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通过腹膜途径在兔模型中诱导腰椎间盘退变

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DOI：

10.3791/65409

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2023年10月6日

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Orthopedic Surgery, Xingtai General Hospital of North China Medical Health Group, 2Orthopaedic Research Institute of Xingtai, 3Medical School, Faculty of Medicine, The University of Queensland, 4School of Chemical Engineering, The University of Queensland, 5Department of Spine Surgery, The Third Hospital of Hebei Medical University

本文内容

摘要

本文介绍了一种通过经腹入路采用针刺穿刺法建立兔腰椎间盘退变的手术方案。通过影像学检查和组织学分析验证了腰椎间盘退变模型的成功建立。

摘要

下背痛是全球人群中极为常见的医学问题。下背痛的主要诱因之一是椎间盘（IVD）退变。理想的椎间盘退变动物模型对于研究下背痛的病理生理机制以及探索潜在治疗策略至关重要。兔模型是一种可靠、经济且易于建立的动物模型。目前，经腹膜后入路已广泛用于在兔模型中诱导椎间盘退变。然而，该技术存在一些报道的并发症，例如节段性动脉撕脱和神经根损伤。本文旨在介绍一种通过经腹入路采用针刺穿刺建立兔腰椎椎间盘退变的手术方案。随后的影像学检查和组织学分析表明，兔腰椎椎间盘退变模型已成功建立。该手术方案能够精确定位目标椎间盘，椎间盘退变模型具有高度可重复性，并且并发症较少。

引言

下背痛（LBP）是全球致残的首要原因1。椎间盘（IVD）退变（IVDD）是导致下背痛的主要原因之一2,3,4。IVDD 是一种复杂且尚未完全阐明的多因素过程，可因不同的环境和生物学因素而加速5,6,7。IVDD 的病理变化特征包括椎间盘结构紊乱、髓核含水量减少以及周围细胞外基质的降解8,9。椎间盘退变动物模型对于与椎间盘相关研究具有重要意义9,10,11。

迄今为止，已建立了多种椎间盘退变（IVDD）动物模型，以模拟人类椎间盘退变的进展过程。大型动物模型，如牛、羊、山羊、犬和非人灵长类动物，在椎间盘大小以及退变椎间盘的细胞组成方面（例如羊和山羊缺乏脊索细胞）与人类具有一定相似性12。然而，由于成本高昂、实验周期长、可重复性差，以及建立退变模型所需技术更为复杂，这些大型动物模型并不常用13。相比之下，小型动物模型，如大鼠、小鼠和兔，在椎间盘相关研究中被广泛使用，因其操作简便、成本较低且结果可靠10。兔的椎间盘尺寸大于小鼠或大鼠，因此在兔模型中具有更大的操作空间。此外，由于兔的脊柱解剖结构（如关节突关节、椎旁肌和韧带）与人类高度相似，其椎间盘与人类椎间盘具有较高的同源性14,15。因此，与其他小型动物相比，兔更适用于建立IVDD模型。

椎间盘退变（IVDD）动物模型包括机械模型（压缩、不稳定）、结构模型（损伤、化学性）以及自发性退变的动物模型16。兔IVDD模型通常通过两种不同的手术方法诱导损伤来建立——经腹途径17和腹膜后途径18。其中，通过穿刺针穿刺目标椎间盘的腹膜后途径被广泛使用，但该方法可能引起多种并发症，例如节段动脉撕脱和神经根损伤18,19。本文报道一种通过经腹途径穿刺椎间盘建立的兔IVDD模型，旨在提供一种简便且可重复的兔IVDD建模方法。

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方案

实验方案经华北医疗健康集团邢台总医院动物护理与使用委员会批准（批准号：ZCKT-2021-0009）。本研究采用健康的骨骼成熟的雌性新西兰白兔（1岁，体重3-5 kg）。

1. 术前准备

  1. 在全身麻醉前，将兔子禁食并禁水 6-8 小时。
  2. 称量兔子的体重。
  3. 使用纱布蘸取 70% 乙醇擦拭兔子耳朵。
  4. 在耳朵上涂抹局部麻醉药膏。
  5. 压迫耳根部位，使耳缘静脉扩张。
  6. 通过耳缘静脉注射咪达唑仑（1-2 mg/kg）对兔子进行镇静20。
  7. 使用面罩给予吸入麻醉。设置氧气流速为 1 L/min，异氟烷浓度为 4%-5%，以诱导麻醉。
    注意：判断麻醉深度时，将动物后肢拉直，并用拇指和食指用力夹捏足部。在撤退反射消失之前，不应进行手术操作21。
  8. 维持异氟烷浓度在 2.5%-3.5%（根据兔子体重调整）。

2. 术中操作

  1. 手术前对所有手术器械（血管钳/镊子、组织剪、缝合剪、手术刀柄、#22 手术刀片、双头手持拉钩、无菌纱布、3-0 可吸收缝线、4-0 不可吸收编织缝线、持针器、花生纱布[手工制成的球形纱布]、5 mL 注射器、1 mL 注射器、16 G 针头、26 G 针头、5 mm 深度限位器）进行高压灭菌处理。
  2. 使用 75% 酒精对手术台进行消毒。
  3. 使用电动剃刀和脱毛膏，剃除兔腹侧从最低肋骨至髂嵴水平区域的毛发。
    注意：避免损伤乳头。
  4. 将兔仰卧位固定于手术台上，并固定四肢。
  5. 以两侧髂嵴连线中点为基准，向上和向下各画一条距中点 2 cm 的线，作为手术切口位置的标记线，并用无菌记号笔标出。
  6. 用聚维酮碘溶液对皮肤消毒两次。在手术区域覆盖无菌带孔方巾，再用大块无菌方巾覆盖手术台。整个操作过程中须保持严格的无菌环境。
  7. 术前在切口部位皮下注射 2 mL 2% 利多卡因，以减轻术后疼痛。
  8. 沿标记线使用 #22 手术刀片切开皮肤，用弯头镊子和组织剪钝性分离筋膜、肌肉和腹壁组织。
  9. 进入腹膜腔后暴露膀胱，使用双头手持拉钩小心将膀胱及其他腹腔肠管组织向左侧牵拉。随后寻找髂静脉分叉处，并以此作为其下方 L5-6 椎间盘的定位标志。
    注意：操作时应注意避免损伤任何腹腔器官，尤其是肠道。
  10. 用手指触诊脊柱右侧搏动的腹主动脉，并将血管及周围器官向左侧牵拉。
  11. 在暴露目标椎间盘（L5-6）后，切开后腹膜，然后使用花生纱布钝性分离椎前肌组织。
  12. 为确认目标椎间盘的准确节段及进针方向，使用 26 G 针头穿刺目标椎间盘旁的椎体，并在 C 型臂透视引导下进行确认。
  13. 确定目标椎间盘位置后，将 16 G 针头尖端调整至与上下软骨终板平行。随后用针尖穿刺椎间盘（IVD）中心，深度达 5 mm（使用限位器），保持 30 秒。
    注意：应拍摄腰椎正位和侧位 X 光片，确认针尖位置是否位于椎间盘中心，且针尖方向是否分别与上下终板平行。
  14. 对下一个 L6-7 椎间盘重复相同操作。
  15. 缝合切口前，使用温生理盐水冲洗腹腔，并检查有无出血。
  16. 逐层缝合切口。使用 3-0 合成可吸收缝线连续缝合筋膜层，使用 4-0 不可吸收编织缝线全层缝合皮肤。
  17. 关闭麻醉蒸发器并停止麻醉。将兔置于代谢笼中持续观察，直至其恢复正常活动能力。

3. 术后管理

  1. 术后立即按 25 mg/kg 剂量肌肉注射头孢曲松钠。
  2. 让动物自由活动和进食。持续观察是否存在任何神经系统并发症的迹象，例如腿部瘫痪、排尿或排便困难，或消化系统并发症。

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结果

经腹途径在我们之前的研究中已得到验证，可用于建立椎间盘退变兔模型22X射线和磁共振成像（MRI）在第4天进行th, 12th, 和 16th 术后数周。X线影像显示，针刺手术后16周内，L5-6和L6-7节段椎间盘（IVD）高度逐渐降低。图1A）。针刺组的DHI在第4天时下降th, 12th，和16th 术后数周与术前相比23 (p < 0.05, 图1B).

为评估椎间盘退变（IVDD）的分级，对腰椎进行了MRI扫描24。MRI图像显示，在针刺手术后16周内，L5-6和L6-7节段的信号强度逐渐降低（图2A）...

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讨论

本方案中的关键步骤包括保护腹部器官、确定目标椎间盘以及针头的位置和方向。L5-6 椎间盘位于髂静脉分叉下方，L6-7 椎间盘则根据其与髂嵴平行的位置来识别。这两个解剖标志有助于精确地定位椎间盘，提高手术的准确性和可重复性——这也是经腹入路的主要优势之一。当针头穿刺目标椎间盘时，应确保针尖位于椎间盘中央，且针尖方向与上下终板平行，以避免损伤终板。

由于兔的腹部较为柔软，在确定腹部正中切口时容易发生偏移。有趣的是，我们发现通过两侧乳头连线的中点可以准确定位中线切口，从而提供一种更为标准化的解剖方法，并减少不必要的损伤。此外，使用花生纱布分离椎前软组织，能够更快且更清晰地暴露椎间盘（IVD）结构，同时减少出血。

经腹途径的局限性包括腹腔内静脉丛破裂风险增加，以及轻度肠管和腹壁粘连。本研究中针刺组共有4只兔子，其中1只死亡。死亡原因为腹腔内静脉丛破裂，导致术中及术后出血过多。根据我们的经验，如果术者对兔的手术操作及解剖结构不熟悉，手术时间将延长，并导致更多的术后并发症。此外，我们未采用气管插管或心电图监测，因为这些措施会显著延长手术时...

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披露

作者声明不存在可能导致利益冲突的竞争性利益或关系。

致谢

本研究由河北省自然科学基金（编号：H2021108006）资助。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
#22 手术刀片Huaiyin MEDICAL Instruments Co., Ltd.AA6468无
16 号针头，26 号针头Zhejiang Kangkang MEDICAL-DEVICES Co., Ltd.305111无
3-0 可吸收缝线Huaiyin MEDICAL Instruments Co., Ltd.V500431无
4-0 不可吸收编织缝线Huaiyin MEDICAL Instruments Co., Ltd.R413无
5 mL 注射器，1 mL 注射器Zhejiang Kangkang MEDICAL-DEVICES Co., Ltd.301942无
双头手持拉钩Huaiyin MEDICAL Instruments Co., Ltd.60002066无
咪达唑仑 宜昌人福药业有限责任公司M-908CAS无
持针器Huaiyin MEDICAL Instruments Co., Ltd.HC00505336无
花生纱布自制无手工制作的球形纱布
兔Tonghui ulture Limited Liability Company SCXK2016--002无
手术刀柄Huaiyin MEDICAL Instruments Co., Ltd.AM5100678无
塞子自制无深度为 5 mm 
组织剪Huaiyin MEDICAL Instruments Co., Ltd.HC00505422无
麻醉蒸发器Apollo Management L.P.BW-AM503无
血管钳/镊子Huaiyin MEDICAL Instruments Co., Ltd.AM5102194无

参考文献

  1. Hartvigsen, J., et al. What low back pain is and why we need to pay attention. The Lancet. 391 (10137), 2356-2367 (2018).
  2. Simon, J., McAuliffe, M., Shamim, F., Vuong, N., Tahaei, A. Discogenic low back pain. Physical Medicine and Rehabilitation Clinics of North America. 25 (2), 305-317 (2014).
  3. Livshits, G., et al. Lumbar disc degeneration and genetic factors are the main risk factors for low back pain in women: The UK twin spine study. Annals of the Rheumatic Diseases. 70 (10), 1740-1745 (2011).
  4. Yang, S., Zhang, F., Ma, J., Ding, W. Intervertebral disc ageing and degeneration: The antiapoptotic effect of oestrogen. Ageing Research Reviews. 57, 100978(2020).
  5. Daly, C., Ghosh, P., Jenkin, G., Oehme, D., Goldschlager, T. A review of animal models of intervertebral disc degeneration: Pathophysiology, regeneration, and translation to the clinic. BioMed Research International. 2016, 5952165(2016).
  6. Li, Z., Gao, X., Ding, W., Li, R., Yang, S. Asymmetric distribution of Modic changes in patients with lumbar disc herniation. European Spine Journal. 32 (5), 1741-1750 (2023).
  7. Huo, Y., et al. Incidence and risk factors of lumbar plexus injury in patients undergoing oblique lumbar interbody fusion surgery. European Spine Journal. 32 (1), 336-344 (2023).
  8. Urban, J. P., Roberts, S. Degeneration of the intervertebral disc. Arthritis Research & Therapy. 5 (3), 120-130 (2003).
  9. Adams, M. A., Roughley, P. J. What is intervertebral disc degeneration, and what causes it. Spine (Phila Pa 1976). 31 (18), 2151-2161 (2006).
  10. Singh, K., Masuda, K., An, H. S. Animal models for human disc degeneration. The Spine Journal. 5 (6 Suppl), 267s-279s (2005).
  11. Mern, D. S., Walsen, T., Beierfuß, A., Thomé, C. Animal models of regenerative medicine for biological treatment approaches of degenerative disc diseases. Experimental Biology and Medicine (Maywood, N. J.). 246 (4), 483-512 (2021).
  12. Alini, M., et al. Are animal models useful for studying human disc disorders/degeneration. European Spine Journal. 17 (1), 2-19 (2008).
  13. Qian, J., et al. Selection of the optimal puncture needle for induction of a rat intervertebral disc degeneration model. Pain Physician. 22 (4), 353-360 (2019).
  14. Kroeber, M. W., et al. New in vivo animal model to create intervertebral disc degeneration and to investigate the effects of therapeutic strategies to stimulate disc regeneration. Spine (Phila Pa 1976). 27 (23), 2684-2690 (2002).
  15. Wang, Y., et al. Puncture intervertebral disc degeneration model: A standard on rabbit. Journal of Hard Tissue Biology. 29 (4), 223-230 (2020).
  16. Lotz, J. C. Animal models of intervertebral disc degeneration: lessons learned. Spine (Phila Pa 1976). 29 (23), 2742-2750 (2004).
  17. Lei, T., et al. A novel approach for the annulus needle puncture model of intervertebral disc degeneration in rabbits. American Journal of Translational Research. 9 (3), 900-909 (2017).
  18. Moss, I. L., et al. Retroperitoneal approach to the intervertebral disc for the annular puncture model of intervertebral disc degeneration in the rabbit. The Spine Journal. 13 (3), 229-234 (2013).
  19. Zhang, Y., et al. Allogeneic articular chondrocyte transplantation downregulates interleukin 8 gene expression in the degenerating rabbit intervertebral disk in vivo. American Journal of Physical Medicine & Rehabilitation. 94 (7), 530-538 (2015).
  20. Inglis, S., Strunk, A. Rabbit anesthesia. Lab Animal (NY). 38 (3), 84-85 (2009).
  21. Greenfield, E. A. Administering anesthesia to rabbits. Cold Spring Harbor Protocols. 2018 (9), (2018).
  22. Yang, K., et al. Comparisons between needle puncture and chondroitinase ABC to induce intervertebral disc degeneration in rabbits. European Spine Journal. 31 (10), 2788-2800 (2022).
  23. Hoogendoorn, R. J., Wuisman, P. I., Smit, T. H., Everts, V. E., Helder, M. N. Experimental intervertebral disc degeneration induced by chondroitinase ABC in the goat. Spine (Phila Pa 1976). 32 (17), 1816-1825 (2007).
  24. Pfirrmann, C. W., Metzdorf, A., Zanetti, M., Hodler, J., Boos, N. Magnetic resonance classification of lumbar intervertebral disc degeneration. Spine (Phila Pa 1976). 26 (17), 1873-1878 (2001).
  25. Masuda, K., et al. A novel rabbit model of mild, reproducible disc degeneration by an anulus needle puncture: correlation between the degree of disc injury and radiological and histological appearances of disc degeneration. Spine. (Phila Pa 1976). 30 (1), 5-14 (2005).

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