小鼠皮肤淋巴管内皮细胞的分离

摘要

本文介绍了一种基于磁珠分离小鼠皮肤淋巴毛细血管内皮细胞的方法。所分离的淋巴内皮细胞可用于后续实验 体外 实验和蛋白质表达分析

摘要

淋巴系统参与免疫监视、脂质吸收以及组织液平衡的调节。小鼠淋巴管内皮细胞的分离是淋巴系统研究中的重要步骤，因为它能够实现后续的 体外 以及对分离细胞进行的生化实验。此外，Cre-lox 技术的发展使得针对无法进行全身性靶向的基因实现组织特异性缺失成为可能，从而精确确定这些基因在所研究组织中的作用。要解析特定基因在淋巴系统生理学和病理生理学中的功能，需要使用淋巴系统特异性启动子，因此必须通过实验验证靶基因的表达水平。

从野生型或转基因小鼠中高效分离淋巴管内皮细胞的方法，使得能够利用离体（ex vivo）和体外（in vitro）实验体系来研究调控淋巴系统功能的机制，并检测目标蛋白的表达水平。我们已开发、标准化并提出了一种基于LYVE-1表达，通过磁珠分选技术高效分离小鼠皮肤来源的淋巴管内皮细胞（DLECs）的实验方案。该方案旨在为研究人员提供一种实用工具，以进一步理解并阐明淋巴管内皮细胞功能中的关键作用分子，尤其适用于缺乏荧光激活细胞分选设备的研究机构。

引言

淋巴系统在人体生理学中发挥着关键作用。它被视为一种重要的稳态调节因子，参与维持组织-血浆液体平衡、免疫监视以及脂质吸收等重要功能¹，同时也涉及一些新近发现的功能，例如心脏的修复能力²以及骨骼再生和造血功能³。尽管淋巴系统具有重要作用，但其在某些生理参数和反应中的具体作用及其调控的分子机制仍不明确。此外，淋巴管系统的结构或功能缺陷是某些病理生理状况的诱发或恶化因素。典型的例子包括原发性和继发性淋巴水肿，分别取决于疾病的遗传性或非遗传性病因；而淋巴系统在原发性肿瘤生长及转移扩散中的作用尤为关键，因其既可作为转移的通道，也可调节免疫功能¹。

与血管系统相比，淋巴系统在研究和认知上的滞后，主要归因于淋巴系统的发现时间晚于血液循环系统，以及特异性淋巴分子标志物的鉴定存在延迟。近几十年来，这一状况已得到显著改善，从而改变了人们对稳态及疾病状态下淋巴系统的传统认知¹。与血管生成类似，淋巴管生成是指由已有淋巴管形成新淋巴管的过程，在多种疾病的发生发展中发挥关键作用^4,5,6。然而，与血管生成不同的是，目前对淋巴管生成的研究主要局限于关注发育过程中血管形成及病理模型中结构缺陷的in vivo模型。分离淋巴内皮细胞对于开展in vitro研究至关重要，本方案将提供实现该目标的具体方法。

已开发出多种从小鼠中分离淋巴管内皮细胞的方案，这些方案需要使用荧光激活细胞分选技术⁷。当设备可用时，细胞分选仪的优势在于可获得更高纯度的细胞，而基于磁珠的分离方法则产量更高。本方案利用淋巴管内皮透明质酸受体1（LYVE-1）的表达，该分子是一种重要的淋巴管内皮标志物，在淋巴管内的细胞迁移过程中发挥关键作用^4,8。由于LYVE-1仅在淋巴毛细管中表达，而在集合淋巴管中不表达，因此该技术适用于特异性分离淋巴毛细管来源的淋巴管内皮细胞，与其他在所有淋巴管内皮细胞中均一表达的淋巴管标志物（如podoplanin）不同⁹。在本方案中，排除了Prox1等非跨膜结构的其他重要淋巴管标志物。

由于生理结果是淋巴管生成，而淋巴管生成通常起始于淋巴毛细血管，因此选择LYVE-1作为靶标，因其在这些细胞中具有特异性，且所选抗体可获得较高的产量。所用酶包括II型胶原酶（通常认为其在胶原解离方面比I型更有效¹⁰）和dispase（一种广谱蛋白酶，常用于真皮与表皮的分离¹¹）；然而，已有其他用于组织分离的酶被报道^12,13，也可使用。本方案的目的是描述一种利用磁珠分选技术从成年小鼠淋巴毛细血管中高效分离真皮淋巴内皮细胞的方法，尤其适用于缺乏荧光激活细胞分选设备的实验室。该方法适用于对淋巴内皮细胞纯度要求不高、可接受一定杂质的下游应用。

方案

动物实验根据德克萨斯理工大学健康科学中心（TTUHSC）机构动物护理与使用委员会（IACUC）批准的方案在TTUHSC进行，以及根据第2010/63号指令由西希腊州兽医管理局批准的方案在帕特雷大学进行。处理动物废弃物时，应严格遵守废弃物处置规定。

1. 小鼠真皮组织的分离

1. 第1天
   注意：第1天；准备好以下材料和设备：麻醉室、动物毛发剪刀、异氟烷、精细镊子、0.2 µm注射器滤器。
   1. 在DMEM中配制含1×抗生素-抗真菌溶液的2 mg/mL Dispase溶液，并进行过滤除菌。
      注意：可使用HBSS替代培养基或PBS，因其已在其他报道中成功应用 实验方案¹²1x 抗生素-抗真菌素溶液可用青霉素（100 I.U./mL）、链霉素（100 µg/mL）和两性霉素（2.5 µg/mL）替代。
   2. 将小鼠置于异氟烷麻醉舱中进行麻醉（异氟烷浓度：0.5–2%，气流速度：1 L/min）。待小鼠停止活动后，将其移出笼具，通过鼻罩继续维持麻醉，异氟烷气流速度保持相近。通过夹趾反应检测以确认麻醉深度，并持续监测小鼠状态，确保维持深度麻醉（无运动反应）。剪除约9 cm² 沿中线使用毛发修剪器纵向剃除小鼠背部和腹部的背侧与腹侧毛发。让小鼠从麻醉中恢复后放回笼中。
      注意：可改用脱毛膏。确保在保持皮肤完整性的前提下，彻底清除待分离区域皮肤上的毛发。尽量剪除更广泛的毛发 尽可能扩大皮肤区域。为确保脱毛可能引起的炎症完全消退，细胞分离必须在第二天进行。为增加分离细胞的数量，每组 pooling 2 至 4 只小鼠。
2. 第2天
   注意：请准备好以下材料和设备：安乐死舱、生物安全柜、CO₂₂ 培养箱，乙醇，精细剪刀，精细镊子，钝头镊子，100 mm 组织培养皿，Dispase，DMEM，1× 抗生素-抗真菌溶液。
   1. 通过 CO 处死小鼠₂ 给药后将其置于仰卧位，暴露已剪毛区域。喷洒70%乙醇进行消毒。
      注意：从这一步开始，所有步骤都必须在无菌条件下（在生物安全柜中）进行。
   2. 将一个无菌的100 mm组织培养皿置于冰上。
   3. 在腹部做一个0.5英寸的浅表切口，沿中线纵向切至颈部和下腹部。做横向切口，以便将皮肤掀开。
      注意：切口大小和分离的皮肤区域面积取决于小鼠的体型。
   4. 使用钝头镊子，小心地将皮肤与周围组织分离。操作时围绕小鼠整个躯干进行，在颈部和下腹部侧面横向剪开皮肤。
   5. 将皮肤小心放入100 mm组织培养皿中，确保真皮面朝下，并尽可能保持皮肤伸展。盖好培养皿，置于冰上。完成该组所有小鼠皮肤的分离操作。
   6. 从小鼠中取出皮肤后，将培养板在室温下孵育10分钟，以使外植体展平。
   7. 加入6 mL Dispase溶液至培养皿中，确保皮肤完全浸没，于4 °C轻微振荡孵育过夜。
      注意：除了使用Dispase，也可进行胰蛋白酶消化¹²，随后用Liberase替代胶原酶II型处理（如下所述）。

2. 从真皮中分离细胞

1. 第3天
   注意：提前准备好以下材料和设备：离心机、CO₂ 培养箱、生物安全柜、剪刀、DMEM、1× 抗生素-抗真菌溶液、II型胶原酶、PBS、50 mL 圆锥形离心管、100 mm 和 60 mm 组织培养皿、DNA酶I溶液、I型胶原蛋白、70 µm 和 40 µm 细胞筛网、0.2 µm 注射器滤器、LEC 培养基。
   1. 配制500 mL 1× PBS（1.37 M NaCl、27 mM KCl、100 mM Na₂HPO₄、18 mM KH₂PO₄，pH 7.4），在15 psi条件下高压灭菌20分钟，或通过过滤除菌。也可使用市售的无菌PBS。
   2. 在含1× 抗生素-抗真菌溶液的DMEM中配制10 mL浓度为2 mg/mL的II型胶原酶溶液，并进行过滤除菌。
      注意：后续步骤应在无菌操作台中进行，以降低样品污染风险。
   3. 使用移液器从培养皿中移除液体。
   4. 使用镊子将真皮层（皮肤底部）与表皮层（顶部）分离，并去除明显的脂肪组织。将真皮层转移至洁净的组织培养皿中。
   5. 在洁净的组织培养皿中加入1 mL含1× 抗生素-抗真菌溶液的DMEM，并倾斜培养皿使液体聚集于一侧。
   6. 将真皮组织剪切成1–2 mm²大小的碎片，并转移至新的50 mL圆锥形离心管中。
      注意：此步骤理想情况下应在4–5分钟内完成，因处理时间过长不会显著提高细胞得率或存活率。
   7. 加入10 mL II型胶原酶溶液。
   8. 加入50 µL DNA酶I溶液（终浓度25单位/mL，用于减少细胞聚集），在37 °C下以持续振荡（使用转速为30–50 rpm的旋转/摇床培养箱）消化2小时。
      注意：应定期检查，确认大部分真皮组织是否已被消化。若未充分消化，可酌情延长消化时间（最多额外1小时）并提高振荡速度。
   9. 用2 mL浓度为10 µg/mL的I型胶原蛋白（溶于0.02 M乙酸）包被60 mm组织培养皿，37 °C孵育>20分钟。用无菌PBS洗涤2次。
   10. 使用70 µm细胞筛网过滤细胞悬液，在250 × g条件下离心5分钟，弃去上清液。
   11. 用10 mL含1× 抗生素-抗真菌溶液的DMEM重悬细胞沉淀。
   12. 使用40 µm细胞筛网再次过滤细胞悬液，在250 × g条件下离心5分钟，弃去上清液。
   13. 用1 mL完全LEC培养基（内皮细胞生长基础培养基加补充剂）重悬细胞。
   14. 将细胞接种至胶原蛋白包被的60 mm组织培养皿中，使用完全LEC培养基培养。此为细胞培养的第0天。
   15. 每隔2天更换一次培养基，先用1× PBS洗涤细胞两次，再加入新鲜的LEC培养基。
   16. 重复步骤2.1.15，直至细胞融合度达到80–90%。
       ​注意：若在细胞融合度未达80–90%前进行纯化，所获得的淋巴管内皮细胞数量将减少。该过程通常需要7至10天。

3. 使用LYVE-1抗体包被磁珠

注意：纯化步骤前一天，请准备好以下材料和设备：4 °C 冰箱、转子、磁力分离器、PBS、抗兔 IgG 磁珠、微量离心管、0.2 µm 注射器滤器、磁珠包被溶液、LYVE-1 抗体。

1. 配制磁珠包被液：将20 mL PBS中加入0.1% BSA和2 mM EDTA，过滤除菌。储存于4 °C。
   注意：不建议储存超过数天；使用前需检查是否有沉淀或污染。
2. 用移液器将500 µL抗兔IgG磁珠加入微量离心管中，并加入1 mL预冷的磁珠包被液。
3. 使用磁力分离器清洗磁珠。
4. 用1 mL预冷的磁珠包被液重复洗涤2次。
5. 将磁珠重悬于500 µL磁珠包被液中，并分装至微量离心管中，每管150 µL。
6. 向每管中加入15 µg LYVE-1抗体（取自1 mg/mL抗体储备液的15 µL）。
7. 在4 °C下孵育过夜 ，持续振荡。

4. 淋巴管内皮细胞纯化

注意：准备好以下材料和设备：CO₂ 培养箱、摇床、计时器、封口膜、DMEM、1× 抗生素-抗真菌溶液、BSA、PBS、磁珠包被溶液、胰蛋白酶-EDTA、100 mm 或 60 mm 组织培养皿、0.2 µm 注射器滤器、I 型胶原蛋白、乙酸、LEC 培养基。

1. 准备 50 mL DMEM，添加 1× 抗生素-抗真菌溶液和 0.1% BSA，并进行过滤除菌。
2. 用含有 10 µg/mL I 型胶原的 0.02 M 乙酸溶液在 37 °C 下对 60 mm 组织培养板包被 >20 分钟，然后用无菌 PBS 洗涤 2 次。
3. 使用磁力分离器，用 1 mL 磁珠包被溶液洗涤预包被的磁珠。
4. 将磁珠重悬于 150 µL 含 0.1% BSA 的 DMEM 中。
   注意：磁珠可在 4 °C 下保存长达 1 个月。
5. 用 PBS 洗涤细胞 2 次。
6. 向细胞中加入 3 mL 含 0.1% BSA 的 DMEM（适用于 60 mm 组织培养板）以及 50 µL 抗体偶联磁珠。
   注意：若合并来自两只或更多小鼠的细胞，则使用 100 mm 组织培养板，并加入 6 mL 含 0.1% BSA 的 DMEM。
7. 用封口膜密封培养皿。
8. 将培养皿置于摇床上，在室温下以 10 RPM 振荡，准确孵育 10 分钟。
   注意：孵育时间过长会导致非特异性结合。为确保磁珠与整个培养板表面充分接触，应在振荡过程中每隔几分钟手动旋转培养板一次。
9. 弃去培养基，用 PBS 洗涤细胞一次。快速检查细胞，确认培养板上存在淋巴管内皮细胞（LEC）克隆。
10. 胰酶消化细胞：加入 1 mL 胰蛋白酶-EDTA 溶液，在 37 °C 下孵育 3 分钟，观察细胞是否成功脱落。
11. 加入 2 mL 完全 LEC 培养基中和反应，将细胞悬液转移至 5 mL 无菌聚丙烯管中。
12. 使用磁力分离器，用含 0.1% BSA 的 DMEM 洗涤细胞 4 次，每次 3 mL，以去除未结合的细胞。
13. 将剩余的磁珠结合细胞重悬于完全 LEC 培养基中，并接种至先前经胶原包被的 60 mm 组织培养板中。
14. 在 37 °C 下孵育细胞，每次用 PBS 洗涤两次后，每隔一天更换一次培养基。
15. 继续培养细胞直至达到汇合状态（通常需要 7 至 10 天）。
16. 此时，在显微镜下检查细胞的汇合程度，并进行流式细胞术前的细胞准备。若检测到较高比例的 F4/80+ 细胞，则应重复使用 LYVE-1（步骤 4：淋巴管内皮细胞纯化）再次进行纯化，或理想情况下使用其他淋巴管标志物（如 podoplanin¹⁴）。
    ​注意：已有研究证实，磁珠纯化后的细胞群体中，抗体所靶向蛋白的表达水平较高^15,16。然而，对于 LYVE-1，进行流式细胞术对照以确定其他 LYVE-1+ 细胞（主要是巨噬细胞）的比例非常重要。LYVE-1 仅在与肿瘤和伤口相关的巨噬细胞亚群中表达，而在健康皮肤中，LYVE-1 的表达更局限于淋巴管内皮细胞¹⁷。因此，F4/80 筛查并非必需，而是取决于具体的实验背景。用于演示的小鼠未携带肿瘤或伤口，仅可能存在因脱毛引起的潜在炎症，但我们仍进行了 F4/80 染色，以作为 LYVE-1+ 巨噬细胞比例的基线参考。

5. 流式细胞术

注意：准备好以下材料和设备：离心机、CO₂ 培养箱、计时器、血细胞计数板、EDTA 溶液、1× 抗生素-抗真菌素溶液、BSA、PBS、胰蛋白酶-EDTA、聚丙烯管、0.2 µm 注射器滤器、70% 乙醇、F4/80 FITC 标记抗体。

1. 配制含有 0.1% BSA 的 PBS，并通过滤膜除菌。
2. 在 PBS 中配制 1 mM EDTA 溶液。
3. 消化细胞：将细胞与 1 mL 1 mM EDTA 溶液在 37 °C 下孵育 5 分钟。
   注意：EDTA 溶液孵育是一种较温和的细胞解离方法，可更好地保留跨膜蛋白，因此更优，但需要较长的孵育时间。也可选用胰蛋白酶-EDTA 溶液，在 37 °C 下孵育 1 分钟，但可能影响流式细胞术应用中抗体的结合亲和力。
4. 用 2 mL 完全 LEC 培养基中和溶液，并将溶液转移至 5 mL 无菌聚丙烯管中。
5. 在 250 × g 条件下离心 5 分钟。
6. 用 PBS 洗涤细胞。
7. 重复一次离心和 PBS 洗涤步骤。
8. 将细胞重悬于含 0.1% BSA 的 PBS 中，使用血细胞计数板或其它方法进行计数。将约 1 × 10⁶ 个细胞分装至聚丙烯管中，终体积为 100 µl。从该步骤开始，所有操作均在 4 °C 下进行。
   注意：细胞可在染色前固定，也可在活细胞状态下染色。固定可能对流式细胞术不理想，因为某些抗体在固定后可能无法识别抗原；因此，建议在上一步完成后立即进行流式细胞术检测，并跳过固定步骤。若无法实现，则可在流式细胞术实验前进行固定，以延迟检测步骤。如需固定，应预先评估抗体在固定细胞条件下的性能表现。
9. 进行固定（可选步骤；若不进行固定，则直接进行免疫染色）：将细胞重悬于预冷的 70% 乙醇中，在冰上轻轻混匀 10 分钟。
   注意：乙醇固定可使细胞通透，导致 GFP 释放；而基于多聚甲醛的固定可能破坏流式细胞术所用的染料，理想情况下应避免使用。
10. 在室温下孵育 15 分钟。
11. 用 1× PBS 以 250 × g 离心 5 分钟，洗涤细胞两次。
12. 继续下一步操作，或将细胞重悬于 0.5–1 mL 1× PBS 中，于 4 °C 保存。

6. 免疫染色

注意：尽量轻柔操作细胞，避免过度吹打，以维持细胞膜完整性并减少细胞死亡，确保细胞不形成团块。从分离的内皮细胞中制备以下各组：未染色细胞，以及用其他内皮细胞标志物（如 VEGFR3、podoplanin）、F4/80 分别染色的细胞和同时用两者染色的细胞。如有条件，可包括市售的小鼠淋巴管内皮细胞和巨噬细胞作为阳性对照。出于演示目的，并由于存在内源性 tdTomato 荧光（PE+），我们采用了 FITC 标记的 F4/80 染色。

1. 根据推荐或优化的稀释比例，将一抗用含0.1% BSA的PBS稀释。向100 µL细胞悬液中加入0.5 µg（1 µL抗体溶液）F4/80 FITC标记抗体。
2. 加入稀释后的荧光标记抗体后，重悬细胞。通过轻弹聚丙烯管混匀，确保无细胞团块且所有细胞均被充分包被。
3. 避光孵育：固定细胞在室温下孵育1小时，活细胞在冰上孵育30分钟。
4. 用含0.1% BSA的PBS在避光条件下洗涤细胞两次，每次以250 × g 离心5分钟，活细胞在4 °C下进行，固定细胞在室温下进行。
5. 对于非荧光标记的一抗：
   1. 将荧光染料标记的二抗用孵育缓冲液稀释。对于Alexa Fluor抗体，使用1:500的稀释比例。
   2. 将二抗加入100 µL细胞悬液中。
   3. 避光孵育30分钟，固定细胞在室温下进行，活细胞在冰上进行。
   4. 用孵育缓冲液洗涤两次，每次以250 × g 离心5分钟，活细胞在4 °C下进行，固定细胞在室温下进行。
6. 将细胞重悬于0.5 mL 1× PBS中，并使用流式细胞仪进行分析。
7. 按照以下设门策略步骤，在LYVE-1表达细胞中鉴定巨噬细胞群体：
   1. 利用前向散射光和侧向散射光区分细胞群体。
   2. 利用前向散射光的面积和高度参数区分单个细胞（单细胞群体，Singlets）。
   3. 结合F4/80（FITC）表达和RFP（PE）表达，在tdTomato（PE）表达的分离小鼠细胞中鉴定巨噬细胞（F4/80+）（由于特定小鼠品系中含有荧光tdTomato报告基因，详见下文描述）。

结果

该方法旨在鉴定一种小GTP酶RhoA的蛋白表达，其编码基因在两个等位基因上均被floxed，并在他莫昔芬诱导的淋巴管内皮特异性启动子Prox1-CreER^{T2 18}作用下被删除。分离得到的LEC可培养至多四代，之后会进入衰老状态。这些细胞已被成功冻存、复苏，并用血管生成素-2进行有效刺激。由于细胞传代次数有限，我们未尝试多次冻融循环。从小鼠分离所得的典型细胞产量可使一个60 mm培养皿达到40-50%的融合度（约1.5 × 10⁶个细胞），且细胞增殖缓慢，在采用基于LYVE-1的纯化方法时，培养皿需5天才能达到完全融合。

第一次纯化后，LYVE-1+ 细胞在 60 mm 培养皿中的汇合度约为 15%（约 4 × 10⁵ 个细胞）。第二轮纯化为可选步骤，本文所提供的数据和图像均基于仅进行一轮纯化的结果。存在一些未被筛选出的细胞，这些细胞携带磁珠，似乎是因为结合的磁珠数量不足以实现有效筛选。如前所述，始终建议在dispase消化的同时加入DNA酶，尽管我们...

讨论

淋巴系统是机体稳态功能的重要调节者，其最重要的功能包括维持血浆液体平衡、清除细胞代谢产物和有毒分子、脂质吸收以及免疫细胞的迁移^1,19。特异性标志物的发现推动了淋巴系统研究领域新数据的大量涌现，揭示了淋巴脉管系统的一些新功能，例如其在某些器官修复和再生能力中的作用^2,3。随着对淋巴系统认知的不断深入，其在多种病理状态中的作用日益明确，改变了以往对该系统的传统认识¹。淋巴系统在多种疾病的进展中发挥着重要作用，例如癌症的生长与转移²⁰、米尔罗伊病（一种原发性淋巴水肿）^21,22，以及卡波西样淋巴管瘤病，后者是一种以淋巴管扩张和相互连接为特征的罕见疾病²³

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
0.2 μm 注射器滤器	Fisher Scientific	09-719C
100 mm 组织培养皿	Fisher Scientific	FB012924
60 mm 组织培养皿	Fisher Scientific	FB012921
动物毛发剪毛器	Wahl
抗生素-抗真菌素溶液 100x	Fisher Scientific	15240-062
钝头镊子	Fine Science Tools	11992-20
牛血清白蛋白	Sigma-Aldrich	A4919
细胞滤网 40 μm	Fisher Scientific	542040
细胞滤网 70 μm	Fisher Scientific	542070
CO2 培养箱
I型胶原蛋白，高浓度大鼠尾部来源	康宁	354249	用 H₂O 将 0.02 M 乙酸稀释2O
II型胶原酶	Life Technologies	17101-015
Dispase	Life Technologies	17105-041
DMEM	Fisher Scientific	11-995-073
DNA酶I溶液（2,500 U/mL）	赛默飞世尔科技	90083
Dynal MPC-L 磁性颗粒浓缩仪	Invitrogen	120-21D
EDTA	Sigma-Aldrich	3690
内皮细胞生长基础培养基 &和补充剂（LEC 培养基）	R&D Systems	CCM027
安乐死舱	Euthanex Corporation
精细镊子	Fine Science Tools	11255-20
精细剪刀-锋利	Fine Science Tools	14060-10
FITC 标记的抗小鼠 F4/80 抗体	Biolegend	123107
Goat Anti-Rabbit IgG 磁珠	New England Biolabs	S1432S
LARC-A E-Z 麻醉诱导室	Euthanex Corporation
MagnaBind 山羊抗兔 IgG 珠	赛默飞世尔科技	21356
4% PBS 甲醛溶液	Fisher Scientific	AAJ19943K2
磷酸盐缓冲液（PBS）	Fisher Scientific	SH30256FS
兔抗小鼠LYVE-1抗体	ReliaTech GmbH	103-PA50
旋转/振荡培养箱
圆底聚丙烯管	康宁	352063
带 0.2 微米滤膜的注射器滤器 μ微孔	Fisher Scientific	09-719C
胰蛋白酶-EDTA	Fisher Scientific	25-300-120