利用哺乳动物锌转运蛋白的表征 体外 锌转运实验

摘要

由于锌转运与蛋白质功能之间的因果关系较弱，且时间分辨率较低，其测量一直具有挑战性。本实验方案介绍了一种利用对 Zn²⁺ 敏感的荧光染料来高时间分辨率监测活细胞 Zn²⁺ 外排的方法，从而直接测定 Zn²⁺ 外流。

摘要

由于锌离子（Zn²⁺）具有细胞毒性，因此必须对其在细胞内的浓度进行严格调控。过去，通常通过测定在不同 Zn²⁺ 浓度条件下转运蛋白的表达水平，间接评估 Zn²⁺ 转运蛋白的活性。这一过程常借助免疫组织化学方法、检测组织中的 mRNA 水平，或测定细胞内 Zn²⁺ 含量来实现。随着细胞内 Zn²⁺ 传感器的发展，目前主要通过荧光探针检测细胞内 Zn²⁺ 的变化，并将其与 Zn²⁺ 转运蛋白的表达水平相关联，从而确定锌转运蛋白的活性。然而，即使在今天，仍仅有少数实验室能够监测细胞内 Zn²⁺ 的动态变化，并直接利用该指标测量锌转运蛋白的活性。部分原因在于，在 ZnT 家族的 10 种锌转运蛋白中，除 ZnT10（转运锰离子）外，只有锌转运蛋白 1（ZnT1）定位于质膜上。因此，将转运活性与细胞内 Zn²⁺ 浓度的变化直接关联存在困难。本文介绍了一种基于锌特异性荧光染料 FluoZin-3 的直接测定锌转运动力学的方法。该染料以其酯化形式被加载到哺乳动物细胞中，并因细胞内的二酯酶活性而在细胞质中被捕获。通过使用 Zn²⁺ 离子载体吡啶硫酮（pyrithione）使细胞加载 Zn²⁺。ZnT1 的活性通过细胞洗脱后荧光下降的线性阶段进行评估。在激发波长 470 nm、发射波长 520 nm 下测得的荧光强度与细胞内游离 Zn²⁺ 浓度成正比。选择表达与 mCherry 荧光蛋白融合标记的 ZnT1 的细胞，可实现仅对表达该转运蛋白的细胞进行监测。该方法可用于研究 ZnT1 蛋白不同结构域在人源 ZnT1（一种将过量锌从细胞中排出的真核跨膜蛋白）转运机制中的作用。

引言

锌是细胞微环境中一种必需的微量元素。它参与了约三分之一的蛋白质构成，并在多种细胞过程中发挥作用，例如催化作用¹、转录调控²以及结构模体的形成³。然而，尽管锌不具备氧化还原活性，高浓度的锌仍会对细胞产生毒性。因此，若缺乏调控锌稳态的机制，任何哺乳动物都无法存活。在哺乳动物中，有三种机制负责这一过程：（1）金属硫蛋白（metallothioneins），这是一类富含半胱氨酸的胞质蛋白，能够高亲和力地结合锌，从而防止胞质中游离锌过量⁴；（2）Zrt/Irt样蛋白（ZIPs），作为锌转运蛋白，介导锌通过质膜或从细胞内细胞器向胞质内流入^4,5,6,7,8；以及（3）ZnTs，属于广泛存在的阳离子扩散促进因子（CDF）家族中的哺乳动物亚群，作为锌转运蛋白，可将锌从胞质中排出至细胞外或转运至细胞内细胞器中^4,5,6,7,8,9。鉴于锌在细胞代谢中的重要性，深入理解细胞内锌的动态变化至关重要。

以往评估锌动态的方法依赖于在不同锌条件下检测mRNA表达水平，并将其与固定组织或细胞的细胞内锌含量测量结果进行关联^10,11,12。这些方法包括化学检测和免疫组织化学染色。然而，这些方法仅能提供间接测量结果，因此只能确定细胞内锌浓度与锌转运蛋白表达之间的离线相关性。因此，这些方法无法推断任何需要高时间分辨率的参数。

一种更直接的Zn²⁺转运测量方法是使用锌的放射性同位素¹³。该方法依赖于对放射性标记的Zn²⁺的检测，以监测锌的转运过程及其动力学特征。然而，由于锌在细胞稳态中的重要性，多种细胞过程共同调控细胞内锌浓度。其中包括细胞外结合以及多个协同作用的转运系统，以严格维持细胞内Zn²⁺水平的稳定。这些过程的共同作用会产生显著的背景噪音，从而难以单独检测与锌相关的特定转运功能。

本文介绍了一种通过使用锌特异性荧光染料FluoZin-3测定细胞内游离锌浓度，从而直接监测锌转运速率的方法。该染料对Zn²⁺具有高度特异性，且受其他二价阳离子（如钙离子）的干扰较小。此外，该染料的酯化形式可通过非离子扩散进入细胞，并因细胞内二酯酶的作用而被截留。因此，其荧光信号主要与细胞质中游离锌的浓度相关。这些实验旨在研究锌转运蛋白1（ZnT1）的结构与功能关系，ZnT1属于ZnT蛋白家族成员。

方案

1. 细胞转染

1. 在添加了10%胎牛血清（FBS）、2 mM L-谷氨酰胺和1×青霉素/链霉素的杜尔贝科改良伊格尔培养基（DMEM）中培养HEK293T细胞（参见 材料表在37 °C、5% CO₂的加湿培养箱中₂ 直至在10 cm培养皿中达到汇合（8.8 × 10⁵）⁶ 总细胞数）。
2. 在12孔板的每个孔中放入一个13 mm盖玻片。将0.44 x 10⁶ 将步骤1.1中胰蛋白酶消化的细胞加入12 mL完全DMEM培养基中，用移液器轻轻吹打3至5次以充分混匀。每孔加入1 mL混悬液。置于37 °C、5% CO₂的加湿培养箱中培养。₂ 过夜。
3. 将每个孔中的完全 DMEM 替换为 1 mL 无血清 DMEM（参见 材料表每个孔中加入） 。将12孔板放回加湿培养箱中，步骤同1.1。
4. 每个转染孔中，将含有目的蛋白并标记有mCherry荧光蛋白的pAAV2质粒1 µg进行稀释（补充文件 1在1.5 mL离心管中，将溶于100 µL无血清DMEM的溶液混合。
5. 加入3 µg聚乙烯亚胺（PEI，参见 材料表) 加入到每次转染的100 µL无血清DMEM中，每次转染使用不同的1.5 mL离心管。质粒与PEI的质量比应为1:3（µg:µg）。
6. 将步骤1.4中的两个试管均进行涡旋振荡 以及步骤1.5 静置10秒，然后在室温下静置至少5分钟。
7. 将步骤1.4中制备的DNA溶液（每孔100 µL）与步骤1.5中制备的PEI溶液（每孔100 µL）等体积混合。涡旋振荡终溶液10秒，室温静置至少20分钟，最长可至6小时。
8. 从培养箱中取出12孔板。将步骤1.7中的终溶液涡旋混匀，然后向步骤1.3中的12孔板各孔中加入200 µL。将12孔板放回湿化培养箱中（步骤1.1）。
9. 孵育3小时后，将每孔中的培养基更换为1 mL完全DMEM。将12孔板放回加湿培养箱中，步骤同1.1。
10. 2天后，从37 °C/5% CO₂培养箱中取出转染后的细胞培养物₂ 孵育箱，并将其置于倒置荧光显微镜下，使用10倍物镜进行观察。
11. 使用显微镜调焦旋钮，在明场光下对细胞进行调焦。
12. 切换至荧光 mCherry 的激发波长（587 nm）和发射波长（610 nm），并关闭明场光源。观察细胞荧光以确认 ZnT1-mCherry 的表达。
13. 配制染料加载溶液。
    1. 取4 µL锌离子特异性荧光染料（参见 材料表) 以其乙酰甲氧基甲酯（AM 酯）形式提供，溶于 DMSO（1 µg/µL），来自避光保存于 −20 °C 冰箱中的储备液。该形式可使染料通过简单扩散穿过质膜进入细胞。
    2. 加入4 µL 10%的普鲁尼克酸（或2 µL 20%的普鲁尼克酸，参见 材料表将8 µL的溶液加入到步骤1.13.1中的等分试样中。用移液器上下吹打混合3次，充分混匀后，将全部8 µL溶液转移至一个1.5 mL离心管中。
    3. 加入750 µL林格氏液（自行配制，参见 材料表 向步骤1.13.2中的试管中加入750 µL裂解缓冲液（含1 mg/mL（约0.1%）牛血清白蛋白），剧烈涡旋振荡。再加入750 µL相同溶液，再次涡旋振荡以确保充分混匀。
14. 加入750 µL步骤1.13.3所得的终溶液 加入新培养板的两个孔中，用铝箔覆盖。
    注意：为避免褪色，从这一步开始，6孔板始终用铝箔覆盖。
15. 使用精细镊子，从转染后的细胞培养板中取出最多四张重复的盖玻片，放入步骤1.14中准备的新6孔板的第一个加样孔中（每孔最多四张盖玻片）。对第二个加样孔重复此操作。
    注意：同一注满液体的孔中的所有盖玻片必须来自相同条件。但不同孔之间可包含不同条件。
16. 用铝箔覆盖，轻轻振荡15-20分钟。
17. 移除染料加载溶液，并替换为新的含白蛋白的任氏液（Ringer's plus albumin）洗涤溶液，其成分同前文所述。 步骤1.13.3. 用铝箔覆盖，再次震荡20分钟。此步骤可使细胞内酯酶裂解AM酯。

2. 显微镜准备

1. 准备好所需的工具（参见材料表）：一台能够检测GFP和mCherry荧光团的倒置荧光显微镜、一个可切换至少两种溶液的灌流系统、一个吸引系统以及一个灌流腔室。
2. 打开显微镜、光源和相机。同时打开吸引系统。
3. 清洗灌流系统。用Ringer溶液清洗第一个腔室，用含有7 µM锌溶液并补充7 µM吡啶硫酮（锌离子载体，参见材料表）的Ringer溶液清洗第二个腔室。为避免产生气泡或空隙，请在每个腔室内保留少量液体。
   注意：由于两个容器通过同一根管道连接至灌流腔室，务必确保共用管段始终用Ringer溶液清洗。
4. 关闭阀门，并按照步骤2.3中的方法，将相应的腔室分别装入Ringer溶液和含锌Ringer溶液。

3. 样品制备

1. 取灌流室，将其放置，使槽的窄边朝上。
   注意：槽是灌流室中央的一个孔洞，用于使灌流液接触细胞。槽的一侧较窄，另一侧较宽。
2. 在槽周围涂抹密封硅胶（见材料表）。使用移液器吸头将槽内的密封硅胶清理干净。
   注意：确保槽周围有足够的硅胶密封，以密封22 mm盖玻片。
3. 使用精细镊子从洗涤液中取出一张盖玻片，将其细胞面朝下放置在槽的上方。这样，在实验过程中细胞将暴露于灌流槽的溶液中。
4. 将一张22 mm盖玻片置于13 mm盖玻片之上，并用镊子夹紧。注意不要压裂盖玻片。
5. 翻转灌流室，按压以排出所有残留液体。向槽内加入100 µL林格氏洗涤液，再次按压以确保无泄漏。
   注意：若发现泄漏，应在泄漏部位补涂密封剂并重新测试。
6. 将灌流室安装至载物台并固定。放置灌流管和吸引管，使灌流液能够流经槽内的细胞。
7. 调节灌流速度至约2 mL/min，开启林格氏溶液的灌流。确保灌流系统正常运行，无泄漏或溢出。

4. 测量准备

1. 通过双击图标打开成像软件（参见材料表）。使用相应的凭据登录，选择连接的相机，然后点击确定。
2. 使用显微镜左侧的按钮将显微镜放大倍数设置为10倍。
3. 选择实时预览模式，并使用操纵杆移动载物台，使沟槽中的细胞聚焦。
4. 在灌注开启状态下，关闭灯光，并通过按下界面中的专用按钮将波长切换至mCherry。使用显微镜的调焦旋钮调整焦距。
5. 当显微镜对准细胞后，使用操纵杆移动载物台，以便选择合适的细胞区域。
   注意：合适的区域是指至少包含10个细胞的感兴趣区域（ROI），以及一个无细胞的空白区域用于背景校正。
6. 选择开启/关闭 ROI下拉菜单，然后选择绘制圆形ROI。
7. 对表达mCherry的细胞簇（表示ZnT1表达）绘制感兴趣区域（ROI）。
8. 从与步骤4.6相同的工具栏中，点击开启/关闭背景ROI按钮，并将背景ROI的位置和大小调整至完全无细胞的区域。
   1. 使用mCherry和EGFP波长进行检查，确保所选的背景ROI区域内无任何细胞。
      注意：波长已设置为mCherry激发波长520 nm、发射波长610 nm；EGFP激发波长470 nm、发射波长520 nm。
9. 选择波长（λ）子选项卡，勾选其复选框，并确认GFP波长已存在且已被选中。若未包含，请添加并勾选。
10. 选择持续时间子选项卡。将测量间隔定义为每5秒一次，并根据实验持续时间调整间隔次数。
11. 在目镜下方的显微镜面板的调焦部分，点击开启按钮以启用完美调焦系统（PFS）。
12. 使用PFS调焦旋钮调整焦距。在软件界面的ND采集下，确保已勾选PFS开启。
13. 点击立即运行。

5. 实验步骤

1. 使用林格氏液灌注，开始90秒的基础期测量。
2. 基础期结束后，关闭林格氏液灌注，然后开启含锌林格氏液灌注。通过点击主界面面板右下角的红色标记来记录溶液切换时间点。此时应观察到荧光信号上升。
3. 当荧光上升趋势开始趋于饱和时，切换回林格氏液灌注。先关闭含锌林格氏液灌注，然后开启林格氏液灌注。
4. 等待实验时间结束。若ZnT1功能正常，应观察到荧光信号明显但稳定地下降。

6. 数据导出

1. 若要导出经过基线扣除的数据，请按下 Subtract Baseline 按钮，并在 "ND acquisition window" 中查看变化。
2. 在 "ND acquisition window" 的软件界面中点击 Export 按钮，将打开一个 Excel 数据表。将其保存至目标位置。

7. 数据分析

1. 针对每个 ROI，使用前 90–100 秒的数据计算平均基础荧光强度。
2. 将每个 ROI 计算得到的荧光强度表示为该 ROI 背景荧光的百分比。
3. 对所有 ROI 取行平均值，并将结果绘制成折线图。由此可获得所有 ROI 随时间变化的平均荧光曲线。
4. 利用线性拟合功能，选取用任氏液洗涤后荧光下降的初始速率。拟合方程的斜率值与转运速率相关。

结果

ZnT1 是一种位于细胞质膜上的哺乳动物锌转运蛋白¹³。它属于阳离子扩散促进因子（CDF）蛋白家族，可将锌从细胞质转运至细胞外环境¹⁴。ZnT1 具有双结构域结构：跨膜结构域负责跨膜转运离子，以及一个C端结构域¹⁴。与其他已知的 CDF 蛋白不同，ZnT1 具有一个延伸的无序C端结构域（USCTD）。目前，该 USCTD 的功能尚不清楚。我们采用上述方案将 ZnT1 野生型与缺失 USCTD 的 ZnT1 进行比较，以评估其在锌转运活性中的作用。

将 HEK 293T 细胞转染含有 ZnT1 WT 或缺失无序 C 末端（ΔUSCTD）的 pAAV2 质粒，并按照上述方法检测其转运活性速率。补充图 1 显示，两种形式的 ZnT1 均能正常表达并定位于质膜，无任何异常。图 1 展示了此类实验的典型结果。荧光强度的增加反映了细胞内 Zn²⁺

讨论

上述方法可实现对细胞内锌浓度的直接测量，并具有高时间分辨率。与其他方法相比，该方法通过监测细胞内 Zn²⁺ 的变化，可显著降低背景噪声。此外，该染料对锌具有选择性，可避免与其他金属阳离子产生潜在的交叉干扰^18,19。最后，该染料无 immediate 细胞毒性，因而可用于活细胞过程的检测¹⁹。

然而，该方法存在一定的局限性。首先，由于本方法所使用的染料设计为滞留在细胞内，但无法靶向特定区域或特定结构，因此检测细胞内动态过程相对更具挑战性。虽然其他荧光染料可被引导至细胞内的特定区域，但遗憾的是其动态范围要小得多²⁰。其次，染料暴露于光照下会导致荧光因漂白而减弱，从而限制了光照时间，进而缩短了实验的有效操作窗口。第三，与使用其他染料（尤其是基因编码染料）相比，该方案中的染料加载过程繁琐且耗时²¹。最后，即使...

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
10 cm 培养皿	greiner bio-one	664160
12 孔细胞培养板	greiner bio-one	665180
13 mm 盖玻片	Superior Marienfeld	111530
22 mm 盖玻片	Superior Marienfeld	101050
6 孔培养板	greiner bio-one	657160
牛血清白蛋白	bioWorld	22070008
无水氯化钙，颗粒状	Sigma Aldrich	C1016	Ringer 溶液中的浓度：1 mM
D-(+)-葡萄糖	Glentham Life Science	GC6947	Ringer 溶液中的浓度：10 mM
Dubelco’s 改良 Eagle 培养基 (DMEM)	Sartorius	01-055-1A
Eclipse Ti 倒置显微镜	Nikon	TI-DH	已停产，由 Eclipse Ti2 取代
胎牛血清 (FBS)	Cytiva	SH30088.03
精细镊子	Dumont	0203-55-PS
Fluozin-3AM	Invitrogen	F24195
HyClone 青霉素-链霉素 100 倍溶液	Cytiva	SV30010
LED 照明系统	CoolLED	pE-4000
L-谷氨酰胺	Biological Industries	03-020-1B
六水合氯化镁	Merck	1.05833	Ringer 溶液中的浓度：0.8 mM
N-[2-羟乙基]哌嗪-N'-[2-乙磺酸] (HEPES)	Formedium	HEPES10	Ringer 溶液中的浓度：10 mM
Neo 5.5 sCMOS 相机	ANDOR	DC-152Q-FI
NIS-Elements 成像软件	Nikon	AR
Pluronic F-127 酸	Millipore	540025
氯化钾	Bio-Lab	163823	Ringer 溶液中的浓度：5.4 mM
吡啶硫酮	Sigma Aldrich	H3261	Ringer 锌溶液中的浓度：7 μM
硅脂试剂盒	Warner Instruments	W4 64-0378
氯化钠	Bio-Lab	190305	Ringer 溶液中的浓度：120 mM
硫酸锌	Sigma Aldrich	31665	Ringer 锌溶液中的浓度：7 μM