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通用分子保留的11倍扩展显微技术

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DOI：

10.3791/65338

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2023年10月6日

 ,  ,  , 
1Department of Biological Sciences, Carnegie Mellon University

本文内容

摘要

本文介绍了一种扩展显微镜技术（ExM）的新版本——Magnify，该技术经过改进后可实现高达11倍的扩展，能够保留多种生物分子类别，并适用于多种组织类型。该方法使得利用常规的衍射受限显微镜即可对生物分子的纳米级构型进行研究。

摘要

生物样本的纳米级成像有助于加深对疾病发病机制的理解。近年来，扩张显微镜技术（ExM）已被证明是一种有效且低成本的光学超分辨率显微镜替代方案。然而，该技术受限于需要特定且通常是定制的锚定试剂，以在凝胶中保留不同类别的生物分子，同时也难以处理标准的临床样本形式，例如福尔马林固定石蜡包埋组织，尤其是在需要较大扩张倍数或保留蛋白质表位的情况下。本文介绍了一种名为 Magnify 的新型 ExM 方法，可在多种组织类型中实现高达 11 倍的稳定扩张。通过使用甲基丙烯醛作为组织与凝胶之间的化学锚定剂，Magnify 能够在凝胶中保留多种生物分子（如蛋白质、脂质和核酸），从而可在常规光学显微镜上对组织进行广泛的纳米级成像。本实验方案描述了确保组织稳定且无裂纹扩张的最佳操作实践，以及处理和成像高度扩张凝胶的实用技巧。

引言

生物系统 在结构上具有异质性，从肢体和器官到纳米尺度的蛋白质均是如此。因此，要全面理解这些系统的运行机制，需要在这些不同尺度上进行可视化观察。然而，光的衍射极限使得在常规荧光显微镜下观察小于约200-300 nm的结构面临挑战。此外，尽管诸如受激辐射损耗（STED）、光激活定位显微镜（PALM）、随机光学重建显微镜（STORM）和结构照明显微镜（SIM）等光学超分辨率方法1,2,3功能强大，但它们自身也存在挑战，例如需要昂贵的硬件和试剂，且通常成像速度较慢，在三维空间中对大体积样本成像的能力较差。

扩展显微技术4 （扩展显微技术，ExM）通过将生物分子共价锚定于可吸水膨胀的聚合物凝胶中，并通过物理方式将其分离，从而在常规光学显微镜下实现对原本受光衍射极限限制的结构的分辨，为突破光学衍射极限提供了另一种途径。自该技术首次发表以来，已发展出多种ExM实验方案变体。 ExM 出现还不到十年，这些方案允许蛋白质的直接整合5,6,7，RNA8,9,10，或脂质11,12,13 通过改变化学锚点或进一步扩增样品（从而提高有效分辨率），以单步方式进入凝胶网络14 或多个迭代步骤15,16直到最近，还没有一种扩张显微镜（ExM）方案能够在使用单一市售化学锚定剂的同时，保留这三类生物分子，并形成机械强度足够、可在单次扩张过程中膨胀约10倍的凝胶。

本文介绍了 Magnify17，这是扩展显微技术（ExM）工具库中的最新成员，采用甲基丙烯醛作为生物分子锚定剂。甲基丙烯醛与组织形成的共价键类似于多聚甲醛的作用，可确保多种类别的生物分子保留在凝胶网络中，而无需使用多种特异性或定制的锚定试剂。此外，该技术可实现广泛组织样本最高达11倍的膨胀，包括福尔马林固定石蜡包埋（FFPE）临床样本等 notoriously 难处理的样品。以往扩展此类机械刚性样本的方法需要强烈的蛋白酶消化，导致样本膨胀后无法对目标蛋白进行抗体标记。相比之下，本技术采用高温变性溶液实现 FFPE 临床样本的膨胀，从而在凝胶中完整保留蛋白质的表位，可在膨胀后用于靶向成像（图1）。

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方案

所有涉及动物的实验操作均按照美国国立卫生研究院（NIH）指南进行，并经卡内基梅隆大学机构动物护理与使用委员会批准。人体组织样本为商业获取。

1. 储备试剂和溶液的配制

注意：所用试剂的列表请参见材料表。

  1. 配制凝胶用储备液。这些储备液将在凝胶步骤前立即混合使用。
    1. 使用 表1 中列出的组分配制单体储备液（每100 mL含 N,N-二甲基丙烯酰胺酸 [DMAA] 4 g、丙烯酸钠 [SA] 50 g、丙烯酰胺 [AA] 66.7 g、N,N′-亚甲基双丙烯酰胺 [Bis] 0.10 g、氯化钠 [NaCl] 33 g，并含有1×磷酸盐缓冲液 [PBS]）。将所有储备液组分溶于水或用水稀释。单体储备液可在4 °C下保存至少3个月。
    2. 分别用水配制以下储备液：0.5% (w/w) 4-羟基-TEMPO (4HT)，用于抑制单体扩散进入组织过程中的凝胶化反应；以及10% (w/w) 四甲基乙二胺 (TEMED)，用于加速过硫酸铵 (APS) 引发的自由基生成，该溶液按10% (w/w) 配制。
      ​注意：上述储备液可分装为1–2 mL等份，在4 °C下保存不超过3个月；但APS溶液需在配制凝胶溶液前新鲜制备。
  2. 通过混合以下组分配制匀浆缓冲液（含1% w/v 十二烷基硫酸钠 [S.D.S.]、8 M 尿素、25 mM EDTA、2× PBS，pH 8，室温 [R.T.]）：1 g SDS、48.048 g 尿素、5 mL EDTA（0.5 M，pH 8）、20 mL 10× PBS、25 mL Tris（2 M）和0.75 g 甘氨酸，加水至总体积为100 mL。该缓冲液可根据需要按比例放大或缩小，可在室温下保存。

2. 归档和新鲜制备的临床组织切片的组织准备

注意：组织预处理步骤根据样本的制备方式而有所不同。

  1. 对于甲醛固定石蜡包埋（FFPE）的临床样本，请按以下步骤操作。
    1. 将样本依次放入一系列溶液中（可使用玻璃切片染色缸或50 mL锥形管）：二甲苯、95%乙醇、70%乙醇和50%乙醇，最后放入双蒸水。每种溶液各使用两次，每次至少3分钟。用镊子将切片放入容器中，并加入15 mL相应溶液（足以覆盖样本）。将盖紧的锥形管水平置于摇床上，室温孵育。
  2. 对于已染色并封片于永久性载玻片上的样本，请按以下步骤操作。
    1. 将载玻片短暂浸入二甲苯中，然后使用适当工具（如刀片）小心移除盖玻片。如果盖玻片仍粘附牢固，请将切片继续置于二甲苯中，恢复至室温直至盖玻片松动。
    2. 随后，按FFPE样本的处理方法进行处理（步骤2.1.1）。
      注意：对于苏木精-伊红（H&E）染色的切片，苏木精和伊红染料在扩增过程中会丢失。
  3. 对于置于最佳切割温度（OCT）包埋剂中的未固定冷冻组织切片，先在−20 °C的丙酮中固定10分钟，然后在室温下用1×PBS溶液洗涤三次，每次10分钟。
  4. 对于先前已固定的冷冻临床组织切片，将切片在室温孵育2分钟以融化OCT包埋剂，然后在室温下用1×PBS溶液洗涤三次，每次5分钟。

3. 多聚甲醛固定的 小鼠 脑组织 制备

  1. 本方案适用于厚度为 30–50 µm 的小鼠脑切片。
    注意：使用更大的切片也可能获得成功，但单体溶液的扩散和均一化可能需要更长时间。
  2. 如果切片当前未保存在 1× PBS 溶液中（例如，保存在含 30% [v/v] 甘油和 30% [v/v] 乙二醇的 1× PBS 溶液中），则在 6 至 24 孔板中用 1× PBS 在室温下洗涤三次，每次至少 10 分钟。
  3. 取一片未包被的玻璃显微镜载玻片。若载玻片一侧有包被，可用湿润的画笔检测未包被的一侧（通常包被侧的标签由磨砂玻璃制成，湿润后会变得较透明）。
  4. 用画笔润湿未包被的载玻片。用画笔将小鼠脑组织从孔板中取出，并小心地将其转移至载玻片上，采用滚动动作确保组织平整。在所有切片完成贴附前，允许过量 PBS 保留在组织上。
    注意：虽然单个载玻片可贴附多个组织切片，但当同时处理更多切片时（即使使用不同载玻片），必须格外注意防止切片完全干燥。
  5. 使用实验室纸巾去除载玻片上大部分多余的 PBS。在每个组织切片周围保留少量液环，但其余区域应保持基本干燥。残留的液体将在凝胶单体溶液配制过程中覆盖组织。

4. 胶凝

注意：本方案适用于采用该技术处理的所有组织类型。

  1. 在组织切片两侧放置间隔物（图2A），以防止组织受压。具体操作为：使用金刚石笔将盖玻片切成薄片作为间隔物，然后用少量水或1×PBS将其固定在载玻片上，或使用少量超级胶水进行固定。随后，轻轻地将间隔物放置在组织切片的两侧。
  2. 配制最终凝胶溶液。通常每张组织切片约需200 µL，但每张载玻片上的体积不应超过800 µL，否则会导致溶液溢出。
    注意：甲基丙烯醛（methacrolein）用于将生物分子锚定在凝胶中。然而，无需单独进行锚定步骤，可直接将甲基丙烯醛加入最终凝胶溶液中。
    1. 每份样品按以下顺序混合：200 µL单体溶液、0.5 µL的0.5% 4HT储备液（1:400稀释）、0.2–0.5 µL甲基丙烯醛（根据组织类型稀释至1:400–1:1,000；通常PFA固定的样本使用1:1,000稀释，FFPE临床样本使用1:400稀释）、2 µL的10% TEMED储备液（1:100稀释）以及5 µL的10%过硫酸铵（A.P.S.）储备液（1:40稀释）。
      注意：应在使用前立即配制最终凝胶溶液。为防止提前凝胶化，请最后加入APS溶液。
  3. 去除组织切片上的多余液体，并将载玻片放入培养皿中。将新鲜配制的冷凝胶溶液全部加入样品上，在4 °C条件下孵育30分钟，使溶液充分扩散进入组织。
  4. 小心地将另一张未包被的玻璃盖片覆盖在组织和凝胶溶液上方，避免产生气泡（图2B）。
    注意：若组织上方出现气泡，可小心抬起盖片后重新放置。此外，聚合后溢出的单体溶液可修剪去除，不会对组织造成影响。
  5. 确保聚合反应完成。该聚合过程可通过两种方式进行，结果相似。第一种方法：将样品置于湿润环境（如内含湿滤纸的密闭培养皿）中，在37 °C下孵育过夜。另一种方法可实现更快聚合：先在37 °C湿润环境中孵育2小时，随后在60 °C继续孵育1小时。

5. 样品消化与组织扩张

注意：本方案适用于所有类型的组织。

  1. 佩戴护目镜，将剃刀刀片插入凝胶室的两片玻璃片之间，将其分开。
    注意：玻璃片应很容易分开。如果凝胶的不同部分粘附在两片玻璃上，可使用画笔将凝胶引导至其中一片。如果凝胶在聚合过程中变得特别干燥，可将1× PBS涂抹在凝胶室外侧，但切勿将凝胶完全浸入液体中，否则会导致凝胶在组织均质化前膨胀，从而引起开裂。
  2. 修剪组织周围的空白凝胶以最小化体积。对凝胶进行不对称切割，可在均质化后追踪凝胶的方向，因为样品将完全透明。
  3. 用剃刀刀片轻轻将含有组织的凝胶从载玻片上抬起，并用画笔小心转移至2 mL离心管中。
  4. 用预热至80 °C的均质化缓冲液（表2）将离心管加满至顶部。
  5. 在80 °C下振荡孵育样品8小时（用于PFA固定的鼠脑）或60小时（大多数FFPE临床样本；见表3）。
    注意：均质化时间取决于组织类型和固定方法。许多条件已得到验证，但对于其他情况，可能需要优化。
  6. 将离心管中的内容物倒入6孔塑料细胞培养板的一个孔中。
  7. 用移液器吸除变性缓冲液。
  8. 为彻底去除水凝胶中残留的SDS，按以下步骤用1%非离子型表面活性剂（C12E10）溶液洗涤样品：室温下每次10分钟，至少洗涤三次；60 °C下洗涤60分钟；然后再次于室温下每次10分钟，共洗涤三次。
  9. 将样品保存在含0.02%叠氮化钠的1× PBS中，4 °C保存，直至需要进行扩增后染色和成像。
    ​注意：此时，样品在每个维度上应已扩大约3–4.5倍，具体取决于组织类型。

6. 扩增后生物分子分析

  1. 抗体染色
    注意：本步骤遵循典型的免疫荧光（IF）/免疫组织化学（I.H.C.）染色方案。一抗和二抗的使用量取决于制造商建议的浓度或针对特定实验优化后的浓度。用户可根据需要自行替换不同的缓冲液。
    1. 将样品置于6孔细胞培养板的单个孔中，于室温下用1×PBS洗涤扩增的样品，每次10分钟，共洗涤三次，使用移液器转移液体。
    2. 可选地进行封闭步骤（例如，含3%牛血清白蛋白和0.1% Triton-X100的1x PBS溶液），室温孵育至少1小时，或4 °C过夜。
    3. 在染色缓冲液（例如，0.1% Triton-X100 1x PBS 或 9x PBS/1% TritonX/10 mg/L 肝素）中加入一抗，37 °C 条件下避光孵育过夜。根据样品大小，使用 0.5–2 mL 染色液可充分覆盖凝胶。
    4. 用1×PBS在室温下清洗样品，每次至少10分钟，共清洗三次。
    5. 在选择的染色缓冲液中，37 °C 下孵育相应的二抗，孵育时间为 3 小时。
    6. 用1×PBS在室温下清洗样品，每次至少10分钟，共清洗三次。
  2. NHS-酯类全蛋白染色
    1. 将样品置于6孔板中，加入1-2 mL聚乙二醇（PEG 200）覆盖样品（用量以完全覆盖样品为宜）。
      注意：组织应收缩并恢复至其原始未膨胀状态的大小（或接近该大小）。
    2. 使用荧光染料偶联的NHS酯，按13.3–80 µg/mL浓度溶于1–2 mL染色缓冲液（例如1× PBS、2× S.S.C.或100 mM碳酸氢钠溶液）中，室温避光孵育3小时。
    3. 用1×PBS在室温下清洗样品，每次至少10分钟，共清洗三次。
  3. 脂质染色
    注意：由于固定过程中脂质会丢失，因此福尔马林固定石蜡包埋（FFPE）临床样本不适用于扩增后脂质染色。
    1. 用1×PBS在室温下清洗样本，每次至少10分钟，共清洗三次。
    2. 将常规脂溶性染料（DiO、DiI 或 DiD）用 2 mL 0.1% TritonX-100/1x PBS 稀释 200 倍，在室温下孵育 72–96 小时。
    3. 用1x PBS至少洗涤三次
  4. 荧光 原位 荧光原位杂交（FISH）
    1. 将均质化的凝胶样品置于预热至60 °C的杂交缓冲液中孵育30分钟。
    2. 制备FISH杂交缓冲液：将2x S.S.C.（300 mM NaCl，30 mM 柠檬酸钠，pH 7.0）、10%（v/v）硫酸葡聚糖、20%（v/v）碳酸乙烯酯和0.1%（v/v）Tween20混合。
    3. 将凝胶样品与杂交缓冲液在45 °C下过夜孵育，杂交缓冲液中含针对目标基因的FISH探针（每条寡核苷酸10 pM，每10 kb至少20条探针）。
    4. 用严格洗涤缓冲液（2× S.S.C. 和 0.1% Tween20）在 45 °C 下每次洗涤 15 分钟，共洗涤两次。
    5. 用严谨性洗涤缓冲液在37 °C下再洗涤两次，每次10分钟。
    6. 最后，在室温下用1×PBS洗涤至少三次，每次10分钟。
    7. 样本可直接用于成像，或在 4 °C 条件下保存于 1x PBS + 0.02% 叠氮化钠中。
  5. 完整的组织扩张与荧光成像
    注意：Magnify 可实现的扩增倍数因组织类型和扩增方法而异（完整总结见于 表3）。然而，作为一般性估算，Magnify 样本在 1x PBS 中将扩张 3-4.5 倍，在 ddH₂O 中稀释至 1:50 的 PBS 中将扩张 5-7 倍2O，以及在ddH中增加8-11倍2O. 成像所需的最优膨胀倍数取决于每个实验的具体需求。膨胀倍数具有高度可调性，因此单个样品可多次进行膨胀与收缩，以实现不同尺度下的成像。
    1. 使用画笔将用 PBS 扩展了 4 倍的样品转移至玻璃底 6 孔成像板中。对于进一步扩展的样品，可通过将其切割成较小片段，或轻轻放入配有薄层柔性塑料片的大型玻璃底成像板中进行转移。
    2. 使用常规的宽场显微镜、共聚焦显微镜或其他选定的成像系统进行荧光成像。用实验室纸巾轻轻吸除凝胶周围多余的液体，可防止成像过程中凝胶移动。此外，可在成像前于玻璃表面涂覆0.1%的聚-L-赖氨酸，以固定凝胶。
      注意：聚-L-赖氨酸的应用会使凝胶在接触时完全固定。因此，必须小心操作，确保凝胶在贴附到玻璃表面时无折叠或拉伸。此外，应避免凝胶在涂有聚-L-赖氨酸的玻璃上完全干燥，否则可能导致后续难以剥离；同时，在凝胶仍通过聚-L-赖氨酸附着于玻璃时，不得在PBS中使其收缩，以免造成凝胶或组织损伤。
    3. 成像后，用1x PBS对样品进行至少三次洗涤，每次10分钟，以缩小样品体积。不建议将样品长期保存在ddH₂O中。2由于荧光信号的降解，特别是用脂溶性染料染色的完全扩增样品，应在扩增后尽快成像，以防止染料在水中解离。
    4. 将样品保存在含有0.02%叠氮化钠的1×PBS中，4 °C保存。

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结果

如果实验方案已成功完成（图1），样品在热变性后应呈现清澈且平整的外观；任何折叠或起皱现象均表明匀质化不完全。成功扩大的样品在1× PBS中体积将增大3-4.5倍，在ddH2O中完全扩大后体积可达原来的8-11倍。图3展示了采用本方案处理的5 µm厚人肾FFPE样品在扩大前后图像的示例，其扩大倍数超过8倍。组织首先使用针对ACTN4的抗体以及DAPI染色，以显示核DNA。随后使用转盘共聚焦显微镜对样品成像（图3A）。接着按照上述方案对组织进行处理，包括对相同靶标进行扩增后染色，并在水中完全扩大（图3B）后重新成像。在热变性后，除蛋白质外的其他生物分子也可进行染色和成像，如图4所示。脂溶性染料可用于揭示小鼠脑组织中的细胞膜和线粒体膜结构（图4A）。此外，还可通过FI...

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讨论

本文介绍了Magnify技术方案17，这是一种扩展显微技术（ExM）的变体，能够通过单一化学锚定剂保留多种生物分子，并利用热变性处理将难以处理的福尔马林固定石蜡包埋（FFPE）临床样本扩展至原来的11倍。本方案与其他ExM方案的关键区别在于采用了重新配制的凝胶，该凝胶即使在完全膨胀后仍保持良好的机械强度，同时使用甲基丙烯醛（methacrolein）作为生物分子的锚定剂。本方案中最关键的步骤如下：1）终末凝胶溶液的组成；2）凝胶化步骤的时间控制；3）凝胶化反应室的设置；4）样本均质化的参数设定；5）在扩增后染色前，必须充分洗去样本中的十二烷基硫酸钠（SDS）。

该方案最关键的参数是终末凝胶溶液的组成，尤其是生物分子锚定剂甲基丙烯醛的浓度。不同类型的组织需要不同的甲基丙烯醛浓度（表3），因此必须谨慎选择与待扩增样本相匹配的浓度。甲基丙烯醛锚定过度会导致扩增倍数降低，并减少扩增后染色可用的表位；而锚定不足，尤其是在福尔马林固定石蜡包埋（FFPE）的临床样本中，可能导致组织开裂或形变。因此，对于尚未验证的组...

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披露

作者声明存在以下竞争性财务利益：Y.Z.、A.K.、Z.C. 和 B.R.G. 发明了多项与 Magnify 和 ExM 相关的技术。

致谢

本工作由卡内基梅隆大学和 D.S.F. 慈善基金会（Y.Z. 和 X.R.）、美国国立卫生研究院（N.I.H.）院长新创新者奖 DP2 OD025926-01 以及考夫曼基金会资助。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
4-羟基-TEMPO (4HT)Sigma Aldrich176141抑制剂
6孔玻璃底培养板 (#1.5 盖玻片)CellvisP06-1.5H-N
丙烯酰胺Sigma AldrichA8887凝胶单体组分
过硫酸铵 (APS) Sigma AldrichA3678引发剂
DAPI (1 mg/mL)Thermo Scientific62248
十乙二醇单十二醚 (C12E10)Sigma AldrichP9769非离子型表面活性剂
金刚石刀片 No. 88 CMGeneral Tools31116
乙醇Pharmco111000200
乙醇Pharmco111000200
乙二胺四乙酸
酸 (EDTA) 0.5 M		VWRBDH7830-1匀浆缓冲液组分
镊子
甘氨酸Sigma AldrichG8898匀浆缓冲液组分
肝素Sigma AldrichH3393
甲基丙烯醛Sigma Aldrich133035锚定剂
显微盖玻片 #1 (24×60 mm)VWR48393 106
显微盖玻片 #1.5 (24×60 mm)VWR48393 251
N,N,N′,N′-
四甲基乙二胺 (TEMED)		Sigma AldrichT9281加速剂
N,N′-亚甲基双丙烯酰胺 (Bis)Sigma AldrichM7279凝胶单体组分
N,N-二甲基丙烯酰胺 (DMAA)Sigma Aldrich274135凝胶单体组分
Nunclon 4孔×5 mL 多孔细胞培养皿Thermo Fisher167063
Nunclon 6孔细胞培养皿Thermo Fisher140675
Nunc™ 15 mL 离心管Thermo Fisher339651
Nunc™ 50 mL 离心管Thermo Fisher339653
旋转摇床
画笔
pH计
磷酸盐缓冲液 (PBS), 10x 溶液Fischer ScientificBP399-1
聚乙二醇 200Sigma AldrichP-3015
蛋白酶K (分子生物学级)Thermo ScientificEO0491
剃须刀片Fischer Scientifc12640
SafeLock 微量离心管 1.5 mLThermo Fisher3457
SafeLock 微量离心管 2.0 mLThermo Fisher3459
丙烯酸钠 (SA)AK ScientificR624凝胶单体组分
叠氮化钠Sigma AldrichS2002
氯化钠Sigma AldrichS6191
柠檬酸三钠二水合物Sigma AldrichC8532-1KG
十二烷基硫酸钠 (SDS)Sigma AldrichL3771匀浆缓冲液组分
Tris碱Fischer ScientificBP152-1匀浆缓冲液组分
吐温X-100Sigma AldrichT8787
尿素Sigma AldrichU5378匀浆缓冲液组分
二甲苯Sigma Aldrich214736
20x SSCThermo ScientificAM9763
吐温20Sigma AldrichP1379
聚-L-赖氨酸 Sigma AldrichP8920

参考文献

  1. Hell, S. W. Far-field optical nanoscopy. Science. 316 (5828), 1153-1158 (2007).
  2. Combs, C. A., Shroff, H. Fluorescence microscopy: A concise guide to current imaging methods. Current Protocols in Neuroscience. 79, 1-25 (2017).
  3. Schermelleh, L., Heintzmann, R., Leonhardt, H. A guide to super-resolution fluorescence microscopy. Journal of Cell Biology. 190 (2), 165-175 (2010).
  4. Chen, F., Tillberg, P. W., Boyden, E. S. Expansion microscopy. Science. 347 (6221), 543-548 (2015).
  5. Tillberg, P. W., et al. Protein-retention expansion microscopy of cells and tissues labeled using standard fluorescent proteins and antibodies. Nature Biotechnology. 34 (9), 987-992 (2016).
  6. Chozinski, T. J., et al. Expansion microscopy with conventional antibodies and fluorescent proteins. Nature Methods. 13 (6), 485-488 (2016).
  7. Ku, T., et al. Multiplexed and scalable super-resolution imaging of three-dimensional protein localization in size-adjustable tissues. Nature Biotechnology. 34 (9), 973-981 (2016).
  8. Chen, F., et al. Nanoscale imaging of R.N.A. with expansion microscopy. Nature Methods. 13 (8), 679-684 (2016).
  9. Tsanov, N., et al. SmiFISH and FISH-quant - A flexible single R.N.A. detection approach with super-resolution capability. Nucleic Acids Research. 44 (22), 165(2016).
  10. Wang, G., Moffitt, J. R., Zhuang, X. Multiplexed imaging of high-density libraries of R.N.A.s with MERFISH and expansion microscopy. Scientific Reports. 8 (1), 4847(2018).
  11. Wen, G., et al. Evaluation of direct grafting strategies via trivalent anchoring for enabling lipid membrane and cytoskeleton staining in expansion microscopy. ACS Nano. 14 (7), 7860-7867 (2020).
  12. Sun, D., et al. Click-ExM enables expansion microscopy for all biomolecules. Nature Methods. 18, 107-113 (2021).
  13. White, B. M., Kumar, P., Conwell, A. N., Wu, K., Baskin, J. M. Lipid expansion microscopy. Journal of the American Chemical Society. 144 (40), 18212-18217 (2022).
  14. Truckenbrodt, S., et al. X10 expansion microscopy enables 25-nm resolution on conventional microscopes. EMBO Reports. 19 (9), e45836(2018).
  15. Chang, J. -B., et al. Iterative expansion microscopy. Nature Methods. 14 (6), 593-599 (2017).
  16. Park, J., et al. Epitope-preserving magnified analysis of proteome (eMAP). Science Advances. 7 (46), (2021).
  17. Klimas, A., et al. Magnify is a universal molecular anchoring strategy for expansion microscopy. Nature Biotechnology. , (2023).
  18. Gao, M., et al. Expansion stimulated emission depletion microscopy (ExSTED). ACS Nano. 12 (5), 4178-4185 (2018).
  19. Zwettler, F. U., et al. Molecular resolution imaging by post-labeling expansion single-molecule localization microscopy (Ex-SMLM). Nature Communications. 11, 3388(2020).

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