则使用250 µL凝胶以获得总量2.5 mg。
    2. 通过将ROCK抑制剂溶于无菌水中，配制成10 mM的rho-激酶（ROCK）抑制剂储备液（表1）。将储备液分装为100–200 µL每份，于-20 °C保存，避免反复冻融。
    3. 将5 g L-抗坏血酸溶于50 mL无菌水中，配制成100 mg/mL的L-抗坏血酸储备液，并于-20 °C保存（表1）。向500 mL高级DMEM/F12培养基中加入6.25 mL谷氨酰胺和305 µL L-抗坏血酸储备液，配制LaSR培养基24（表1）。于2–8 °C保存不超过2周。
    4. 将CHIR99021溶于未稀释的二甲基亚砜（DMSO）中，配制成终浓度为10 mM的CHIR99021溶液（表1）。将溶液分装为100–200 µL每份，避免反复冻融，于-20 °C保存不超过1年。工作分装液可于4 °C保存不超过1个月。
    5. 向450 mL DMEM/F12培养基中加入50 mL热灭活胎牛血清，配制DMEM/F12-10培养基。于2–8 °C保存不超过1个月（表1）。
    6. 向467 mL Dulbecco磷酸盐缓冲液（PBS）中加入33.3 mL 7.5%牛血清白蛋白（BSA），配制流式缓冲液-1（表1）。于2–8 °C保存不超过6个月。
  2. 单细胞化hiPSC的接种及EPC分化前扩增（第-3天至第-1天）
    1. 当6孔板中的hiPSC集落无自发分化且达到适宜传代密度（通常约为80%融合度，即2.5–3.5 × 106个细胞）时，开始分化。在显微镜下仔细观察是否存在自发分化的细胞，以判断是否需要多次传代以清除未分化细胞。有关细胞培养基和细胞外基质的信息，请参见步骤1.4.15下方的注释。
    2. 吸除培养基，向各孔加入1 mL消化试剂，于37 °C孵育5–7分钟。用移液器在孔表面轻柔吹打2–3次，使细胞解离并单细胞化。
    3. 将解离的细胞转移至含4 mL hiPSC维持培养基的15 mL离心管中，充分重悬细胞。保留10 µL用于细胞计数。
    4. 在20–25 °C下以200 × g离心5分钟使细胞沉淀。计数细胞，并计算在基底膜基质包被的12孔板（步骤1.1.1）中达到适当hiPSC密度（每孔75–400 × 103个细胞）所需的体积。
    5. 吸除各孔中的包被液，每孔加入含10 µM ROCK抑制剂的1 mL hiPSC培养基（1:1,000稀释）。离心后吸除上清液，用1 mL hiPSC培养基重悬细胞沉淀。
    6. 将步骤1.2.4中确定的所需体积的hiPSC加入12孔板各孔。分化一个hiPSC克隆可能需要2–4块12孔板。请参考步骤1.2.4以确定接种细胞所需的板数。
    7. 将培养板置于培养箱（37 °C，5% CO2）中。在培养箱内轻柔地前后、左右滑动培养板，使细胞均匀分布。
    8. 次日（即第-2天），更换为不含ROCK抑制剂的2 mL hiPSC维持培养基。再下一日（第-1天），更换为2 mL新鲜hiPSC维持培养基。
  3. 使用糖原合成酶激酶3（GSK-3）抑制剂CHIR99021诱导EPC（第0天至第5天）
    1. 第0天，将各孔中的hiPSC维持培养基更换为含8 µM CHIR99021的2 mL LaSR培养基。
    2. 第1天，吸除培养基，加入含8 µM CHIR99021的新鲜LaSR培养基2 mL。
    3. 第2、3、4天，更换为不含CHIR99021的新鲜LaSR培养基2 mL。
  4. 磁珠激活细胞分选（MACS）纯化CD31+ EPC（第5天）
    1. 第5天，吸除培养基，每孔加入1 mL消化试剂，于37 °C孵育6–8分钟。
    2. 使用微量移液器将细胞解离并单细胞化，通过40 µm细胞筛过滤至含10 mL DMEM/F12-10培养基的50 mL离心管中。来自两块以上12孔板的细胞悬液应至少分装至两个50 mL离心管中。
    3. 加入DMEM/F12-10培养基（总量可达50 mL）终止消化反应。充分吹打混匀，保留10 µL用于细胞计数。在20–25 °C下以200 × g离心5分钟使细胞沉淀。
    4. 去除上清液后，加入10 mL DMEM/F12-10培养基，将细胞悬液转移至新的15 mL离心管中。在20–25 °C下以200 × g离心5分钟使细胞沉淀。
    5. 吸除上清液，用流式缓冲液-1重悬细胞，密度为每100 µL缓冲液含1.0 × 107个细胞。
    6. 按1:100比例加入FcR阻断试剂，孵育5分钟后，再加入稀释1:200的异硫氰酸荧光素（FITC）标记CD31抗体。于20–25 °C避光孵育30分钟。
    7. 加入10 mL流式缓冲液-1，保留10 µL悬液用于流式细胞术分析，以确定CD31+细胞比例（图2）。
    8. 在20–25 °C下以200 × g离心5分钟使细胞沉淀。去除上清液后，用流式缓冲液-1重悬至每100 µL溶液含1.0 × 107个细胞的密度。加入FITC分选混合液（每100 µL细胞悬液加5 µL）。充分吹打混匀，于20–25 °C避光孵育15分钟。
    9. 每100 µL细胞悬液加入5 µL磁性纳米颗粒，充分吹打混匀，于20–25 °C避光孵育10分钟。
    10. 将细胞悬液转移至5 mL流式管中，加入流式缓冲液-1使总体积达2.5 mL。将流式管置于磁铁上5分钟。
    11. 连续操作，将磁铁和流式管倒置，倾倒出未被FITC-CD31抗体标记的细胞悬液。保持倒置状态2–3秒，然后移除残留液体。在将流式管恢复直立前，吸除管口边缘的液滴。
    12. 从磁铁上取下流式管，加入2.5 mL流式缓冲液-1以洗涤残留的CD31+细胞。轻柔吹打2–3次使细胞重悬。将流式管放回磁铁上5分钟。
    13. 重复步骤1.4.11–1.4.12三次，再重复步骤1.4.11一次，共洗涤四次。
    14. 将流式管从磁铁上取下，加入适量适宜培养基（例如，用于长期内皮细胞培养的人内皮细胞无血清培养基[hECSR]或用于冻存的冻存液），重悬纯化的CD31+细胞。保留两份10 µL悬液，一份用于细胞计数，另一份用于流式细胞术分析，以评估MACS后CD31+细胞的纯度（图2）。若无法立即进行流式分析，可将样品分装于4 °C保存至分析前。
    15. 若后续步骤（至步骤2）无法立即进行，可在此时冻存CD31+ EPC。如需进行EPC扩增和选择性传代，请进入步骤2。
      ​注意：可使用包被维通宁（vitronectin）25的12孔板和更稳定的hiPSC维持培养基（mTeSR plus）替代基底膜基质包被板和hiPSC维持培养基（mTeSR1）。制备维通宁包被的12孔板时，用稀释缓冲液将维通宁稀释至终浓度10 µg/mL，每孔加入500 µL稀释液，于20–25 °C放置至少1小时。单细胞化hiPSC的接种密度与基底膜基质包被板相当。更换培养基或基质成分可能影响hiPSC的增殖和自发分化，通常需要1–2周适应新培养条件。若使用更稳定的hiPSC维持培养基进行hiPSC维持，则该培养基也可用于EPC分化，替代原hiPSC维持培养基。此时，应在第-2天更换该更稳定的hiPSC维持培养基以去除ROCK抑制剂，第-1天的换液步骤可省略。

2. 扩展的内皮细胞培养方法（EECM）用于分化脑微血管内皮细胞样细胞（BMEC样细胞）和血管平滑肌样细胞（SMLC）

  1. 胶原蛋白包被板和试剂的制备
    1. 通过将5 mg结晶IV型胶原蛋白溶解于5 mL无菌水中来制备胶原蛋白包被的6孔板。4 °C下孵育过夜，然后分装并储存于-20 °C。将IV型胶原蛋白分装液以无菌水1:100稀释，得到10 µg/mL的溶液，并向每个6孔板孔中加入1 mL该10 µg/mL的IV型胶原蛋白溶液。37 °C孵育至少30分钟。板可在37 °C保存长达1周。
    2. 通过将500 µg FGF2溶解于5 mL杜氏磷酸盐缓冲液（Dulbecco's PBS）中，制备人成纤维细胞生长因子2（FGF2）的储存液，并加入BSA至终浓度为0.1%（7.5% BSA），然后将储存液分装为20–200 µL体积。储存液可于-20 °C保存长达3个月（表1）。储存液亦可在4 °C保存长达1个月；避免冻融循环。通过向98 mL hECSR培养基中加入2 mL B-27补充剂和20 µL FGF2来制备hECSR培养基（表1）。hECSR培养基可在2–8 °C保存长达2周。
    3. 通过向30 mL hECSR培养基中加入15 mL胎牛血清、5 mL DMSO和25 µL ROCK抑制剂溶液，制备用于EPCs、EECM-BMEC样细胞和SMLCs的冻存培养基（表1）。冻存培养基可在2–8 °C保存长达2周。
  2. 接种EPCs以进行延长的内皮细胞培养
    1. 从6孔板中移除胶原蛋白溶液。然后，在含有5 µM ROCK抑制剂（1:2,000稀释）的2 mL hECSR培养基中加入1.0–2.0 × 105个纯化的CD31+ EPCs。将板放入培养箱（37 °C，5% CO2）。通过轻轻前后滑动、再左右滑动板，使细胞均匀分布。
    2. 次日，移除含ROCK抑制剂的hECSR培养基，加入2 mL不含ROCK抑制剂的新鲜hECSR培养基。每隔一天更换一次hECSR培养基，直至达到100%汇合度。
      注：若周末无法维持常规换液周期，可在工作日最后一天的晚上更换培养基，并在周末后的次日清晨再次更换。
  3. 选择性传代以纯化EECM-BMEC样细胞和SMLCs
    1. 从含有内皮细胞（ECs）和非内皮细胞（non-ECs）混合群体的6孔板中移除hECSR培养基。向每孔加入1 mL解离试剂。
    2. 在显微镜下仔细观察细胞形态。当内皮细胞（但非内皮细胞未出现）变得明亮且呈圆形（通常在2–5分钟内）时，轻敲板边缘使内皮细胞脱落。大多数非内皮细胞仍附着在板上。
    3. 使用移液器收集脱落的内皮细胞，注意避免重悬非内皮细胞。将内皮细胞转移至含有每1 mL解离试剂对应4 mL DMEM/F12-10的15 mL或50 mL离心管中。
    4. 向剩余附着非内皮细胞的孔中加入2 mL hECSR培养基，以建立SMLCs。将板放入培养箱中。
    5. 用移液器充分混匀离心管中的细胞悬液，并保留10 µL用于细胞计数。其余细胞在20–25 °C下以200 × g离心5分钟。弃去上清液，按每1.0–2.0 × 105个内皮细胞加入2 mL hECSR培养基。
    6. 从新的6孔板中移除IV型胶原蛋白溶液后，向每孔加入2 mL内皮细胞悬液，随后在含5% CO2的37 °C条件下孵育。为使细胞在板中均匀分布，轻轻在培养箱架上前后、再左右移动板。
    7. 每隔一天更换一次hECSR培养基，直至内皮细胞达到100%汇合。
    8. 重复步骤2.3.1–2.3.7，直至获得纯的内皮细胞单层。若无法继续后续操作，可冻存CD31+内皮细胞（见步骤2.4.2）。若需分析内皮细胞功能，请进入步骤3。
      注：通常需要两到三次选择性传代，才能获得适用于功能分析的近乎纯的内皮细胞培养物，我们将这些细胞视为EECM-BMEC样细胞。经过五到六次以上传代后，细胞增殖通常会减慢，但此情况因hiPSC细胞系而异。
    9. 培养SMLCs时，每隔一天更换一次hECSR培养基。为收集SMLC条件培养基（CM），每次换液时将收集的培养基通过0.22 µm滤器过滤。该CM可用于上调EECM-BMEC样细胞的VCAM-1表达。将SMLC-CM收集至SMLCs达到100%汇合度为止。
  4. EPCs、EECM-BMEC样细胞和SMLCs的冻存与复苏
    1. 冻存EPCs时，在最后一次MACS洗涤（步骤1.4.13）后，将EPCs以1.0–2.0 × 106个细胞/mL的密度重悬于冻存培养基而非hECSR培养基中。将1 mL细胞悬液分装至冻存管中。将冻存管放入程序降温仪中，并迅速转移至-80 °C。长期储存时，冻存管在冻存后24–48小时转移至液氮罐中。
    2. 冻存EECM-BMEC样细胞和SMLCs时，在移除孔中培养基后，加入解离试剂（1 mL/孔），并在含5% CO2的37 °C条件下孵育，直至细胞脱落（EECM-BMEC样细胞约5–7分钟，SMLCs约20–30分钟）。将细胞收集至含有每1 mL解离试剂对应4 mL DMEM/F12-10的15 mL或50 mL离心管中。
    3. 充分混匀后，保留10 µL细胞悬液用于细胞计数。在20–25 °C下以200 × g离心5分钟，使细胞沉淀。弃去上清液，并将细胞充分重悬于冻存培养基中，密度为1.0–2.0 × 106个细胞/mL。将1 mL细胞悬液分装至新的冻存管中。
    4. 将冻存管放入程序降温仪中，并立即转移至-80 °C。长期储存时，可在冻存后24–48小时将冻存管转移至液氮罐中。
    5. 复苏EPCs、EECM-BMEC样细胞和SMLCs时，将冻存管在手中轻轻滚动或置于37 °C水浴中，直至细胞几乎完全解冻。加入500 µL DMEM/F12-10，轻轻将细胞悬液转移至含有4 mL DMEM/F12-10培养基的15 mL离心管中。用1 mL DMEM/F12-10洗涤冻存管一次，然后在20–25 °C下以200 × g离心5分钟。
    6. 吸除上清液，将沉淀重悬于2 mL含5 µM ROCK抑制剂（1:2,000稀释）的hECSR培养基中，EPCs的密度为每2 mL含1.0–2.0 × 105个细胞，EECM-BMEC样细胞和SMLCs的密度为每2 mL含2.0–3.0 × 105个细胞。吸除胶原蛋白溶液后，将细胞悬液分配至胶原蛋白包被的6孔板各孔中。
    7. 在37 °C、5% CO2培养箱的架上，轻轻前后移动、再左右移动板，使细胞在孔中均匀分布。
    8. 次日，更换为不含ROCK抑制剂的新鲜hECSR培养基。每隔一天更换一次hECSR培养基，直至达到100%汇合度。然后，对EPCs进行选择性传代（见步骤2.3），对EECM-BMEC样细胞进行功能分析（见步骤3）。在进行分子表征和功能检测前，EECM-BMEC样细胞应达到100%汇合，通常在复苏后2–3天内实现。

3. EECM-BMEC样细胞和SMLC的验证

  1. 小分子示踪剂通透性检测
    1. 参照 Nishihara 等人26所述方法，通过测定荧光素钠的通透性来评估 EECM-BMEC 样细胞屏障的完整性。将 EECM-BMEC 样细胞接种于滤膜插件上，形成完整的单层细胞后，测定荧光素钠的通透性。
  2. 免疫荧光染色以评估关键分子
    1. 为监测单层 EECM-BMEC 样细胞或 SMLC 中连接分子、黏附分子或细胞骨架蛋白的表达，可采用腔室载玻片、96 孔板或带插入式滤膜的膜材料进行免疫荧光染色。参照 Nishihara 等人26所述方法，在有或无炎症细胞因子刺激的条件下评估 EECM-BMEC 样细胞表面黏附分子的表达。
  3. 流式细胞术分析 EECM-BMEC 样细胞表面黏附分子的表达
    1. 采用流式细胞术半定量分析参与免疫细胞迁移进入中枢神经系统（CNS）的 EECM-BMEC 样细胞表面黏附分子的表达，包括 ICAM-1、ICAM-2、VCAM-1、P-选择素、E-选择素、CD99 和血小板内皮细胞黏附分子-1（PECAM-1），方法参照 Nishihara 等人26。将 EECM-BMEC 样细胞在含或不含炎症细胞因子的 SMLC 条件培养基中培养 16–18 小时。
  4. 静态条件下免疫细胞黏附实验以评估功能性黏附分子的表达
    1. 采用 Nishihara 等人26所述方法，确定 EECM-BMEC 样细胞表面黏附分子是否具有功能活性。
    2. 简言之，将 EECM-BMEC 样细胞以 5.5 × 104/cm2 的密度接种于腔室载玻片中，培养至完全融合。约 24 小时后，更换为含或不含促炎细胞因子的 SMLC 条件培养基，并继续培养 EECM-BMEC 样细胞 16 小时。
    3. 实验当天，使用 T 细胞洗涤缓冲液（表 1）解冻冻存的免疫细胞（如 T 细胞或外周血单个核细胞 [PBMCs]），并在 T 细胞培养基（表 1）中用荧光染料（如细胞追踪染料）进行标记。免疫细胞培养基的优化应根据所研究的具体免疫细胞类型进行调整。
    4. 在 16 孔腔室载玻片中，向 EECM-BMEC 样细胞加入 2 × 104 个 Th1 细胞。具体而言，当使用 Th1 等效应 T 细胞时，观察到其对 EECM-BMEC 样细胞的黏附能力较 PBMCs 更强（Nishihara 等 [2022]）。因此，与纯效应 T 细胞相比，加入 EECM-BMEC 样细胞的 PBMCs 数量需更高。
    5. 在迁移实验培养基（表 1）中，将免疫细胞与 EECM-BMEC 样细胞单层共孵育 30 分钟。30 分钟后，轻轻将载玻片浸入含 Dulbecco's PBS 的容器中清洗两次，随后在 4 °C 下用 2.5% 戊二醛溶液固定 2 小时。
    6. 固定后，将载玻片再次浸入含 Dulbecco's PBS 的容器中清洗两次，加盖盖玻片封片。随后获取载玻片上单层细胞中心区域的荧光显微镜图像，用于计数黏附于 EECM-BMEC 样细胞单层上的免疫细胞数量。

结果

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

通透性检测
通过测定在15、30、45和60分钟时从下室收集的培养基的荧光强度，计算荧光素钠的通透性。每个时间点取样150 µL培养基，并用hECSR培养基补充缺失的150 µL体积。使用荧光酶标仪（激发波长485 nm，发射波长530 nm）读取荧光强度，并根据先前描述的公式18（表2）计算校正后的信号值、清除体积和通透性。建议确认荧光素钠的荧光强度是否随时间增加。为确保实验可重复性，每次检测应使用多个滤膜——至少三个重复。对于健康对照来源的EECM-BMEC样细胞，荧光素钠（376 Da）的通透性应低于0.3 × 10-3 cm/min。为确认形成融合的EECM-BMEC样细胞单层，应在通透性检测后对用于该检测的每个滤膜上的EECM-BMEC样细胞进行连接蛋白的免疫荧光染色分析。

免疫荧光染色
采用免疫荧光染色检测EECM-BMEC样细胞连接分子（包括claudin-5、occludin和VE-cadherin1），以评估细胞形态以及连续且成熟连接的存在情况（图4）。将滤膜插件膜上生长的EECM-BMEC样细胞单层用冷甲醇（-20 °C）固定20秒，用封闭缓冲液（表1）封闭，随后与一抗和二抗孵育。EECM-BMEC样细胞呈现纺锤形形态和锯齿状连接结构，均为BMEC的典型形态特征27。在小室载玻片上接种的EECM-BMEC样细胞经促炎性细胞因子（如肿瘤坏死因子-α（TNF-α）和干扰素-γ（INF-γ））刺激（TNF-α 0.1 ng/mL + IFN-γ 2 IU/mL，溶于SMLC来源的条件培养基中稀释）后，可上调黏附分子（如ICAM-1和VCAM-1）的表达28（图5）。代表性图像显示了平滑肌细胞标志物，包括α-平滑肌肌动蛋白（SMA）、钙调素结合蛋白（calponin）和平滑肌蛋白22-Alpha（SM22a）29（图6）。将接种于小室载玻片的SMLC用4%多聚甲醛固定10分钟，用封闭缓冲液封闭，随后与一抗和二抗孵育。

EECM-BMEC样细胞表面黏附分子表达的流式细胞术分析
EECM-BMEC样细胞表面内皮黏附分子表达的代表性结果如图7所示。经促炎性细胞因子（如TNF-α和INF-γ）刺激后，多种黏附分子的细胞表面表达上调，包括ICAM-1、VCAM-1和P-selectin。使用SMLC条件培养基培养EECM-BMEC样细胞可增强内皮细胞VCAM-1的细胞表面表达。不同批次的SMLC条件培养基对VCAM-1细胞表面表达的诱导效果可能存在差异。建议在由相同hiPSC来源分化SMLC时，保存多个批次的SMLC条件培养基，以便验证哪一批次能够诱导出适当的VCAM-1表达水平。

静态条件下免疫细胞黏附实验
黏附的免疫细胞数量与EECM-BMEC样细胞表面功能性黏附分子的表达水平相关。经炎症性细胞因子刺激后，内皮黏附分子的表达上调，导致黏附于EECM-BMEC样细胞单层的免疫细胞数量增加（图8）。本实验验证了EECM-BMEC样细胞上黏附分子的功能性，表明该模型适用于研究免疫细胞与内皮细胞之间的相互作用。

流式细胞术分析图表；MACS分选前后的结果；细胞群体的FITC/SSC散点图。
图2：CD31+ 内皮细胞（ECs）的纯化。代表性流式细胞术数据的散点图，显示内皮细胞的散射门控以及细胞群体在磁珠分选（MACS）前（步骤1.4.7）和分选后（步骤1.4.14）经FITC标记的CD31染色结果。MACS可提高细胞群体中CD31+ 内皮祖细胞（EPCs）的纯度。缩写：SSC = 侧向散射；FSC = 前向散射；FITC = 异硫氰酸荧光素；MACS = 磁珠激活细胞分选。 请点击此处查看该图的放大版本。

清除体积与时间关系图；公式：Yf=3.885Xf+56.78；Pe=1/m–1/mg；数据分析
图3：根据荧光素钠的原始荧光强度计算的EECM-BMEC单层通透性（10-3 cm/min）。 清除体积的线性斜率通过每个滤膜的线性回归计算得出（图3A）。荧光素钠的通透性通过两个公式计算（图3B）。（A）清除体积对时间的线性斜率通过线性回归法计算滤膜1（mc1）和空白滤膜（mf）的值。mc1 和 mf 分别为 Xc1 和 Xf 的系数。（B）使用 mc 和 mf 计算荧光素通透性（Pe）的公式（公式1）。Pe 单位通过滤膜表面积进行换算（公式2）。请点击此处查看该图的放大版本。

内皮细胞连接蛋白的免疫荧光显微图像：claudin-5、occludin、VE-cadherin。
图 4：EECM-BMEC样细胞表现出成熟的细胞连接结构。 对生长于插入式滤膜上的EECM-BMEC样细胞进行claudin-5、occludin或VE-cadherin（红色）的免疫荧光染色。细胞核使用4′,6-二脒基-2-苯基吲哚（DAPI）染色（蓝色）。染色所用的滤膜插入物与通透性实验中使用的完全相同。比例尺 = 50 µm。请点击此处查看该图的放大版本。

免疫荧光检测；ICAM-1、VCAM-1 比较；非刺激与刺激条件下细胞反应。
图 5：EECM-BMEC样细胞中内皮黏附分子的表达。 对在滤膜插件膜上生长并暴露于SMLC来源的条件培养基（CM）中的EECM-BMEC样细胞进行免疫荧光染色。图中显示了非刺激状态以及经1 ng/mL TNF-α 和 20 IU/mL IFN-γ 刺激后的EECM-BMEC样细胞中ICAM-1或VCAM-1（红色）的免疫染色结果。细胞核用DAPI染色（蓝色）。比例尺 = 50 µm。 请点击此处查看该图的放大版本。

免疫荧光显微镜；α-SMA、calponin、SM-22；细胞中蛋白表达分析。
图6：SMLC的表征。 展示了在培养皿中生长的SMLC的α-平滑肌肌动蛋白（SMA）、calponin或平滑肌蛋白22-Alpha（SM22a）（红色）的免疫细胞化学染色结果。细胞核用DAPI染色（蓝色）。比例尺 = 50 µm。请点击此处查看该图的放大版本。

黏附分子ICAM、VCAM的荧光强度直方图；TNF-α + INF-γ 与同型对照。
图7：EECM-BMEC样细胞上内皮细胞表面黏附分子的表达。 展示了对EECM-BMEC样细胞内皮细胞表面黏附分子表达进行的流式细胞术分析结果。EECM-BMEC样细胞使用SMLC来源的条件培养基进行培养。直方图叠加中的蓝色、红色和灰色线条分别表示未刺激（NS）条件、1 ng/mL TNF-α + 20 IU/mL IFN-γ刺激条件以及同型对照。检测的细胞表面黏附分子包括细胞间黏附分子1（ICAM-1）、ICAM-2、血管细胞黏附分子1（VCAM-1）、P-选择素、E-选择素、CD99以及血小板内皮细胞黏附分子-1（PECAM-1）。请点击此处查看该图的放大版本。

T细胞黏附实验结果、荧光显微镜图像、TNFα+IFNγ处理组对比图。
图8：免疫细胞在EECM-BMEC样细胞上的黏附。（A）在未刺激（NS）和经0.1 ng/mL TNF-α + 2 IU/mL IFN-γ刺激（TNF-α + IFN-γ）的EECM-BMEC样细胞单层上，荧光标记的黏附免疫细胞图像。图像对应于孔板中央区域。比例尺 = 50 µm。（B）在未刺激及TNF-α + IFN-γ刺激的EECM-BMEC样细胞单层上黏附的荧光标记免疫细胞数量。使用FIJI软件自动计数每视野（FOVs）的黏附免疫细胞数。每个点代表附着的T细胞数量，柱状图表示平均值，误差线表示八次重复实验的标准差（SD）。请点击此处查看该图的放大版本。

表1：各检测所用试剂的具体信息。 每种特定试剂的成分名称及确切用量均有说明。请点击此处下载该表格。

表2：用于Pe计算的荧光酶标仪原始数据示例。 加粗的数字为酶标仪测得的荧光素钠的原始荧光强度。为了准确分析数据，必须从原始值中扣除背景信号，并校正因取样下室所导致的信号损失，随后对信号进行校正。例如，在扣除背景信号后，15分钟样品的信号为100相对荧光单位（RFU），30分钟样品的信号为150 RFU。30分钟时的校正信号为（150 RFU + 15分钟时缺失的值 [100 RFU × 150 µL/1,500 µL]），即150 RFU + 10 RFU = 160 RFU。清除体积 = (1,500 × [SB,t])/(ST,60 min)，其中1,500为下室体积（1,500 µL），SB,t为时间t时的校正信号，ST,60 min为60分钟时上室的信号。请点击此处下载该表格。

讨论

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

关键要点与故障排除
在开始EPC分化之前，研究人员应确保hiPSC培养物中未发生自发性细胞分化事件。避免出现自发分化的细胞，并使用纯的hiPSC克隆，对于获得可重复的实验结果至关重要。第-3天hiPSC的接种密度对于MACS后获得高纯度的CD31+ EPC具有重要意义。不同hiPSC细胞系及不同传代次数的接种密度可能需要优化。根据hiPSC细胞系和传代数的不同，每孔12孔板的接种密度可在75 × 103 至 400 × 103 个hiPSC之间（即20–100 × 103/cm2）。hiPSC的最低密度检查点为第2天的细胞密度。最晚到第2天，hiPSC应达到100%汇合度。若第2天仍未达到完全汇合，则MACS后CD31+ EPC的纯度通常会较低。此时可考虑提高hiPSC的初始接种密度。若在第3至第5天左右有大量分化中的细胞从培养板脱落，则可降低初始接种密度。根据我们的经验，7–8 µM CHIR99021是本研究中所用hiPSC细胞系的最佳浓度，但其他hiPSC细胞系可能对抑制剂处理的反应不同，因此该浓度可能需要进一步优化。应在MACS前后确认CD31+ EPC的纯度。在进行MACS前，分选前的细胞混合物中CD31+细胞比例应>10%。若CD31+细胞比例<6%，通常会导致MACS后EPC纯度<80%。此种情况下需优化初始接种密度和/或CHIR99021的浓度。

为了成功实现选择性传代并生成纯内皮细胞（EC）单层，磁珠分选（MACS）后CD31+ 内皮祖细胞（EPC）的纯度至关重要。若MACS后的纯度<90%，建议进行一至两次额外洗涤（步骤1.4.11–1.4.12）。理想情况下，MACS后的纯度应>95%。在胶原包被的培养板上接种EPC时，应根据不同的人诱导多能干细胞（hiPSC）系优化接种密度，以在3–7天内达到100%汇合。通常，等到内皮细胞完全汇合（100%）后再进行传代，可实现成功的选择性传代。然而，对于某些hiPSC系，即使内皮细胞已完全汇合，其平滑肌样细胞（SMLC）也可能提前脱落。此时，在较低汇合度（例如≤80%）时进行选择性传代可能更为有效。若部分SMLC比内皮细胞更早脱落，则往往难以从混合的内皮细胞-SMLC群体中挽救出纯内皮细胞。在此情况下，缩短传代过程中解离试剂的激活时间，并进行多次选择性传代，可能有所帮助。使用商品化解离试剂而非胰酶作为解离试剂有利于实现选择性传代，因为胰酶无法实现内皮细胞与SMLC的分离脱落。我们利用小分子示踪剂进行的通透性检测，以及对紧密连接蛋白和黏附分子表达水平的分析表明，EPC、EECM-BMEC样细胞以及SMLC均可在液氮中保存至少2年。

方法的意义与局限性
该方法通过使用化学GSK-3抑制剂激活Wnt/β-catenin信号通路，从而从hiPSCs中分化出CD31+ EPCs。经MACS对CD31+ EPCs进行阳性筛选后，将EPCs培养于特定的内皮细胞培养基中，以促进其分化为混合的内皮细胞和SMLC群体。利用这些混合群体不同的黏附特性进行选择性传代，可实现内皮细胞（ECs）与SMLCs的分离。经过一次或两次传代后，EECM-BMEC样细胞表现出屏障功能，并表达类似于原代人脑微血管内皮细胞（BMECs）的内皮黏附分子。与SMLCs或其上清液共培养可诱导VCAM-1的细胞因子依赖性表达。

体内，血脑屏障通过限制分子的细胞旁和跨细胞通透性，并调控营养物质的转运，维持中枢神经系统的稳态 通过 特异性转运蛋白及免疫细胞向中枢神经系统迁移的调控。在血脑屏障（BBB）研究中，建立能够表达相关分子并具备目标功能的合适模型至关重要。利用定义明确的试剂及来自患者或健康个体的样本，可制备出具有类EECM-BMEC特性的细胞，从而构建可扩展的人源性血脑屏障模型。相较于其他血脑屏障模型，采用类EECM-BMEC细胞模型的优势包括：1）具备典型的形态学特征及内皮细胞转录组谱型30 与原代人脑微血管内皮细胞（BMECs）相似的特性；2）存在成熟的紧密连接；3）理想的屏障功能；4）内皮细胞黏附分子的强表达，包括ICAM-1、ICAM-2、VCAM-1、E-选择素和P-选择素、CD99、黑色素瘤细胞黏附分子（MCAM）以及活化白细胞黏附分子（ALCAM）22因此，该模型特别适用于研究免疫细胞与脑微血管内皮细胞（BMECs）之间的相互作用。尽管EECM-BMEC样细胞对小分子示踪剂的通透性高于此前报道的iPSC来源的BMEC样细胞14,15，其屏障特性与原代人脑微血管内皮细胞（BMECs）所描述的特性相当接近。这一相似性表明，EECM-BMEC样细胞很可能是一种良好的 体外 血脑屏障模型。在使用该模型研究不表达组成型E-selectin的非炎症性血脑屏障时，必须考虑生理条件下EECM-BMEC样细胞上E-selectin的表达情况 体内31在我们之前的研究中，我们证明了EECM-BMEC样细胞能够模拟多发性硬化症（MS）患者脑组织中血脑屏障（BBB）的表型特征，即紧密连接结构的破坏。这导致小分子通透性升高，以及功能性黏附分子表达增加，从而介导免疫细胞在BMEC样细胞上的黏附和跨内皮迁移增强。32此外，我们发现Wnt/β-catenin信号通路的激活可改善多发性硬化症来源的EECM-BMEC样细胞中紧密连接的破坏以及VCAM-1表达的升高32这些结果表明，该模型确实可用于研究血脑屏障在神经免疫性疾病（如多发性硬化症）中的作用。

综上所述，EECM-BMEC样细胞是深入理解血脑屏障（BBB）水平上病理生理机制的有力工具，也可用于开发针对BBB稳定的新型治疗靶点。未来，该模型可应用于更广泛疾病中BBB功能障碍的研究，并有望为新型治疗策略的开发开辟途径。

披露

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

BE 收到了来自 Biogen 的资助，用于研究纳他珠单抗在T细胞跨血脑屏障迁移中的扩展给药方案，以及来自 CSL Behring 的资助，用于探究神经系统疾病中血脑屏障功能障碍的分子机制。HN 和 BE 是与 EECM-BMEC 样细胞相关的美国临时专利申请（63/084980 和 63/185815）的发明人。

致谢

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

HN 获得了上山纪念基金会、ECTRIMS 博士后研究交流奖学金、日本学术振兴会（JSPS）与瑞士国家科学基金会（SNSF）联合研究项目（JRPs）（项目编号 JPJSJRP20221507）及科学研究费补助金（KAKENHI）（项目编号 22K15711）、日本科学技术振兴机构（JST）FOREST 计划（项目编号 JPMJFR2269）、横山临床药理学基金会（项目编号 YRY-2217）、池田伊鲁奥基金会、成茂神经科学研究所、日本诺华科学促进基金会以及山口大学基金的资助。BE 获得了瑞士多发性硬化症学会、瑞士国家科学基金会（项目编号 310030_189080 和 ZLJZ3_214086） 以及 日瑞战略科学技术合作计划（SJSSTP） 项目 IZLJZ3_214086 的资助。

材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
0.22 mm 注射器滤器TPP99722
15 mL 离心管Falcon352196
40 μm Falcon 细胞筛Falcon352340
5 mL 圆底管SPL40005
50 mL 离心管Falcon352070
96孔板，圆底SPL34096
AccutaseSigma-AldrichA6964-500ml
乙酸Sigma-Aldrich695092
Advanced DMEM/F12Life Technologies12634
一体化荧光显微镜KeyenceBZ-X810
B-27 补充剂 (503)，无血清Thermo Fischer Scientific17504044
牛血清白蛋白 (BSA)，7.5% 溶于 dPBSSigma-AldrichA8412
CellAdhere 稀释缓冲液STEMCELL TechnologiesST-07183
CellTracker Green CMFDA 染料InvitrogenC7025
培养皿载玻片Thermo Fischer Scientific178599
CHIR99021Selleck ChemicalsS1263
人胎盘来源的 IV 型胶原蛋白Sigma-AldrichC5533
Corning 组织培养板 (12 孔)Corning3512
Corning 组织培养板 (6 孔)Corning3506
冻存管内盖 2.0 mLWatson1396-201S
二甲基亚砜 (DMSO)，无菌Sigma-AldrichD2650
DMEM (13)，含 4.5 g/L D-葡萄糖，不含 L-谷氨酰胺，不含丙酮酸Thermo Fischer Scientific31053-028
Dulbecco’s (d) PBS (不含钙、镁)Thermo Fisher14190250
Dulbecco’s 改良 Eagle’s 培养基/营养混合物 F-12 (DMEM-F12)Thermo Fischer Scientific11320074
EasySepFITC 阳性选择试剂盒 IISTEMCELL Technologies18558
EasySep 磁力架Stemcell Technologies18000
乙二胺四乙酸溶液 0.02% 溶于 DPBSSigmaE8008-100ML
胎牛血清，经鉴定Thermo Fischer Scientific10270106
牛血浆来源的纤连蛋白Sigma-AldrichF1141
Ficoll-Paque PLUSSigma-AldrichGE17144002
FIJI 软件 (版本 2.0.0)Image J, USA
FlowJo 版本 10BD
荧光素钠盐Sigma-AldrichF6377
GlutaMAX 补充剂Thermo Fischer Scientific35050-061
戊二醛溶液Sigma-AldrichG6257
HCLSigma-AldrichH1758
HEPES 缓冲液Thermo Fischer Scientific15630-056
人内皮细胞无血清培养基 (hESFM)Thermo Fischer Scientific11111-044
人成纤维细胞生长因子 2 (FGF2)Tocris233-FB-500
iPS 人诱导多能干细胞Riken RBCHPS1006
卡那霉素硫酸盐 (100x)Thermo Fischer Scientific15160-047
L-抗坏血酸-2-磷酸三镁盐水合物Sigma-AldrichA8960-5G
L-谷氨酰胺 200 mM (1003)Thermo Fischer Scientific25030-024
Matrigel，生长因子减少型Corning354230
MEM NEAA (1003)Thermo Fischer Scientific11140-035
甲醇Sigma-Aldrich32213
MowiolSigma-Aldrich81381
mTeSR Plus-cGMPSTEMCELL TechnologiesST-100-0276
mTeSR1 完整试剂盒 (基础培养基加 53 补充剂)STEMCELL Technologies85850
NaClSigma-Aldrich71376
多聚甲醛Millipore104005
青霉素-链霉素 (Pen Strep)Thermo Fischer Scientific15140-122
重组人 IFN-γ 蛋白R&D Systems285-IF-100
重组人 IL-2BD Biosciences554603
重组人 TNF-α 蛋白R&D Systems210-TA-020
ROCK 抑制剂 Y-27632Tocris1254
RPMI 1640 培养基Thermo Fischer Scientific21875-034
手术刀FEATHER2975-11
脱脂牛奶BD Biosciences232100
叠氮化钠 (NaN3)Sigma-Aldrich71290
丙酮酸钠Thermo Fischer Scientific11360-039
Transwell 小室，PC 膜，0.4 mm，12 mm，经组织培养处理Corning3401
Tris 碱Sigma-Aldrich93362
Triton X-100Sigma-AldrichX100
Vitronectin XFSTEMCELL Technologies078180
水，无菌，用于细胞培养Sigma-AldrichW3500

参考文献

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
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