人外周血单核源性巨噬细胞内 基质木霉 分生孢子的活力测定

摘要

涉及巨噬细胞吞噬真菌分生孢子的技术被广泛用于评估对真菌免疫反应的调节的研究。本文的目的是提出一种评估分 生孢子木霉 刺激的人外周血单核来源巨噬细胞的吞噬作用和清除能力的方法。

摘要

巨噬细胞是一道重要的防线，负责防止病原体在不同组织中的生长和定植。分生孢子吞噬作用是一个关键过程，可以研究巨噬细胞 - 病原体相互作用中涉及的细胞质和分子事件，以及确定内化分生孢子的死亡时间。涉及巨噬细胞吞噬真菌分生孢子的技术被广泛用于评估对真菌免疫反应的调节的研究。吞噬作用的逃避和吞噬体的逃逸是真菌毒力的机制。在这里，我们报告了可用于分析 T. stromaticum conidia 的吞噬作用、清除率和活力的方法，分生孢子是一种用作生物防治和生物肥料剂并能够诱导人类感染的真菌。该方案包括 1） 木霉 培养，2） 洗涤以获得分生孢子，3） 使用聚蔗糖溶液方法分离外周血单核细胞 （PBMC） 并将 PBMC 分化为巨噬细胞，4） 使用圆形玻璃盖玻片和着色的 体外 吞噬作用方法，以及 5） 清除测定以评估分生孢子吞噬后的分生孢子活力。综上所述，这些技术可用于测量巨噬细胞的真菌清除效率。

引言

木霉属（木霉属:木霉属，科:木霉科木霉属）由无处不在的腐生真菌组成，这些真菌是其他真菌物种的寄生虫，能够产生一系列商业上有用的酶¹。这些真菌种类用于生产异源蛋白质²，生产纤维素³，乙醇，啤酒，葡萄酒和造纸⁴，在纺织工业⁵，食品工业⁶中，以及在农业中作为生物控制剂^7,8。除了对这些真菌物种的工业兴趣外，人类感染数量的增加使一些木霉物种具有机会性病原体^的地位9。

木霉属在培养物中生长迅速，最初有白色和棉质菌落，然后变成黄绿色至深绿色¹⁰.它们适应生活在广泛的pH值和温度条件下，机会主义物种能够在生理pH值和温度下生存，因此可以在不同的人体组织中定植11,12,13。重要的是，木霉属感染率的上升可能与毒力因素有关，而这些因素尚未得到很好的研究。此外，专注于了解针对机会性木霉菌种的免疫反应的研究仍然很少见。

在感染期间，巨噬细胞与中性粒细胞一起代表负责吞噬作用的防线，从而防止病原体在不同组织中的生长和定植。使用模式识别受体，如Toll样受体和C型凝集素受体，巨噬细胞吞噬真菌并将它们加工成吞噬溶酶体，从而促进呼吸爆发，促炎细胞因子的释放，以及吞噬微生物^的破坏14。然而，吞噬作用的机制可以受到不同微生物策略的影响和逃避，例如真菌细胞的大小和形状;存在阻碍吞噬作用的胶囊;减少吞噬诱导受体的数量;细胞质中肌动蛋白纤维结构的重塑;阻碍伪足的形成;吞噬体或吞噬溶酶体在吞噬过程后逃逸¹⁴.

许多病原体，包括新型隐球菌，利用巨噬细胞作为在宿主体内生存、传播和诱导感染的生态位¹⁵。吞噬作用和清除测定用于评估对病原体的免疫反应，并鉴定用于逃避先天免疫系统的微生物策略15,16,17。这种类型的技术还可用于检查吞噬作用、延迟吞噬体酸化和氧化爆发的差异动力学，这些动力学导致真菌杀伤减少¹⁸。

可以使用不同的方法来评估吞噬作用、真菌存活和吞噬体成熟过程的逃避。这些包括荧光显微镜，用于观察吞噬作用、细胞位置和吞噬作用过程中产生的分子¹⁹;流式细胞术，其提供吞噬作用的定量数据，并用于评估该过程中涉及的不同标志物^20,21;活体显微镜，用于评估微生物捕获和吞噬体成熟²²;抗体介导的吞噬作用，用于评估病原体吞噬过程的特异性²³;和其他24,25,26,27。

这里介绍的方案采用一种通用的、低成本的、直接的方法，使用光学显微镜和平板生长测定来评估真菌分生孢子的吞噬作用和杀伤作用。该方案将为读者提供使用暴露于 基质锥虫的人外周血单核来源的巨噬细胞进行吞噬作用和清除测定的分步说明。之所以使用PBMC，是因为分生 孢子木霉 被用作对抗植物病原体的生物防治剂和全球植物作物的生物肥料，并引起了几种人类感染，称为木霉病。除此之外，之前只有两篇研究分生 孢子 与人类免疫系统之间相互作用的工作，其中我们研究了中性粒细胞²⁸ 和巨噬细胞²⁹中的自噬。本文首先展示了如何研究PBMC衍生的巨噬细胞对 T. stromaticum 分生孢子的吞噬作用，然后如何使用基于显微镜的简单技术评估被吞噬的分生孢子的活力。该方案可以进一步促进对巨噬细胞相关免疫反应或免疫系统调节相关机制的研究。

方案

伦理考虑和人类主体
本研究中描述的所有人类实验均根据《赫尔辛基宣言》和巴西联邦法律进行，并经圣克鲁斯州立大学伦理委员会批准（项目识别代码:550.382/ 2014）。

从巴西巴伊亚州伊列乌斯市的健康志愿者那里收集人类外周血，这些志愿者没有暴露于与所研究真菌相关的职业活动。有健康医疗状况或使用药物的个人被排除在外。所有受试者在参与本研究之前都自愿同意参与并签署了知情同意书。

1.试剂和溶液的制备

注意:在继续之前准备以下试剂和溶液。有关试剂和材料供应商的信息，请参阅 材料表 （TOM）。

1. 制备平衡的无菌磷酸盐缓冲盐水溶液 1x （PBS）。
   注意:在本方案中，未使用不含内毒素的PBS。
2. 制备马铃薯葡萄糖琼脂 （PDA） 培养基，并将 20 mL 倒入每个培养皿中用于 T. stromaticum 培养物。为每个供体准备六个带有PDA的板，并针对每种条件使用一块板:3小时，24小时，48小时，72小时，96小时和120小时。此外，每个对照使用三个板: 三个用于木霉 对照，三个用于R10培养基对照。使用 60 mm x 15 mm 或 100 mm x 15 mm 的培养皿以获得最佳分生孢子回收率。
3. 灭菌100%甘油。
4. 制备用于细胞培养的 R10 培养基:补充有 10% 胎牛血清和 1% 抗生素（青霉素/链霉素）的 RPMI 培养基。
5. 对蒸馏水进行灭菌以进行细胞裂解。
6. 准备pH值为7.0的水进行着色过程。
   注意:如有必要，使用 pH 计和 0.1 M/L NaOH 和 0.1 M/L HCl 溶液调节 pH。
7. 对圆形玻璃盖玻片（13毫米）和镊子进行消毒。

2. 基质木霉培养和加工

1. T. stromaticum母体（M1）的制备:
   注意:需要母料（M1）以确保所有实验都是从同一新鲜代（F1）的培养物中完成的。
   1. 在28°C的PDA培养皿中在黑暗中生长7-10天，直到观察到分生孢子并且培养物变绿。
   2. 洗涤 T. stromaticum 的培养物。使用移液管向培养表面加入 3-5 mL PBS。从平板中收集PBS，然后再次将其分配到培养物上，以使用移液管逐渐除去分生孢子。根据需要重复此过程，直到悬架变为深绿色。
      注意:或者，建议通过向平板中加入 3-5 mL PBS 然后进行圆周运动来轻轻洗涤培养物，直到悬浮液变绿以回收分生孢子。通过反复移液，可以收集更多的分生孢子。
   3. 用移液管将回收的悬浮液从板转移到 15 mL 无菌管中。根据需要多次重复步骤 2.1.2-2.1.3 以获得更多分生孢子。
   4. 在12°C下以1,160× g 离心悬浮液5分钟，并将沉淀重悬于5mLPBS中。重复此步骤（2.1.4）三次以获得无菌丝悬浮液。
      注意:为了正确重悬颗粒，离心后，建议进行短暂的涡旋。
   5. 将最终沉淀重悬于 2-3 mL PBS 中，并使用 1:100 或 1:1,000 的稀释度在 Neubauer 室中计数分生孢子。
      注意:在最佳条件下，可以从培养物中回收2×10⁸ conidia / mL的终浓度。 使用台盼蓝排除法评估分生孢子的活力是可选的。
   6. 通过向每个试管中加入 0.5 mL 分生孢子悬浮液（来自步骤 2.1.5），将悬浮液分装到 1.5 mL 无菌管中。然后，加入 0.5 mL 无菌 100% 甘油以获得 M1 原液。短暂涡旋，识别管，并在-20°C或-80°C下储存。
2. T . stromaticum 的培养和获得用于实验的分生孢子
   1. 在28°C的PDA中，在黑暗中培养10μLM1悬浮液（在步骤2.1中制备）7-10天，直到观察到分生孢子并且培养物变绿以获得新鲜的F1一代。
      注意:为确保实验的新鲜 基质锥虫 培养物，评估真菌生长所需的时间和巨噬细胞分化所需的时间。
   2. 收集分生孢子，重复步骤2.1.2-2.1.4。
   3. 将最终沉淀重悬于2-3mL PBS中。使用台盼蓝排除法评估分生孢子的活力，或按照步骤2.1.5中提到的分生孢子计数。

3. 外周血单核细胞（PBMC）分离

注:PBMCs是使用密度为1.077 g / mL³⁰的聚蔗糖溶液通过密度屏障法获得的。

1. 将 15 mL 聚蔗糖溶液分装到一个 50 mL 试管中，用于将收集的每个供体样品。
2. 使用三到四个 EDTA 管从每个献血者那里收集 20 mL 血液。每个实验至少招募四名供体。不要汇集献血者的血液;相反，将每个样品单独用作生物学重复。对于每个供体，将血液转移到一个 50 mL 管中，并加入 PBS 以获得 35 mL 的最终体积。
3. 沿着含有聚蔗糖溶液的管壁缓慢转移血液悬浮液（步骤3.2）（步骤3.2）以形成双相悬浮液。
   注意:为防止血液与聚蔗糖溶液混合，请缓慢加入血液。建议使用每位供体至少 7 mL 的血液进行 PBMC 分离。
4. 立即将含有双相悬浮液的管以1,600× g 在24°C离心30分钟。 对 PBMC 的离心进行编程:使用加速 1 和减速 0 以避免离心突然停止。
5. 观察离心后含有PBMC的白色环的形成。红细胞和粒细胞位于下层，下一层包含聚蔗糖溶液，PBMC 位于聚蔗糖溶液和血浆之间的白环（上层）。使用移液管或无菌巴斯德移液管轻轻吸气收集白环，以免捕获红细胞、血浆或聚蔗糖溶液，然后转移到一个 15 mL 试管中。
6. 将 PBS 加入含有 PBMC 的 15 mL 管中，以获得 10 mL 的最终体积。匀浆悬浮液，并在24°C下以1,600× g 离心管30分钟。
7. 用10mLPBS在24°C下以1,600× g 洗涤细胞3次，持续5分钟。然后，将最终沉淀重悬于 2 mL R10 培养基中。
8. 使用台盼蓝排除法评估细胞活力，并在Neubauer室中计数细胞。

4. 吞噬动力学

注意:人外周血单核来源的巨噬细胞以1:10的感染多重性（MOI）或仅R10培养基作为对照用 T. stromaticum conidia 处理。感染的多重性 （MOI） 表示添加到感染目标的传染性病原体的比率，以绝对数字表示:MOI = 病原体:目标³¹。在这里，我们对 10 个巨噬细胞（靶标）使用 1 个 T. stromaticum 分生孢子（试剂）。然后，将细胞在37°C和5%CO₂ 下孵育不同时间段（3小时，24小时，48小时，72小时，96小时和120小时）。接下来，使用圆形玻璃盖玻片在显微镜下观察参与吞噬过程的贴壁巨噬细胞。提供了实验设计图（图1）。

注意:建议使用 24 孔板。

1. 用 T. stromaticum 分生孢子治疗人源性巨噬细胞
   1. 使用无菌镊子向每个孔中加入无菌圆形玻璃盖玻片（13mm）。
   2. 将步骤3.7-3.8中获得的细胞悬液的体积调整至每孔板8×10⁵ 个细胞至最终体积为1mL，并含有R10培养基。使用倒置显微镜评估细胞形态。
      注意:细胞必须悬浮在培养基中并具有圆形形态。
   3. 将细胞在37°C下在5%CO₂ 气氛下孵育7天，并每2天用新鲜的R10培养基替换培养基，以使单核细胞分化为巨噬细胞³²。使用倒置显微镜观察细胞形态。巨噬细胞将呈现纺锤形形态，具有扁平和延伸的形状;还可以观察到细胞质比率增加和伪足的存在。寻找贴壁性单核来源的巨噬细胞。
      注意:极小比例的未分化单核细胞可能仍悬浮在培养基中。
   4. 使用移液管除去每个孔的培养基，并用 1 mL PBS 洗涤细胞以除去碎片和非贴壁细胞。
   5. 使用步骤2.2中制备的悬浮液在R10培养基中制备终浓度为8×10⁴分生孢子/ mL的T.stromaticum conidia的新悬浮液。
   6. 将步骤4.1.5制备的分生孢子悬浮液的1mL加入到每个处理孔（3小时，24小时，48小时，72小时，96小时和120小时）中，以获得1:10的MOI。在对照中，仅向孔中加入 1 mL R10 培养基。
   7. 在37°C下，在5%CO₂气氛下用T. stromaticum conidia挑战巨噬细胞3小时。3小时后，除去培养基，洗涤细胞以除去未吞噬的分生孢子。
   8. 向每个孔中加入1mL R10培养基，并在37°C下在5%CO₂ 气氛下孵育板不同时间（3小时，24小时，48小时，72小时，96小时和120小时）。
2. 着色和分析
   1. 在相应的孵育（步骤4.1.8）完成后，从每个孔中取出培养基，并向该孔中加入1mL PBS。
   2. 使用无菌镊子和针从孔中取出圆形玻璃盖玻片，用染色套件进行着色。
      注意:或者，可以使用 May Grünwald-Giemsa^{染色剂 33} 进行染色。
   3. 在每个圆形玻璃盖玻片中，加入染色固定剂（5 秒）、染料 1（5 秒）、染料 2（2 秒）和 pH 值为 7.0 的缓冲水（5 秒），这些都是染色套件的组成部分。等到它们干燥，然后使用封固剂将盖玻片固定在载玻片上。
   4. 量化结果:对每个时间条件的总共 100 个巨噬细胞 （Mø） 进行计数。使用光学显微镜，使用100倍物镜和浸油计算具有吞噬分生孢子的巨噬细胞的数量（公式[1]）。
      （一）
   5. 获得每个巨噬细胞吞噬的分生孢子数量:将 100 个巨噬细胞中存在的分生孢子除以具有至少一个吞噬分生孢子的巨噬细胞数量（等式 [2]）³⁴。
      （2）
      注意:要评估和计数分生孢子，可以使用^{ImageJ 软件 35}.
   6. 使用40倍和100倍物镜拍摄每个样品和时间条件的吞噬作用，以呈现结果。

图 1:使用人外周血单核来源巨噬细胞的吞噬作用和分生孢子活力测定的示意图。 （1-10）吞噬作用测定:T. stromaticum 必须在 PDA 中生长，并通过用 PBS 洗涤板来回收分生孢子。PBMC应使用所述方案通过密度屏障法分离，在24孔板中用无菌圆形玻璃盖玻片培养7天以分化为巨噬细胞，然后以1:10的MOI处理，时间间隔不同。取出圆形玻璃盖玻片并用染色试剂盒染色，并使用光学显微镜分析结果。（1-8,11-13）分生孢子活力测定:分离后，将PBMC在没有圆形玻璃盖玻片的24孔板中培养7天，以分化为巨噬细胞，然后以不同时间间隔的MOI进行1:10处理。细胞必须通过与蒸馏水孵育来裂解;然后将悬浮液离心，然后将重悬的沉淀接种在PDA中，以分析木霉的生长动力学。该图是使用图像数据库设计的。请点击这里查看此图的较大版本.

5.吞噬作用后的分生孢子活力测定

注意:提供了实验设计图（图1）。

注意:使用 24 孔板。

1. 用 T. stromaticum conidia 挑战人源性巨噬细胞。
   1. 重复步骤4.1.2-4.1.8区分单核细胞，并用分生 孢子锥虫 处理巨噬细胞。
      注意: 不要在孔中使用圆形玻璃盖玻片。使用用于测定吞噬作用动力学的相同时间间隔，以便吞噬作用可以与分生孢子活力相关联。
   2. 通过使用步骤4.1.5（R10培养基+分生孢子）中制备的悬浮液作为对照，评估R10培养基对 T.基质 生长的影响。
2. 分生孢子活力测定
   1. 在每个孵育期（3小时，24小时，48小时，72小时，96小时和120小时）后除去培养基，并用PBS洗涤细胞两次以除去未吞噬的分生孢子。
      注意:含有R10培养基+分生孢子的对照品不应洗涤。
   2. 向每个孔中加入0.5mL无菌蒸馏水，并将板在37°C和5%CO₂ 下孵育30分钟。在此之后，在倒置显微镜下观察细胞形态，以确保细胞已被裂解。
   3. 收集悬浮液，并将其转移到 1.5 mL 试管中。在室温下使用6,000× g 的微型离心机离心悬浮液5分钟。
   4. 小心弃去上清液，将沉淀重悬于10μL无菌蒸馏水中，并将10μL悬浮液接种到28°C的含PDA的平板中。
   5. 制备基 质锥虫 生长的阳性对照:使用 基质锥虫 分生孢子的悬浮液（步骤2.2）制备终浓度为8×10⁶ 分生孢子/mL的新悬浮液。在黑暗中，在28°C的PDA中培养10μL该悬浮液。
      注意:10μL该悬浮液将含有相同数量的分生孢子（8×10⁴），该分生孢子用于感染血液单核来源的巨噬细胞。该阳性对照与步骤5.1.2中提到的对照之间的区别在于，上述步骤5.1.2中提到的对照用于评估R10培养基在吞噬作用期间对 木霉 生长的可能影响。步骤5.2.5中的阳性对照使用PBS中收集的 T. stromaticum conidia悬浮液代表了木 霉 生长的对照，而不受R10培养基的影响，以反映真菌如何自然生长。使用这种对照，可以评估 R10 培养基是否影响 木霉 的生长。
   6. 每天观察PDA中 T. stromaticum 的生长动力学，并拍摄培养物。
   7. 分析:可以使用两点来评估结果:1）培养物占据整个培养板所需的时间（以天为单位），以及2）培养物中 出现T. stromaticum conidia的特征性绿色色素沉着的时间（以天为单位）。

6. 统计分析

1. 使用 Kruskal-Wallis 检验确定 8 组/治疗之间的统计学显着差异。将 p < 0.05 视为具有统计学意义。所有数据均以均值±标准差 （SD） 表示。在图中，# 表示 p < 0.05 时的统计显著性。

结果

涉及巨噬细胞吞噬真菌分生孢子的技术被广泛用于评估对真菌免疫反应的调节的研究。我们利用 T. stromaticum 分生孢子的吞噬作用来评估吞噬作用后分生孢子的活力，因为吞噬作用的逃避和吞噬体的逃逸是真菌毒力的机制。研究人员在研究具有临床意义的物种时，应将这些技术作为首批检测之一。

图2:人外周血单核来源巨噬细胞对 T. stromaticum conidia的吞噬作用。 吞噬动力学的代表性结果 （A） 在 40 倍和 （B） 100 倍物镜下显示含有 T. stromaticum 分生孢子的 PBMC 衍生巨噬细胞。...

讨论

对于几种真菌病原体，包括烟曲霉、隐球菌、白色念珠菌等，分生孢子或酵母吞噬作用是一个关键过程，可以研究巨噬细胞-病原体相互作用中的细胞质和分子事件，以及确定内化分生孢子的死亡时间14,39,40。吞噬作用是木霉-宿主相互作用的关键过程。木霉属调节多种吞噬途径，包括 Dectin-1 和 Dectin-2、Toll 样受体 2 和 Toll 样受体 4、MHC 和 NF-κB^{25、28、41、42、43}。木霉病在免疫功能低下和非...

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
15 mL 离心管	康宁	CLS431470	15 mL 离心管，聚丙烯材质，锥形底，带盖，单独无菌
24 孔平底细胞培养板	Kasvi	K12-024	由聚苯乙烯制成，带有字母数字标识;细胞培养板不含 DNase、RNase 和热原，不含细胞毒性物质;经伽马射线灭菌;
细胞培养 CO2 培养箱	Sanyo	303082	CO2 培养箱的作用是创造和控制类似于人体的条件，从而允许不同细胞类型的体外生长和增殖。
离心机微管（eppendorf 型） 1.5 mL	Capp	5101500	由聚丙烯制成，管上附有盖子，只需一只手即可打开和关闭。其内部抛光，可防止蛋白质粘附，并且样品可见，不含 DNase、RNase 和热原
圆形盖玻片 15 mm	Olen	K5-0015	圆形盖玻片用于细胞培养中的显微镜技术。由超透明半透明玻璃制成;厚度为 0.13 mm
II 级 B2 型（总排气）生物安全柜	Esco Lifesciences 集团2010274		Airstream II 类 B2 型生物安全柜 （AB2） 提供产品、作员和环境保护，适用于处理微量有毒化学品和被指定为生物安全等级 I、II 或 III 的试剂的工作。在 II 类 B2 型机柜中，所有流入和的空气在 HEPA/ULPA 过滤后都排到外部环境中，而不会在工作台面上再循环。
葡萄糖马铃薯琼脂培养基	Merck	145	马铃薯葡萄糖琼脂用于酵母和真菌的培养和计数
EDTA 真空采血管	FirstLab	FL5-1109L	EDTA 是血液学常规的推荐抗凝剂，因为它是保存细胞形态的最佳抗凝剂。
Entellan	Merck	1.07961	固定剂;Entellan 是一种用于显微镜永久封片的无水封片剂。
胎牛血清	Gibco	A2720801	胎牛血清 （FBS） 是一种 细胞和组织培养基的通用生长添加剂。FBS 是细胞粘附、生长和增殖所需的大多数因子的天然混合物，对大多数类型的人类和动物（包括昆虫）细胞有效。
平面图标			图像数据库
油	默克	24900988	冷冻保护剂 甘油用于冷冻细胞和孢子
Histopaque-1077			聚蔗糖溶液
图片 J			图像分析软件
显微镜载玻片	Precision	7105	显微镜载玻片 26 x 76 毫米 哑光研磨厚度 1.0 至 1.2 毫米。由特殊光学玻璃制成，包装有丝纸隔板，透明度高，无瑕疵
迷你离心	Prism	C1801	Prism Mini 离心机设计非常紧凑，占地面积极小。包括 2 个可互换的快速释放转子，转速高达 6000 rpm。电子制动器提供快速减速，自动打开的盖子便于取用样品，减少处理时间。
Neubauer 计数室	Kasvi	K5-0011	Neubauer 计数室用于对细胞或其他悬浮颗粒进行计数。
全景快速	Laborclin	620529	Laborclin的  panoptic fast c是一种用于血液学快速染色的试剂盒
青霉素/链霉素溶液 - 10,000U	LGC- 生物技术	BR3011001	抗生素是为了避免层流外部作可能造成的污染。
培养皿 90 x 15 mm 光滑	的 Cralplast	18248	一次性培养皿;由高透明度聚苯乙烯 （PS） 制成;平底;光滑;尺寸：90 x 15 毫米。
磷酸盐缓冲盐水 （PBS）	Thermo Fisher Scientific	10010001	PBS 是一种配方简单的水基盐水溶液。它是等渗的，对大多数细胞无毒。它包括氯化钠和磷酸盐缓冲液，其配方可防止渗透压休克，同时保持活细胞的水平衡。
移液管 巴斯德 3 mL 无菌	Accumax	AP-3-B-S	无菌 ACCUMAX 巴斯德 3 ML 移液管，容量为 3 mL，由透明低密度聚乙烯 （LDPE） 制成，单独无菌
冷冻离心机	Thermo Scientific		Heraeus Megafuge 16R 冷冻离心机是一款冷冻离心机，带有用户友好的控制面板，可轻松预设速度、RCF 值、 运行时间， 温度和运行曲线。Megafuge 16R 的最大速度可达 15,200 RPM，最大 RCF 为 25,830 x g。
RPMI-1640 培养基	Merck	MFCD00217820	HEPES 改良液，含 L-谷氨酰胺和 25 mM HEPES，不含碳酸氢钠，粉末，适用于细胞培养
单通道微量移液器	Eppendorf	Z683809	单通道微量移液器用于准确转移和测量极少量液体。
微量移液器	Corning	4894	为 10 &微量;L 和 1,000 µL 可高压灭菌
的三目倒置显微镜	LABOMED	VU-7125500	它允许您观察试管和瓶子内的细胞，而无需打开它们，从而避免污染问题。