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方法文章

婴猴手养方法

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DOI：

10.3791/65296

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2023年6月9日

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1Department of Neurology of the Second Affiliated Hospital and Interdisciplinary Institute of Neuroscience and Technology, School of Medicine, Zhejiang University, 2Key Laboratory of Biomedical Engineering of Ministry of Education, College of Biomedical Engineering and Instrument Science, Zhejiang University, 3Rehabilitation Medicine Center, Rehabilitation & Sports Medicine Research Institute of Zhejiang Province, Department of Rehabilitation Medicine, Zhejiang Provincial People’s Hospital, Affiliated People’s Hospital, Hangzhou Medical College, 4NHC and CAMS Key Laboratory of Medical Neurobiology, MOE Frontier Science Center for Brain Science and Brain-Machine Integration, School of Brain Science and Brain Medicine, Zhejiang University

本文内容

摘要

本文介绍了一种在动物培养箱中人工饲养婴猴的方法。该方法显著提高了婴猴的存活率，为研究具有相似遗传背景但在不同产后环境中饲养的婴猴的发育过程提供了可能。

摘要

普通狨猴（Callithrix jacchus）是一种体型小且社会性极强的新世界猴，具有较高的繁殖率，已被证实是生物医学和神经科学研究中极具价值的非人灵长类动物模型。部分雌性狨猴会产下三胞胎；然而，亲猴无法成功抚育全部幼崽。为了挽救这些幼崽，我们开发了一种人工抚育方法用于饲养新生狨猴。本方案中，我们详细描述了饲料配方、喂养时间、温湿度设置，以及人工抚育幼崽向群体环境的适应过程。该人工抚育方法显著提高了狨猴幼崽的存活率（无人工抚育：45%；人工抚育：86%），并为研究具有相似遗传背景但在不同产后环境中成长的狨猴幼崽发育提供了机会。由于该方法实用且易于操作，我们预期其也可被其他从事普通狨猴研究的实验室所采用。

引言

普通狨猴（Callithrix jacchus）是一种小型树栖的新世界猴，原产于南美洲和中美洲。在过去几十年中，由于与其它非人灵长类动物（NHPs）相比，狨猴具有体型较小、易于在圈养条件下饲养和繁殖、妊娠期较短、性成熟较早以及人畜共患病风险较低等多项显著优势，其在生物医学研究中的应用迅速增长1,2,3,4,5,6。普通狨猴的大脑结构和功能与人类相似，具有丰富的发声行为和高度社会化的行为特征，并表现出复杂的情感活动。因此，它已成为多种神经科学研究中极具吸引力的非人灵长类动物模型，例如感觉信息处理7,8,9,10,11,12,13,14、发声交流15,16,17,18,19、脊髓损伤模型20,21,22,23、帕金森病模型24,25,26,27,28以及与年龄相关疾病的研究29。与其他非人灵长类动物相比，普通狨猴具有相对较高的繁殖率，这使其在转基因修饰研究中具有潜在的应用价值30,31,32。此外，这种灵长类动物还被广泛应用于药理学、血管造影、病原体及免疫学研究33,34,35,36,37,38,39。然而，狨猴的供应仍然非常有限，尤其是在中国，难以满足科学研究日益增长的需求。

在狨猴群体中，成年动物每天喂食一至两次，少数机构会对幼年狨猴的饮食进行调整40。通常情况下，婴儿期狨猴会紧紧抓住父亲或年长同胞的身体以获得日常照料，并在一天中多次被交给母亲哺乳。一些雌性狨猴会产下三胞胎，此时由于乳汁不足，其中一个或两个婴儿可能无法存活；此外，部分父母不照顾其幼崽，原因可能是缺乏哺育经验或其他未知因素。这对许多实验室而言是重大损失。已有少数研究报道了圈养条件下成年狨猴的营养管理方法40,41,42，采用不同宏量营养素组成、维生素和矿物质含量的食物与配方，并结合不同的喂食方案进行营养强化（如糊状、凝胶状、纯化或罐头食品）2,41。一项先前的研究报道了一种协作式三胞胎狨猴哺育方法43，即护理人员每天轮流照看其中一个婴儿，全天进行人工喂养，并在次日将其更换为三胞胎中的另一个个体。尽管该方法能使幼崽获得亲代照料，但需要经验丰富的护理人员每天从亲代身上取下幼崽，劳动强度较大。迄今为止，尚无研究报道针对新生狨猴的详细、分步式人工哺育方法。

本研究的目的是为那些对狨猴发育感兴趣但资源有限的研究者提供一种人工哺育方法。与先前的协作哺育方法43相比，本方法是一种对婴儿狨猴家庭干扰更小且易于掌握的替代方案。基于母乳喂养的基本原则以及5年的实践经验，本文介绍了一种人工哺育婴儿狨猴的方法，内容包括食物的制备、喂养时间表、动物培养箱温湿度的设置，以及幼年动物对群体环境的适应过程。

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方案

所有实验程序均经浙江大学动物使用与护理委员会批准，并遵循美国国立卫生研究院（NIH）的指南。

1. 饲养与管理44

  1. 将猴群饲养室设置为12小时光照/12小时黑暗的昼夜循环，温度保持在26–28 °C，相对湿度维持在45%–55%。
  2. 将2–6岁的雄性和雌性狨猴配对饲养，安置于足够空间并具有良好通风条件的笼具（850 mm × 800 mm × 800 mm）中，并配备24小时持续通风系统。
  3. 在笼内提供休息板、秋千、栖木和吊床。
  4. 每日两次为配对的狨猴提供新鲜饮水及30–40 g饲料，饲料包括谷物、鸡蛋、甘薯、蜂蜜、水果、蔬菜和面包虫。
    ​注意：兽医和实验人员必须每天至少检查一次动物设施，确保及时发现病患个体并进行诊断与治疗。

2. 繁殖猴婴儿出生前的准备工作

  1. 妊娠绒猴的护理
    注意：通过触诊诊断受孕时间（通常在胚胎期开始后10-20天），并参考动物个体的繁殖史。
    1. 为繁殖配对提供更大的空间，并尽量减少人为干扰。
    2. 为繁殖配对额外提供如面包虫、鸡蛋、酸奶和干果等食物，以确保雌性营养充足。
    3. 细心照料并频繁检查妊娠绒猴，为其分娩做好准备。
      注意：绒猴的妊娠期约为148天 ± 4.3天45。
  2. 准备以下物品：动物培养箱（855 mm [宽] x 470 mm [长] x 440 mm [高]）、一次性尿垫（M/L尺寸）、婴儿湿巾、毛绒玩具（图1A）、玩具滚筒（图1B）、攀爬架（图1B）、毯子（10 cm х 10 cm，图1C）以及电子天平（精度0.2 g，图1F）。
    ​注意：为避免动物被缠绕，毛绒玩具不应带有环状结构。
  3. 食物及喂养器具的准备
    1. 准备以下物品：婴儿配方奶粉（适用于0-12月龄）、婴儿米糊（适用于0-6月龄）、电热水壶、烧杯（100 mL）、加热垫、塑料称量皿（80 mm x 80 mm x 22 mm，图1D）、无菌离心管（50 mL）、一次性无菌注射器（1-5 mL）、静脉输液器（用于自制喂养奶嘴）（图1E）以及棉签（80-100 cm）。
      注意：为制作喂养奶嘴，可在连接注射器的静脉输液器末端1 cm处剪开一个小口（图1E）。
  4. 记录表格的准备
    1. 为每只新生绒猴准备一份通常为数页的记录表，用于记录基本信息，如名称、出生日期、出生体重、父母信息，以及其他关注的基本信息（如头围和尾长），以及饲养信息，如喂养日期和时间、摄食量（mL）、排便情况（有/无，硬/稀）以及培养箱的温度和湿度。
      ​注意：通常每天测量并记录两次体重，分别在第一次喂食前和最后一次喂食前进行。

狨猴环境丰富化装置，包含毛绒玩具、攀爬架；动物护理研究中的穿戴个人防护装备的护理人员。
图 1：培养箱内物品及喂食工具与配件的照片。 （A）毛绒玩具；（B）玩具滚筒和攀爬架；（C）毯子；（D）塑料称量皿；（E）静脉注射器及配有定制喂食奶嘴的注射器；（F）电子天平；（G）穿戴个人防护装备的护理人员。 请点击此处查看此图的高清版本。

3. 人工哺育程序

  1. 在预定日期前对房间进行清洁和消毒。
    1. 将次氯酸或75%乙醇喷洒于地面和桌面，静置30秒后，用布擦拭桌面，并用拖把清洁地面。
  2. 将培养箱温度设定为35 °C，湿度设定为40%。通常为模拟婴猴的基本温度需求，如表1所示，在出生后第14天（P14）之前，保持培养箱温度为35 °C；从P15开始，每3天降低0.5 °C。培养箱内湿度保持在40%-45%，接近猴群饲养环境的湿度，有助于保持幼猴毛发干燥。
  3. 铺设一次性尿垫以覆盖培养箱底盘。
  4. 为尽量减少幼猴的应激反应，在引入婴猴前，提前在培养箱内放置若干毛毯和毛绒玩具，以模拟成年狨猴的存在。
    注意：毛毯和毛绒玩具应在使用前先置于繁殖对的居住笼内1天。
  5. 将婴猴从居住笼中与其父母分离后，立即放入培养箱，并将其置于毛绒玩具上。
    注意：为避免社会隔离并符合动物福利要求，通常选择两只幼猴共同进行人工哺育。
    1. 喂食前穿戴已灭菌的个人防护装备（PPE，图1G）。
    2. 将数块毛毯预热至35 °C。
    3. 用预热的毛毯轻轻包裹婴猴，并称量其体重作为出生体重。
    4. 用预热的毛毯将婴猴转移至培养箱中。
    5. 按步骤2.4所述进行记录。
  6. 混合食物成分并喂饲婴猴。
    1. 在50 mL无菌离心管中，将5 g婴儿配方奶粉溶于30 mL 50 °C的煮沸水中。
      注意：不同出生后日龄的婴猴需要不同的食物配方。表2列出了从P1至P60日龄期间婴儿配方奶粉、米糊和水的不同剂量。该剂量通常足够一天使用。在首次喂食前混合好食材，剩余食物储存于4 °C冰箱中。每次喂食前将食物加热至30-35 °C。
    2. 用1 mL注射器吸取1 mL食物，并用定制喂食奶嘴封住注射器口。
      注意：请参考表2选择合适尺寸的注射器。
    3. 使用加热板将食物温度维持在30-35 °C。
    4. 喂食前将手预热，并在培养箱内用预热的毛毯一手轻柔地抱住婴猴。
    5. 将喂食奶嘴放入婴猴口中，同时用持抱手的拇指和食指轻轻固定其头部，并以恒定速度缓慢推动注射器输送食物。
      注意：推进速度不得快于婴猴吞咽速度。推进过快可能导致食物经咽喉从鼻腔溢出，引发呛咳，甚至导致肺炎等疾病，严重时可致死亡。若发现食物溢出，婴猴会出现挣扎行为。一旦发生此情况，应立即停止喂食，小心擦拭其面部食物，待婴猴行为恢复正常后再继续喂食。
  7. 婴猴摄入适量食物后，用温水浸湿的棉签擦拭其肛门，既可清洁肛门区域，也有助于促进排便。
  8. 观察动物数分钟，检查其运动能力和排便情况。
  9. 记录喂食时间、摄食量（mL）、排便状态（有/无，硬/稀）以及培养箱的温度和湿度。
    注意：称重时应用预热毛毯包裹婴猴，以防其受凉或受伤。
  10. 通过清除固体粪便或更换新的一次性尿垫，保持培养箱底盘清洁。
  11. 在P50之前，按照步骤3.3–3.7对婴猴进行喂食，并参照表2中的食物成分剂量、喂食时间和频率。
  12. 从P50开始，婴猴通常已具备自主进食能力。
    1. 改用塑料称量皿代替注射器。直接在皿中混合食物成分；具体用量请参见表2。
    2. 将食物皿放入培养箱中，并固定底部以防倾倒。观察数分钟，确保婴猴能够进食。最初几次可通过引导方式，诱使其靠近食物皿并多次引导其口部接触食物，以帮助其学会自主进食。
      ​注意：切勿让动物鼻部接触食物。通常情况下，动物可在1天内学会自主进食。

4. 婴儿绒猴返回种群前的适应期

注意：通常，当婴猴学会自主进食后，手养过程即告结束。在将它们送回狨猴种群的家居笼具之前，需进行若干项适应性操作。

  1. 将婴猴从动物培养箱转移至小型笼子（45 cm × 45 cm × 40 cm），笼子形状类似于鸟笼。在每个小型笼子上悬挂一个水瓶（50 mL）。
  2. 将带有婴猴的小型笼子转移到猴群饲养区，并将其放置在家庭笼子附近。
  3. 使用塑料称量皿单独喂养婴猴一周，食物按整个猴群每日配制的食谱进行混合。
  4. 每天记录一次体重和排便情况。

5. 婴儿狨猴返回家庭笼舍

注意：婴猴在小笼中生活7-10天后，通常能很好地适应群体环境，不再表现出焦虑情绪。

  1. 早晨将婴猴放回家庭笼舍中。
  2. 观察动物至少15分钟，确保家庭成员与新加入的婴猴之间没有发生咬伤、打斗或追逐行为。
    注意：如果出现咬伤、打斗或追逐行为，应尽快将婴猴与其他个体隔离；并尝试在另一天再次将其送回原家庭。若再次失败，则选择另一个家庭进行寄养。优先选择具有丰富育幼经验的家庭群体进行寄养。若无家庭接受该婴猴，则在其新笼舍中放置毛绒玩具陪伴。
  3. 停止对婴猴进行单独喂食，开始使用群体标准饮食进行喂养。
  4. 在婴猴返回家庭笼舍后的1周内，密切观察其活动情况。
  5. 每2天测量一次婴猴的体重，并做好记录。若发现体重下降，需在家庭笼舍内使用注射器额外补充营养食物。
  6. 对婴猴进行日常护理，护理标准与群体中其他狨猴相同。

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结果

体重是动物身体发育的关键指标，在本方案中用作评估狨猴健康状况的指标。在本研究中，人工饲养动物的体重随年龄增长而逐渐增加（图2A，n = 16），与先前研究中新生儿婴儿的体重增长趋势相似46。为了尽量减少对群体中繁殖家庭的干扰，我们未对群体中饲养的婴儿狨猴每日称重。我们仅在出生后1个月及之后获取亲代抚养动物的体重数据，并将其与同龄人工饲养婴儿的体重进行比较。亲代抚养组与人工饲养组的婴儿体重之间无显著差异（P30，人工饲养组：52.25 g ± 2.10 g，n = 18；群体组：57.34 g ± 2.77 g，n = 7；t = −1.3417，P = 0.1928；P60，人工饲养组：91.76 g ± 3.44 g，群体组：93.06 g ± 4.68 g；t= −0.2019，P = 0.8424；Student's t-test）（图2B）。

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讨论

普通狨猴是生物医学和神经科学研究中非常有用的非人灵长类动物模型。然而，狨猴资源过于有限，难以满足日益增长的研究需求。在本研究中，我们建立了一种人工哺育方法，该方法不仅提高了狨猴婴儿的存活率，还为研究其出生后发育提供了机会。这种人工哺育方法具有实用性且易于掌握，因此可方便地推广应用于其他从事普通狨猴研究的实验室。

一些先天性缺陷通常在出生后的前两周内出现。迄今为止，我们已发现多例新生狨猴存在眼睑、肺、肠道和脑部的先天缺陷，这些个体极少能存活至出生后第14天（P14）。因此，P1至P14是通过人工哺育方法筛选出健康新生狨猴的关键时期。此外，若婴儿期的狨猴因父母疏忽或乳汁不足而从母体脱落，它们也无法存活。因此，人工哺育方法有助于挽救其生命。在本研究中，未采用人工哺育时，存活率为45%（n = 13/29），而应用人工哺育方法后，存活率提高至86%（n = 25/29）。

有几点需要特别注意。护理人员在喂食时必须保持耐心；推进注射器过快是不可取的，因为这会妨碍婴猴吞咽，可能导致呛咳或肠梗阻，从而损害动物的呼吸系统或消化系统。喂食过程中...

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披露

作者声明无利益冲突。

致谢

作者感谢李明轩对本文初稿的语法修改与润色。本工作得到中国浙江省自然科学基金（LD22H090003）、国家自然科学基金（32170991 和 32071097）、科技创新2030重大项目 2021ZD0204100（2021ZD0204101）和 2022ZD0205000（2022ZD0205003）以及教育部脑科学前沿科学中心的资助。 & 脑机融合，浙江大学

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
动物培养箱RCOM, 韩国MX - BL600N, 855 mm (W) x 470 mm (L) x 440 mm (H)
婴儿奶粉Meadjohnson, 美国适用于0-12月龄，执行标准 - GB25596
婴儿米糊HEINZ, 中国适用于0-6月龄，执行标准 - GB10769
婴儿湿巾babycare, 中国柔软
烧杯ShuNiu, 中国100 mL
毯子Grace, 中国10 cm × 10 cm, 柔软
攀爬架WowWee, 中国牢固且无细小环状结构
一次性吸水垫Hi Health Pet, 中国M或L号均可
一次性无菌注射器Cofoe, 中国1 mL, 2.5 mL, 3 mL, 5 mL, 10 mL
电子天平YouSheng, 中国量程0至6,000 g，精度0.2 g
静脉注射器HD, 中国0.55 mm x 20 mm 针头
电热水壶FGA, 中国保温电水壶 1,500 mL
乳果糖BELCOL, 中国用于缓解便秘
塑料称量皿SKSLAB, 中国80 mm x 80 mm x 22 mm，用作小碗
毛绒玩具Lebiyou, 中国柔软
益生菌粉剂G-Pet, 中国用于调节胃肠道环境
无菌离心管NEST, 中国50 mL
拭子OYEAH, 中国80 - 100 mm
玩具滚筒WowWee, 中国牢固且无细小环状结构

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