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方法文章

Trichoderma stromaticum 分生孢子在人外周血单核细胞来源巨噬细胞内的活性检测

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DOI：

10.3791/65231

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2023年10月20日

 ,  ,  ,  , 
1Laboratory of Immunobiology - Department of Biological Sciences, State University of Santa Cruz - UESC, 2Università Degli Studi di Genova

* These authors contributed equally

本文内容

摘要

巨噬细胞吞噬真菌分生孢子的技术被广泛用于评估针对真菌的免疫应答调控的研究。本文旨在介绍一种方法，用于评估经Trichoderma stromaticum分生孢子刺激后，人外周血单个核细胞来源的巨噬细胞的吞噬与清除能力。

摘要

巨噬细胞代表了抵御病原体的重要防线，负责防止病原体在不同组织中的生长和定植。分生孢子的吞噬作用是一个关键过程，可用于研究巨噬细胞与病原体相互作用中涉及的胞质和分子事件，并确定被吞噬分生孢子的死亡时间。利用巨噬细胞吞噬真菌分生孢子的技术被广泛用于评估针对真菌的免疫应答调节的研究。逃避吞噬作用以及从吞噬体中逃逸是真菌毒力的机制。本文报道了可用于分析T. stromaticum分生孢子的吞噬、清除及活力的方法，T. stromaticum是一种用作生物防治和生物肥料的真菌，同时也具有引起人类感染的能力。该实验方案包括：1）Trichoderma的培养；2）洗涤以获得分生孢子；3）采用多蔗糖溶液法分离外周血单个核细胞（PBMCs），并将其分化为巨噬细胞；4）使用圆形玻璃盖玻片和染色法进行体外吞噬实验；5）在分生孢子被吞噬后，通过清除实验评估其活力。总之，这些技术可用于测量巨噬细胞对真菌的 清除效率。

引言

该 Trichoderma 属（目：肉座菌目，科：肉座菌科）) 由普遍存在的腐生真菌组成，这些真菌寄生于其他真菌物种，并能够产生一系列具有商业价值的酶1这些真菌物种被用于异源蛋白的生产2，纤维素的生产3乙醇、啤酒、葡萄酒和纸张4，纺织工业中5，食品工业6，以及在农业中作为生物防治剂7,8除了这些真菌物种在工业上的应用价值外，其对人类感染数量的不断增加也引起了一些关注 Trichoderma 机会性病原体的物种状态9.

Trichoderma 属真菌在培养中生长迅速，菌落初期呈白色棉絮状，随后逐渐变为黄绿色至深绿色10。它们能够适应广泛的 pH 和温度条件，其中机会性致病物种可在生理 pH 和体温条件下存活，从而定植于人体多种组织11,12,13。值得注意的是，Trichoderma 属感染率的上升可能与毒力因子有关，但这些因子尚未得到充分研究。此外，针对机会性致病 Trichoderma 物种的免疫应答机制的研究仍较为罕见。

在感染过程中，巨噬细胞与中性粒细胞共同构成负责吞噬作用的防御防线，从而防止病原体在不同组织中的生长和定植。巨噬细胞通过模式识别受体（如Toll样受体和C型凝集素受体）识别并吞噬真菌，并将其转运至吞噬溶酶体，进而引发呼吸爆发、促炎性细胞因子的释放，以及被吞噬微生物的破坏14。然而，吞噬作用的机制可能受到多种微生物策略的影响或逃避，例如真菌细胞的大小和形状；存在阻碍吞噬的荚膜；减少诱导吞噬作用的受体数量；细胞质中肌动蛋白纤维结构的重塑；抑制伪足的形成；以及在吞噬完成后逃逸吞噬体或吞噬溶酶体14。

许多病原体，包括Cryptococcus neoformans，利用巨噬细胞作为在宿主体内存活、播散并引发感染的生态位15。吞噬与清除实验可用于评估宿主对病原体的免疫应答，并鉴定微生物逃逸先天免疫系统的策略15,16,17。此类技术还可用于研究吞噬作用的动力学差异、吞噬体酸化延迟以及氧化爆发，这些因素均可导致真菌杀伤能力下降18。

可采用多种方法评估吞噬作用、真菌存活以及逃避吞噬体成熟过程的情况。这些方法包括：荧光显微镜技术，用于观察吞噬作用、细胞内定位以及吞噬过程中产生的分子19；流式细胞术，可提供关于吞噬作用的定量数据，并用于评估参与该过程的不同标志分子20,21；活体显微镜技术，用于评估微生物的捕获及吞噬体的成熟过程22；抗体介导的吞噬作用检测，用于评估吞噬过程对病原体的特异性23；以及其他方法24,25,26,27。

本文所介绍的方案采用一种常见、低成本且直接的方法，利用光学显微镜结合平板培养测定法，评估巨噬细胞对真菌分生孢子的吞噬与杀灭能力。本方案将为读者提供详细的分步操作指南，用于开展吞噬与清除实验，实验中使用人外周血单个核细胞来源的巨噬细胞与真菌分生孢子共孵育 T. stromaticum. 外周血单个核细胞（PBMCs）被使用是因为 Trichoderma 分生孢子在全球范围内被用作防治植物病原菌的生物防治剂以及农作物的生物肥料，但也已引起多起人类感染病例，称为木霉菌病（Trichodermosis）。此外，目前仅有两项先前研究专注于木霉菌与 Trichoderma 分生孢子与人类免疫系统，其中我们研究了中性粒细胞28 巨噬细胞中的自噬29本文首先展示了分生孢子被吞噬的过程 T. stromaticum 可研究由PBMC来源的巨噬细胞介导的吞噬作用，随后利用基于显微镜的简单技术评估被吞噬分生孢子的存活能力。该方案可进一步促进针对巨噬细胞相关免疫应答或免疫系统调节机制的研究。

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方案

伦理考量与人体受试者
本研究中涉及人类的所有实验均按照《赫尔辛基宣言》及巴西联邦法律进行，并已获得圣克鲁斯州立大学伦理委员会批准（项目识别编号：550.382/ 2014）。

采集自巴西巴伊亚州伊尔埃乌斯市未接触过所研究真菌相关职业活动的健康志愿者的人类外周血。排除有已知健康疾病或正在服药的个体。所有受试者均自愿同意参与，并在纳入本研究前签署知情同意书。

1. 试剂与溶液的准备

注意：在开始之前，请准备好以下试剂和溶液。有关试剂和材料供应商的信息，请参见材料表（TOM）。

  1. 制备1×平衡无菌磷酸盐缓冲液（PBS）。
    注意：本实验方案中未使用无内毒素的PBS。
  2. 制备马铃薯葡萄糖琼脂（PDA）培养基，每皿倒入20 mL，用于T. stromaticum的培养。每个供体准备六块PDA平板，每种条件使用一块平板：3 h、24 h、48 h、72 h、96 h和120 h。此外，每组对照各使用三块平板：三块用于Trichoderma对照，三块用于R10培养基对照。建议使用60 mm × 15 mm或100 mm × 15 mm的培养皿，以获得最佳分生孢子回收效果。
  3. 对100%甘油进行灭菌处理。
  4. 制备用于细胞培养的R10培养基：在RPMI培养基中添加10%胎牛血清和1%抗生素（青霉素/链霉素）。
  5. 对用于细胞裂解的蒸馏水进行灭菌。
  6. 为染色过程准备pH 7.0的水。
    注意：如有必要，使用pH计以及0.1 M/L NaOH和0.1 M/L HCl溶液调节pH。
  7. 对圆形玻璃盖玻片（13 mm）和镊子进行灭菌处理。

2. Trichoderma stromaticum 的培养与处理

  1. 母液（M1）的配制 T. stromaticum:
    注意：需要制备母液（M1），以确保所有实验均使用同一代新鲜培养物（F1）进行。
    1. 培养一个 T. stromaticum PDA 培养皿中的接种物 28 °C 在黑暗中培养7-10天，直至观察到分生孢子且菌落变为绿色。
    2. 洗涤培养物 T. stromaticum用移液管向培养表面加入3-5 mL PBS。从培养板中收集PBS，再次将其分配至培养表面，利用移液管逐步去除分生孢子。重复此操作，直至悬液变为深绿色为止。
      注意：也可通过向培养板中加入 3–5 mL PBS 并轻轻晃动，进行轻柔洗涤，直至悬浮液变为绿色，以回收分生孢子。通过反复吹打，可收集更多分生孢子。
    3. 用移液管将从培养皿中回收的悬浮液转移至一个15 mL无菌离心管中。根据需要重复步骤2.1.2–2.1.3，以获得更多的分生孢子。
    4. 将悬液在 1,160 x g 5 分钟 12 °C，将沉淀重悬于5 mL PBS中。重复此步骤（2.1.4）三次，以获得无菌丝的悬浮液。
      注意：离心后，为充分重悬沉淀，建议短暂涡旋振荡。
    5. 将最终的沉淀重悬于 2–3 mL PBS 中，使用 1:100 或 1:1,000 的稀释比例，在血球计数板中对分生孢子进行计数。
      注意：在最佳条件下，最终浓度为 2 x 108 可从培养物中回收到 conidia/mL. 使用台盼蓝排斥法评估分生孢子活力是可选步骤。
    6. 将孢子悬液（来自步骤2.1.5）按每管0.5 mL分装至1.5 mL无菌离心管中。随后，向每管加入0.5 mL无菌100%甘油，制备M1保存液。短暂涡旋混匀，标记管号，并于−80 °C保存。20 °C 或 −80 °C.
  2. 培养 T. stromaticum 并获取实验所需的分生孢子
    1. 培养皿 10 µL 步骤2.1中制备的M1悬液在PDA中的 28 °C 在黑暗中培养7-10天，直至观察到分生孢子且菌落变为绿色，以获得新鲜的F1代。
      注意：为确保新鲜 T. stromaticum 为实验进行培养，评估真菌生长所需时间以及巨噬细胞分化所需时间。
    2. 收集分生孢子，重复步骤 2.1.2–2.1.4。
    3. 将最终沉淀重悬于2-3 mL PBS中。使用台盼蓝排斥法检测分生孢子活力，或按照步骤2.1.5所述方法计数分生孢子。

3. 外周血单个核细胞（PBMC）的分离

注意：外周血单个核细胞（PBMC）通过密度梯度法获得，使用密度为1.077 g/mL的多蔗糖溶液30。

  1. 为每个待采集的供体样本，取15 mL多糖溶液分装至一个50 mL离心管中。
  2. 使用三到四个EDTA管，从每位供体采集20 mL血液。每项实验至少招募四位供体。不要将不同供体的血液混合；应将每个样本单独使用，作为生物学重复。对于每位供体，将血液转移至一个50 mL离心管中，并加入PBS，使最终体积达到35 mL。
  3. 将血液悬液（步骤3.2）沿含有多糖溶液（步骤3.1）的离心管管壁缓慢加入，形成双相悬液。
    注意：为防止血液与多糖溶液混合，应缓慢加入。建议每位供体至少使用7 mL血液用于PBMC分离。
  4. 立即以1,600 × g、24 °C离心30分钟。对PBMC离心程序进行设置：加速度设为1，减速度设为0，以避免离心过程突然停止。
  5. 离心后观察可见含有PBMC的白色环状层。红细胞和粒细胞位于下层，中间层为多糖溶液，PBMC则位于多糖溶液与血浆（上层）之间的白色环状区域。使用移液器或无菌巴斯德吸管小心吸取该白色环状层，避免吸取红细胞、血浆或多糖溶液，并转移至一个15 mL离心管中。
  6. 向含有PBMC的15 mL离心管中加入PBS，使最终体积达到10 mL。混匀悬液后，以1,600 × g、24 °C离心30分钟。
  7. 用10 mL PBS以1,600 × g、24 °C洗涤细胞三次，每次5分钟。然后将最终沉淀重悬于2 mL R10培养基中。
  8. 采用台盼蓝排斥法评估细胞活力，并在牛鲍计数板中进行细胞计数。

4. 吞噬作用动力学

注意：将人外周血单个核细胞来源的巨噬细胞以感染复数（MOI）为1:10的T. stromaticum分生孢子处理，或仅使用R10培养基作为对照。感染复数（MOI）表示所添加的感染性病原体与感染靶细胞之间的比例，以绝对数值表示：MOI = 病原体:靶细胞31。本实验中，每10个巨噬细胞（靶细胞）使用1个T. stromaticum分生孢子（病原体）。随后，将细胞在37 °C、5% CO2条件下孵育不同时间（3 h、24 h、48 h、72 h、96 h和120 h）。接着，使用圆形玻璃盖玻片在显微镜下观察参与吞噬过程的贴壁巨噬细胞。实验设计示意图见（图1）。

注意：建议使用 24 孔板。

  1. 用人源巨噬细胞与T. stromaticum分生孢子共孵育
    1. 使用无菌镊子将无菌圆形玻璃盖玻片（13 mm）放入每个孔中。
    2. 调整步骤 3.7–3.8 获得的细胞悬液体积，用 R10 培养基将每孔细胞数调至 8 × 105 个，终体积为 1 mL。使用倒置显微镜观察细胞形态。
      注意：细胞必须悬浮于培养基中，并呈圆形形态。
    3. 将细胞在 37 °C、5% CO2 条件下培养 7 天，每 2 天更换一次新鲜 R10 培养基，以诱导单核细胞向巨噬细胞分化32。使用倒置显微镜观察细胞形态。巨噬细胞呈纺锤形，扁平且伸展；可观察到胞质比例增加及伪足形成。寻找贴壁的单核细胞来源巨噬细胞。
      注意：极少数未分化的单核细胞可能仍悬浮于培养基中。
    4. 用移液器吸去每孔中的培养基，并用 1 mL PBS 洗涤细胞，以去除碎片和非贴壁细胞。
    5. 使用步骤 2.2 中制备的悬液，在 R10 培养基中配制新的T. stromaticum分生孢子悬液，终浓度为 8 × 104 个分生孢子/mL。
    6. 向每个处理孔（3 h、24 h、48 h、72 h、96 h 和 120 h）加入 1 mL 步骤 4.1.5 制备的分生孢子悬液，使感染复数（MOI）为 1:10。对照组每孔仅加入 1 mL R10 培养基。
    7. 在 37 °C、5% CO2 条件下，用T. stromaticum分生孢子刺激巨噬细胞 3 小时。3 小时后，吸去培养基，并洗涤细胞以去除未被吞噬的分生孢子。
    8. 向每孔加入 1 mL R10 培养基，并在 37 °C、5% CO2 条件下继续孵育不同时间（3 h、24 h、48 h、72 h、96 h 和 120 h）。
  2. 染色与分析
    1. 在完成相应孵育时间（步骤 4.1.8）后，吸去每孔中的培养基，并向每孔加入 1 mL PBS。
    2. 使用无菌镊子和针头从孔中取出圆形玻璃盖玻片，用于染色试剂盒染色。
      注意：也可选择使用 May-Grünwald-Giemsa 染色法进行染色33。
    3. 向每张圆形玻璃盖玻片依次加入染色固定液（5 秒）、染料 1（5 秒）、染料 2（2 秒）和 pH 7.0 缓冲水（5 秒），以上为染色试剂盒组分。待其自然干燥后，用封片剂将盖玻片固定于载玻片上。
    4. 定量分析结果：对每种时间条件下的 100 个巨噬细胞（Mø）进行计数。使用光学显微镜，采用 100 倍油镜，统计吞噬了分生孢子的巨噬细胞数量（公式 [1])。
      微生物学研究中巨噬细胞吞噬分生孢子百分比的吞噬公式。 (1)
    5. 计算每个巨噬细胞吞噬的分生孢子数量：将 100 个巨噬细胞中所含分生孢子总数除以至少吞噬一个分生孢子的巨噬细胞数量，得到平均吞噬数（公式 [2])34。
      吞噬能力公式示意图；分析含分生孢子巨噬细胞中吞噬分生孢子的比值。 (2)
      ​注意：可使用 ImageJ 软件辅助评估和计数分生孢子35。
    6. 使用 40 倍和 100 倍物镜拍摄各样品在各时间点的吞噬图像，以展示实验结果。

木霉培养过程示意图；PBMC分化实验设置；显微镜分析
图1使用人外周血单核细胞来源巨噬细胞进行吞噬作用与分生孢子活力检测的示意图 (1-10吞噬作用检测： T. stromaticum 必须在PDA培养基中培养，通过用PBS洗涤平板回收分生孢子。PBMC应采用密度梯度屏障法，按照所述方案进行分离，在24孔板中与无菌圆形玻璃盖玻片共同培养7天，使其分化为巨噬细胞，随后以1:10的感染复数（MOI）进行处理，并设置不同的作用时间。取出圆形玻璃盖玻片，使用染色试剂盒染色，结果通过光学显微镜分析。1-8,11-13) 分生孢子活力检测：分离后，将PBMCs在24孔板中培养7天以分化为巨噬细胞，培养时无需圆形玻璃盖玻片。随后以1:10的感染复数（MOI）处理不同时间。细胞需通过加入蒸馏水孵育裂解，悬液离心后，将重悬的沉淀物接种于PDA培养基中，以分析分生孢子的生长动力学 Trichoderma该图使用图像数据库设计而成。 请点击此处以查看此图的放大版本。

5. 吞噬作用后分生孢子活力测定

注意：提供了一个实验设计示意图（图 1）。

注意：使用 24 孔板。

  1. 用人类来源的巨噬细胞进行挑战实验 T. stromaticum 分生孢子
    1. 重复步骤 4.1.2–4.1.8 以诱导单核细胞分化，并用以下方法处理巨噬细胞： T. stromaticum 分生孢子
      注意：不要在孔中使用圆形玻璃盖玻片。应采用与吞噬动力学检测相同的时间间隔，以便将吞噬作用与分生孢子活力相关联。
    2. 评估R10培养基对 T. stromaticum 使用第4.1.5步制备的悬浮液（R10培养基 + 分生孢子）作为对照，进行生长测定。
  2. 分生孢子活力测定
    1. 在每个孵育时间点（3 h、24 h、48 h、72 h、96 h 和 120 h）后移除培养基，用 PBS 洗涤细胞两次，以去除未被吞噬的分生孢子。
      注意：含有 R10 培养基 + 分生孢子的对照组不应洗涤。
    2. 向每个孔中加入 0.5 mL 无菌蒸馏水，并将培养板置于 37 °C 和5% CO₂2 孵育30分钟。此后，在倒置显微镜下观察细胞形态，以确认细胞已裂解。
    3. 收集悬浮液，并转移至1.5 mL离心管中。使用小型离心机以6,000 x g 室温下孵育5分钟。
    4. 小心弃去上清液，将沉淀重悬于 10 µL 无菌蒸馏水，并接种 10 µL 将悬浮液加入含有PDA的培养皿中 28 °C 在暗处。
    5. 制备阳性对照 T. stromaticum 生长：使用悬浮液的 T. stromaticum 分生孢子（步骤2.2）以制备新的悬浮液，终浓度为8 x 106 分生孢子/mL。平板 10 µL PDA 中该悬浮液的 28 °C 在暗处。
      注意： 10 µL 该悬浮液的等分试样将含有相同数量的分生孢子（8 x 10）4用于感染外周血单个核细胞来源的巨噬细胞。此阳性对照与步骤 5.1.2 中提到的阳性对照之间的区别在于，上述步骤 5.1.2 中提及的对照用于评估 R10 培养基对 Trichoderma 吞噬作用期间的生长情况。第5.2.5步中使用悬液进行的该阳性对照 T. stromaticum 在 PBS 中收集的分生孢子作为对照 Trichoderma 在无R10培养基影响下的生长情况，以反映真菌的自然生长状态。通过该对照，可评估R10培养基是否对真菌生长产生影响 木霉属 生长
    6. 观察生长动力学 T. stromaticum 每天在PDA培养基上培养，并拍摄菌落照片。
    7. 分析：可通过两个指标评估结果：1）培养物占据整个培养板所需的时间（以天计）；2）出现特征性绿色色素的时间（以天计） T. stromaticum 培养中的分生孢子

6. 统计学分析

  1. 采用 Kruskal-Wallis 检验确定 8 个组/处理之间的统计学显著性差异。将 p < 0.05 视为具有统计学显著性。所有数据均以均值 ± 标准差（SD）表示。在图中，# 表示在 p < 0.05 水平上具有统计学显著性。

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结果

巨噬细胞吞噬真菌分生孢子的技术被广泛用于评估针对真菌的免疫应答调控的研究。我们采用了巨噬细胞对分生孢子的吞噬作用 T. stromaticum 分生孢子以评估分生孢子在被吞噬后的存活能力，因为逃逸吞噬作用和吞噬体逃逸是真菌毒力的机制。研究人员在研究具有临床意义的真菌物种时，应将这些技术作为首批检测方法之一来实施。

细胞形态随时间变化；40倍、100倍放大下的显微镜图像；延时研究。
图2：吞噬作用 T. stromaticum 人外周血单核细胞来源的巨噬细胞对分生孢子的吞噬作用 吞噬作用动力学的代表性结果A

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讨论

对于包括Aspergillus fumigatus、Cryptococcus、Candida albicans 在内的多种真菌病原体而言，分生孢子或酵母细胞的吞噬作用是研究巨噬细胞与病原体相互作用过程中胞质及分子事件的关键过程，同时也可用于确定被吞噬分生孢子的死亡时间14,39,40。吞噬作用也是Trichoderma与宿主相互作用中的关键过程。 Trichoderma属可调控多种吞噬通路，包括Dectin-1和Dectin-2、Toll样受体2和Toll样受体4、MHC以及NF-κB25,28,41,...

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披露

所有作者均声明无利益冲突。

致谢

本工作得到以下巴西资助机构的支持：巴伊亚州研究支持基金会（FAPESB），资助编号为 RED0011/2012 和 RED008/2014。U.R.S.、J.O.C. 和 M.E.S.M. 分别感谢高等教育人员提升协调办公室（CAPES）和巴伊亚州研究支持基金会（FAPESB）提供的奖学金支持。

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材料

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参考文献

  1. Samuels, G. J. Trichoderma: A review of biology and systematics of the genus. Mycological Research. 100 (8), 923-935 (1996).
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