可见光光学相干断层扫描光纤图像与同一小鼠视网膜共聚焦图像的配准

摘要

本方案概述了用于校准的步骤 体内 可见光光学相干断层扫描光纤成像（vis-OCTF）图像 离体 同一小鼠视网膜的共聚焦图像，用于验证所观察到的视网膜神经节细胞轴突束形态 体内 图像

摘要

近年来， 体内 视网膜成像技术可无创、实时、纵向地提供关于生物系统与生物过程的信息，现已被 increasingly 用于获取眼病中神经损伤的客观评估。 离体 同一视网膜的共聚焦成像通常是验证结果所必需的 体内 研究结果，尤其是在动物研究中。在本研究中，我们展示了一种用于对齐的 离体 小鼠视网膜的共聚焦图像及其 体内 图像。一种名为可见光光学相干断层扫描纤维成像（vis-OCTF）的新型临床就绪成像技术被用于获取 体内 小鼠视网膜的图像。随后，我们对同一视网膜进行了共聚焦成像 "金标准" 验证 体内 vis-OCTF成像。本研究不仅为进一步探究分子与细胞机制提供了可能，同时也为神经损伤的敏感且客观的评估建立了基础 体内.

引言

视网膜神经节细胞（RGCs）在视觉信息处理中起着关键作用，它们通过内丛状层（IPL）中的树突接收突触输入，并通过视网膜神经纤维层（RNFL）中的轴突将信息传递至大脑^1,2,3,4。在青光眼等疾病状态下，早期RGC变性可能导致患者及啮齿类动物模型中RNFL、神经节细胞层（GCL）、IPL以及视神经发生细微变化^5,6,7,8,9。因此，早期检测RGC的这些形态学改变对于及时干预、防止RGC丢失和视力损害至关重要。

我们近期开发了一种新型的临床可用成像技术，称为可见光光学相干断层扫描（vis-OCT），以满足对 体内 监测RGC损伤。Vis-OCT提高了轴向分辨率，在视网膜中达到1.3 µm^{10, 11}，从而实现对RNFL中单个RGC轴突束的可视化。随后，建立了可见光光学相干断层扫描纤维成像技术（vis-OCTF），用于在小鼠中对RGC损伤进行单轴突束水平的追踪与定量分析。^11,12,13。然而， 离体 为验证同一视网膜的成像结果，通常需要以共聚焦成像作为金标准进行验证 体内 结果。因此，本研究将演示如何对齐 在体 vis-OCTF 获取的图像 离体 同一小鼠视网膜的共聚焦图像。该方案旨在验证 体内 研究结果由 离体 共聚焦成像，并为研究疾病状态下视网膜神经节细胞损伤所涉及的分子与细胞改变奠定基础。

方案

所有动物实验程序均经弗吉尼亚大学机构动物护理和使用委员会批准，并符合美国国立卫生研究院（NIH）关于动物使用指南的规定。有关本实验方案中使用的所有材料、试剂和仪器的详细信息，请参见材料表。

1. 在体 可见光光学相干断层扫描成像

1. vis-OCT 系统
   1. 使用小型动物可视光光学相干断层扫描系统（vis-OCT）对小鼠眼睛进行成像，该系统采用超连续谱光源，提供480 nm至650 nm范围内的可见光照明。确保角膜表面入射功率为1 mW，A扫描速率为25 kHz，每条A扫描的积分时间为39.3 µs。
   2. 确保光谱仪的光谱检测范围在508 nm至613 nm之间，该范围可在视网膜中实现1.3 µm的轴向分辨率。成像总体积约为700 µm（x）× 700 µm（y）× 1,500 µm（z）。横向分辨率在视场中心处为4.5 µm，在距中心350 µm处为8.7 µm。^11,13.
2. 小鼠麻醉
   1. 使用氯胺酮（114 mg/kg）和赛拉嗪（17 mg/kg）混合物对C57BL/6背景的雄性或雌性小鼠进行腹腔注射麻醉，并用1%托吡卡胺滴眼液散瞳。通过用力捏压足趾后 pedal 反射消失来确认麻醉效果充分。
   2. 成像过程中，使用红外加热灯保持小鼠体温。每次图像采集后，涂抹人工泪液以防止角膜脱水。
3. 小鼠成像时的体位摆放
   1. 将麻醉后的小鼠置于动物固定器上，并使用两条尼龙搭扣带将其固定。
      注意：动物固定装置可在三个维度上移动（垂直调节、精细的水平调节，以及俯仰和偏摆调节），以便将激光准确定位于小鼠眼中。
4. 调整成像参数
   1. 打开计算机并启动相关软件，软件将自动开启激光器。
   2. 调整动物固定装置，直至激光在小鼠眼内稳定且居中。通过显微镜观察眼后段 正面观 软件界面预览、浅层血管丛的视野（FOV），以及FOV内视网膜的B扫描横截面图像。
   3. 通过点击获取 vis-OCT 体积图像 获取 在对光学焦点进行微调后，点击软件界面上的按钮，该设置包含每B扫描512条A线和每体积512次B扫描。
      注意：此过程耗时约10.5秒。图像采集由内置的质量指数（QI）评估器引导，以确保图像质量高于预设阈值（QI） < 45）未包含在内。
      1. 对每只小鼠，从同一只眼睛获取四个可见光光学相干断层扫描（vis-OCT）体积数据。将视神经头（ONH）分别对准视场（FOV）的四个角落，以覆盖视网膜的不同区域。
         注意：此位置可最大限度地减小视网膜曲率，从而在整个视场范围内最大化视网膜神经纤维层（RNFL）的反射率。每次采集之间重新定位眼睛约需 1 分钟。图1A，B).
5. Vis-OCTF 分析
   注意：使用 MATLAB 进行图像分析。
   1. 为了从可见光光学相干断层扫描（vis-OCT）体积数据生成 vis-OCT 纤维图，采用基于强度的阈值方法（MATLAB 代码行 808）以检测视网膜表面。
      注意：这些步骤使用了 imadjust 用于调整B-scan的强度值。传递给函数的参数 [0.0087 0.08] imadjust 指定映射到输出图像完整动态范围的强度范围。
   2. 通过选择深度方向前约16 µm的范围来裁剪RNFL。参见Matlab代码第782行。
      注意：典型的 体内 成年野生型C57BL/6小鼠的RNFL厚度约为14 µm，不同分割方法之间可能存在差异¹³.
   3. 更改RAW文件的路径（第9行）、用于重建的文件路径（第11行）以及文件名（第15行），然后点击 运行，等待 MATLAB 代码分析 OCT 图像。沿轴向（z 方向）计算平均强度投影（MATLAB 代码第 905–908 行），生成包含视网膜神经节细胞（RGC）轴突束及周围血管结构的纤维图（fibergram）图像。对每个视野（FOV）经纤维图处理后的四幅图像，使用任意图形编辑软件通过血管结构进行配准并拼接，总覆盖范围约为 1.2 × 1.2 mm。RAW 文件通常保存在以 OCT 成像日期命名的文件夹下的“Halo Data”目录中（例如：0606 Opticent）。
      ​注意：MATLAB 代码可在 补充文件 1.

2. 离体 共聚焦成像

1. 小鼠安乐死
   1. 获取视网膜OCT数据后，使用戊巴比妥钠（390 mg/mL）和苯妥英钠（50 mg/mL）混合物对小鼠实施安乐死。 苯妥英钠通过增强戊巴比妥钠的作用实现安乐死效果，该方法已广泛应用于啮齿类动物的安乐死^14,15。每只小鼠使用稀释后的混合液（156 mg/mL）0.2 mL/20 g，并用20 mL磷酸盐缓冲液（PBS）灌注，随后用20 mL含4%多聚甲醛（PFA）的PBS溶液灌注^16,17。
2. 眼球解剖与定位
   1. 摘除眼球，并在颞侧做标记以指示方向。
   2. 小心移除前房 、晶状体和玻璃体后，将眼杯置于PFA中固定30分钟。
   3. 用PBS清洗眼杯30分钟，并在清洗过程中更换PBS溶液3次。然后用含0.5% Triton X-100的PBS溶液（pH 7.5）清洗30分钟。
   4. 将眼杯在封闭缓冲液（含5%驴血清、2.5%牛血清白蛋白和0.5% Triton X-100的Tris缓冲盐水，pH 7.5）中室温孵育2小时。
3. 免疫染色
   注意：眼杯现已准备好使用初级抗体进行染色，包括小鼠抗Tuj1抗体用于检测视网膜神经节细胞（RGC）轴突束，以及大鼠抗ICAM-2抗体用于检测血管。
   1. 将眼杯与初级抗体在4 °C下过夜孵育，抗体包括小鼠抗Tuj1（1:200稀释于封闭缓冲液中）和大鼠抗ICAM-2（1:500稀释于封闭缓冲液中）。
   2. 用含0.5% Triton X-100的磷酸盐缓冲液（PBST）清洗眼杯3至5次，每次1小时，以降低背景信号并去除未结合的抗体。
   3. 清洗后，将眼杯与次级抗体在4 °C下过夜孵育，次级抗体包括Alexa Fluor 488标记的驴抗小鼠IgG（绿色荧光）和Alexa Fluor 594标记的驴抗大鼠IgG（红色荧光），均以1:1000比例稀释于封闭缓冲液中。
   4. 次日，用PBST清洗眼杯3至5次，每次1小时，以降低背景信号并去除未结合的抗体。
   5. 在进行平铺制片前，将眼杯转移至盛有PBS的培养皿中。
4. 平铺视网膜制备
   1. 完成免疫染色后，在显微镜下将视网膜从眼杯中分离。
   2. 将视网膜切成四片，并以RGC层朝上的方式平铺。保留附着在视网膜颞侧的标记以指示方向。
   3. 使用封片介质覆盖盖玻片^13,18。用指甲油密封载玻片^13,18,19。
5. 共聚焦成像
   注意：共聚焦图像的图像处理使用ZEN显微软件完成。
   1. 打开共聚焦显微镜，在定位模式下通过显微镜目镜找到感兴趣区域。
   2. 在采集模式下设置拼接图像以覆盖整个视网膜，并设置z轴层扫以涵盖所有信息层。在整个视网膜上至少成像25个拼接区域，覆盖总体积为5.99 mm (x) × 5.88 mm (y) × 30 µm (z)，像素大小为1.24 µm/像素。
   3. 将z轴层扫图像投影生成二维表面视图（en face）共聚焦显微图像（图1C,D）^{11,13,19,20,21}。

3. 序列比对 在体 和 离体 图像

1. 处理纤维图后，使用选定的图形编辑软件将每只小鼠获取的四幅图像进行配准，使所有血管对齐，从而生成一幅复合图像。
   注意：最终的复合图像平均尺寸约为 1.2 mm (x) × 1.2 mm (y)，如图1B所示。
2. 以视神经乳头（ONH）和血管分布模式为解剖标志，对复合纤维图进行配准。通过将复合OCT图像的血管模式与同一视网膜经ICAM-2染色后的共聚焦图像进行叠加，实现体内（in vivo）与离体（ex vivo）的对齐。

结果

将复合的可见光光学相干断层扫描（vis-OCT）纤维图像与用Tuj-1免疫标记视网膜神经节细胞（RGC）轴突的平铺视网膜共聚焦图像进行比较（图1D，上图）。vis-OCTF成像的轴突束可与共聚焦图像中Tuj-1标记的轴突束相对应。在纤维图像中，血管通常表现出与周围轴突束可区分的分支结构，这些结构可与共聚焦图像中ICAM-2标记的血管相对应（图1D，下图）。

并排比较 离体 共聚焦显微镜和 体内 vis-OCT 显示了相同的视网膜神经节细胞轴突束网络及周围视网膜血管结构。请注意，共聚焦图像可能与之并非完全匹配 体内 图像，尤其是在周边区域；这是由于视网膜在载玻片上呈扁平铺展状态所致。综上所述，这些结果验证了可见光光学相干断层扫描纤维成像技术（vis-OCT fibergraphy）能够分辨出大小不同的相邻视网膜神经节细胞（RGC）轴突束 体内.

讨论

本方案中有两个步骤需要特别注意。首先，必须确保动物处于深度麻醉状态，并且瞳孔已充分散大，然后再进行视网膜光学相干断层扫描（vis-OCT）成像。如果小鼠麻醉不充分，其快速呼吸可能导致en face图像出现不稳定运动，从而对纤维图的质量产生不利影响。此外，散瞳不充分也会对图像质量产生负面影响，因为虹膜可能阻挡光线，使其无法到达视网膜。其次，在灌注后、但尚未将眼球从小鼠眼眶中取出之前，必须标记左眼或右眼以及眼睛的颞侧。由于铺平的视网膜是以神经纤维层（RNFL）朝上的方式放置，标记颞侧将有助于正确确定铺平视网膜的方向。

其中一个优势是，只要眼前段透明，适用于光学成像，该方案便可应用于多种小鼠眼部疾病模型，例如视网膜缺血和糖尿病性视网膜病变。然而，该方法的一个局限性在于，即使视网膜在免疫染色和共聚焦成像前已妥善固定，轴突束的形态仍可能发生改变。这通常是由于视网膜剥离过程中操作不当，导致轴突束破裂所致。此外，在成像时视网膜为弯曲的碗状结构 体内，它们在载玻片上被压平以进行共聚焦成像。因此，两者之间可能存在不完全重叠 体内 vis-OCT ...

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
仪器
Halo 100	Opticent Health, Evanston, IL
Zeiss LSM800 显微镜	Carl Zeiss
药物与抗体
4% 多聚甲醛（PFA）	Santz Cruz Biotechnology, SC-281692		1–2 滴
牛血清白蛋白粉末	Fisher Scientific, BP9706-100		1:10
驴抗小鼠 Alexa Fluor 488 荧光染料	Thermo Fisher Scientific, Cat# A-21202		1:1,000
驴抗大鼠 Alexa Fluor 594 荧光染料	Thermo Fisher Scientific, Cat# A-21209		1:1,000
Euthasol（戊巴比妥钠（390 mg/mL）和苯妥英钠（50 mg/mL）的混合物）	Covetrus, NDC 11695-4860-1		15.6 mg/mL
氯胺酮	Covetrus, NADA043304		114 mg/kg
小鼠抗 Tuj1 抗体	由弗吉尼亚大学 Anthony J. Spano 赠送		1:200
正常驴血清（NDS）	Millipore Sigma, S30-100 mL		1:100
磷酸盐缓冲液（PBS, 10x），pH 7.4 （含 1370 mM NaCl、27 mM KCl、80 mM Na2HPO4 和 20 mM KH2PO4）	Thermo Fisher Scientific, Cat# J62036.K3		1:10
大鼠抗 ICAM-2 抗体	BD Pharmingen, Cat#553325		1:500
托吡卡胺滴眼液	Covetrus, NDC17478-102-12
Triton X-100 （试剂级）	VWR, CAS: 9002-93-1		1:20
Vectashield 封片剂	Vector Laboratories Inc. H2000-10
赛拉嗪	Covetrus, NDC59399-110-20		17 mg/kg