本文介绍了一种高速磁镊装置，可在最高达 1.2 kHz 的采样速率下对受力敏感的生物分子进行纳米力学测量。我们以 DNA 发夹结构和 SNARE 复合物作为模型体系展示了该装置的应用，但该系统也可适用于研究其他参与力学生物学过程的分子。
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本文内容
摘要
摘要
单分子磁镊（MTs）作为一种强大的工具，可通过施加外力来研究生物大分子（如核酸和蛋白质），因此在力学生物学领域具有广阔的应用前景。由于该方法通常依赖基于图像的磁珠追踪技术，图像记录与分析的速度限制以及磁珠的热涨落长期以来制约了其在观测靶分子微小且快速的结构变化中的应用。本文详细描述了高分辨率磁镊装置的构建与操作方法，该系统能够解析生物大分子及其复合物在纳米尺度、毫秒级时间分辨率下的动态行为。作为应用实例，本文展示了DNA发夹结构和SNARE复合物（介导膜融合的分子机器）的实验，重点说明如何在皮牛顿量级的外力条件下检测其瞬时状态及状态间的转换。我们预期，高速磁镊技术将继续推动对细胞内感知、传递和产生力学信号的分子进行高精度的纳米力学测量，从而加深我们在分子水平上对力学生物学的理解。
引言
细胞能够主动感知并响应机械刺激。在此过程中，许多生物分子表现出依赖于力的特性，从而实现动态的结构变化。典型的例子包括机械敏感性离子通道和细胞骨架元件，它们为细胞提供来自周围环境的关键力学信息。
此外，在更广泛的意义上，那些表现出独特受力特性的分子也可被视为力敏性分子。例如，核酸双链的局部形成与解链，以及G-四链体等高级结构，在复制、转录、重组以及近年来的基因组编辑中发挥着关键作用。此外，一些参与突触通讯的神经元蛋白通过产生超过典型分子间相互作用水平的物理力来执行其功能。无论研究哪一类实例，以高时空精度研究相关生物分子的纳米力学特性，对于揭示相应力学生物学过程的分子机制都具有重要意义1,2,3。
单分子力谱方法已被用作研究生物大分子力学性质的有力工具2,4,5,6它们可以在施加力的同时监测核酸和蛋白质的结构变化，从而研究力依赖性特性。两种广为人知的装置是光镊和磁镊（MTs），二者均利用....
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方案
本方案中描述的所有材料和设备均列于材料表中。用于操作下述高速磁镊装置的 LabVIEW 软件，以及用于分析样本数据的 MATLAB 脚本，均已存放于 GitHub (https://github.com/ShonLab/Magnetic-Tweezers) 并公开可用。
1. 装置构建
注：高速微管构建的基本原理与标准常规微管系统相似，不同之处在于使用了高速互补金属氧化物半导体（CMOS）相机和高功率相干光源（图 1）。关于标准微管仪器的更多描述，请参阅其他文献5,26,27。
- 在防振光学平台上搭建一台倒置显微镜。安装一台高速CMOS相机和一个帧捕获器。
- 构建一个用于三维操控磁体的平移台。将一个电动线性平移台（行程>20 mm）垂直安装在一个手动XY平移台顶部。
注：垂直运动控制力，而XY平移台用于在初始搭建装置时手动将磁体对准光轴。 - 安装一个旋转步进电机以及一套用于旋转磁体的皮带和滑轮系统。
注：皮带在相距几厘米的电机轴和磁体....
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结果
力的校准
两种力测量方法（磁珠的横向位移方差和功率谱分析）的结果差异为 0–2 pN（图 2G）。根据图 2F中的结果，使用常规钕磁铁可稳定达到高达 30 pN 的力。
8 bp DNA 发夹结构的两态转变
我们首先研究了一种短DNA发夹结构的纳米力学特性（图5）。DNA发夹结构已被传统单分子力谱技术广泛表征，因此可参考的文献资料极为丰富。短发夹的解链过程通常是可逆的，因此其重新折叠事件也在与解链相同的力范围内被观察到（图5A）。通过施加从0 pN到20 pN的力斜坡（图5B），验证了该发夹结构在受力作用下的伸长行为符合WLC模型，该模型完全归因于DNA手柄的弹性（
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讨论
在本研究中，我们介绍了一种单分子力谱装置，可高时空精度地观测生物大分子的结构变化。所采用的高速CMOS相机每秒可采集1,200帧图像。−1 分辨率为1280 × 1024，可实现1.2 kHz的微珠追踪。然而，目前测量速度受限于微珠追踪软件，因此在高速测量中通常将感兴趣区域（ROI）缩小至更小范围。SLD的高输出功率提供了明亮的照明，这对于达到数千赫兹带宽的快速微珠成像至关重要。此外，光束的空间相干性在微珠周围产生高对比度的同心衍射环图1A（插图），可通过其对称性精确定位微珠位置。
可通过测量拴系微珠的布朗波动来确定作用在微珠-拴系结构上的磁力35,37,38。由于实时力分析计算量较大，通常使用参考结构预先测量所施加的力。例如，将待用的磁性微珠通过长（>5 kbp）双链DNA片段进行拴系，并测量微珠位置的热波动随磁铁.......
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披露
作者声明无利益冲突。
致谢
本工作由韩国国家研究基金会（NRF）资助，资助资金来自韩国政府（MSIT）（NRF-2022R1C1C1012176、NRF-2021R1A4A1031754 和 NRF-2021R1A6A1A10042944）。S.-H.R. 获得了NRF基金（2021R1C1C2009717）的支持。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 构建合成所需材料 | |||
| 琼脂糖凝胶电泳系统 | 进展 | Mupid-2plus | |
| DNA 标准分子量标记 | Bioneer | D-1037 | |
| nTaq 聚合酶 | Enzynomics | P050A | |
| PCR 纯化试剂盒 | LaboPass | CMR0112 | |
| PEG化SMCC交联剂 / SM(PEG)2 | ThermoFisher Scientific | 22102 | 对于SNARE–DNA 连接 |
| 引物B | Bioneer | 5'-生物素/TCGCCACCATCATTTCCA-3' | 用于5-kbp力学校准结构和DNA手柄 |
| 引物 B_hp | IDT | 5'-生物素/TTTTTTTTTTGTTCTCTATTT TTTTAGAGAAC /AP位点/ /AP位点/ TCGCCACCATCATTTCCA-3' | 用于发夹结构构建 |
| 引物 N | Bioneer | 5'-C6氨基/CATGTGGGTGACGCGAAA-3' | 用于DNA接头 |
| 引物Z | Bioneer | 5'-叠氮基/TCGCCACCATCATTTCCA-3' | 用于DNA接头 |
| 引物 Z_5k | Bioneer | 5'-叠氮基/TTAGAGAGTATGGGTATATGACA TCG-3' | 用于5-kbp力学校准的构建体 |
| 引物 Z_hp | Bioneer | 5'-叠氮基/GTGGCAGCATGACACC-3' | 用于发夹结构构建 |
| SYBR Safe DNA凝胶染料 | ThermoFisher Scientific | S33102 | |
| λDNA | Bioneer | D-2510 | PCR用的模板链 |
| SNARE蛋白的DNA序列 | |||
| 6×pET28a 载体中的 His 标签 SNAP-25b（2-206；大写） | 自制的 | tggcgaatgggacgcgccctgtagcggcgca ttaagcgcggcgggtgtggtggttacgcgca gcgtgaccgctacacttgccagcgccctagc gcccgctcctttcgctttcttcccttccttt ctcgccacgttcgccggctttccccgtcaag ctctaaatcgggggctccctttagggttccg atttagtgctttacggcacctcgaccccaaa aaacttgattagggtgatggttcacgtagtg ggccatcgccctgatagacggtttttcgccc tttgacgttggagtccacgttctttaatagt ggactcttgttccaaactggaacaacactca accctatctcggtctattcttttgatttata agggattttgccgatttcggcctattggtta aaaaatgagctgatttaacaaaaatttaacg cgaattttaacaaaatattaacgtttacaat ttcaggtggcacttttcggggaaatgtgcgc ggaacccctatttgtttatttttctaaatac attcaaatatgtatccgctcatgaattaatt cttagaaaaactcatcgagcatcaaatgaaa ctgcaatttattcatatcaggattatcaata ccatatttttgaaaaagccgtttctgtaatg aaggagaaaactcaccgaggcagttccatag gatggcaagatcctggtatcggtctgcgatt ccgactcgtccaacatcaatacaacctatta atttcccctcgtcaaaaataaggttatcaag tgagaaatcaccatgagtgacgactgaatcc ggtgagaatggcaaaagtttatgcatttctt tccagacttgttcaacaggccagccattacg ctcgtcatcaaaatcactcgcatcaaccaaa 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| 6×pET28a 载体中的 His 标签 VAMP2（2-97，L32C/I97C；大写字母表示） | 自制的 | tggcgaatgggacgcgccctgtagcggcgca ttaagcgcggcgggtgtggtggttacgcgca gcgtgaccgctacacttgccagcgccctagc gcccgctcctttcgctttcttcccttccttt ctcgccacgttcgccggctttccccgtcaag ctctaaatcgggggctccctttagggttccg atttagtgctttacggcacctcgaccccaaa aaacttgattagggtgatggttcacgtagtg ggccatcgccctgatagacggtttttcgccc tttgacgttggagtccacgttctttaatagt ggactcttgttccaaactggaacaacactca accctatctcggtctattcttttgatttata agggattttgccgatttcggcctattggtta aaaaatgagctgatttaacaaaaatttaacg cgaattttaacaaaatattaacgtttacaat ttcaggtggcacttttcggggaaatgtgcgc ggaacccctatttgtttatttttctaaatac attcaaatatgtatccgctcatgaattaatt cttagaaaaactcatcgagcatcaaatgaaa ctgcaatttattcatatcaggattatcaata ccatatttttgaaaaagccgtttctgtaatg aaggagaaaactcaccgaggcagttccatag gatggcaagatcctggtatcggtctgcgatt ccgactcgtccaacatcaatacaacctatta atttcccctcgtcaaaaataaggttatcaag tgagaaatcaccatgagtgacgactgaatcc ggtgagaatggcaaaagtttatgcatttctt tccagacttgttcaacaggccagccattacg ctcgtcatcaaaatcactcgcatcaaccaaa 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| 6×His标签蛋白 ΔN-VAMP2 (49–96；大写）和突触融合蛋白-1A（191–267，I202C/I266C；大写）在 pETDuet-1 中 | 自制的 | gggaattgtgagcggataacaattcccctc tagaaataattttgtttaactttaagaagga gatataccATGGGCAGCAGCCATCA TCATCATCATCACAGCAGCGG CCTGGAAGTTCTGTTCCAGGG GCCCGGTAATGTGGACAAGGT CCTGGAGCGAGACCAGAAGCT ATCGGAACTGGATGATCGCGC AGATGCCCTCCAGGCAGGGGC CTCCCAGTTTGAAACAAGTGC AGCCAAGCTCAAGCGCAAATAC TGGTGGAAAAACCTCAAGATGAT GTAAgcggccgcataatgcttaagtcgaaca gaaagtaatcgtattgtacacggccgcataa tcgaaattaatacgactcactataggggaat tgtgagcggataacaattccccatcttagta tattagttaagtataagaaggagatatacat ATGGCCCTCAGTGAGATCGAGA CCAGGCACAGTGAGTGCATC AAGTTGGAGAACAGCATCCG GGAGCTACACGATATGTTCAT GGACATGGCCATGCTGGTGG AGAGCCAGGGGGAGATGATT GACAGGATCGAGTACAATGTG GAACACGCTGTGGACTACGTG GAGAGGGCCGTGTCTGACACC AAGAAGGCCGTCAAGTACCAG AGCAAGGCACGCAGGAAGAA GTGCATGATCTAActcgagtc tggtaaagaaaccgctgctgcgaaatttgaa cgccagcacatggactcgtctactagcgcag cttaattaacctaggctgctgccaccgctga gcaataactagcataaccccttggggcctct aaacgggtcttgaggggttttttgctgaaag gaggaactatatccggattggcgaatgggac 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| SNAP-25b（1–206，所有 C 变为 A；大写）在 pET28a 中 | 自制 | tggcgaatgggacgcgccctgtagcggcgca ttaagcgcggcgggtgtggtggttacgcgca gcgtgaccgctacacttgccagcgccctagc gcccgctcctttcgctttcttcccttccttt ctcgccacgttcgccggctttccccgtcaag ctctaaatcgggggctccctttagggttccg atttagtgctttacggcacctcgaccccaaa aaacttgattagggtgatggttcacgtagtg ggccatcgccctgatagacggtttttcgccc tttgacgttggagtccacgttctttaatagt ggactcttgttccaaactggaacaacactca accctatctcggtctattcttttgatttata agggattttgccgatttcggcctattggtta aaaaatgagctgatttaacaaaaatttaacg cgaattttaacaaaatattaacgtttacaat ttcaggtggcacttttcggggaaatgtgcgc ggaacccctatttgtttatttttctaaatac attcaaatatgtatccgctcatgaattaatt cttagaaaaactcatcgagcatcaaatgaaa ctgcaatttattcatatcaggattatcaata ccatatttttgaaaaagccgtttctgtaatg aaggagaaaactcaccgaggcagttccatag gatggcaagatcctggtatcggtctgcgatt ccgactcgtccaacatcaatacaacctatta atttcccctcgtcaaaaataaggttatcaag tgagaaatcaccatgagtgacgactgaatcc ggtgagaatggcaaaagtttatgcatttctt tccagacttgttcaacaggccagccattacg ctcgtcatcaaaatcactcgcatcaaccaaa 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| 蛋白质纯化材料 | |||
| 2-巯基乙醇 | SIGMA | M3148-25ML | |
| 琼脂 | LPS 溶液 | AGA500 | |
| 氨苄青霉素钠盐 | 请提供需要翻译的源文本内容。 | AC1043-005-00 | |
| 氯霉素 | 请提供需要翻译的源文本内容。 | CR1023-050-00 | |
| 感受态细胞（E. coli) | Novagen | 70956 | Rosetta(DE3)pLysS |
| 甘油 | SIGMA | G5516-500ML | |
| HEPES | SIGMA | H4034-100G | |
| 盐酸 / HCl | SIGMA | 320331-500ML | |
| 咪唑 | SIGMA | I2399-100G | |
| 异丙基 β异丙基-β-D-硫代半乳糖吡喃糖苷 / IPTG | SIGMA | 10724815001 | |
| 硫酸卡那霉素 | 请提供需要翻译的源文本内容。 | KC1001-005-02 | |
| Luria-Bertani (LB) 培养基 | LPS 溶液 | LB-05 | |
| Ni-NTA树脂 | Qiagen | 30210 | |
| PD MiniTrap G-25（脱盐柱） | Cytiva | GE28-9180-07 | 有关说明，请参见：https://www.cytivalifesciences.com/en/us/shop/chromatography/prepacked-columns/desalting-and-buffer-exchange/pd-minitrap-desalting-columns-with-sephadex-g-25-resin-p-06174 |
| 苯甲基磺酰氟 / PMSF | ThermoFisher Scientific | 36978 | |
| SNARE蛋白的质粒 | 克隆于本实验室 | N/A | 应要求提供 |
| 蛋白酶抑制剂混合物 | genDEPOT | P3100 | |
| 氯化钠 | SIGMA | S5886-500G | |
| 磷酸氢二钠 / Na2HPO4 | SIGMA | S7907-100G | |
| 磷酸二氢钠 / NaH2PO4 | SIGMA | S3139-250G | |
| Tris(2-羧乙基)膦 / TCEP | SIGMA | C4706-2G | |
| Trizma碱 | SIGMA | T1503-250G | |
| 样品组装材料 | |||
| 生物素-PEG-SVA | LAYSAN BIO | BIO-PEG-SVA-5K-100MG & MPEG-SVA-5K-1g | 用于 PEG 化 |
| 二苯并环辛炔-胺 / DBCO-NH2 | SIGMA | 761540-10MG | 用于微珠包被 |
| 双面胶带 | 3M | 136 | 用于流动池组装 |
| 环氧胶 | DEVCON | S-208 | 用于流动池组装 |
| 用于底面的玻璃盖玻片 | VWR | 48393-251 | 矩形，60×24 mm，#1.5 |
| 用于顶面的玻璃盖玻片 | VWR | 48393-241 | 矩形，50×24 mm，#1.5 |
| 磁珠 | ThermoFisher Scientific | 14301 | Dynabeads M-270 Epoxy 2.8 μm |
| mPEG-SVA | LAYSAN BIO | mPEG-SVA 1g | 用于 PEG 化 |
| N,N-二甲基甲酰胺 / DMF | SIGMA | D4551-250ML | 用于珠子包被 |
| N-[3-(三甲氧基硅基)丙基]乙二胺 | SIGMA | 104884-100ML | 用于 PEG 化 |
| Neutravidin | ThermoFisher Scientific | 31000 | 用于样品连接 |
| 磷酸盐缓冲液 / PBS，pH 7.2 | 请提供需要翻译的源文本内容。 | PR2007-100-00 | |
| 塑料注射器 | Norm-ject | A5 | 5 ml，鲁尔接头尖端 |
| 聚乙烯管 | SCI | BB31695-PE/4 | PE-60 |
| 参照微珠 | SPHEROTECH | SVP-30-5 | 链霉亲和素包被的聚苯乙烯微粒；3.0-3.4 µm |
| 注射器针头 | Kovax | 21G-1 1/4'' | 21 G |
| 注射泵 | KD SCIENTIFIC | 788210 | |
| 磁力镊仪器设备 | |||
| 一轴电动微位移台 | PI | M-126.PD1 | 用于磁铁的垂直定位 |
| 2轴手动平移台 | ST1 | LEE400 | 磁体与光轴对准的步骤 |
| 磁铁用丙烯酸支架 | DaiKwang Precision | 定制订单 | 索取即可提供示意图 |
| 图像采集卡 | 有源硅 | AS-FBD-4XCXP6-2PE8 | |
| 高速CMOS相机 | Mikrotron | EoSens 3CXP | |
| 倒置显微镜 | Olympus | IX73P2F-1-2 | |
| 钕磁铁 | LG 磁铁 | ND 10x10x12t | 尺寸：10 mm × 10 mm × 12 mm；需要两个 |
| 物镜 | Olympus | UPLXAPO100XO | 油浸，数值孔径 1.45 |
| 物镜纳米定位器 | Mad City Labs | Nano-F100S | |
| 旋转步进电机 | AUTONICS | A3K-S545W | 用于旋转磁体 |
| 超辐射发光二极管 | QPHOTONICS | QSDM-680-2 | 680 nm |
| 软件 | |||
| LabVIEW | 国家仪器 | v20.0f1 | |
| MATLAB | MathWorks | v2021a |
参考文献
- Le, S., Liu, R., Lim, C. T., Yan, J. Uncovering mechanosensing mechanisms at the single protein level using magnetic tweezers. Methods. 94, 13-18 (2016).
- Choi, H. -K., Kim, H. G., Shon, M. J., Yoon, T. -Y. High-resolution single-molecule magnetic tweezers. Ann....
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