靶向显微注射与电穿孔法对灵长类大脑类器官进行遗传修饰

摘要

灵长类大脑类器官的电穿孔技术为在接近灵长类（病理）生理新皮层发育的模型系统中，向不同类型的前体细胞和神经元引入瞬时遗传修饰提供了一种精确且高效的方法。该技术可用于研究神经发育和进化过程，也可应用于疾病建模。

摘要

大脑皮层是最外层的脑结构，负责感觉输入和运动输出的处理；它被认为是哺乳动物，尤其是灵长类动物高级认知功能的中枢。由于技术和伦理原因，在灵长类动物大脑中研究基因功能具有挑战性，但脑类器官技术的建立使得在传统灵长类模型（如恒河猴和普通狨猴）以及此前实验难以触及的灵长类物种（如大型类人猿）中，能够在符合伦理且技术要求较低的体系下研究脑发育过程。此外，人类脑类器官还允许对神经发育障碍和神经系统疾病进行深入研究。

由于脑类器官能够重现大脑发育的诸多过程，因此它们也成为在进化背景下识别不同物种脑发育遗传决定因素差异并进行功能比较的有力工具。使用类器官的一大优势在于可以引入遗传修饰，从而实现基因功能的检测。然而，此类修饰的引入过程繁琐且成本较高。本文介绍了一种快速且经济高效的遗传修饰方法，可用于灵长类脑类器官——一种脑类器官亚型——中类似脑室结构内的细胞群体。该方法结合了改良后的人源、黑猩猩源、恒河猴源和普通狨猴源诱导性多能干细胞（iPSCs）脑类器官稳定生成方案，以及显微注射与电穿孔技术，为研究神经发育和进化过程提供了有效工具，亦可用于疾病建模。

引言

研究大脑皮层的（病理）生理发育与进化是一项艰巨的任务，其进展受到缺乏合适模型系统的限制。以往，此类研究局限于二维细胞培养模型（如原代神经前体细胞或神经元细胞培养）以及进化上相距较远的动物模型（如啮齿类动物）^1,2。尽管这些模型在回答某些问题方面具有价值，但它们在模拟健康和疾病状态下发育中人类新皮层的复杂性、细胞类型组成、细胞结构以及基因表达模式方面存在局限性。这些局限性导致例如小头畸形等人类疾病的小鼠模型难以有效转化为人类实际情况，正如某些研究案例所述（如 Zhang 等人³）。近年来，转基因非人灵长类动物因其在进化、功能和形态上更接近人类新皮层发育过程，逐渐成为研究焦点^4,5,6,7,8，能够克服基于细胞培养和啮齿类动物模型的诸多局限。然而，非人灵长类动物在科研中的使用不仅成本高昂且耗时漫长，还引发伦理方面的担忧。最近，脑类器官技术的发展^9,

方案

1. 灵长类 iPSC 的培养

注意：由于该方法具有较强的稳健性，可应用于任何灵长类诱导多能干细胞（iPSC）系。本文描述了利用人源（iLonza2.2）²⁹、黑猩猩（Sandra A）³⁰、恒河猴（iRh33.1）²⁹, 和普通狨猴（cj_160419_5）³¹ 的iPSC系进行脑类器官的制备。培养条件总结于表1中。有关本实验方案所用全部材料、试剂和设备的详细信息，请参见材料表。

1. 培养相应的iPSC时，应遵循最初描述的培养条件。通常情况下，为成功生成和电转染脑类器官，应使用传代次数不超过90代的iPSC细胞系。此外，在开始生成脑类器官时，需确保iPSC具有多能性特征，且无任何分化迹象。

2. 利用灵长类动物诱导多能干细胞生成脑类器官

注意：脑类器官生成方案基于原始脑类器官方案^10,34

结果

本文所述方案可高效地从人类、黑猩猩、恒河猴和普通狨猴的诱导多能干细胞系生成脑类器官，且不同物种间所需的时间调整极少（图1A）。这些类器官可在20至50天之间进行电穿孔，具体时间取决于类似脑室结构的可及性以及目标细胞群体的丰度。然而，在电穿孔之前，必须首先确定脑类器官是否具备足够的质量以进行电穿孔。

适合电穿孔的脑类器官应在外周表现出明显且明亮的类似脑室结构，无退化迹象（如细胞脱落、扩大的凋亡核心），并具有总体致密健康的形态（如无过度生长）（图1B，“可用”）。优先选择具有较大且结构良好的类似脑室结构的脑类器官，以靶向更多数量的细胞。如果类器官的外周区域较暗且未显示任何突出结构，建议不要用于电穿孔，因为缺乏可视标志可能会影响精确的微量注射（图1B，“不可用”）。为获得理想的脑类器官形态，必须确保神经外胚层诱导和基质包埋等关键步骤的时间控制得当。脑类器官形态相关的问题通常源于神经外胚层和/或神经上皮芽形成失败.......

讨论

本文所述方法代表了一种统一的实验方案，用于通过靶向电穿孔技术从不同灵长类物种生成脑类器官。该方法可在模拟灵长类（包括人类）新皮层（病理）生理发育的模型系统中实现目的基因（GOI）的异位表达。这一用于生成灵长类脑类器官的统一方案，在所涉及的四种灵长类物种中均使用相同的材料（如培养基）和操作步骤。不同物种间的发育差异通过调整关键步骤的时间节点来应对（即神经诱导及在基底膜基质中的包埋；见上文）。这可能大致反映了 体内 这些物种之间神经发育的时间差异，构成了一个值得进一步研究的有趣课题。

该方法基于先前一篇关于脑类器官的电穿孔实验研究所描述的技术¹⁰。然而，正如Lancaster及其同事所指出的，这些实验受限于严重的细胞凋亡现象，这是由于绿色荧光蛋白（GFP）浓度过高所致，并导致表达强GFP信号的电穿孔细胞被排除¹⁰。在我们的实验中，我们发现最终总质粒浓度（例如，编码EGFP的质粒浓度加上编码目的基因的质粒浓度）以1,000 ng/µL为最佳。.......

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
20 µL 微量移液器	Eppendorf	5242956003
2-巯基乙醇	Merck	8.05740.0005
35 mm 细胞培养皿	Sarstedt	83.3900
60 mm 细胞培养皿	CytoOne	CC7682-3359
激活素 A（Activin A）	Sigma-Aldrich	SRP3003
AOC1	Selleckchem	S7217
Axio Observer.Z1 倒置荧光显微镜	Zeiss		可由性能相当的荧光显微镜替代
AZD0530	Selleckchem	S1006
B-27 添加剂（含维生素 A（视黄酸，RA））（50x）	Gibco	17504-044
B-27 添加剂（不含维生素 A）（50x）	Gibco	12587-010
BTX ECM 830 方波电穿孔系统	BTX	45-2052
CGP77675	Sigma-Aldrich	SML0314
黑猩猩诱导多能干细胞系 Sandra A			doi: 10.7554/elife.18683
普通狨猴诱导多能干细胞系 cj_160419_5			doi: 10.3390/cells9112422
杜尔贝科改良伊格尔培养基/营养混合物 F-12（DMEM/F12）	Gibco	11320-033
杜尔贝科磷酸盐缓冲液（DPBS）	Gibco	14190-094	pH 7.0−7.3；使用前恢复至室温
快绿染料（Fast Green）	Sigma-Aldrich	F7252-5G
佛司可林（Forskolin）	Selleckchem	2449
GlutaMAX 添加剂（100x）	Gibco	35050-061	谷氨酰胺替代添加剂
肝素（1 mg/mL 储存液）	Sigma-Aldrich	H3149
人诱导多能干细胞系 iLonza2.2			doi: 10.3390/cells9061349
人神经营养因子-3（NT-3）	PeproTech	450-03
胰岛素	Sigma-Aldrich	19278
IWR1	Sigma-Aldrich	I0161
Leica MS5 体视显微镜（MDG 17 透射光底座）	Leica	10473849	可由性能相当的体视显微镜替代
Matrigel	Corning	354277/354234	基底膜基质；也可使用 Geltrex（ThermoFisher Scientific，A1413302）
MEM 非必需氨基酸溶液（100x）	Sigma-Aldrich	M7145
N-2 添加剂（100x）	Gibco	17502-048
Neurobasal 培养基	Gibco	21103-049
Parafilm 封口膜	Sigma-Aldrich	P7793
多聚甲醛	Merck	818715	因具有致癌性，操作时需谨慎
青霉素/链霉素（10,000 U/mL）	PanBiotech	P06-07100
培养皿电极室	自制（见补充文件1）		也可商业购买
预拉制玻璃移液管	WPI	TIP10LT	长锥形硼硅酸盐玻璃移液管，尖端直径 10 µm
促存活化合物（Pro-Survival Compound）	MerckMillipore	529659
重组人/小鼠/大鼠脑源性神经营养因子（BDNF）	PeproTech	AF-450-02
恒河猴诱导多能干细胞系 iRh33.1			doi: 10.3390/cells9061349
StemMACS iPS-Brew XF	Miltenyi Biotech	130-104-368
StemPro Accutase 细胞解离试剂	Gibco	A1110501	蛋白水解和胶原水解酶混合物
TrypLE	Gibco	12604-013	重组胰蛋白酶替代物；使用前恢复至室温
超低吸附 96 孔板	Costar	7007
Y27632	Stemcell Technologies	72305