通用分子保留的11倍扩展显微技术

摘要

本文介绍了一种扩展显微镜技术（ExM）的新版本——Magnify，该技术经过改进后可实现高达11倍的扩展，能够保留多种生物分子类别，并适用于多种组织类型。该方法使得利用常规的衍射受限显微镜即可对生物分子的纳米级构型进行研究。

摘要

生物样本的纳米级成像有助于加深对疾病发病机制的理解。近年来，扩张显微镜技术（ExM）已被证明是一种有效且低成本的光学超分辨率显微镜替代方案。然而，该技术受限于需要特定且通常是定制的锚定试剂，以在凝胶中保留不同类别的生物分子，同时也难以处理标准的临床样本形式，例如福尔马林固定石蜡包埋组织，尤其是在需要较大扩张倍数或保留蛋白质表位的情况下。本文介绍了一种名为 Magnify 的新型 ExM 方法，可在多种组织类型中实现高达 11 倍的稳定扩张。通过使用甲基丙烯醛作为组织与凝胶之间的化学锚定剂，Magnify 能够在凝胶中保留多种生物分子（如蛋白质、脂质和核酸），从而可在常规光学显微镜上对组织进行广泛的纳米级成像。本实验方案描述了确保组织稳定且无裂纹扩张的最佳操作实践，以及处理和成像高度扩张凝胶的实用技巧。

引言

生物系统 在结构上具有异质性，从肢体和器官到纳米尺度的蛋白质均是如此。因此，要全面理解这些系统的运行机制，需要在这些不同尺度上进行可视化观察。然而，光的衍射极限使得在常规荧光显微镜下观察小于约200-300 nm的结构面临挑战。此外，尽管诸如受激辐射损耗（STED）、光激活定位显微镜（PALM）、随机光学重建显微镜（STORM）和结构照明显微镜（SIM）等光学超分辨率方法^1,2,3功能强大，但它们自身也存在挑战，例如需要昂贵的硬件和试剂，且通常成像速度较慢，在三维空间中对大体积样本成像的能力较差。

扩展显微技术⁴ （扩展显微技术，ExM）通过将生物分子共价锚定于可吸水膨胀的聚合物凝胶中，并通过物理方式将其分离，从而在常规光学显微镜下实现对原本受光衍射极限限制的结构的分辨，为突破光学衍射极限提供了另一种途径。自该技术首次发表以来，已发展出多种ExM实验方案变体。 ExM 出现还不到十年，这些方案允许蛋白质的直接整合^5,6,7，RNA

方案

所有涉及动物的实验操作均按照美国国立卫生研究院（NIH）指南进行，并经卡内基梅隆大学机构动物护理与使用委员会批准。人体组织样本为商业获取。

1. 储备试剂和溶液的配制

注意：所用试剂的列表请参见材料表。

1. 配制凝胶用储备液。这些储备液将在凝胶步骤前立即混合使用。
   1. 使用 表1 中列出的组分配制单体储备液（每100 mL含 N,N-二甲基丙烯酰胺酸 [DMAA] 4 g、丙烯酸钠 [SA] 50 g、丙烯酰胺 [AA] 66.7 g、N,N′-亚甲基双丙烯酰胺 [Bis] 0.10 g、氯化钠 [NaCl] 33 g，并含有1×磷酸盐缓冲液 [PBS]）。将所有储备液组分溶于水或用水稀释。单体储备液可在4 °C下保存至少3个月。
   2. 分别用水配制以下储备液：0.5% (w/w) 4-羟基-TEMPO (4HT)，用于抑制单体扩散进入组织过程中的凝胶化反应；以及10% (w/w) 四甲基乙二胺 (TEMED)，用于加速过硫酸铵 (APS) 引发的自由基生成，该溶液按10% (w/w) 配制。
      ​注意：上述储备液可分装为1–2 mL等份，在4 °C下保存不超过3个月；但APS溶液需在配制凝胶溶液前新鲜制备。

结果

如果实验方案成功完成（图1），样品在热变性后应呈现清澈且平整的状态；任何折叠或起皱现象均表明匀质化不完全。成功扩增的样品在1x PBS中体积将扩大3-4.5倍，在ddH₂O中完全扩增后体积将扩大8-11倍。图3展示了采用本方案处理的5 µm厚福尔马林固定石蜡包埋（FFPE）人肾组织样品在扩增前后的示例图像，该样品成功实现了超过8倍的扩增。组织首先使用针对ACTN4的抗体以及DAPI染色，以显示细胞核DNA。随后使用转盘共聚焦显微镜进行成像（图3A）。接着按照上述方案对组织进行处理，包括扩增后对相同靶标重新染色，并在水中完全扩增（图3B）后再次成像。在热变性完成后，除蛋白质外的其他生物分子也可进行染色和成像，如图4所示。脂溶性染料可用于揭示小鼠脑组织中的细胞膜和线粒体膜结构（图4A.......

讨论

本文介绍了Magnify技术方案¹⁷，这是一种扩展显微技术（ExM）的变体，能够通过单一化学锚定剂保留多种生物分子，并利用热变性处理将难以处理的福尔马林固定石蜡包埋（FFPE）临床样本扩展至原来的11倍。本方案与其他ExM方案的关键区别在于采用了重新配制的凝胶，该凝胶即使在完全膨胀后仍保持良好的机械强度，同时使用甲基丙烯醛（methacrolein）作为生物分子的锚定剂。本方案中最关键的步骤如下：1）终末凝胶溶液的组成；2）凝胶化步骤的时间控制；3）凝胶化反应室的设置；4）样本均质化的参数设定；5）在扩增后染色前，必须充分洗去样本中的十二烷基硫酸钠（SDS）。

该方案最关键的参数是终末凝胶溶液的组成，尤其是生物分子锚定剂甲基丙烯醛的浓度。不同类型的组织需要不同的甲基丙烯醛浓度（表3），因此必须谨慎选择与待扩增样本相匹配的浓度。甲基丙烯醛锚定过度会导致扩增倍数降低，并减少扩增后染色可用的表位；而锚定不足，尤其是在福尔马林固定石蜡包埋（FFPE）的临床样本中，可能导致组织开裂或形变。因此，对于尚未验证的组.......

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
4-羟基-TEMPO (4HT)	Sigma Aldrich	176141	抑制剂
6孔玻璃底培养板 (#1.5 盖玻片)	Cellvis	P06-1.5H-N
丙烯酰胺	Sigma Aldrich	A8887	凝胶单体组分
过硫酸铵 (APS)	Sigma Aldrich	A3678	引发剂
DAPI (1 mg/mL)	Thermo Scientific	62248
十乙二醇单十二醚 (C12E10)	Sigma Aldrich	P9769	非离子型表面活性剂
金刚石刀片 No. 88 CM	General Tools	31116
乙醇	Pharmco	111000200
乙醇	Pharmco	111000200
乙二胺四乙酸 酸 (EDTA) 0.5 M	VWR	BDH7830-1	匀浆缓冲液组分
镊子
甘氨酸	Sigma Aldrich	G8898	匀浆缓冲液组分
肝素	Sigma Aldrich	H3393
甲基丙烯醛	Sigma Aldrich	133035	锚定剂
显微盖玻片 #1 (24×60 mm)	VWR	48393 106
显微盖玻片 #1.5 (24×60 mm)	VWR	48393 251
N,N,N′,N′- 四甲基乙二胺 (TEMED)	Sigma Aldrich	T9281	加速剂
N,N′-亚甲基双丙烯酰胺 (Bis)	Sigma Aldrich	M7279	凝胶单体组分
N,N-二甲基丙烯酰胺 (DMAA)	Sigma Aldrich	274135	凝胶单体组分
Nunclon 4孔×5 mL 多孔细胞培养皿	Thermo Fisher	167063
Nunclon 6孔细胞培养皿	Thermo Fisher	140675
Nunc™ 15 mL 离心管	Thermo Fisher	339651
Nunc™ 50 mL 离心管	Thermo Fisher	339653
旋转摇床
画笔
pH计
磷酸盐缓冲液 (PBS), 10x 溶液	Fischer Scientific	BP399-1
聚乙二醇 200	Sigma Aldrich	P-3015
蛋白酶K (分子生物学级)	Thermo Scientific	EO0491
剃须刀片	Fischer Scientifc	12640
SafeLock 微量离心管 1.5 mL	Thermo Fisher	3457
SafeLock 微量离心管 2.0 mL	Thermo Fisher	3459
丙烯酸钠 (SA)	AK Scientific	R624	凝胶单体组分
叠氮化钠	Sigma Aldrich	S2002
氯化钠	Sigma Aldrich	S6191
柠檬酸三钠二水合物	Sigma Aldrich	C8532-1KG
十二烷基硫酸钠 (SDS)	Sigma Aldrich	L3771	匀浆缓冲液组分
Tris碱	Fischer Scientific	BP152-1	匀浆缓冲液组分
吐温X-100	Sigma Aldrich	T8787
尿素	Sigma Aldrich	U5378	匀浆缓冲液组分
二甲苯	Sigma Aldrich	214736
20x SSC	Thermo Scientific	AM9763
吐温20	Sigma Aldrich	P1379
聚-L-赖氨酸	Sigma Aldrich	P8920