利用哺乳动物锌转运蛋白的表征 体外 锌转运实验

摘要

由于锌转运与蛋白质功能之间的因果关系较弱，且时间分辨率较低，其测量一直具有挑战性。本实验方案介绍了一种利用对 Zn²⁺ 敏感的荧光染料来高时间分辨率监测活细胞 Zn²⁺ 外排的方法，从而直接测定 Zn²⁺ 外流。

摘要

由于锌离子（Zn²⁺）具有细胞毒性，因此必须对其在细胞内的浓度进行严格调控。过去，通常通过测定在不同 Zn²⁺ 浓度条件下转运蛋白的表达水平，间接评估 Zn²⁺ 转运蛋白的活性。这一过程常借助免疫组织化学方法、检测组织中的 mRNA 水平，或测定细胞内 Zn²⁺ 含量来实现。随着细胞内 Zn²⁺ 传感器的发展，目前主要通过荧光探针检测细胞内 Zn²⁺ 的变化，并将其与 Zn²⁺ 转运蛋白的表达水平相关联，从而确定锌转运蛋白的活性。然而，即使在今天，仍仅有少数实验室能够监测细胞内 Zn²⁺ 的动态变化，并直接利用该指标测量锌转运蛋白的活性。部分原因在于，在 ZnT 家族的 10 种锌转运蛋白中，除 ZnT10（转运锰离子）外，只有锌转运蛋白 1（ZnT1）定位于质膜上。因此，将转运活性与细胞内 Zn²⁺ 浓度的变化直接关联存在困难。本文介绍了一种基于锌特异性荧光染料 FluoZin-3 的直接测定锌转运动力学的方法。该染料以其酯化形式被加载到哺乳动物细胞中，并因细胞内的二酯酶活性而在细胞质中被捕获。通过使用 Zn²⁺ 离子载体吡啶硫酮（pyrithione）使细胞加载 Zn²⁺。ZnT1 的活性通过细胞洗脱后荧光下降的线性阶段进行评估。在激发波长 470 nm、发射波长 520 nm 下测得的荧光强度与细胞内游离 Zn²⁺ 浓度成正比。选择表达与 mCherry 荧光蛋白融合标记的 ZnT1 的细胞，可实现仅对表达该转运蛋白的细胞进行监测。该方法可用于研究 ZnT1 蛋白不同结构域在人源 ZnT1（一种将过量锌从细胞中排出的真核跨膜蛋白）转运机制中的作用。

引言

锌是细胞微环境中一种必需的微量元素。它参与了约三分之一的蛋白质构成，并在多种细胞过程中发挥作用，例如催化作用¹、转录调控²以及结构模体的形成³。然而，尽管锌不具备氧化还原活性，高浓度的锌仍会对细胞产生毒性。因此，若缺乏调控锌稳态的机制，任何哺乳动物都无法存活。在哺乳动物中，有三种机制负责这一过程：（1）金属硫蛋白（metallothioneins），这是一类富含半胱氨酸的胞质蛋白，能够高亲和力地结合锌，从而防止胞质中游离锌过量⁴；（2）Zrt/Irt样蛋白（ZIPs），作为锌转运蛋白，介导锌通过质膜或从细胞内细胞器向胞质内流入^4,5,6,7,8；以及（3）ZnTs，属于广泛存在的阳离子扩散促进因子（CDF）家族中的哺乳动物亚群，作为锌转运蛋白，可将锌从胞质中排出至细胞外或转运至细胞内细胞器中^4,5

方案

1. 细胞转染

1. 在添加了10%胎牛血清（FBS）、2 mM L-谷氨酰胺和1×青霉素/链霉素的杜尔贝科改良伊格尔培养基（DMEM）中培养HEK293T细胞（参见 材料表在37 °C、5% CO₂的加湿培养箱中₂ 直至在10 cm培养皿中达到汇合（8.8 × 10⁵）⁶ 总细胞数）。
2. 在12孔板的每个孔中放入一个13 mm盖玻片。将0.44 x 10⁶ 将步骤1.1中胰蛋白酶消化的细胞加入12 mL完全DMEM培养基中，用移液器轻轻吹打3至5次以充分混匀。每孔加入1 mL混悬液。置于37 °C、5% CO₂的加湿培养箱中培养。₂ 过夜。
3. 将每个孔中的完全 DMEM 替换为 1 mL 无血清 DMEM（参见 材料表每个孔中加入） 。将12孔板放回加湿培养箱中，步骤同1.1。
4. 每个转染孔中，将含有目的蛋白并标记有mCherry荧光蛋白的pAAV2质粒1 µg进行稀释（补充文件 1在1.5 mL离心管中，将溶于100 µL无血清DMEM的溶液混合。
5. 加入3 µg聚乙烯亚胺（PEI，参见 材料表) 加入到每次转染的100 µL无血清DMEM中，每次转染使用不同的1.5 mL离心管。质粒....

结果

ZnT1 是一种位于细胞质膜上的哺乳动物锌转运蛋白¹³。它属于阳离子扩散促进因子（CDF）蛋白家族，可将锌从细胞质转运至细胞外环境¹⁴。ZnT1 具有双结构域结构：跨膜结构域负责跨膜转运离子，以及一个C端结构域¹⁴。与其他已知的 CDF 蛋白不同，ZnT1 具有一个延伸的无序C端结构域（USCTD）。目前，该 USCTD 的功能尚不清楚。我们采用上述方案将 ZnT1 野生型与缺失 USCTD 的 ZnT1 进行比较，以评估其在锌转运活性中的作用。

将 HEK 293T 细胞转染含有 ZnT1 WT 或缺失无序 C 末端（ΔUSCTD）的 pAAV2 质粒，并按照上述方法检测其转运活性速率。补充图 1 显示，两种形式的 ZnT1 均能正常表达并定位于质膜，无任何异常。图 1 展示了此类实验的典型结果。荧光强度的增加反映了细胞内 Zn²⁺

讨论

上述方法可实现对细胞内锌浓度的直接测量，并具有高时间分辨率。与其他方法相比，该方法通过监测细胞内 Zn²⁺ 的变化，可显著降低背景噪声。此外，该染料对锌具有选择性，可避免与其他金属阳离子产生潜在的交叉干扰^18,19。最后，该染料无 immediate 细胞毒性，因而可用于活细胞过程的检测¹⁹。

然而，该方法存在一定的局限性。首先，由于本方法所使用的染料设计为滞留在细胞内，但无法靶向特定区域或特定结构，因此检测细胞内动态过程相对更具挑战性。虽然其他荧光染料可被引导至细胞内的特定区域，但遗憾的是其动态范围要小得多²⁰。其次，染料暴露于光照下会导致荧光因漂白而减弱，从而限制了光照时间，进而缩短了实验的有效操作窗口。第三，与使用其他染料（尤其是基因编码染料）相比，该方案中的染料加载过程繁琐且耗时²¹。最后，即使.......

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
10 cm 培养皿	greiner bio-one	664160
12 孔细胞培养板	greiner bio-one	665180
13 mm 盖玻片	Superior Marienfeld	111530
22 mm 盖玻片	Superior Marienfeld	101050
6 孔培养板	greiner bio-one	657160
牛血清白蛋白	bioWorld	22070008
无水氯化钙，颗粒状	Sigma Aldrich	C1016	Ringer 溶液中的浓度：1 mM
D-(+)-葡萄糖	Glentham Life Science	GC6947	Ringer 溶液中的浓度：10 mM
Dubelco’s 改良 Eagle 培养基 (DMEM)	Sartorius	01-055-1A
Eclipse Ti 倒置显微镜	Nikon	TI-DH	已停产，由 Eclipse Ti2 取代
胎牛血清 (FBS)	Cytiva	SH30088.03
精细镊子	Dumont	0203-55-PS
Fluozin-3AM	Invitrogen	F24195
HyClone 青霉素-链霉素 100 倍溶液	Cytiva	SV30010
LED 照明系统	CoolLED	pE-4000
L-谷氨酰胺	Biological Industries	03-020-1B
六水合氯化镁	Merck	1.05833	Ringer 溶液中的浓度：0.8 mM
N-[2-羟乙基]哌嗪-N'-[2-乙磺酸] (HEPES)	Formedium	HEPES10	Ringer 溶液中的浓度：10 mM
Neo 5.5 sCMOS 相机	ANDOR	DC-152Q-FI
NIS-Elements 成像软件	Nikon	AR
Pluronic F-127 酸	Millipore	540025
氯化钾	Bio-Lab	163823	Ringer 溶液中的浓度：5.4 mM
吡啶硫酮	Sigma Aldrich	H3261	Ringer 锌溶液中的浓度：7 μM
硅脂试剂盒	Warner Instruments	W4 64-0378
氯化钠	Bio-Lab	190305	Ringer 溶液中的浓度：120 mM
硫酸锌	Sigma Aldrich	31665	Ringer 锌溶液中的浓度：7 μM