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方法文章

高速磁镊技术用于力敏感元件的纳米力学测量

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DOI：

10.3791/65137

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2023年5月12日

 ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Physics, Pohang University of Science and Technology (POSTECH), 2School of Biological Sciences, Seoul National University, 3Institute for Molecular Biology and Genetics, Seoul National University, 4School of Interdisciplinary Bioscience and Bioengineering, Pohang University of Science and Technology (POSTECH)

* These authors contributed equally

本文内容

摘要

本文介绍了一种高速磁镊装置，可在最高达 1.2 kHz 的采样速率下对受力敏感的生物分子进行纳米力学测量。我们以 DNA 发夹结构和 SNARE 复合物作为模型体系展示了该装置的应用，但该系统也可适用于研究其他参与力学生物学过程的分子。

摘要

单分子磁镊（MTs）作为一种强大的工具，可通过施加外力来研究生物大分子（如核酸和蛋白质），因此在力学生物学领域具有广阔的应用前景。由于该方法通常依赖基于图像的磁珠追踪技术，图像记录与分析的速度限制以及磁珠的热涨落长期以来制约了其在观测靶分子微小且快速的结构变化中的应用。本文详细描述了高分辨率磁镊装置的构建与操作方法，该系统能够解析生物大分子及其复合物在纳米尺度、毫秒级时间分辨率下的动态行为。作为应用实例，本文展示了DNA发夹结构和SNARE复合物（介导膜融合的分子机器）的实验，重点说明如何在皮牛顿量级的外力条件下检测其瞬时状态及状态间的转换。我们预期，高速磁镊技术将继续推动对细胞内感知、传递和产生力学信号的分子进行高精度的纳米力学测量，从而加深我们在分子水平上对力学生物学的理解。

引言

细胞能够主动感知并响应机械刺激。在此过程中，许多生物分子表现出依赖于力的特性，从而实现动态的结构变化。典型的例子包括机械敏感性离子通道和细胞骨架元件，它们为细胞提供来自周围环境的关键力学信息。

此外，在更广泛的意义上，那些表现出独特受力特性的分子也可被视为力敏性分子。例如，核酸双链的局部形成与解链，以及G-四链体等高级结构，在复制、转录、重组以及近年来的基因组编辑中发挥着关键作用。此外，一些参与突触通讯的神经元蛋白通过产生超过典型分子间相互作用水平的物理力来执行其功能。无论研究哪一类实例，以高时空精度研究相关生物分子的纳米力学特性，对于揭示相应力学生物学过程的分子机制都具有重要意义1,2,3。

单分子力谱方法已被用作研究生物大分子力学性质的有力工具2,4,5,6它们可以在施加力的同时监测核酸和蛋白质的结构变化，从而研究力依赖性特性。两种广为人知的装置是光镊和磁镊（MTs），二者均利用微米级小球来操控分子。5,6,7,8在这些平台中，聚苯乙烯微球（用于光镊）或磁珠（用于磁镊）被连接至目标分子（如核酸和蛋白质） 通过 分子 "手柄"，通常由短片段的双链DNA（dsDNA）制成。随后移动磁珠以施加力，并通过成像追踪其位置，从而报告目标分子的结构变化。光镊和磁镊在其应用中基本可互换，但在力的控制方式上存在重要差异。光镊本质上是位置钳制装置，可将磁珠固定在特定位置，因此当目标分子构象发生变化时，施加的力会发生波动；例如，延伸长度增加（如因去折叠）会使连接链松弛并降低张力， 反之亦然尽管可以通过主动反馈来控制光镊中的力，但磁镊则天然地作为力钳装置运行，利用永磁体产生的稳定远场磁力，从而能够耐受环境扰动。

尽管磁镊（MTs）具有悠久的历史和简单的结构设计，但由于快速磁珠追踪方面的技术挑战，其在高精度测量中的应用一直落后于光镊。然而，近年来多个研究团队共同推动了磁镊仪器在硬件和软件方面的多方面改进2,9,10,11,12,13,14,15,16,17,18,19。本文介绍了一种运行频率达1.2 kHz的高分辨率磁镊装置实例，并详细描述了如何利用该装置对受力敏感的生物大分子进行纳米力学测量。以DNA发夹结构和神经元SNARE复合物作为模型体系，研究其在皮牛顿力范围内的快速结构变化。DNA发夹在明确的力范围内表现出简单的两态跃迁20,21，因此可作为验证磁镊系统性能的理想模型。SNARE蛋白可组装成一种对力敏感并驱动膜融合的复合物22，也已被广泛应用于单分子力谱研究14,23,24,25。本文同时介绍了标准的数据分析方法，以及提取热力学和动力学有用信息的流程。我们希望本文能够促进高精度磁镊在力学生物学研究中的广泛应用，并激励读者探索各自感兴趣的力敏感体系。

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方案

本方案中描述的所有材料和设备均列于材料表中。用于操作下述高速磁镊装置的 LabVIEW 软件，以及用于分析样本数据的 MATLAB 脚本，均已存放于 GitHub (https://github.com/ShonLab/Magnetic-Tweezers) 并公开可用。

1. 装置构建

注：高速微管构建的基本原理与标准常规微管系统相似，不同之处在于使用了高速互补金属氧化物半导体（CMOS）相机和高功率相干光源（图 1）。关于标准微管仪器的更多描述，请参阅其他文献5,26,27。

  1. 在防振光学平台上搭建一台倒置显微镜。安装一台高速CMOS相机和一个帧捕获器。
  2. 构建一个用于三维操控磁体的平移台。将一个电动线性平移台（行程>20 mm）垂直安装在一个手动XY平移台顶部。
    注：垂直运动控制力，而XY平移台用于在初始搭建装置时手动将磁体对准光轴。
  3. 安装一个旋转步进电机以及一套用于旋转磁体的皮带和滑轮系统。
    注：皮带在相距几厘米的电机轴和磁体之间传递旋转运动。磁体的旋转是平移操控的内部运动。
  4. 安装磁体。使用一个亚克力支架（向制造公司订购；参见补充图S1），该支架可以紧密地平行容纳两个相同的磁体，磁体之间有明确的1 mm间隙（图1B）。为了利用给定一对磁体可获得的最大力，调整平移台的垂直位置，使得当磁体移动到最低位置时，其底面与样品平面对齐。
    注：有关支架设计和磁体配置的更多信息，请参阅Lipfert等人的文献28。磁体的高度和方向由LabVIEW软件结合数据采集进行控制。
  5. 使用低倍物镜观察，将磁体对准视场中心。检查旋转磁体是否导致磁体对中心发生大的位移。
    注：如果磁体之间的中点绕旋转轴旋转，则可能是由于支架不完美导致磁体偏离中心。相对于间隙尺寸，微小的未对准是可以容忍的，因为磁体旋转仅用于检查系绳和在特定应用中施加扭矩。
  6. 安装一个用于珠子照明的超辐射发光二极管。使光束穿过两个磁体之间的1 mm间隙。确保光束经过适当准直以适合该间隙，并且照明不被磁体遮挡。
  7. 在物镜转换器上安装一个压电透镜扫描器，并安装一个用于珠子追踪的100倍油浸物镜（数值孔径[NA]：1.45）。为避免追踪结果中出现潜在伪影，请确保在移动磁体时照明保持均匀。最后，将光强调整到不使像素饱和的最大亮度。
    ​注：关于用于珠子高速追踪的不同光源的比较，请参阅Dulin等人的文献29。

2. 磁力校准

  1. 使用聚合酶链式反应（PCR；参见表 1），制备一端标记生物素（用于表面附着）、另一端标记叠氮基团（用于磁珠附着）的 5 kbp 双链 DNA 片段（使用引物 B、引物 Z_5k 和 λ-DNA）。
  2. 按照第 6 节所述，制备包含 5 kbp 分子的流动池。
  3. 按照第 7 节所述，通过验证其延伸长度与旋转情况来筛选合适的磁珠-系链复合物。特别要注意，应选择旋转轨迹半径最小（即半径 <200 nm）的磁珠，以最大程度减少因非中心附着导致的磁珠高度偏移30,31。一旦识别出合适的系链，即可开始磁珠追踪，参见第 9 节。
  4. 若为新建置的系统，需表征其噪声与稳定性，以确保可靠的高分辨率测量。将磁铁置于距离流动池表面约 3 mm 处（以施加 >10 pN 的力并抑制磁珠的布朗运动），以 1.2 kHz 的频率追踪磁珠的 z 位置，并根据 z 坐标时间序列计算艾伦偏差（AD）32,33（图 2C）。检查在高速测量条件下（<0.1 s）是否可实现数纳米的 AD 值，并确认差分追踪（磁珠相对于参考珠的位置）是否降低了更长时间尺度上的 AD。
    注：我们通常在最大采样率（1.2 kHz 或 0.83 ms 分辨率）下获得 <3 nm 的 AD，且 AD 至少在 10 s 内持续下降，表明漂移极小。其他研究者在类似装置上也报告了相近的数值9,10,11,12,34。
  5. 在磁铁处于静止位置（F ~ 0 pN）时，以 1.2 kHz 的频率记录被系留磁珠的 x 和 y 坐标。记录时间需足够长（即远长于波动的特征弛豫时间35），以确保对布朗运动进行充分采样。
    注：此处，x 方向沿磁场方向，而 y 方向的运动代表垂直于磁场的横向运动。
  6. 将磁铁向流动池方向移动，并重复进行磁珠位置测量，直至磁铁轻轻接触流动池顶部。当磁铁距离样品平面超过 7 mm 时（因在磁铁远场中施加的力增加缓慢），可采用较大步长（例如 1-2 mm）移动；但随着磁铁逐渐靠近，应逐步减小步长（例如 0.1-0.5 mm），以便在更高力水平下进行更精细的校准（图 2B）。
  7. 使用以下两种方法之一（提供的 MATLAB 脚本 "force calibration.m" 包含两种方法；参见补充文件 1）计算每个磁铁位置 d 所对应的力。
    1. 测量磁珠 y 坐标的方差 静态平衡方程 ⟨δy²⟩，用于方差分析的公式表示，数学概念。（图 2D）以及磁珠相对于最低位置的 z 位置平均值 量子期望值，⟨Z⟩ 符号，用于统计力学和量子物理方程。（图 2B，底部）。然后，使用方程（1）7,27,36 估算力（设定磁珠半径 R = 1,400 nm，热能 kRT = 4.11 pN∙nm）：
      力公式 F=kB*T/<δy²>*(<z>+R) 用于热涨落研究的物理方程图。    （1）
    2. 或者，计算 y 坐标的功率谱密度（PSD）Sy （图 2E）。通过使用方程（2）将双洛伦兹模型37拟合到测得的 Sy 来确定施加的力 F。
      用于频率稳定性分析的谱密度方程，包含数学公式。    （2）
      此处，谐振频率方程；符号数学；谱分析应用；研究用途。，R 为磁珠半径，γy 和 γφ 分别为平移和旋转阻力系数（根据斯托克斯-爱因斯坦方程估算），kRT 为热能，f+ 和 f- 是使用方程（3）得到的两个特征频率。
      动态系统谐振频率方程，包含公式中的变量和分数。 （3）
      注：由于系链延伸长度 L 是遵循公认的蠕虫状链（WLC）模型的力的函数，上述表达式使 F 成为唯一的拟合参数（为简化起见，我们将 R 固定为 1,400 nm，因为它在所有力水平下均相同，且其精确值对结果影响不大）。必要时，必须考虑基于相机的图像采集所带来的运动模糊和混叠效应38,39，但在我们使用 5 kbp 系链进行高于 1 kHz 的高速测量时，此效应可忽略不计。
  8. 对另外几个复合物重复步骤 2.4-2.7。探测三到五个不同的磁珠，以平均化磁珠间的力变异性。
    注：应考虑所用磁珠之间的力差异，以确定用于平均的合适复合物数量。这种变异性虽小，但即使对于商业产品，也可能导致测量力出现超过 1 pN 的误差31。对于大多数不涉及精确测定绝对力的应用，平均三到五个磁珠的校准结果通常已足够。考虑这种变异性的另一种方法是在实验开始时用单个系链测量力，但这可能耗时较长。另一种选择是在每个复合物中嵌入在已知力水平下解链的发夹结构31。
  9. 将测得的力绘制为磁铁距离的函数，并使用方程（4）将双指数函数拟合到数据（图 2F）。
    指数衰减公式 F(d)=F₀+A₁exp(-d/d₁)+A₂exp(-d/d₂) 用于数据拟合分析。    （4）
    此处，F0（基线）、A1 和 A2（振幅）以及 d1 和 d2（衰减常数）为拟合参数。确保两种方法得到的力值以及由此得出的双指数拟合结果基本一致（图 2F,G）。
    注：为确认力校准操作正确，可通过绘制延伸长度与测量力的关系图来验证所探测复合物的力-延伸关系。
  10. 为校正因磁珠随力倾斜导致的磁珠高度偏移 zoff30,31，需根据横向偏移 xoff 并考虑具有磁珠半径的非中心系链的几何形状，使用方程（5）估算 zoff，并将该值应用于测得的延伸值。此步骤已在 MATLAB 脚本 "force calibration.m" 中实现（第 252-254 行）。
    静态平衡公式，\(z_{off}(F)=R(1-\sqrt{1-(x_{off}(F)/R)^2})\)，物理方程。    （5）
    注：尽管此校正对延伸长度的影响较小，特别是对于旋转半径较小（<200 nm）的磁珠，但此偏移常对弹性响应产生关键影响，如从图 2H到图 2I的变化所示30,31。
  11. 使用方程（6）将可延伸 WLC 模型拟合到数据，以检查持久长度 Lp。
    用于分子力分析的静态平衡方程，显示详细的公式组成部分。    （6）
    此处，L0 为轮廓长度（5 kbp 对应 1.7 µm），K0 为焓拉伸模量。
    注：尽管在典型缓冲液（如磷酸盐缓冲盐水，PBS）中，双链 DNA 的 Lp 被广泛接受为 40-50 nm，但应用于短分子（<5 kbp）的 WLC 公式会随着 L0 的减小而系统性地低估 Lp31,40。这是因为经典 WLC 模型假设聚合物的链长远大于其持久长度。此处，我们对 5 kbp 复合物得到 Lp = 40 ± 3 nm（图 2H），延伸校正进一步得到均匀的 K0 值 1,100 ± 200 pN（图 2I）。应用有限 WLC 模型31,40以及对延伸分布非高斯性的校正41，将使 Lp 略有增加。
  12. 一旦力校准得到验证，将所得双指数模型的拟合参数应用于提供的 LabVIEW 软件（补充文件 2），并等待软件根据电机读数（即磁铁位置）实时计算当前力。由于反函数 d(F) 的解析表达式不可用，需通过数值估算目标力水平 d 来准备以 0.1 pN 为步长的 d 与 F 的查找表。将此表也存储在软件中，以便进行力控制指令。

3. DNA 发夹结构的合成

注意：用于磁镊实验的DNA发夹结构是通过PCR扩增λ-DNA中一段510 bp区域，并使用两个定制引物制备而成，其中一个引物在其5′端含有一个发夹结构（图3A）。通过这种方式，发夹基序被置于PCR产物的一端。

  1. 制备引物。
    1. 正向引物：引物 B_hp，其 5′ 端带有生物素标记用于玻璃表面附着，并与 λ-DNA 结合。该引物在 λ 结合区域上游含有一个发夹基序，具有 8 bp 的茎和 6 nt 的环。
    2. 反向引物：引物 Z_hp，其 5′ 端带有叠氮化物标记用于磁珠附着，并在距离正向引物 1 kbp 处与 λ-DNA 结合。
  2. 使用 λ-DNA（模板）、nTaq 聚合酶和标准 PCR 条件（参见表 1）建立并运行 PCR。使用商业纯化试剂盒纯化产物。
  3. 通过 260 nm 处的紫外吸收（A260）测量 DNA 浓度，并进行琼脂糖凝胶电泳（2% 凝胶）（参见表 2）以验证产物大小。典型产量约为 35 µL 浓度约 600 nM 的溶液。

4. SNARE 蛋白的制备

注：神经元 SNARE 复合物通过组合三种从 E. coli 中表达的纯化大鼠蛋白来组装：VAMP2/突触小泡蛋白-2、Syntaxin-1A 和 SNAP-25 (图 3B)。为促进其组装，Syntaxin 和 SNAP-25 与一个 VAMP2 片段（缺少 N 端区域；称为“ΔN-VAMP2”）共表达，形成称为“ΔN-复合物”的结构，然后在 DNA 手柄附着后与全长 VAMP2 混合，形成完整复合物。

  1. 制备含有 SNARE 蛋白表达 cDNA 的质粒（所有质粒的 DNA 序列见材料表）。
    1. 制备克隆至 pET28a 载体中的、缺乏跨膜结构域（2-97；L32C/I97C 用于二硫键连接）的 6×His 标签化 VAMP2。
    2. 制备克隆至 pETDuet-1 载体中的、缺乏 Habc 结构域和跨膜结构域（191-267，I202C/I266C 取代用于二硫键连接）的 syntaxin-1A 与 6×His 标签化 ΔN-VAMP2（49-96）。
    3. 制备克隆至 pET28a 载体中的、全长 SNAP-25 亚型 b（2-206，所有 C 突变为 A）。这将用于制备 ΔN 复合物。
    4. 制备克隆至 pET28a 载体中的、用于直接加入 MT 测定缓冲液以在解折叠后重新组装 SNARE 复合物的 6×His 标签化全长 SNAP-25 亚型 b（1-206，所有 C 突变为 A）。
  2. 准备两管 Rosetta (DE3) E. coli 细胞。将一组用 VAMP2 质粒（来自步骤 4.1.1）转化，一组用 syntaxin-1A/ΔN-VAMP2 和未标记的 SNAP-25 质粒（来自步骤 4.1.2 和 4.1.3）转化以表达 ΔN 复合物，另一组用 His 标签化 SNAP-25 质粒（来自步骤 4.1.4）转化。
  3. 将转化后的细胞转移至含有适当抗生素的 Luria-Bertani 肉汤（LB）中（此处，VAMP2 和 His 标签化 SNAP-25 使用卡那霉素和氯霉素；ΔN 复合物使用卡那霉素、氯霉素和氨苄青霉素）。在 37 °C 的摇床培养箱（220 rpm）中培养，直至肉汤的光密度（OD）达到 0.7-0.9。
  4. 加入 1 mM 异丙基-β-d-硫代半乳糖苷（IPTG）诱导蛋白表达，并在 37 °C 的摇床培养箱（220 rpm）中孵育细胞 3-4 小时。
  5. 将培养物在 4 °C 下以 4,500 × g 离心 15 分钟，使细胞沉淀。
  6. 准备用于蛋白质纯化的缓冲液（见表 2）。
  7. 将表达 SNARE 的细胞沉淀重悬于 40 mL 冰预冷的裂解缓冲液中，并在冰上通过超声破碎细胞（振幅 15%，超声 5 秒，间隔 5 秒，总计 30 分钟）。
  8. 将裂解液在 4 °C 下以 15,000 × g 离心 30 分钟，去除不溶性物质。
  9. 将上清液过填充有 1 mL Ni-NTA 树脂的重力柱。用洗涤缓冲液 A 洗涤树脂，然后用洗涤缓冲液 B 洗涤，最后用 10 mL 洗脱缓冲液洗脱蛋白质。
  10. 使用脱盐柱（遵循制造商说明）从洗脱液中去除三(2-羧乙基)膦（TCEP）和咪唑。用 PBS 洗脱样品。
  11. 使用离心过滤管（10 kDa 截留分子量）将蛋白质浓缩至约 70 µM，同时保持蛋白质在 PBS 中（通常产量为 2 mL）。通过 280 nm 处的紫外（UV）吸收（A280）或 Bradford 法测定蛋白质浓度。
  12. 制备小份分装，液氮速冻，并储存于 -80 °C 直至使用。
    ​注：完整的 SNARE 复合物将在 ΔN 复合物与 DNA 手柄偶联后组装（见下文）。

5. DNA 手柄的附着

注意：首先通过 PCR 制备两条 510 bp 的双链 DNA 手柄，其一端带有伯胺基团，随后使用双功能交联剂 SM(PEG) 将这些胺基团转化为马来酰亚胺基团。2随后，两个手柄通过共价键与SNARE复合物连接。 通过 其半胱氨酸基团可用于位点特异性偶联图 3B).

  1. 制备引物。
    1. 制备正向引物：引物 B（用于扩增手柄 B），其 5′ 端带有生物素标记，用于玻璃表面附着，并与 λ-DNA 结合；引物 Z（用于扩增手柄 Z），其 5′ 端带有叠氮化物标记，用于磁珠附着，其序列与引物 B 相同。
    2. 制备反向引物：引物 N（手柄 B 和手柄 Z 共用），其 5′ 端带有胺基标记，用于蛋白质偶联，并与 λ-DNA 结合，距离正向引物 510 bp。
  2. 设置并运行两组 PCR 反应（每个手柄 18 管，每管 200 µL 反应体系），使用 λ-DNA（模板）、nTaq 聚合酶和标准 PCR 条件（参见表 1）。使用 PCR 纯化试剂盒纯化产物，并用 45 µL 超纯水洗脱每个手柄。使用最小体积的水以获得高浓度的手柄，确保后续步骤反应有效。
  3. 通过 A260 测量 DNA 浓度。每个手柄的典型产量约为 650 µL 浓度约 2 µM 的溶液。留出少量样品用于后续琼脂糖凝胶电泳验证。
  4. 将每个手柄（在 PBS 中浓度为 1 µM）与 5 mM SM(PEG)2 反应。室温下温和旋转孵育。1 小时后，使用 DNA 纯化试剂盒去除未反应的 SM(PEG)2。用 250 µL PBS 洗脱每个手柄，获得浓度约 2 µM 的溶液。
  5. 将手柄 B 溶液与 ΔN 复合物溶液在 PBS 中按 1:16 的摩尔比混合（例如，1 µM 手柄 B 和 16 µM ΔN 复合物），室温下振荡孵育 2 小时。留出少量样品用于琼脂糖凝胶电泳。
  6. 加入 VAMP2 溶液，其摩尔数超过上一步所用 ΔN 复合物的 2.5 倍。将混合物在室温下继续振荡孵育 1 小时。完整的 SNARE 复合物在此步骤中组装。
  7. 使用新鲜 PBS 和离心过滤装置（100 kDa 截留分子量）通过缓冲液置换去除游离蛋白质：4 °C 下 14,000 × g 离心 5 分钟，重复至少 6 次，最后一次离心 15 分钟。监测 A260/A280 比值的增加以追踪游离蛋白质的去除情况。留出少量样品用于琼脂糖凝胶电泳。
  8. 向溶液中加入手柄 Z，其摩尔数超过手柄 B 的 15 倍。保持手柄 Z 的浓度至少高于 1 µM 以促进反应。将混合物在 4 °C 下振荡孵育过夜。
  9. 通过琼脂糖凝胶电泳验证中间产物（手柄 B 及其蛋白质偶联物）和最终产物（带有两个手柄的 SNARE 复合物）（图 3B，插图）（参见表 2）。
    注：如果蛋白质成功连接到手柄 B，将检测到迁移率变化。特别是，与 ΔN 复合物不同，在 DNA 手柄上形成的完整 SNARE 复合物对十二烷基硫酸钠 (SDS) 具有抗性，而 ΔN 复合物在 SDS 中会解离，仅留下 syntaxin 与 DNA 结合（比较图 3B 中的 b 和 c）。
  10. 制备小份等分试样，液氮速冻，并储存于 -80 °C 直至使用。
    ​注：虽然最终溶液中含有未反应的手柄，但在流动池中进行样品组装时，只会选择所需的、同时带有生物素和叠氮化物标记的构建体。

6. 流通池的制备

注意：用于微管测量的流动池由两片玻璃盖玻片构成，通过双面胶带粘合在一起。图 3C将一片盖玻片涂覆聚乙二醇（PEG）与生物素化聚乙二醇（PEG）的混合物，以避免非特异性结合，并实现目标分子的特异性固定。 通过 生物素-中性亲和素连接图 3D）。随后，使用注射泵将用于微管实验的材料溶液依次注入流动池。图 3CD).

  1. 准备两片盖玻片，分别用于顶部（24 mm × 50 mm，1.5号厚度）和底部（24 mm × 60 mm，1.5号厚度）表面。将盖玻片置于 1 M KOH 中超声清洗 30 分钟。超声清洗后，用蒸馏水冲洗盖玻片并保持浸于水中直至下一步。
  2. 根据已发表的方案42,43对底部盖玻片进行聚乙二醇化处理。使用 N-[3-(三甲氧基甲硅烷基)丙基]乙二胺进行硅烷化，并使用 100 mM 碳酸氢盐缓冲液中的生物素-PEG-SVA 与 mPEG-SVA 按 1:100 (w/w) 比例混合的混合物。将聚乙二醇化盖玻片在 -20 °C 下干燥保存数周。
  3. 在实验当天，取出聚乙二醇化盖玻片并用氮气枪吹干。目视检查是否有污物，确保其清洁。
  4. 为制作样品通道，准备约 2 mm 宽的双面胶条，在底部盖玻片（聚乙二醇化表面朝上）上平行放置四条胶条，彼此间隔约 5 mm（图 3C）。
    注：通过这种方式，可以在单个流通池中创建三个 5 mm 宽的样品通道。
  5. 将顶部盖玻片放置在底部盖玻片中心，在短边留出约 5 mm 空间用于通道入口和出口。用镊子轻轻按压顶部盖玻片背面，以牢固密封通道。
  6. 为制作入口储液池，修剪一个 200 µL 移液器吸头尖端。从较宽开口端切下约 10 mm，使其能容纳约 200 µL 溶液。为三个流通通道制作三个这样的储液池。为配置出口，准备三个与注射泵管路匹配的注射器针头。
  7. 使用 5 分钟环氧树脂胶，将储液池和针头座粘接到流通池上。确保形成完全密封以防泄漏，并确保通道未被过量胶水堵塞。让其干燥至少 30 分钟。

7. 磁珠-系绳复合物的组装

注意：用于微管实验的材料溶液，包括用于微珠-系绳构建体的溶液，均使用注射泵依次引入流通池（图 3C、D）。

  1. 制备磁珠。从储备液（约 3.3 × 108 颗磁珠于 167.5 µL 二甲基甲酰胺中）中取出 5 mg M270-环氧磁珠，通过磁力分离，用磷酸盐缓冲液（参见表 2）置换溶剂。
  2. 在含 1 M 硫酸铵的磷酸盐缓冲液中制备浓度约为 1.1 × 109 颗磁珠 mL−1 的磁珠悬液，并与 2 mM 二苯并环辛炔 (DBCO)-NH2 反应。将混合物在室温下于旋转混合器上孵育 3 小时。反应后，用新鲜磷酸盐缓冲液洗涤磁珠 3 次以去除未反应的分子。
    注：洗涤后的磁珠可在 4 °C 下静置保存数周，无需额外旋转。
  3. 用聚乙烯管将针头连接到流动池通道出口，并与注射泵相连。用 PBS 平衡通道。
  4. 通过泵吸依次将以下溶液引入通道：NeutrAvidin、目标构建体（DNA 发夹或带有 DNA 手柄的 SNARE 复合物）、参考聚苯乙烯微球和 DBCO 包被的磁珠。使用前，充分涡旋磁珠溶液以分散潜在的磁珠聚集体。
  5. 在施加 0.1 pN 力的同时，洗去未结合的磁珠。
    注：施加一个小的向上力有助于去除未结合的磁珠，并有助于避免特异性结合的磁珠-系绳构建体发生断裂。
  6. 对于涉及 SNARE 复合物的实验，在最终缓冲液中加入 1.5 µM SNAP-25。
    ​注：游离的 SNAP-25 分子可在复合物解折叠后重新结合 SNARE 复合物，从而允许对单个复合物进行重复测量。

8. 目标构建体的鉴定

  1. 在流动池通道表面，寻找被目标构建体单分子拴系的磁珠。确保附近存在一个参考珠。
  2. 旋转一个候选珠，检查其是否能自由旋转。如果该珠被多个分子拴系，其运动会表现出受限状态。
  3. 将磁珠旋转数整圈，找出旋转半径（此功能已在提供的软件中实现）。最好选择旋转半径较小的磁珠。
    注意：此半径表明磁珠偏离拴系轴线的程度，这是在磁珠-拴系组装过程中随机决定的30,31。在所有实验中，磁珠的最小化偏心可以减轻因我们使用的高磁珠半径与拴系延伸长度比而产生的许多伪影。
  4. 将力从 0 pN 增加到 5 pN，以识别良好的单拴系磁珠。观察由于 1 kbp 拴系（或等效的两个 510 bp 手柄）拉伸导致的磁珠衍射图案的显著变化。如果衍射图案没有显著变化，则将力降至零并扫描另一个候选磁珠。
    ​注意：无需实际启动追踪过程，即可从原始图像中轻易注意到磁珠约 300 nm 的抬升。

9. 用于延伸测量的磁珠追踪

注意：微珠追踪是通过在本文提供的 LabVIEW 软件中实时分析微珠图像来进行的。该追踪方法及其变体已在大多数传统磁镊系统中使用，并在先前文献中有所阐述2,5,7,26。通过测量磁性微珠相对于固定参考微珠的位置（即差分追踪），位置测量对外部扰动变得极为稳健。

  1. 一旦定位到合适的磁珠及参照珠，点击校准按钮开始准备磁珠追踪。
  2. 点击图像中的磁珠以定义其位置。随后图像将被裁剪为围绕磁珠的感兴趣区域（例如，对于3 µm磁珠使用150 x 150像素），并进一步分析以提取精确的磁珠坐标。
  3. 等待磁体旋转完成。此过程记录磁珠的x和y坐标（通过计算磁珠图像的二维互相关44或利用其径向对称性45，两者性能相当），同时旋转磁体以记录磁珠的偏心附着情况31。
  4. 对于z方向的追踪，等待软件生成磁珠在不同焦平面距离下的衍射图像查找表。此过程通过压电扫描器以等距步进移动物镜，并在每个位置记录经波动平均的磁珠图像来完成。随后，通过将实时磁珠图像与插值后的查找表进行比较，确定实际实验中磁珠的z坐标7。
  5. 查找表生成完成后，启用追踪和自动聚焦功能（按下追踪？和自动聚焦？按钮），并点击采集按钮开始记录磁珠位置。
    ​注意：自动聚焦为可选功能，但建议启用以校正采集过程中载物台在z方向的漂移。

10. 施力方案

  1. 力斜坡实验： 为验证构建体的力-延伸关系，以恒定加载速率（± 1.0 pN s−1）施加一个先升后降的力斜坡（图 4A）。例如，施加三个 0-20-0 pN 的循环，以验证构建体的总长度及手柄的力-延伸曲线。
  2. 通过在软件中指定系绳参数，将一条蠕虫状链力-延伸曲线叠加在测量数据之上，并判断目标微球是否由具有正确 DNA 手柄的真实样品构建体所系连。使用构建体已知的轮廓长度（例如，1 kbp 双链 DNA 约为 340 nm）和蠕虫状链持续长度（短双链 DNA 为 30-45 nm31）作为起始点。必要时，应用步骤 2.11 中描述的延伸校正方法。
  3. 若构建体验证无误，则详细检查力-延伸响应，以寻找由目标分子（发夹或 SNARE 复合物）引起的额外延伸。
  4. 恒力实验： 以离散步长逐渐改变所施加的力，以探测目标分子的力敏感性（图 4B）。
    注：磁镊可实现简单有效的恒力实验，因为当磁体保持静止时，所施加的力维持恒定。
    1. 对于 DNA 发夹，施加 4-8 pN 的力，步长为 0.2-0.5 pN，并在每个力水平下测量微球位置约 10 秒。
    2. 对于 SNARE 复合物，施加 14-16 pN 的力，步长为 0.1-0.2 pN，并在每个力水平下测量微球位置约 10 秒。
  5. 力跃变实验： 观察 SNARE 复合物的转变事件。
    注：力跃变实验与恒力实验类似，都涉及力水平的改变。然而，力跃变采用更突然的施加力变化，从而能够监测被探测分子中由力触发的事件，例如蛋白质复合物的突然断裂。例如，由于 SNARE 复合物在力循环中表现出结构滞后性23，进行力跃变实验并测量转变延迟时间具有参考价值（图 4C）。
    1. 解链： 从完整的三元 SNARE 复合物上剥离一个 VAMP2 分子，留下 syntaxin-1A 和 SNAP-25 的二元复合物。
    2. 再链合： 已解链的 VAMP2 分子重新链合，再生出完整的 SNARE 复合物。
      1. 去折叠： SNARE 复合物的完全解组装，伴随 SNAP-25 的完全解离。去折叠后，构建体中仅剩 VAMP2 和 syntaxin 分子。
      2. 重折叠： 游离的 SNAP-25 分子从缓冲液中结合后，SNARE 复合物的再生。
  6. 在 2 pN 下，通过等待（约 30 秒）游离的 SNAP25 分子结合，诱导完整 SNARE 复合物的组装。SNARE 复合物形成时，会观察到延伸的突然减小。
  7. 为观察解链事件，先在 10-12 pN 下等待几秒钟，然后以尽可能最大的电机速度突然移至 14-15 pN。根据目标力的不同，SNARE 复合物将表现出部分解链中间态之间的可逆转变（如在恒力实验中），或在随机的等待时间（或延迟）后发生约 25 nm 的跳跃，进入更高的解链状态。
  8. 为观察再链合事件，在观察到解链后立即将力降至 10-12 pN。同样，SNARE 复合物在经历一段随机的延迟后，会随机转变至较低的链合状态。如果解链后发生了去折叠，则复合物将无法再链合，因为会缺少一个 SNAP-25 分子。
  9. 为观察去折叠事件，在观察到解链后等待更长时间，以检测延伸的进一步增加（约 2 nm）。

11. 数据分析

注意：可对 MT 数据进行的分析类型取决于目标系统。然而，从图 4所述的相应实验中提取有用信息存在一些通用方法。所有分析均使用 MATLAB (R2021a) 并配合本文提供的自定义代码进行。这些代码使用本文中呈现的相同数据生成图表。请注意，虽然 100 Hz 跟踪的原始数据被直接用于分析，但 1.2 kHz 跟踪的数据通常在分析前进行了中值滤波（使用五点滑动窗口）以降低噪声（噪声分析除外）。

  1. 力斜坡实验：分析力-延伸关系（例如聚合物的弹性），并通过力的转变来提取纳米力学性质的信息。
  2. 恒力实验：分析状态布居数和驻留时间（或转变速率）随力的变化，以提取构象变化的结构（例如参与转变的区域）、热力学（例如自由能差）和动力学（例如能垒）参数。
  3. 力跃变实验：分析断裂动力学（例如蛋白质-蛋白质相互作用和受体-配体结合）或瞬态中间体的寿命（例如生物分子的去折叠），以提取目标分子及其状态的稳定性。
  4. 作为代表性应用，分析DNA发夹和SNARE复合物的样本数据：
    1. DNA发夹的双态转变：解链力、打开距离、布居数偏移的力依赖性，以及使用隐马尔可夫模型（HMM）进行状态分配和转变速率测量（提供MATLAB代码）。
    2. SNARE复合物的构象变化：解链力、中间态的力依赖性和解链延迟、再退火过程中的滞后现象，以及去折叠/重折叠行为。
      注：DNA手柄、DNA发夹和SNARE复合物构象的力-延伸模型已在先前参考文献14,31中给出。

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结果

力的校准
两种力测量方法（磁珠的横向位移方差和功率谱分析）的结果差异为 0–2 pN（图 2G）。根据图 2F中的结果，使用常规钕磁铁可稳定达到高达 30 pN 的力。

8 bp DNA 发夹结构的两态转变
我们首先研究了一种短DNA发夹结构的纳米力学特性（图5）。DNA发夹结构已被传统单分子力谱技术广泛表征，因此可参考的文献资料极为丰富。短发夹的解链过程通常是可逆的，因此其重新折叠事件也在与解链相同的力范围内被观察到（图5A）。通过施加从0 pN到20 pN的力斜坡（图5B），验证了该发夹结构在受力作用下的伸长行为符合WLC模型，该模型完全归因于DNA手柄的弹性（

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讨论

在本研究中，我们介绍了一种单分子力谱装置，可高时空精度地观测生物大分子的结构变化。所采用的高速CMOS相机每秒可采集1,200帧图像。−1 分辨率为1280 × 1024，可实现1.2 kHz的微珠追踪。然而，目前测量速度受限于微珠追踪软件，因此在高速测量中通常将感兴趣区域（ROI）缩小至更小范围。SLD的高输出功率提供了明亮的照明，这对于达到数千赫兹带宽的快速微珠成像至关重要。此外，光束的空间相干性在微珠周围产生高对比度的同心衍射环图1A（插图），可通过其对称性精确定位微珠位置。

可通过测量拴系微珠的布朗波动来确定作用在微珠-拴系结构上的磁力35,37,38。由于实时力分析计算量较大，通常使用参考结构预先测量所施加的力。例如，将待用的磁性微珠通过长（>5 kbp）双链DNA片段进行拴系，并测量微珠位置的热波动随磁铁...

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披露

作者声明无利益冲突。

致谢

本工作由韩国国家研究基金会（NRF）资助，资助资金来自韩国政府（MSIT）（NRF-2022R1C1C1012176、NRF-2021R1A4A1031754 和 NRF-2021R1A6A1A10042944）。S.-H.R. 获得了NRF基金（2021R1C1C2009717）的支持。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
构建合成所需材料
琼脂糖凝胶电泳系统进展Mupid-2plus
DNA 标准分子量标记BioneerD-1037
nTaq 聚合酶EnzynomicsP050A
PCR 纯化试剂盒LaboPassCMR0112
PEG化SMCC交联剂 / SM(PEG)2ThermoFisher Scientific22102对于SNARE–DNA 连接
引物BBioneer5'-生物素/TCGCCACCATCATTTCCA-3'用于5-kbp力学校准结构和DNA手柄
引物 B_hpIDT5'-生物素/TTTTTTTTTTGTTCTCTATTT
TTTTAGAGAAC /AP位点/ /AP位点/ TCGCCACCATCATTTCCA-3'		用于发夹结构构建
引物 NBioneer5'-C6氨基/CATGTGGGTGACGCGAAA-3'用于DNA接头
引物ZBioneer5'-叠氮基/TCGCCACCATCATTTCCA-3'用于DNA接头
引物 Z_5kBioneer5'-叠氮基/TTAGAGAGTATGGGTATATGACA
TCG-3'		用于5-kbp力学校准的构建体
引物 Z_hpBioneer5'-叠氮基/GTGGCAGCATGACACC-3'用于发夹结构构建
SYBR Safe DNA凝胶染料ThermoFisher ScientificS33102
λDNABioneerD-2510PCR用的模板链
SNARE蛋白的DNA序列
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6×His标签蛋白 ΔN-VAMP2 (49–96；大写）和突触融合蛋白-1A（191–267，I202C/I266C；大写）在 pETDuet-1 中自制的gggaattgtgagcggataacaattcccctc
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GGACGCAGACATGCGCAATG
AGCTGGAGGAGATGCAGAGG
AGGGCTGACCAGCTGGCTGA
TGAGTCCCTGGAAAGCACCC
GTCGCATGCTGCAGCTGGTT
GAAGAGAGTAAAGATGCTGG
CATCAGGACTTTGGTTATGTT
GGATGAGCAAGGCGAACAAC
TGGAACGCATTGAGGAAGGG
ATGGACCAAATCAATAAGGAC
ATGAAAGAAGCAGAAAAGAAT
TTGACGGACCTAGGAAAATTC
GCCGGCCTTGCCGTGGCCCC
CGCCAACAAGCTTAAATCCAG
TGATGCTTACAAAAAAGCCTG
GGGCAATAATCAGGATGGAGT
AGTGGCCAGCCAGCCTGCCC
GTGTGGTGGATGAACGGGAG
CAGATGGCCATCAGTGGTGGC
TTCATCCGCAGGGTAACAAAT
GATGCCCGGGAAAATGAGATG
GATGAGAACCTGGAGCAGGT
GAGCGGCATCATCGGAAACCT
CCGCCACATGGCTCTAGACAT
GGGCAATGAGATTGACACCCA
GAATCGCCAGATCGACAGGAT
CATGGAGAAGGCTGATTCCAA
CAAAACCAGAATTGATGAAGC
CAACCAACGTGCAACAAAGAT
GCTGGGAAGTGGTTAA
ctcgagcaccaccaccaccaccactgag
atccggctgctaacaaagcccgaaagga
agctgagttggctgctgccaccgctgagc
aataactagcataaccccttggggcctc
taaacgggtcttgaggggttttttgctgaa
aggaggaactatatccggat
蛋白质纯化材料
2-巯基乙醇SIGMAM3148-25ML
琼脂LPS 溶液AGA500
氨苄青霉素钠盐请提供需要翻译的源文本内容。AC1043-005-00
氯霉素请提供需要翻译的源文本内容。CR1023-050-00
感受态细胞（E. coli)Novagen70956Rosetta(DE3)pLysS
甘油SIGMAG5516-500ML
HEPESSIGMAH4034-100G
盐酸 / HClSIGMA320331-500ML
咪唑SIGMAI2399-100G
异丙基 β异丙基-β-D-硫代半乳糖吡喃糖苷 / IPTGSIGMA10724815001
硫酸卡那霉素请提供需要翻译的源文本内容。KC1001-005-02
Luria-Bertani (LB) 培养基LPS 溶液LB-05
Ni-NTA树脂Qiagen30210
PD MiniTrap G-25（脱盐柱）CytivaGE28-9180-07有关说明，请参见：https://www.cytivalifesciences.com/en/us/shop/chromatography/prepacked-columns/desalting-and-buffer-exchange/pd-minitrap-desalting-columns-with-sephadex-g-25-resin-p-06174
苯甲基磺酰氟 / PMSFThermoFisher Scientific36978
SNARE蛋白的质粒克隆于本实验室N/A应要求提供
蛋白酶抑制剂混合物genDEPOTP3100
氯化钠SIGMAS5886-500G
磷酸氢二钠 / Na2HPO4SIGMAS7907-100G
磷酸二氢钠 / NaH2PO4SIGMAS3139-250G
Tris(2-羧乙基)膦 / TCEPSIGMAC4706-2G
Trizma碱SIGMAT1503-250G
样品组装材料
生物素-PEG-SVALAYSAN BIOBIO-PEG-SVA-5K-100MG & MPEG-SVA-5K-1g用于 PEG 化
二苯并环辛炔-胺 / DBCO-NH2SIGMA761540-10MG用于微珠包被
双面胶带3M136用于流动池组装
环氧胶DEVCONS-208用于流动池组装
用于底面的玻璃盖玻片VWR48393-251矩形，60×24 mm，#1.5
用于顶面的玻璃盖玻片VWR48393-241矩形，50×24 mm，#1.5
磁珠ThermoFisher Scientific14301Dynabeads M-270 Epoxy 2.8 μm
mPEG-SVALAYSAN BIOmPEG-SVA 1g用于 PEG 化
N,N-二甲基甲酰胺 / DMFSIGMAD4551-250ML用于珠子包被
N-[3-(三甲氧基硅基)丙基]乙二胺SIGMA104884-100ML用于 PEG 化
NeutravidinThermoFisher Scientific31000用于样品连接
磷酸盐缓冲液 / PBS，pH 7.2请提供需要翻译的源文本内容。PR2007-100-00
塑料注射器Norm-jectA55 ml，鲁尔接头尖端
聚乙烯管SCIBB31695-PE/4PE-60
参照微珠SPHEROTECHSVP-30-5链霉亲和素包被的聚苯乙烯微粒；3.0-3.4 µm
注射器针头Kovax21G-1 1/4''21 G
注射泵KD SCIENTIFIC788210
磁力镊仪器设备
一轴电动微位移台PIM-126.PD1用于磁铁的垂直定位
2轴手动平移台ST1LEE400磁体与光轴对准的步骤
磁铁用丙烯酸支架DaiKwang Precision定制订单索取即可提供示意图
图像采集卡有源硅AS-FBD-4XCXP6-2PE8
高速CMOS相机MikrotronEoSens 3CXP
倒置显微镜OlympusIX73P2F-1-2
钕磁铁LG 磁铁ND 10x10x12t尺寸：10 mm × 10 mm × 12 mm；需要两个
物镜OlympusUPLXAPO100XO油浸，数值孔径 1.45
物镜纳米定位器Mad City LabsNano-F100S
旋转步进电机AUTONICSA3K-S545W用于旋转磁体
超辐射发光二极管QPHOTONICSQSDM-680-2680 nm
软件
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MATLABMathWorksv2021a

参考文献

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