本研究描述了一种在自愈性可退火颗粒-细胞外基质复合材料内进行神经干细胞自由成型嵌入式3D打印的实验方案。该方案能够高保真地程序化构建相互连接的人类神经组织结构。
本文内容
摘要
摘要
在过去十年中，将细胞在颗粒状支撑介质内进行嵌入式3D打印，已成为一种用于自由成形构建软组织工程结构的强大方法。然而，颗粒凝胶的配方一直局限于少数几种生物材料，这些材料能够以较低成本大量制备水凝胶微粒。因此，颗粒凝胶支撑介质通常缺乏天然细胞外基质（ECM）中所具有的细胞黏附性和细胞指导性功能。
为解决这一问题，已开发出一种用于制备自愈性可退火颗粒-细胞外基质（SHAPE）复合材料的方法。SHAPE复合材料由颗粒相（微凝胶）和连续相（黏性细胞外基质溶液）组成，二者共同实现了可编程的高保真打印以及可调控的生物功能性细胞外环境。本研究阐述了如何利用该方法实现人源神经结构的精确生物制造。
首先，制备作为SHAPE复合材料中颗粒组分的海藻酸盐微粒，并将其与基于胶原蛋白的连续相组分结合。然后，将人神经干细胞打印到支撑材料内部，随后对支撑材料进行退火处理。打印得到的结构可维持数周，以支持打印细胞分化为神经元。同时，胶原蛋白连续相支持轴突向外生长并实现不同区域之间的连接。最后，本文提供了如何进行活细胞荧光成像和免疫细胞化学染色以表征3D打印人源神经结构的方法信息。
引言
精确且可编程的含细胞水凝胶结构三维打印以模拟软组织 体外 提出了一个重大挑战。例如，基于软水凝胶直接挤出的方法本身就存在固有问题，因为要模拟所需的较差机械性能 体内 微环境会导致结构完整性缺失、预设特征变形，或所构建结构完全坍塌。解决这一问题的传统方法是使用刚性更强的生物相容性材料打印支撑支架，以维持最终结构的形状。然而，这种方法极大地限制了设计自由度，并需要对相邻油墨的流变特性进行精细调控。
为了克服传统逐层挤出式3D打印的局限性，近年来嵌入式3D打印作为一种强大的替代方法，在软材料和组织制造领域崭露头角1,2,3,4,5,6。该技术并非将墨水在空气中逐层挤出到表面之上，而是通过注射器针头直接将墨水沉积于一种支撑浴内；该支撑浴在静止状态下呈类固态，但在移动的针尖周围可逆地液化，从而允许对柔软的含细胞材料进行精确沉积。随着针头移动，支撑浴在针后重新固化，从而将沉积的材料固定在原位。因此，嵌入式3D打印能够以高分辨率自由成形制造出由软性生物材料构成的复杂结构，显著拓展了设计可能性7,8。
颗粒凝胶由于可配制成在低屈服应力下表现出平滑、局部且可逆的固-液转变，已被广泛研究作为嵌入式3D打印的支撑浴材料9,10,11。尽管颗粒凝胶在高分辨率打印中表现出优异的流变性能，但其应用仍局限于少数几种生物材料12。颗粒凝胶配方缺乏多样性，若与块体水凝胶配方中可用的广泛生物材料相比，这一局限尤为明显，其原因在于需要通过简单的化学方法经济高效地制备大量微凝胶。由于颗粒凝胶支撑材料可用的生物材料种类有限，通过打印支撑材料调控细胞外微环境的能力在该领域仍面临挑战。
最近开发出一种模块化方法，用于生成嵌入式3D打印支撑材料，称为自愈合可退火颗粒-细胞外基质（self-healing annealable particle-extracellular matrix, SHAPE）复合材料13。该方法结合了颗粒凝胶独特的流变特性与块体水凝胶配方的生物功能多样性。所提出的SHAPE复合支撑材料由紧密堆积的海藻酸盐微粒（颗粒相，体积分数约70%）构成，其增大的间隙空间中填充了高黏性的胶原蛋白基细胞外基质预凝胶溶液（连续相，体积分数约30%）。进一步研究表明，SHAPE支撑材料可实现人神经干细胞（hNSCs）的高分辨率沉积，在支撑浴退火后，这些细胞可分化为神经元，并维持数周以达到功能成熟。在SHAPE支撑浴内进行嵌入式3D打印，克服了传统神经组织生物制造技术的一些主要局限，同时提供了一个多功能的实验平台。
本研究详细阐述了在SHAPE支撑材料内嵌式3D打印人神经干细胞（hNSCs）的步骤，以及后续将其分化为功能性神经元的过程图1。首先，生成海藻酸盐微粒 通过 内凝胶化过程中的剪切作用。该方法无需特殊设备和细胞毒性试剂，即可轻松制备大量微颗粒。此外，海藻酸盐是一种广泛可得且经济的材料，适用于形成多种细胞类型的生物相容性水凝胶基质。所制备的海藻酸盐微颗粒与胶原溶液混合，形成SHAPE复合支撑材料。随后，收集人神经干细胞（hNSCs），并将其装入注射器中作为细胞生物墨水用于3D打印。采用3D生物打印机在SHAPE复合材料内部进行基于挤出的嵌入式打印。3D打印后的细胞可分化为神经元，形成空间结构明确且具有功能的人类神经组织构建物。最后，本方案描述了如何利用活细胞成像和免疫细胞化学对所生成的组织构建物进行表征，并提供了优化与故障排除建议。值得注意的是，根据其他细胞和组织类型的需求，颗粒相和连续相的组分均可替换为其他水凝胶配方，以适配不同的生物功能基团、力学性能及交联机制。
方案
1. 缓冲液与试剂的准备
- 在层流空气操作台（LAF）中，向含L-丙氨酰-L-谷氨酰胺二肽的DMEM/F12培养基中加入以下补充成分：30 mM葡萄糖、5 µM HEPES、0.5% w/v 富脂牛血清白蛋白、40 µM L-丙氨酸、40 µM L-天冬酰胺一水合物、40 µM L-天冬氨酸、40 µM L-谷氨酸、40 µM L-脯氨酸、1% N2补充剂、1%青霉素-链霉素，以及各20 ng/L的表皮生长因子（EGF）和成纤维细胞生长因子（FGF），配制细胞生长培养基。
- 将海藻酸钠在超纯水中配制成1% w/v溶液，在60 °C下剧烈搅拌4小时。在 LAF操作台中，使用孔径0.45 µm的滤器对已溶解的热海藻酸钠溶液进行无菌过滤。4 °C保存。
注意：若海藻酸钠溶液温度低于60 °C，则无法通过滤器。 - 在超纯水中配制37 g/L的NaHCO3溶液。用NaOH调节溶液pH至9.5，并在 LAF操作台中进行过滤除菌。4 °C保存该溶液。
2. SHAPE 复合材料的制备
- 海藻酸盐微粒的制备
- 制备 2 mg/mL 的 CaCO₃ 悬液3 将溶液加入无菌烧杯中的超纯水中，与海藻酸盐溶液按1:1比例混合，并使用磁力搅拌器在室温下搅拌1小时。
- 以1:500的比例加入乙酸，在650 rpm条件下搅拌过夜。
注意：海藻酸钠溶液会立即开始凝胶化。务必使用长度与所用玻璃器皿直径相同的搅拌子，以确保形成的凝胶得到充分且均匀的搅拌。第二天，所得溶液 通过 凝胶过程中搅拌将呈现黏稠状（图2A). - 将凝胶状海藻酸钠溶液置于超净工作台中，使用匀浆机以15,000 rpm均质10分钟，机械破碎成微粒图2B).
- 以 18,500 × g 离心微粒 g 20 分钟（图 2C室温下。
- 在超净工作台内小心弃去上清液，将颗粒重悬于含有 2 mM NaOH 和 1% P/S 的 DMEM 中，4 °C 过夜孵育（图 2D).
注意：悬液颜色应恢复为红色。如果悬液仍为黄色，需逐滴加入 NaOH 并混匀，直至变为红色（图 2E). - 以15,000 rpm均质化颗粒3分钟，然后在18,500 × g 室温下孵育10分钟。
- 观察沉淀物（图2F），并小心移除上清液。
注意：紧密聚集的海藻酸盐微粒沉淀物可于4 °C保存，以备后续使用。若海藻酸盐溶液未经过滤除菌，则微粒应在1周内使用完毕。
- SHAPE 复合配方
- 打印前一天，将海藻酸盐微粒沉淀物重悬于两倍体积的生长培养基中，培养基中含4% HEPES（1 M 储液）和4% NaHCO₃3 溶液在 a 中 LAF工作台中，室温下孵育过夜。
- 将微凝胶悬浮液在 18,500 × g 室温孵育10分钟，弃去上清液。
- 在超净工作台中将胶原蛋白与海藻酸盐微粒混合前进行中和。将胶原蛋白储备液稀释至终浓度为1 mg/mL，并通过加入4% HEPES和4% NaHCO₃进行中和。3例如，对于3 mL的SHAPE复合物，将2 mL藻酸盐微粒与1 mL中和的胶原蛋白（0.12 mL HEPES、0.12 mL NaHCO₃）混合。3，0.16 mL 培养基和 0.6 mL 胶原蛋白。
注意：所有与胶原混合的材料均需在冰上操作，以防止胶原聚合。胶原一旦被中和，聚合反应将开始缓慢进行。 - 按2:1的比例将海藻酸盐微粒沉淀与稀释并中和后的胶原蛋白混合，制备SHAPE复合物。在冰上用移液器缓慢吹打混匀凝胶 LAF 工作台
注意：请勿涡旋，以免将气泡引入支撑材料中。 - 在超净工作台中，将制备的复合材料转移至预冷的微孔板或其他容器中 合适的打印容器，并在30分钟内使用（图3E，F).
3. hNSC 培养与生物墨水制备
- 将细胞培养于包被有基底膜提取物的T75培养瓶中，使用生长培养基。细胞复苏后至少传代两次，方可用于3D打印实验。
- 打印前，使用0.025%胰蛋白酶溶液在37 °C条件下对细胞进行5分钟的酶解消化，随后用生长培养基中和胰蛋白酶，并将细胞悬液在室温下以400 × g离心5分钟。离心后吸除上清液，将沉淀物重悬于2–3 mL生长培养基中。
- 进行细胞计数，以400 × g离心细胞，然后将沉淀物重悬于添加了0.1%黄原胶（防止细胞沉降）的生长培养基中，终浓度为9 × 106 个细胞/mL。
- 使用21 G钝头金属针将100 µL紧密堆积的海藻酸盐微颗粒装入注射器中（图3A）。
注意：使用海藻酸盐微颗粒形成塞状结构具有两个作用：有助于维持打印过程中的挤出稳定性，并确保所加载的细胞墨水能够完全挤出（无死体积）。 - 使用同一根针将制备好的细胞悬液装入注射器中（图3B）。
注意：在装填注射器过程中需格外小心，避免引入任何气泡。气泡会导致打印过程中出现不稳定现象。 - 将装填用针头更换为27 G钝头金属针头，用于后续打印（图3C）。
4. 嵌入式3D打印
- 使用参考软件设计待打印的结构（参见材料表）。
注意：确保将打印结构的初始高度调整至SHAPE复合支撑材料的深度范围内。螺旋形和木堆形设计示例见图4A。 - 点击生成以生成G代码。
- 将含有细胞的玻璃注射器插入基于挤出式生物打印机的体积挤出头中（图3D）。
- 点击针头长度测量以测量含细胞玻璃注射器的针头长度。
- 将装载有SHAPE复合材料的微孔板或容器放置于打印机上。
注意：在打印前，应将细胞板或容器保持在4 °C，以防止支撑材料过早交联。 - 点击SHM（表面高度测量），测量同一微孔板或容器中未加样孔的表面高度（该板或容器中已装载SHAPE凝胶）。
注意：也可通过针头手动测量孔的高度来确定表面高度。 - 将挤出速率设置为3.6 µL/min，将进给速率设置为0.3 mm/s。
注意：打印前务必测试挤出情况。细胞沉降可能导致喷嘴堵塞，可通过在正式嵌入式打印前预先挤出少量材料，或在体积式注射器中添加回缩体积来避免。在某些情况下，当针头插入或退出SHAPE凝胶时，进给速率需保持在低于0.5 mm/s，以避免墨水被拖拽。 - 将G代码加载到打印机的用户界面中。
注意：每次对设计结构进行修改后，都需要重新生成新的G代码。 - 点击运行以启动打印程序（图3G）。
- 打印完成后立即把SHAPE凝胶置于37 °C细胞培养孵育箱中，退火30分钟。
- 在退火后的SHAPE凝胶支撑材料上方轻柔地加入生长培养基。
- 次日，更换为如下配方的分化培养基：DMEM/F12培养基，含L-丙氨酰-L-谷氨酰胺二肽、30 mM葡萄糖、5 µM HEPES、0.5% w/v 富脂牛血清白蛋白、40 µM L-丙氨酸、40 µM L-天冬酰胺一水合物、40 µM L-天冬氨酸、40 µM L-谷氨酸、40 µM L-脯氨酸、1% N2补充剂、1%青霉素-链霉素、100 µM二丁酰环腺苷酸（dibutyryl-cAMP）以及2 ng/mL胶质细胞系源性神经营养因子（GDNF）。
注意：更换培养基时务必避免损伤水凝胶。可倾斜培养板，轻柔吸除旧培养基，并将新鲜培养基逐滴加至含有凝胶的孔壁上，而非直接滴加在凝胶表面。切勿使用抽吸装置移除培养基。 - 每隔2天更换一次分化培养基，直至实验终点。
5. 活细胞荧光成像
- 从凝胶中移除多余的培养基。
- 向支撑凝胶中加入与凝胶体积相等的 20 µM Calcein AM 溶液（用分化培养基将储备液稀释而成）。
- 在 37 °C 下孵育 40 分钟。
- 移除 Calcein AM 溶液，并加入适量新鲜的分化培养基。
- 将培养板转移至显微镜下进行成像。
6. 免疫细胞化学
- 移除凝胶中多余的培养基。
- 使用小刮铲将凝胶转移至含有DPBS的大容器中。
- 用DPBS洗涤三次，每次20分钟，并将培养板转移至通风橱中。
- 吸除DPBS，加入足量的4%多聚甲醛溶液以覆盖凝胶，在室温下孵育1小时。
- 用DPBS洗涤三次，每次20分钟。
- 配制封闭液：在DPBS中加入5%驴血清、0.25%去污剂和0.02%叠氮化钠。
注意：配制所需体积三倍量的封闭液；后续将用于配制一抗和二抗溶液。 - DPBS洗涤后，向凝胶中加入封闭液，在室温下孵育6小时以防止非特异性结合，轻轻摇动培养板。
- 将TUBB3一抗用封闭液按1:1,000的比例稀释，配制一抗溶液。
- 从凝胶中吸除封闭液，加入一抗溶液，在4 °C孵育48小时，轻轻摇动培养板。
- 用DPBS洗涤三次，每次20分钟。
- 用封闭液将4',6-二脒基-2-苯基吲哚（DAPI，1:1,000）和二抗（1:200）稀释，配制二抗溶液。
- DPBS洗涤后，将凝胶在二抗溶液中于4 °C孵育24小时，轻轻摇动培养板。
- 用DPBS洗涤三次，每次20分钟，之后于4 °C保存直至成像。
- 成像前，用刮铲将染色后的凝胶转移至带有薄底成像皿或孔板中。
结果
海藻酸盐微凝胶制备 通过 内源性凝胶化过程中的剪切变稀随后经机械破碎，可产生尺寸多分散且呈片状的海藻酸盐微凝胶，如图所示 图2G这些不规则颗粒的尺寸范围从小于1 µm到直径约40 µm。当紧密堆积时，微粒形成一种透明的整体材料，其不透明度仅略高于相应的细胞培养基。图2F）。支撑材料的透明度是该平台的一个重要特性，因为它能够在培养期间实现对打印结构的可视化观察，同时也可用于对经活细胞染料标记的构建物进行高分辨率共聚焦显微镜成像 通过 免疫细胞化学。当浸泡在缓冲的细胞培养基中时，所得的pH调整凝胶应呈现红色，表明处于生理条件（图 2F）。中和海藻酸盐微粒的pH值至关重要，原因有二：酸性微粒可直接损伤细胞；此外，酸性环境会阻碍SHAPE复合支架的有效退火，因其将干扰胶原蛋白的聚合过程。
采用上述参数打印hNSC墨水可得到直径约为200 µm的细胞丝状结构（图4A）。无论是单层平面打印，还是多层叠加打印，程序设定的几何形状均能得到良好保持。在多层打印的情况下，所打印的结构保持完整，层与层之间的最小距离为200 µm13。细胞在墨水制备和挤出过程中应不受显著影响，保持良好活力。打印出的丝状结构富含活细胞，细胞呈圆形形态（图4B，左）。即使打印完成后立即观察时所构建的结构未出现任何形变，打印后第二天仍可能出现丝状结构中的间隙。这很可能是由于支撑材料混合不均所致。由于细胞不与海藻酸盐微粒相互作用，它们会从海藻酸盐富集区域迁移至胶原蛋白和细胞富集区域，从而导致打印丝状结构出现断裂。此外，SHAPE支撑材料应不含气泡，因为气穴会影响打印的保真度。
人神经干细胞（hNSCs）成功分化后，应在打印后30天形成富含神经元的结构，细胞呈现典型的神经元形态，具有较小的胞体和细长的突起（图4B，右图）。此外，若打印高密度图案（如矩形细胞片），在分化过程中不应出现明显的空隙或聚集体，而应保持连续完整的细胞层（图4C）。本方案描述了对3D打印样品进行荧光免疫细胞化学染色的操作步骤。针对细胞质神经元标志物TUBB3的染色可直接可视化所形成的神经元网络。分化后样品的荧光显微镜观察应显示富含TUBB3且保持原有几何结构的组织形态（图4D，左图）。在分化过程中，细胞不会从打印的纤维结构中迁移出来，这一点可通过DAPI对细胞核染色得以证实（图4D，中图）。因此，神经元胞体被限制在打印结构的边界内，而轴突可向外延伸数百微米，进入包围构建物的SHAPE支撑材料中。轴突对周围空间的探索表明，SHAPE支撑材料提供了允许轴突导向的生物功能信号。可进一步采用更成熟的神经元标志物或亚型特异性标志物进行免疫细胞化学染色，以更深入地表征所生成的神经元群体。此外，还可通过RT-qPCR或电生理学方法对打印的神经元结构进行表征13。然而，这两种方法均需使用胶原酶去除胶原蛋白，因为水凝胶层会阻碍RNA提取以及微移液器对细胞的物理接触。
图1：SHAPE嵌入式打印方法的概念示意图。 将胶原蛋白溶液与海藻酸盐微粒混合，形成SHAPE复合材料；该SHAPE复合材料作为支撑材料，用于人神经干细胞（hNSCs）的嵌入式3D打印，干细胞在退火后的支撑材料内部分化为神经元。SHAPE复合材料的生物功能性使神经元能够延伸突起，并通过轴突投射填充支撑材料中的空余空间。本图经Kajtez等13修改。缩写：SHAPE = 自愈性可退火微粒-细胞外基质；hNSCs = 人神经干细胞。 请点击此处查看此图的放大版本。
图 2：海藻酸盐微粒的制备。（A）过夜凝胶化后的海藻酸盐溶液。（B）通过均质化生成的海藻酸盐微粒。（C）离心后的微粒沉淀。（D）沉淀重悬于DMEM中，在pH调节前（E）和pH调节后。（F）微粒在培养基中过夜孵育并离心后的状态。（G）所制备的海藻酸盐微粒的明场图像。比例尺 = 100 µm。请点击此处查看该图的放大版本。
图 3：3D 打印过程的准备。（A）将浆料塞（约 100 µL）装入注射器，随后（B）装入细胞生物墨水（此处添加了彩色微珠以方便可视化）。（C）用于装墨的锥形塑料针头（21 G）被替换为 27 G 钝头金属针头。（D）将注射器插入 3D 打印头中。（E、F）用移液器将 SHAPE 复合物转移至 48 孔板的一个孔中。未操作时，装有 SHAPE 复合物的管子需置于冰上保存。（G）将打印针头插入 SHAPE 支撑材料中，并启动由计算机设计定义的打印路径（此处显示为螺旋结构的打印过程）。缩写：SHAPE = 自愈合可退火颗粒-细胞外基质复合物。请点击此处查看该图的放大版本。
图4：SHAPE复合支撑材料内部的3D打印神经结构。（A）支撑水凝胶内打印的人神经干细胞（hNSCs）的明场图像。显示了螺旋形（左）和木堆形（右）结构设计。（B）3D打印结构在打印后当天（左）和神经元分化后（右）的活细胞成像。（C）使用刮铲从培养孔中取出的一个3D打印方形结构，显示出良好的结构完整性。（D）同一方形结构的荧光共聚焦图像，经神经元标志物（TUBB3）免疫标记并用DAPI复染细胞核，证实hNSCs在3D打印结构内成功分化。比例尺 = 500 µm（A，右）；100 µm（B，D）。本图中的图版C和D经Kajtez等13修改。 请点击此处查看该图的放大版本。
讨论
SHAPE复合材料方法为配制可退火且具有生物功能的支持浴提供了多功能途径，可用于细胞墨水的嵌入式3D打印。尽管本方案以神经结构的3D打印为例，但SHAPE工具箱可轻松适配于其他细胞来源的生物制造，以精确构建多种目标组织类型。该打印方法还可实现多种细胞类型的精确图案化，用于研究细胞间相互作用，或构建具有明确定义空间排列的细胞区室（如神经元和胶质细胞）的组织。与传统的颗粒凝胶相比，SHAPE复合材料具有扩大的间隙空间（本方案中所描述配方的体积分数约为30%）。颗粒组分作为流变学调节剂，赋予复合材料有利于高分辨率嵌入式打印的优良材料性能。这为通过调整连续相组分的配方（同时保持颗粒组分不变）来理性设计细胞微环境开辟了路径。例如，可在支持浴中引入其他功能性细胞外基质（ECM）分子（如透明质酸、层粘连蛋白、纤连蛋白），或利用不同的交联机制（如酶促交联、光引发交联）13。此外，颗粒组分中的海藻酸盐可替换为来自不同水凝胶材料的微粒（如明胶8、聚乙二醇14,15、琼脂糖16），或根据不同的组织工程或疾病建模应用需求，制备成不同尺寸和形状。颗粒相与连续相之间的比例可根据具体3D打印项目的需求进行调节，但若将连续相比例提高至30%以上，可能会影响打印保真度和分辨率。
在微凝胶制备过程中，加入乙酸后对海藻酸盐溶液的搅拌必须在整个凝胶化溶液体积范围内充分有效。如果搅拌速度过低或磁力搅拌子过小，搅拌作用可能无法到达溶液上层，导致上层形成大量交联的块状水凝胶，而下层则被剪切。不均匀剪切的海藻酸盐水凝胶在均质化后将产生不适合3D打印应用的次优海藻酸盐微粒。此外，海藻酸盐微粒必须与胶原蛋白溶液充分混合，因为非均质混合会导致支撑材料中出现缺乏胶原蛋白的区域；这些区域无法发生退火，因而不具备细胞相互作用特性。也可能出现缺乏海藻酸盐微粒的区域，从而无法支持打印。因此，混合不均的打印支撑材料将无法支持高保真打印，并且结构上存在缺陷，因其在整个体积内无法完成退火。还应避免气泡的产生，这并非因为气泡对细胞有害，而是因为空气 pockets 可能在打印过程中引起形变，并干扰对构建物的成像。气泡的两个常见来源是涡旋振荡（冷支撑材料中的微小气泡在37 °C退火时膨胀）和剧烈移液操作。
本研究中的SHAPE复合支撑材料并非设计为打印后需去除的牺牲性材料，而是作为干细胞分化、神经元生长及功能成熟过程中的长期生物功能性支撑。与打印后未经退火处理的颗粒状凝胶相比，经过退火处理的SHAPE复合材料具有更好的结构稳定性和透明度，可在固定和免疫标记过程中为精细的神经元结构提供保护性环境，从而有利于通过抗原可视化实现形态学表征。via 荧光报告分子还可用于长期追踪细胞形态的变化，并监测细胞在退火后打印支撑材料内的增殖与迁移行为。此外，钙成像技术可用于获取细胞自发活动的信息（例如神经元动作电位的发放，甚至同步化的神经元网络活动）。然而，由于水凝胶层包裹着细胞，会减缓物质扩散，难以实现细胞微环境的瞬时调控，因此对工程化细胞结构进行化学刺激（例如使用KCl刺激神经元）可能存在困难。相比之下，光遗传学刺激是调控细胞活动的更优选择，因为SHAPE水凝胶不会阻碍对细胞的光学访问。
氧敏感微珠可被掺入生物墨水或支撑材料中通过 直接打印或在复合材料制备过程中进行分散，以实现对打印结构内部及周围氧张力水平的高灵敏度实时空间和时间映射13这种基于磷光寿命测量的非侵入性三维氧分布成像方法，为构建具有更佳氧合状态、可能同时具有更优营养供给的组织工程结构提供了途径。氧合不足可能导致打印结构内部形成坏死区域，干扰干细胞分化，并影响神经元代谢。通过氧分布成像可获得反馈信息，据此可调整3D打印设计，以实现整个结构内均匀的氧合状态，精确调控氧浓度以匹配生理条件，或构建氧浓度梯度。
还可以通过打印一种牺牲性墨水（如明胶）在可退火的打印支撑材料内部整合工程化通道，该墨水在低温支撑浴中固化，但在37°C时可轻松去除4,13。对于细胞密度较高或尺寸超出基于设计的氧张力调控策略能力范围的组织构建体，需要此类通道来输送营养物质和氧气。此外，还可利用类似血管的通道建立小分子梯度，以驱动细胞身份的模式形成、调节细胞活性或引导趋化性。
总之，在 SHAPE 复合材料内部进行嵌入式 3D 打印，提供了一个模块化的材料平台，具有易于调整和广泛适应性的特点，适用于力学敏感组织的功能性建模。本文提供的实验方案详细阐述了制备支撑材料并高保真打印细胞墨水所需的各个步骤和基本原理。该方法利用价格低廉的材料和易获取的设备，同时为研究人员根据自身需求和应用对技术进行个性化调整提供了空间。
披露
作者声明无利益冲突。
致谢
本研究主要由欧盟“地平线2020”计划 BrainMatTrain 项目（编号：H2020-MSCA-ITN-2015）在玛丽·斯克沃多夫斯卡-居里初始培训网络框架下及资助协议编号 676408 的支持下完成。C.R. 和 J.U.L. 衷心感谢伦德贝克基金会（R250-2017-1425）和丹麦独立研究基金（8048-00050）对本研究提供的支持。 我们衷心感谢 HORIZON-EIC-2021-PATHFINDEROPEN-01 项目 101047177 OpenMIND 提供的资助。
材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 1 mL 气密注射器 1001 TLL | Hamilton | 81320 | |
| 3DDiscovery 3D 生物打印机 | RegenHU | ||
| 乙酸 | Sigma-Aldrich | A6283 | |
| AlbuMAX | ThermoFisher | 11020021 | |
| Alexa Fluor 488 二抗 | ThermoFisher | A-11001 | 山羊抗小鼠 |
| 钝头针，Sterican（21 G） | Braun | 9180109 | |
| 钝头针（27 G） | Cellink | NZ5270505001 | |
| BioCAD 软件 | SolidWorks | ||
| 钙黄绿素 AM | ThermoFisher | 65-0853-39 | |
| 碳酸钙 | Sigma-Aldrich | C5929 | |
| 二丁酰基-cAMP 钠盐 | Sigma-Aldrich | D0627 | |
| Cultrex 大鼠 I 型胶原蛋白（5 mg/mL） | R&D Systems | 3440-100-01 | |
| DAPI | ThermoFisher | 62248 | |
| DMEM/F-12，含 GlutaMAX | ThermoFisher | 10565018 | |
| 驴血清 | Sigma-Aldrich | D9663 | |
| DPBS | ThermoFisher | 14190094 | |
| EGF | R&D Systems | 236-EG | |
| FGF | R&D Systems | 3718-FB | |
| 4% 甲醛溶液，缓冲液，pH 6.9 | Sigma-Aldrich | 100496 | |
| GDNF | R&D Systems | 212-GD | |
| Geltrex | ThermoFisher | A1569601 | |
| 葡萄糖 | Sigma-Aldrich | G7021 | |
| HEPES 缓冲液（1 M） | ThermoFisher | 15630080 | |
| L-丙氨酸 | Sigma-Aldrich | 5129 | |
| L-天冬酰胺一水合物 | Sigma-Aldrich | A4284 | |
| L-天冬氨酸 | Sigma-Aldrich | A9256 | |
| L-谷氨酸 | Sigma-Aldrich | G1251 | |
| L-脯氨酸 | Sigma-Aldrich | P0380 | |
| 磁力搅拌器 RET basic | IKA | 3622000 | |
| N-2 补充剂 | ThermoFisher | 17502048 | |
| 青霉素-链霉素 | ThermoFisher | 15140122 | |
| S25N-10G 分散工具 | IKA | 4447100 | |
| 海藻酸钠（80–120 cP） | FUJIFILM Wako | 194-13321 | |
| 叠氮化钠 | Sigma-Aldrich | S2002 | |
| 碳酸氢钠 | Sigma-Aldrich | S5761 | |
| 氢氧化钠 | Sigma-Aldrich | S5881 | |
| T18 Digital ULTRA-TURAX 匀浆器 | IKA | 3720000 | |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | X100 | |
| 胰蛋白酶/EDTA 溶液 | ThermoFisher | R001100 | |
| TUBB3 抗体 | BioLegend | 801213 | 小鼠 |
| 黄原胶 | Sigma-Aldrich | G1253 |
参考文献
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