本方案概述了用于校准的步骤 体内 可见光光学相干断层扫描光纤成像（vis-OCTF）图像 离体 同一小鼠视网膜的共聚焦图像，用于验证所观察到的视网膜神经节细胞轴突束形态 体内 图像
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摘要
摘要
近年来， 体内 视网膜成像技术可无创、实时、纵向地提供关于生物系统与生物过程的信息，现已被 increasingly 用于获取眼病中神经损伤的客观评估。 离体 同一视网膜的共聚焦成像通常是验证结果所必需的 体内 研究结果，尤其是在动物研究中。在本研究中，我们展示了一种用于对齐的 离体 小鼠视网膜的共聚焦图像及其 体内 图像。一种名为可见光光学相干断层扫描纤维成像（vis-OCTF）的新型临床就绪成像技术被用于获取 体内 小鼠视网膜的图像。随后，我们对同一视网膜进行了共聚焦成像 "金标准" 验证 体内 vis-OCTF成像。本研究不仅为进一步探究分子与细胞机制提供了可能，同时也为神经损伤的敏感且客观的评估建立了基础 体内.
引言
视网膜神经节细胞（RGCs）在视觉信息处理中起着关键作用，它们通过内丛状层（IPL）中的树突接收突触输入，并通过视网膜神经纤维层（RNFL）中的轴突将信息传递至大脑1,2,3,4。在青光眼等疾病状态下，早期RGC变性可能导致患者及啮齿类动物模型中RNFL、神经节细胞层（GCL）、IPL以及视神经发生细微变化5,6,7,8,9。因此，早期检测RGC的这些形态学改变对于及时干预、防止RGC丢失和视力损害至关重要。
我们近期开发了一种新型的临床可用成像技术，称为可见光光学相干断层扫描（vis-OCT），以满足对 体内 监测RGC损伤。Vis-OCT提高了轴向分辨率，在视网膜中达到1.3 µm10
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方案
所有动物实验程序均经弗吉尼亚大学机构动物护理和使用委员会批准，并符合美国国立卫生研究院（NIH）关于动物使用指南的规定。有关本实验方案中使用的所有材料、试剂和仪器的详细信息，请参见材料表。
1. 在体 可见光光学相干断层扫描成像
- vis-OCT 系统
- 使用小型动物可视光光学相干断层扫描系统（vis-OCT）对小鼠眼睛进行成像，该系统采用超连续谱光源，提供480 nm至650 nm范围内的可见光照明。确保角膜表面入射功率为1 mW，A扫描速率为25 kHz，每条A扫描的积分时间为39.3 µs。
- 确保光谱仪的光谱检测范围在508 nm至613 nm之间，该范围可在视网膜中实现1.3 µm的轴向分辨率。成像总体积约为700 µm（x）× 700 µm（y）× 1,500 µm（z）。横向分辨率在视场中心处为4.5 µm，在距中心350 µm处为8.7 µm。11,13.
- 小鼠麻醉
- 使用氯胺酮（114 mg/kg）和赛拉嗪（17 mg/kg）混合物对C57BL/6背景的雄性或雌性小鼠进行腹腔注射麻醉，并用1%托吡卡胺滴眼液散瞳。通过用力捏压足....
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结果
将复合的可见光光学相干断层扫描纤维图像与用Tuj-1免疫标记RGC轴突的平铺视网膜共聚焦图像进行比较（图1D，上图）。通过可见光OCTF成像的轴突束可与共聚焦图像中Tuj-1标记的轴突束相对应。在纤维图像中，血管通常表现出与周围轴突束可区分的分支结构，这些结构可与共聚焦图像中ICAM-2标记的血管相对应（图1D，下图）。
并排比较 离体 共聚焦显微镜和 在体 vis-OCT 显示了相同的视网膜神经节细胞（RGC）轴突束网络及周围视网膜血管结构。请注意，共聚焦图像可能无法与之完全匹配 体内 图像，尤其是在周边区域；这是由于视网膜已在载玻片上被展平。综上所述，这些结果验证了可见光光学相干断层扫描纤维成像（vis-OCT fibergraphy）能够分辨出两条尺寸不同的相邻视网膜神经节细胞（RGC）轴突束 体内.
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讨论
本方案中有两个步骤需要特别注意。首先，必须确保动物处于深度麻醉状态，并且瞳孔已充分散大，然后再进行视网膜光学相干断层扫描（vis-OCT）成像。如果小鼠麻醉不充分，其快速呼吸可能导致en face图像出现不稳定运动，从而对纤维图的质量产生不利影响。此外，散瞳不充分也会对图像质量产生负面影响，因为虹膜可能阻挡光线，使其无法到达视网膜。其次，在灌注后、但尚未将眼球从小鼠眼眶中取出之前，必须标记左眼或右眼以及眼睛的颞侧。由于铺平的视网膜是以神经纤维层（RNFL）朝上的方式放置，标记颞侧将有助于正确确定铺平视网膜的方向。
其中一个优势是，只要眼前段透明，适用于光学成像，该方案便可应用于多种小鼠眼部疾病模型，例如视网膜缺血和糖尿病性视网膜病变。然而，该方法的一个局限性在于，即使视网膜在免疫染色和共聚焦成像前已妥善固定，轴突束的形态仍可能发生改变。这通常是由于视网膜剥离过程中操作不当，导致轴突束破裂所致。此外，在成像时视网膜为弯曲的碗状结构 体内，它们在载玻片上被压平以进行共聚焦成像。因此，两者之间可能存在不完全重叠 体内 vis-OCT .......
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披露
Chang, S., 无；Xu, W., 无；Fan, W., 无；McDaniel, J.A., 无；D.A. Miller, 无；M. Grannonico, 无；M. Liu, 无；X. Liu, 无；H.F. Zhang 在 Opticent Health 拥有财务利益，但本工作未获得该公司支持。
致谢
本研究由青光眼研究基金会Shaffer奖、4-CA骑士合作奖、R01EY029121、R01EY035088以及圣殿骑士眼科基金会资助。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 仪器 | |||
| Halo 100 | Opticent Health, Evanston, IL | ||
| Zeiss LSM800 显微镜 | Carl Zeiss | ||
| 药物与抗体 | |||
| 4% 多聚甲醛（PFA） | Santz Cruz Biotechnology, SC-281692 | 1–2 滴 | |
| 牛血清白蛋白粉末 | Fisher Scientific, BP9706-100 | 1:10 | |
| 驴抗小鼠 Alexa Fluor 488 荧光染料 | Thermo Fisher Scientific, Cat# A-21202 | 1:1,000 | |
| 驴抗大鼠 Alexa Fluor 594 荧光染料 | Thermo Fisher Scientific, Cat# A-21209 | 1:1,000 | |
| Euthasol（戊巴比妥钠（390 mg/mL）和苯妥英钠（50 mg/mL）的混合物） | Covetrus, NDC 11695-4860-1 | 15.6 mg/mL | |
| 氯胺酮 | Covetrus, NADA043304 | 114 mg/kg | |
| 小鼠抗 Tuj1 抗体 | 由弗吉尼亚大学 Anthony J. Spano 赠送 | 1:200 | |
| 正常驴血清（NDS） | Millipore Sigma, S30-100 mL | 1:100 | |
| 磷酸盐缓冲液（PBS, 10x），pH 7.4 （含 1370 mM NaCl、27 mM KCl、80 mM Na2HPO4 和 20 mM KH2PO4） | Thermo Fisher Scientific, Cat# J62036.K3 | 1:10 | |
| 大鼠抗 ICAM-2 抗体 | BD Pharmingen, Cat#553325 | 1:500 | |
| 托吡卡胺滴眼液 | Covetrus, NDC17478-102-12 | ||
| Triton X-100 （试剂级） | VWR, CAS: 9002-93-1 | 1:20 | |
| Vectashield 封片剂 | Vector Laboratories Inc. H2000-10 | ||
| 赛拉嗪 | Covetrus, NDC59399-110-20 | 17 mg/kg |
参考文献
- Sernagor, E., Eglen, S. J., Wong, R. O. Development of retinal ganglion cell structure and function. Progress in Retinal and Eye Research. 20 (2), 139-174 (2001).
- Sanes, J. R., Masland, R. H. The types of retinal gangli....
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重印与许可
