我们描述了一种通过脑电场测量和相关生物标志物——脑血流量，来评估颅外刺激剂量-反应曲线的实验方案。由于该方案涉及将电极侵入性地植入脑内，因此需要实施全身麻醉，并优先选择自主呼吸而非控制性呼吸。
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摘要
摘要
检测脑血流（CBF）对各种神经元激活形式的反应，对于理解大脑动态功能以及脑组织供血底物的变化至关重要。本文描述了一种测量经颅交流电刺激（tACS）所诱发的CBF反应的实验方案。剂量-反应曲线既根据tACS电流强度（mA）引起的CBF变化进行估计，也根据颅内电场（mV/mm）进行估计。我们基于玻璃微电极在大脑两侧测得的不同幅度来估算颅内电场。本文介绍了实验装置，该装置使用双侧激光多普勒（LD）探头或激光散斑成像（LSI）技术测量CBF；因此，该实验需要麻醉以确保电极植入和记录过程中的稳定性。我们展示了CBF反应与电流强度随年龄变化的相关性，结果显示，在年轻对照组动物（12–14周龄）中，较高电流（1.5 mA和2.0 mA）引起的CBF反应显著大于老年动物（28–32周龄）（p < 0.005 差异）。我们还发现，在电场强度<5 mV/mm时即可引发显著的CBF反应，这一发现对未来的人体研究具有重要意义。这些CBF反应还受到麻醉使用情况（与清醒动物相比）、呼吸控制方式（即插管通气与自主呼吸）、系统性因素（如CO2）以及血管内局部传导（由周细胞和内皮细胞介导）的显著影响。同样，更精细的成像或记录技术可能会将观测视野从全脑限制为仅一个小区域。本文还描述了用于施加tACS刺激的颅外电极的使用方法，包括自制和商用的啮齿类动物电极设计、利用双侧玻璃直流记录电极同步测量CBF和颅内电场的技术，以及成像方法。目前，我们正在将这些技术应用于阿尔茨海默病和脑卒中动物模型中，以实现闭环调控方式增强CBF的目标。
引言
经颅电刺激（tES；采用正弦波刺激时称为tACS）是一种常见的外部非侵入性脑神经调控方法1,2此前，我们提出假设认为，在特定剂量下，经颅电刺激（tES，尤其是经颅交流电刺激tACS）可能增加相应脑区的脑血流量（CBF）3此外，施加的外部电流或颅内电场与相应的脑血流（CBF）反应之间可能存在剂量-效应关系。然而，大多数临床刺激方案均采用在预定时间段内（即30–45分钟）以受试者可耐受的最大舒适皮肤刺激强度（即约2 mA）作为治疗方案4,5在啮齿类动物中，可以使用侵入性颅外脑电极，直接将其放置于颅骨上，以研究经颅电刺激（tES）在脑内诱导的电场。6因此，本方法的目标是确定在相关频率下，经颅交流电刺激（tACS）强度对脑血流（CBF）变化的影响，即建立剂量-反应关系。该剂量-反应曲线基于脑血流的直接测量这一短期生理生物标志物，与施加于大脑的电场相关。3我们先前已表明，在较大振幅下（通常超出临床tACS在脑内诱导的电场范围），诱导的电场与皮层脑血流量（CBF）之间存在近乎线性的相关性。3然而，较小范围的刺激（即1-5 ....
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方案
所有动物实验程序均经杜克大学机构动物护理和使用委员会或监管涉及动物研究的同等地方主管部门批准。有关本实验方案中使用的所有材料、仪器和设备的详细信息，请参见材料表。
1. 仪器准备
- 确保所有必需物品和手术器械均已备齐（图2头皮清洁液（酒精棉片）、胶带、镊子、剪刀以及用于钻制小（0.5 mm）钻孔的钻头。
- 准备用于颅骨表面的颅外电极，并确保如果电极曾被使用过，则已清除其上的任何手术胶残留物。
- 在将这些经颅交流电刺激（tACS）电极应用于颅骨之前，直接验证其阻抗。为此，将两个电极置于生理盐水浴中，并使用tACS刺激器内置的测量功能进行检测。
注意：首选阻抗为 <每对电极的电阻为5 KΩ，以允许足够的电流通过颅骨。刺激器设备在输出恒流脉冲前会检测阻抗，并直接显示其数值。
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结果
代表性结果如图4、图5和图6所示。图4展示了四个通道的示例，其中上方通道为颅内记录电极信号，下方通道为脑血流（CBF）反应。经颅交流电刺激（tACS）在颅骨两侧呈对称分布，但通常情况下，颅内电场反应对于施加的交流电流呈现轻微的不对称性，一侧的反应幅度大于另一侧（图4）。tACS电刺激诱发的CBF反应3在较高刺激强度下（即0.75–2.0 mA，图4B）通常表现为时相性反应，而在较低刺激强度下（0.5–0.75 mA，图4A）则更为持续稳定。由于CBF记录（无论是采用激光散斑成像还是激光多普勒测量）存在噪声并表现出自发性波动，因此在较低刺激强度下，我们对5–10个tACS周期进行.......
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讨论
本方案重点关注 体内，麻醉状态下测量脑血流（CBF）反应作为评估脑对经颅电刺激（tES）反应的生物标志物14长期的tES反应生物标志物包括组织学治疗效应，例如在多种阿尔茨海默病模型中通过40 Hz伽马刺激对淀粉样斑块形成所起到的预防作用或改变。16,17,18,19但短期生物标志物也有助于评估即时生理效应，并用于计算剂量-反应曲线3该相同方案也可用于跨颅骨的慢性tES刺激，但需要将刺激导线引至便于间歇性连接的位置，以实现清醒状态下的刺激。
该方案中的第一个关键步骤是保持双侧刺激电极的低阻抗，并在每次刺激时段测量该阻抗。可通过使用足够的导电膏、颅骨表面的绝缘处理，以及在颅骨钻孔处使用矿物油（以防止电流进入颅内的替代通路.......
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披露
作者声明无利益冲突。
致谢
本研究获得了以下基金项目资助（资助对象：D.A.T.）：NIA RO1 AG074999、NIA R21AG051103、VA I21RX002223 和 VA I21 BX003023。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 酒精棉片 | HenryShein | 112-6131 | |
| 婴儿矿物油 | Johnson & Johnson | ||
| BD 1 mL 注射器 | Becton Dikinson | REF 305699 | |
| C3 平面电极 | Neuronexus | ||
| C57BL/6 小鼠 | 来自 NIH 种群 | ||
| 铜颅骨电极 | 实验室自制 | ||
| Digidata 1440，Clampex | Axon Instruments | ||
| Dumont #5 镊子 | FST | #5 | |
| Dumont #7 弯头镊子 | Dumont | RS-5047 | |
| 眼药膏 | Major | LubiFresh P.M. NDC-0904-6488-38 | |
| Flaming/Brown 微量移液器拉制仪 | Sutter Instrument Co. | Model P-87 | |
| 11.5 cm 轻度弯曲带齿镊子 | Roboz | RS-8254 | |
| Intramedic 23 G 针头 | Becton Dikinson | REF 427565 | |
| 1 M KCl 溶液 | 实验室自制 | ||
| 激光多普勒探头 | Moor Instruments | 0.46 mm 激光多普勒探头 | |
| 激光散斑成像设备 | RWD | RFLSI-ZW | |
| 13 cm 微型刮匙 | FST | 10080-05 | |
| 显微解剖剪刀，11.5 cm | Roboz | RS-5914 | |
| 小鼠麻醉固定装置 | Stoelting | ||
| Neuroconn-DS | Neurocare | DC-Stimulator Plus | |
| PhysioSuite 监测系统 | Kent Scientific | ||
| 棉签 | Fisherbrand | 22363167 | |
| 0.9% NaCl 生理盐水溶液 | Baxter | 281322 | |
| Sensicam QE 相机 | PCO Instruments | ||
| 软件 | Axon Instruments Clampex | ||
| 外科粘合剂 | Covetrus | 31477 | |
| 外科胶带 | 3M Transpore | T9784 |
参考文献
- Bestmann, S., Walsh, V. Transcranial electrical stimulation. Current Biology. 27 (23), R1258-R1262 (2017).
- Bikson, M., et al. Rigor and reproducibility in research with transcranial electrical stimulation: An NIMH-sponsored workshop. Brain Stimulati....
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重印与许可
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