人外周血单核源性巨噬细胞内 基质木霉 分生孢子的活力测定

摘要

涉及巨噬细胞吞噬真菌分生孢子的技术被广泛用于评估对真菌免疫反应的调节的研究。本文的目的是提出一种评估分 生孢子木霉 刺激的人外周血单核来源巨噬细胞的吞噬作用和清除能力的方法。

摘要

巨噬细胞是一道重要的防线，负责防止病原体在不同组织中的生长和定植。分生孢子吞噬作用是一个关键过程，可以研究巨噬细胞 - 病原体相互作用中涉及的细胞质和分子事件，以及确定内化分生孢子的死亡时间。涉及巨噬细胞吞噬真菌分生孢子的技术被广泛用于评估对真菌免疫反应的调节的研究。吞噬作用的逃避和吞噬体的逃逸是真菌毒力的机制。在这里，我们报告了可用于分析 T. stromaticum conidia 的吞噬作用、清除率和活力的方法，分生孢子是一种用作生物防治和生物肥料剂并能够诱导人类感染的真菌。该方案包括 1） 木霉 培养，2） 洗涤以获得分生孢子，3） 使用聚蔗糖溶液方法分离外周血单核细胞 （PBMC） 并将 PBMC 分化为巨噬细胞，4） 使用圆形玻璃盖玻片和着色的 体外 吞噬作用方法，以及 5） 清除测定以评估分生孢子吞噬后的分生孢子活力。综上所述，这些技术可用于测量巨噬细胞的真菌清除效率。

引言

木霉属（木霉属:木霉属，科:木霉科木霉属）由无处不在的腐生真菌组成，这些真菌是其他真菌物种的寄生虫，能够产生一系列商业上有用的酶¹。这些真菌种类用于生产异源蛋白质²，生产纤维素³，乙醇，啤酒，葡萄酒和造纸⁴，在纺织工业⁵，食品工业⁶中，以及在农业中作为生物控制剂^7,8。除了对这些真菌物种的工业兴趣外，人类感染数量的增加使一些木霉物种具有机会性病原体^的地位9。

木霉属在培养物中生长迅速，最初有白色和棉质菌落，然后变成黄绿色至深绿色¹⁰.它们适应生活在广泛的pH值和温度条件下，机会主义物种能够在生理pH值和温度下生存，因此可以在不同的人体组织中定植11,12,13。

方案

伦理考虑和人类主体
本研究中描述的所有人类实验均根据《赫尔辛基宣言》和巴西联邦法律进行，并经圣克鲁斯州立大学伦理委员会批准（项目识别代码:550.382/ 2014）。

从巴西巴伊亚州伊列乌斯市的健康志愿者那里收集人类外周血，这些志愿者没有暴露于与所研究真菌相关的职业活动。有健康医疗状况或使用药物的个人被排除在外。所有受试者在参与本研究之前都自愿同意参与并签署了知情同意书。

1.试剂和溶液的制备

注意:在继续之前准备以下试剂和溶液。有关试剂和材料供应商的信息，请参阅 材料表 （TOM）。

1. 制备平衡的无菌磷酸盐缓冲盐水溶液 1x （PBS）。
   注意:在本方案中，未使用不含内毒素的PBS。
2. 制备马铃薯葡萄糖琼脂 （PDA） 培养基，并将 20 mL 倒入每个培养皿中用于 T. stromaticum 培养物。为每个供体准备六个带有PDA的板，并针对每种条件使用一块板:3小时，24小时，48小时，72小时，96小时和120小时。此外，每个对照使用三个板: 三个用于木霉 对照，三个用于R10培养基对照。使用 60 mm x 15 mm 或 100 mm x 15 mm 的培养皿以获得最佳....

结果

涉及巨噬细胞吞噬真菌分生孢子的技术被广泛用于评估对真菌免疫反应的调节的研究。我们利用 T. stromaticum 分生孢子的吞噬作用来评估吞噬作用后分生孢子的活力，因为吞噬作用的逃避和吞噬体的逃逸是真菌毒力的机制。研究人员在研究具有临床意义的物种时，应将这些技术作为首批检测之一。

图2:人外周血单核来源巨噬细胞对 T. stromaticum conidia的吞噬作用。 吞噬动力学的代表性结果 （A） 在 40 倍和 （B） 100 倍物镜下显示含有 T. stromaticum 分生孢子的 PBMC 衍生巨噬细胞。.......

讨论

对于几种真菌病原体，包括烟曲霉、隐球菌、白色念珠菌等，分生孢子或酵母吞噬作用是一个关键过程，可以研究巨噬细胞-病原体相互作用中的细胞质和分子事件，以及确定内化分生孢子的死亡时间14,39,40。吞噬作用是木霉-宿主相互作用的关键过程。木霉属调节多种吞噬途径，包括 Dectin-1 和 Dectin-2、Toll 样受体 2 和 Toll 样受体 4、MHC 和 NF-κB^{25、28、41、42、43}。木霉病在免疫功能低下和非.......

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
15 mL 离心管	康宁	CLS431470	15 mL 离心管，聚丙烯材质，锥形底，带盖，单独无菌
24 孔平底细胞培养板	Kasvi	K12-024	由聚苯乙烯制成，带有字母数字标识;细胞培养板不含 DNase、RNase 和热原，不含细胞毒性物质;经伽马射线灭菌;
细胞培养 CO2 培养箱	Sanyo	303082	CO2 培养箱的作用是创造和控制类似于人体的条件，从而允许不同细胞类型的体外生长和增殖。
离心机微管（eppendorf 型） 1.5 mL	Capp	5101500	由聚丙烯制成，管上附有盖子，只需一只手即可打开和关闭。其内部抛光，可防止蛋白质粘附，并且样品可见，不含 DNase、RNase 和热原
圆形盖玻片 15 mm	Olen	K5-0015	圆形盖玻片用于细胞培养中的显微镜技术。由超透明半透明玻璃制成;厚度为 0.13 mm
II 级 B2 型（总排气）生物安全柜	Esco Lifesciences 集团2010274		Airstream II 类 B2 型生物安全柜 （AB2） 提供产品、作员和环境保护，适用于处理微量有毒化学品和被指定为生物安全等级 I、II 或 III 的试剂的工作。在 II 类 B2 型机柜中，所有流入和的空气在 HEPA/ULPA 过滤后都排到外部环境中，而不会在工作台面上再循环。
葡萄糖马铃薯琼脂培养基	Merck	145	马铃薯葡萄糖琼脂用于酵母和真菌的培养和计数
EDTA 真空采血管	FirstLab	FL5-1109L	EDTA 是血液学常规的推荐抗凝剂，因为它是保存细胞形态的最佳抗凝剂。
Entellan	Merck	1.07961	固定剂;Entellan 是一种用于显微镜永久封片的无水封片剂。
胎牛血清	Gibco	A2720801	胎牛血清 （FBS） 是一种 细胞和组织培养基的通用生长添加剂。FBS 是细胞粘附、生长和增殖所需的大多数因子的天然混合物，对大多数类型的人类和动物（包括昆虫）细胞有效。
平面图标			图像数据库
油	默克	24900988	冷冻保护剂 甘油用于冷冻细胞和孢子
Histopaque-1077			聚蔗糖溶液
图片 J			图像分析软件
显微镜载玻片	Precision	7105	显微镜载玻片 26 x 76 毫米 哑光研磨厚度 1.0 至 1.2 毫米。由特殊光学玻璃制成，包装有丝纸隔板，透明度高，无瑕疵
迷你离心	Prism	C1801	Prism Mini 离心机设计非常紧凑，占地面积极小。包括 2 个可互换的快速释放转子，转速高达 6000 rpm。电子制动器提供快速减速，自动打开的盖子便于取用样品，减少处理时间。
Neubauer 计数室	Kasvi	K5-0011	Neubauer 计数室用于对细胞或其他悬浮颗粒进行计数。
全景快速	Laborclin	620529	Laborclin的  panoptic fast c是一种用于血液学快速染色的试剂盒
青霉素/链霉素溶液 - 10,000U	LGC- 生物技术	BR3011001	抗生素是为了避免层流外部作可能造成的污染。
培养皿 90 x 15 mm 光滑	的 Cralplast	18248	一次性培养皿;由高透明度聚苯乙烯 （PS） 制成;平底;光滑;尺寸：90 x 15 毫米。
磷酸盐缓冲盐水 （PBS）	Thermo Fisher Scientific	10010001	PBS 是一种配方简单的水基盐水溶液。它是等渗的，对大多数细胞无毒。它包括氯化钠和磷酸盐缓冲液，其配方可防止渗透压休克，同时保持活细胞的水平衡。
移液管 巴斯德 3 mL 无菌	Accumax	AP-3-B-S	无菌 ACCUMAX 巴斯德 3 ML 移液管，容量为 3 mL，由透明低密度聚乙烯 （LDPE） 制成，单独无菌
冷冻离心机	Thermo Scientific		Heraeus Megafuge 16R 冷冻离心机是一款冷冻离心机，带有用户友好的控制面板，可轻松预设速度、RCF 值、 运行时间， 温度和运行曲线。Megafuge 16R 的最大速度可达 15,200 RPM，最大 RCF 为 25,830 x g。
RPMI-1640 培养基	Merck	MFCD00217820	HEPES 改良液，含 L-谷氨酰胺和 25 mM HEPES，不含碳酸氢钠，粉末，适用于细胞培养
单通道微量移液器	Eppendorf	Z683809	单通道微量移液器用于准确转移和测量极少量液体。
微量移液器	Corning	4894	为 10 &微量;L 和 1,000 µL 可高压灭菌
的三目倒置显微镜	LABOMED	VU-7125500	它允许您观察试管和瓶子内的细胞，而无需打开它们，从而避免污染问题。