设计和构建用于细胞骨架网络可视化的可定制、单物镜、光片荧光显微镜

Summary

该协议详细描述了如何构建单物镜，光片荧光显微镜及其用于可视化细胞骨架网络的用途。

Abstract

重组的细胞骨架复合材料已成为研究非平衡软物质的有价值的模型系统。忠实地捕捉这些3D密集网络的动态需要光学切片，这通常与荧光共聚焦显微镜有关。然而，光片荧光显微镜 （LSFM） 的最新发展使其成为一种具有成本效益且有时更优越的替代方案。为了让不太熟悉光学的细胞骨架研究人员能够使用LSFM，我们提供了一个循序渐进的初学者指南，介绍如何使用现成的组件构建多功能光片荧光显微镜。为了实现传统载玻片样品的样品安装，该LSFM采用单物镜光片（SOLS）设计，该设计利用单一物镜进行激发和发射收集。我们足够详细地描述了 SOLS 每个组件的功能，以便读者修改仪器并设计以满足他们的特定需求。最后，我们通过可视化驱动蛋白驱动的微管网络中的紫苑来演示这种定制 SOLS 仪器的使用。

Introduction

光片荧光显微镜 （LSFM） 代表了一系列高分辨率荧光成像技术，其中激发光被塑造成片 ^1,2，^包括选择性平面照明显微镜 （SPIM）、扫频共聚焦平面激发 （SCAPE） 和斜面显微镜 （OPM）^3,4,5,6,7.与落射荧光、全内反射荧光显微镜 （TIRFM） 或共聚焦显微镜等其他显微镜模式不同，LSFM 中的光毒性最小，并且样品可以在更长的时间尺度上成像，因为只有被主动成像的样品平面被照亮 ^8,9,10.因此，LSFM技术对于长时间对3D样品进行成像非常有用，特别是即使是那些对于共聚焦显微镜技术来说太厚的样品。由于这些原因，自 2004 年首次开发以来，LSFM 已成为许多生理学家、发育生物学家和神经科学家可视化整个生物体（如活斑马鱼和果蝇胚胎）的首选成像技术 3,4,6,11 .在过去的二十年中，LSFM 的优势已被用于在逐渐变小的尺度上可视化结构和动力学，包括组织^11,12、细胞和亚细胞尺度，包括体内和体外^{13、14、15、17}。

尽管文献中报告了成功的用例，但商业 LSFM 系统的高成本（截至撰写本文时为 ~25 万美元）^18,19 阻碍了该技术的广泛使用。为了使 DIY 构建成为研究人员的可行替代方案，已经发布了多个构建指南 8,13,20,21，包括开放获取工作 OpenSPIM ²²。然而，迄今为止，光学经验最少的研究人员只能使用早期的LSFM设计，这些设计与传统的载玻片样品不兼容（图1A）。最近的单物镜光片（SOLS）实现使用单物镜进行激发和检测（图1C），从而克服了与兼容性^{相关的限制}5,6,8,13,20。然而，由于需要两个额外的物镜来中继、去倾斜和重新成像物体平面到相机上进行成像，因此 SOLS 设计的多功能性成本大大增加了构建的复杂性（图 1D）。为了便于访问复杂的 SOLS 式设置，本文提供了有关设计、构建、对准过程和使用滑块兼容 SOLS 系统的分步指南，这对于仅了解入门级光学课程的研究人员很有用。

尽管协议本身简明扼要，但读者必须在准备步骤中参考其他资源，以了解有关设计或硬件注意事项的特定部分的更多信息。但是，如果读者打算遵循此设计的规范，则可能没有必要了解如何选择特定的光学元件。

图 1:不同 LSFM 配置的特性。 （A） 具有两个正交物镜的设置，在早期的LSFM设计中很常见。在这种配置中，使用毛细管或凝胶圆柱体来容纳样品，这与传统的载玻片安装技术不兼容。（B） SOLS光片设计示意图，显示以下内容:（C）用于样品平面（O1）激发和发射收集的单个物镜;这允许将传统滑块安装在顶部，并且 （D） 在 SOLS 发射路径中安装继电器物镜系统。O2 收集发射光并放大图像。O3 以正确的倾斜角度将飞机成像到相机传感器上。缩写:LSFM = 光片荧光显微镜;SOLS = 单物镜光片;O1-O3 = 物镜。 请点击这里查看此图的较大版本.

Protocol

1. 对齐准备

1. 在开始构建之前，请进行任何必要的文献综述，以清楚地了解预期的用例（例如，要成像的荧光团、必要的成像体积、分辨率要求）。特别是，请参阅下面的代表性结果部分，以确定是否适合遵循此处描述的确切设计。如果是，请跳到步骤 1.2。如果没有，请在 Sheunglab SOLS 构建指南²³ 中找到硬件选择的建议和指导。
   注意:用户可以在讨论部分找到有关此特定系统规格的更多信息。
2. 收集 材料表中详述的所有必要的光学、光机和电气元件。对于修改系统的用户，请收集所有等效部件。
3. 如 图2A所示构建对准激光器。使用剪力板检查梁是否准直。
4. 如 图 2B 所示构建双磨砂玻璃圆盘对准笼。
5. 制备荧光染料涂层测试样品。
   1. 通过将 1 mL 蒸馏水逐渐加入 0.2 g 冻干粉中直至全部溶解，制备饱和罗丹明染料溶液。涡流均匀化。
      注意: 此解决方案对光敏感。虽然在制备过程中没有必要的预防措施，但请确保在制备后将溶液储存在黑暗区域。
      注意: 处理罗丹明粉末时务必戴上手套和口罩。
   2. 将 10 μL 移液到测试载玻片的中心。
   3. 将 22 mm x 22 mm 的盖玻片放在液体顶部，确保荧光层尽可能薄。
   4. 用透明指甲油密封。
      注意:此示例对光敏感。为了最大限度地延长样品的使用寿命，请确保在不使用时将载玻片存放在黑暗区域。
6. 制备3D微珠样品（嵌入凝胶中的1μm微珠）。
   1. 使用双面胶带在样品载玻片上创建一个 4-5 毫米宽的垂直通道，三层胶带高。
   2. 将一个 22 mm x 22 mm 的盖玻片放在载玻片中央的胶带顶部。用力按压胶带区域，以确保胶带和盖玻片之间有良好的密封。
   3. 使用剃须刀片去除多余的胶带。
   4. 通过将去离子水逐渐加入 1 g 结冷胶粉中来制备 125 mL 饱和结冷胶溶液。该溶液在室温下为固体，在65°C下为液体。
   5. 将 1 mL 结冷胶溶液引入微量离心管中。在65°C的热板上加热一容器水，并加热微量离心管，直到结冷胶明显粘稠。
   6. 在温热的结冷胶溶液中制备 10 μL 1:1,000 稀释的珠子。
   7. 小心地将溶液移液到腔室中，直至充满。用牙签在通道两侧轻拍少量环氧树脂，完全覆盖开口进行密封。为确保正确密封，请目视检查两端，以确保环氧树脂已略微渗透通道的每一端。

图 2:对齐工具的照片。 （A） 准直对准激光器。AL1:对准镜头 1，−50 mm;AL2:对准镜头 2,100 mm （B） 双磨砂玻璃圆盘对准笼。缩写:RMS CP=RMS螺纹保持架板;SM1 CP = SM1 螺纹保持架板。 请点击这里查看此图的较大版本.

2. 调整激励路径

1. 在光学工作台表面勾勒出显微镜布局。尽可能准确地测量所有距离。
   注: 有关组件在系统中的位置，请参阅 图 3 。
2. 将激发激光器安装到工作台上。将两个虹膜设置到激光的预期高度，并将它们相距 2-3 英尺安装在反射镜 1 （M1） 位置后面的所需孔线上。使用这些光圈来确保光束与工作台表面齐平，并以光学工作台上的孔线为中心。
   注意: 戴上激光安全眼镜以保护眼睛，并用激光安全屏阻挡任何杂散激光束作为安全预防措施。在所有组件被永久夹紧之前，漂移可能是几个小时。在每天结束时，在对齐的最远点设置一个光圈，以便在返回构建时快速目视检查漂移。振动、光学工作台浮动不当和气流是光学漂移的最常见原因。
3. 将激光快门安装在尽可能靠近激发激光器的位置。利用此快门在对准过程中快速阻挡激光，而不是反复打开和关闭激光。
4. 将 ND 滤光片组装到 ND 滤光片转盘（ND 0.5、1.0. 2.0、3.0、4.0 和空白槽）中，并安装在激光快门后。
5. 将电动执行器切换到一个平移台 （TS1），然后将台插入 M1 位置下方。确保载物台沿激光所遵循的同一条孔线轴向平移。将舞台设置在其范围的中间，以便进行初始放置。
   1. 在以下步骤 2.6-2.10 中，将反射光学元件一次一个插入光束路径中，以将激光沿着桌子上绘制的路径引导。使用设置为精确高度的一对虹膜来定义所需的出射光束路径，并指导每个反射元件的放置和对齐。对于每个元件，调整支架的高度和位置，以确保入射光束击中中心。然后，旋转支架的底座，使光束沿着桌子上拉出的光束路径引导光束，使其穿过两个光圈，并使用每个支架背面的旋钮微调出光束的倾斜度。
      注意: 每个元素对齐到正确的高度后，在柱子上添加一个套穿式衣领以确保高度。
6. 将 M1 安装并对齐在 TS1 的顶部。
7. 将二向色镜安装并对齐到工作台上。
8. 按照制造商的说明，将振镜连接到电源和函数发生器。
9. 安装振镜，使激光入射到镜子的精确中心。打开振镜电源，然后按住波形发生器上的 AM 按钮，将反射镜倾斜度设置为 0 V DC 电流（范围的中心）。现在，将振镜对准虹膜。
10. 安装并对齐镜像 2 （M2）。
11. 将大圆柱镜插入圆柱镜支架。使用 1 in 笼杆在镜子 30 （M3） 上方连接一个 60-3 mm 的笼式适配器。使用镜子支架上的旋钮压平 M3 镜子的倾斜度以进行初始放置。
12. 将双磨砂玻璃对准笼安装到 M3 上方的笼子适配器中; 每次用于对准时，请务必拧紧笼式适配器上的固定螺钉，这些螺钉将定位架固定到位。将 M3 安装到工作台上，并调整高度和位置，直到光束大致位于两个磨砂玻璃对准盘的中心。将 M3 夹在桌子上，并使用 M3 两侧的立柱安装、3 英寸立柱、90° 夹具和 2 立柱，使用镜架两侧的胶带孔添加支撑。使用镜子背面的旋钮微调光束。
    注意: 激励路径中的所有反射元件现在都已设置，不应触摸。
13. 将镜头 1 （L1） 安装到桌子上。对于所有初始镜头放置，请使用旋入式镜头目标将入射光束居中在镜头前部。调整镜头 1 （L1） 的倾斜度和横向位置，直到光束位于 M3 上方对准笼上的两个磨砂玻璃板上。
14. 将镜头 2 （L2） 安装在各自的位置，以创建带有 L1 的 4f 系统。轴向移动L2得到准直光束，利用激发激光和剪切板检查准直情况。调整 L2 的倾斜度和横向位置，使光束在 M3 上方的两个磨砂玻璃圆盘上居中。
15. 将针孔安装到 xy 平移支架中。将其安装在一维平移平台的顶部，以提供精细的轴向平移。将针孔和载物台安装到立柱和立柱安装座上，并将其放置在 L1 和 L2 之间的共享焦点处。用手调整针孔，直到激光可以通过针孔看到。
16. 紧接针孔后安装功率计传感器，使用功率计数字控制台上的波长按钮选择激发激光器的波长。调整针孔的xy位置，以最大限度地提高透射率，并获得接近TEM00的光束轮廓。然后，用 1D 级轴向调整针孔，以进一步最大化传输。
17. 将镜头 4 （L4） 安装到工作台上的位置，然后将卡口调整到正确的高度。轴向调整 L4，使激发光束聚焦在振镜表面。调整 L4 的倾斜度和横向位置，使光束在 M3 上方的两个磨砂玻璃圆盘上居中。
18. 将镜头 3 （L3） 安装到工作台上的位置，然后将安装座调整到正确的高度。使用激发激光和剪切板检查 L3 和 L4 的准直。调整 L3 的倾斜度和横向位置，使光束在 M3 上方的两个磨砂玻璃盘上居中。
19. 暂时删除 L3。将扫描透镜 1 （SL1） 安装到工作台上，并调整轴距以形成与 L4 的准直望远镜，如剪切板测量的那样。调整 SL1 的倾斜度和横向位置，使光束在 M3 上方的两个磨砂玻璃盘上居中。
20. 重新插入 L3。安装镜筒 1 （TL1），并使用激发光束和剪切板准直 SL1 和 TL1。调整 TL1 的倾斜度和横向位置，使光束在 M3 上方的两个磨砂玻璃盘上居中。
21. 使用转接环，将物镜 1 （O1） 拧入 M3 上方的保持架板。暂时移除 SL1，让横梁撞到天花板上。调整笼式系统上 O1 的高度（轴向距离），直到梁在天花板上形成一个 Airy 圆盘，然后继续调整，直到圆盘的尺寸最小化。
22. 在 O1 就位的情况下，将样品台安装在适当的位置。

图 3:组件在 SOLS 系统中的位置。 （A） SOLS系统的示意图布局，所有组件都已标记。（B） 光学台上物理 SOLS 系统的自上而下照片，不包括样品台区域。（C）样品台区域的自上而下照片（ 扩展至图3B）。激励路径以绿色显示。发射路径以红色显示。镜头焦距:L1:100 mm;L2:45 毫米;CL1:50毫米;CL2:200毫米;CL3:100毫米;长3:150毫米;L4:100毫米;SL1:75毫米;TL1:200毫米;SL2:150毫米;TL2:125毫米;TL3:200 毫米。有关更详细的零件规格，请参阅 材料表 。缩写:SOLS = 单物镜光片;ND转盘=可变中性密度滤光片转盘;L1-L4 = 平凹消色差透镜;CL1-CL3 = 柱面透镜;M1-M3 = 镜子;TS1-TS2 = 翻译阶段;DM = 二向色镜;振镜 = 扫描振镜;SL1-SL2 = 扫描镜头;TL1-TL2 = 镜筒透镜;O1-O3 = 物镜;EF = 发射滤波器。 请点击这里查看此图的较大版本.

3. 调整发射路径

1. 设置对准激光器。
   1. 在与激发激光器相同的高度旁边安装两个空笼板。使用这些保持架板通过将取向激光器的保持架杆滑入两个保持架板上的空孔来安装对准激光器。确保激光器可以设置为打开位置，方法是在电源按钮周围贴胶带或连接开/关开关。
   2. 取下 O1，然后重新插入磨砂玻璃对准笼。使用一个运动镜支架和一个下拉镜将对准光束与激发光束路径对齐。
   3. 使用功率计通过微调两个反射镜来最大化针孔后的对准光束的信号。确保光束保持在磨砂玻璃对准笼的中心。
2. 取下对准笼，然后重新插入 O1。将方形反射镜放在O1的样品台上，轴向调整反射镜，直到二向色后光束轮廓的尺寸最小化。
3. 在发射路径中安装一个光圈，并向后足够远，以便可以无干扰地插入扫描镜头 2 （SL2）、镜筒镜头 2 （TL2） 和物镜 2 （O2）。将此光圈与对准激光器对齐。在虹膜后方至少 1 英寸处安装磨砂玻璃盘，并确保它也与激光对齐。
4. 以正确的距离插入 SL2，用尺子从振镜测量。调整 SL2 的倾斜度和横向位置，使入射对准光束以 SL2 为中心，出射光束穿过光圈和磨砂玻璃盘。
5. 用尺子从 SL2 测量的正确距离插入 TL2。调整 TL2 的倾斜度和横向位置，使入射对准光束以 TL2 为中心，出射光束穿过光圈和磨砂玻璃盘。
6. 将 TS2 安装到桌子上。确保载物台沿 O2 的光轴平移。
7. 将 O2 拧到 xy 平移支架上。在 xy 支架下方连接一根柱子，将 O2 安装到翻译台上。使用旋入式目标将 O2 的背面放在红色激光器上居中。
8. 调整 xy 旋钮和 O2 的倾斜度，使红色对准光束穿过虹膜和磨砂玻璃盘。
9. 将对准激光移动到 O1 上方并向下指向发射路径。打开激光，并确保该光束位于发射路径中的所有透镜上。
10. 通过打开虹膜并移除磨砂玻璃盘来共轭 O1 和 O2 的瞳孔平面，以便从 O2 出来的对准光束继续畅通无阻地到达远处的表面或墙壁 （>0.5 m）（图 4）。调整 TS2 直到光束在表面上形成一个小的 Airy 圆盘，然后继续调整 TS2 以最小化 Airy 圆盘的大小。
    注意: 强烈发散的光束表示 O2 的位置不正确。然而，由于该光束穿过两个物镜，因此固有的少量发散是固有的。因此，Airy 磁盘是最好的指南。
11. 优化倾斜不变扫描的振镜:按波形发生器上的 FSK 按钮为振镜选择三角波信号，并设置为低频 （~1 Hz）。观察同一远处表面或墙壁上的对准梁。
    注意: 如果振镜放置不正确，光束将随着振镜运动水平扫过表面。这可以通过微调（手动）振镜基座的倾斜度和 xy 位置来解决，直到肉眼无法检测到光束位移。
12. 通过0°成像检查系统质量。
    1. 将 O3 拧入 xy 平移支架。将 1 英寸镜筒拧入笼式平移台，然后将 xy 平移台拧入镜筒。使用两根保持架杆将保持架平移台的前部连接到保持架板，并将保持架板安装到立柱上。 以 0° 将物镜 3 （O3） 安装在靠近 O2 （~4-5 mm） 的前部，并调整高度以匹配。
    2. 在 SL2 和 TL2 之间的共享焦平面上安装磨砂玻璃对准盘，用尺子测量。将亚克力荧光测试载玻片安装到载物台上，并用激发激光照亮载玻片。透过 O3 的背面，调整 O3 的高度和轴向位置以找到发射光，然后轴向调整 O3，直到发射光充满后孔（图 5）。
    3. 将两根 8 英寸笼杆拧入 O3 平移台的背面。将带有已安装磨砂玻璃盘的笼板滑到杆上，然后使用 xy 支架微调 O3，以确保发射光以 O3 为中心离开。然后，取下笼杆。
    4. 在相机传感器的粗糙位置安装磨砂玻璃盘，并将盘的高度和位置对准发射光。
    5. 将镜筒 3 （TL3） 拧入笼板，并将其安装在 O3 的正后方。将 TL3 居中放在入射发射光上，然后调整 TL3 的倾斜度，使出射光对准磨砂玻璃盘。
    6. 将相机安装在与镜筒透镜的正确距离处，用尺子测量。
    7. 将 2 英寸镜筒和发射滤光片都拧到相机上。
    8. 将磨砂玻璃对准盘重新安装在 SL2 和 TL2 之间的共享焦平面中。安装荧光染料测试样品，并用激发光束照亮样品。
    9. 打开相机，然后在连接的计算机上打开Micromanager程序。点击 直播 进入直播取景。单击 "自动一次 "以设置初始曝光设置，然后在成像时根据需要重置曝光。
       注意: 除非在相机打开 后 打开微管理器，否则它将无法正常工作。
    10. 调整 O3 支架上的 xy 平移旋钮，直到玻璃对准盘上的小孔在视场 （FoV） 内居中。使用笼式平移台轴向调整 O3，直到孔聚焦;边缘应该看起来很锋利（图 6）。
    11. 对荧光磁珠进行成像，以检查系统的质量。
        1. 取下磨砂玻璃对准盘，安装 3D 珠样品，然后用激发光束照亮样品。
        2. 调整样品相对于 O1 的高度，直到荧光珠填充 FoV 中心的圆形区域。
        3. 使用 xy 级和轴向平移级微调 O3 的位置，直到点扩散函数 （PSF） 是圆形的（表示最小的像差）和明亮的（表示良好的信噪比）（图 7）。如果不能通过调整 O3 来实现这一点，则组件 O1 和 O2 之间的光学系统很可能没有达到最佳对准状态;按照下面步骤 3.13 中的诊断检查进行操作。
        4. 如果可以获得 圆形 PSF ，请跳过诊断步骤，并继续倾斜成像系统。
13. 如果需要，请执行诊断检查。
    注意:获得良好的 PSF 后，可以跳过其余的诊断步骤。
    1. 将明场 （BF） 灯安装在 O1 上方。将正栅测试目标安装在与 对准镜相同的轴向高度的样品台上。将 10 μm 网格居中，并用 BF 灯照亮网格。
    2. 在相机上对网格进行成像，然后平移样本，直到网格对焦。使用网格图像确认 FoV 上的视场是平坦的:否则，网格将出现扭曲和弯曲。要校正不良的网格图像，请调整 O3 的 xyz 位置和倾斜度，然后相应地调整 TL3 和相机。
       注意:如果可以实现平坦的网格，请重复步骤 3.12.10，然后继续倾斜成像系统。
    3. 将对准相机或成像相机设置在正确的距离，以便 SL2 将图像聚焦到传感器上。在中间平面上对网格目标进行成像（图 8）。如果该网格也偏斜，则组件 O1 和 SL2 之间的光学系统很可能未最佳对齐，应重新审视。在继续之前，根据需要优化对齐方式。
       注意: 如果相机不适合 SL2 和 TL2 之间，请使用额外的镜子在 SL2 之后将图像反射 90° 并反射到相机上。
    4. 检查中间平面的 PSF:检查网格后，另一个很好的诊断检查是检查同一中间平面的 PSF。该平面上的良好图像与 图 7 相似，但放大倍率不同（图 9），表明通过 SL2 的对准良好。
       注意:如果可以在中间平面上实现平坦的网格和圆形 PSF，请重复步骤 3.13.2，然后重复步骤 3.12.10，然后继续倾斜成像系统。
14. 将 O3 成像子系统倾斜至 30°。
    1. 卸下 O3、TL3 和相机。
    2. 以桌子上的线为指导，将 O3 以 30° 重新插入 O2 的光轴。
    3. 在 SL2 和 TL2 之间的共享焦平面上安装磨砂玻璃对准盘。将亚克力荧光测试载玻片安装到载物台上，并用激发激光照亮载玻片。再次，透过 O3 的背面，调整 O3 的高度和轴向位置，找到 30° 的发射光，然后轴向调整 O3，直到发射光充满后孔。
    4. 从 SL2 和 TL2 之间取下磨砂玻璃对准盘以获得更强的发射信号。
    5. 将两根 8 英寸笼杆拧入 O3 平移台的背面。将带有已安装磨砂玻璃盘的笼板滑到杆上，然后使用 xy 支架微调 O3，以确保发射光以 O3 为中心离开。然后，取下笼杆。
    6. 在相机传感器的粗糙位置安装磨砂玻璃盘，并将盘的高度和位置对准发射光。
    7. 安装 TL3 紧跟在 O3 后面。将 TL3 居中放在入射发射光上，然后调整 TL3 的倾斜度，使出射光对准磨砂玻璃盘。
    8. 要更准确地设置 TL3 相机距离，请小心地拧下 O3，然后安装对准激光器，使其被 TL3 聚焦到相机上。必要时使用 ND 滤光片，使激光强度为 <1 mW。启动 摄像机实时取景，并轴向调整 TL3 以最小化摄像机上的激光光斑。
    9. 将磨砂玻璃对准盘重新安装在 SL2 和 TL2 之间的共享焦平面中。安装荧光染料测试样品，并用激发光束照亮样品。调整 O3 卡口上的 xy 平移旋钮，直到玻璃对准盘上的小孔位于相机的 FoV 范围内。调整保持架平移台以轴向移动 O3 直到孔聚焦;确保孔看起来与 0° 时相似。
    10. 在相同的轴向高度重新安装正栅测试目标，并用 BF 灯照亮栅格。确认只有一个垂直截面处于对焦状态（由于 30° 倾斜）。再次使用网格图像确认 FoV 上的视场是平坦的，即使在失焦时也是如此。当幻灯片轴向平移时，确认 FoV（网格目标）的对焦部分水平扫过屏幕，而网格方块保持一致的大小（图 10）。
        注意:由于样品处成像平面的倾斜，网格在 x 平面中可能会略微拉伸。

图 4:激光输入激光输出技术。 通过 O1 的前部发送准直测试光束，并在遥远的表面上观察从 O2 出来的光束。如果所有组件都以正确的距离对齐，光束将在远处的表面上形成一个小的艾里圆盘。所有缩写均与 图 3 相同。 请点击这里查看此图的较大版本.

图 5:利用发射光进行对准。 （A） 亚克力荧光载玻片在 O2 BFP 后面的旋入式目标上的发射光。（B） 通过O3背面的目视找到发射光。缩写:O2-O3 = 物镜;BFP = 后焦平面。 请点击这里查看此图的较大版本.

图 6:正确对焦的磨砂玻璃对准盘的相机图像。 磁盘放置在 SL2 和 TL2 之间的中间平面上。比例尺 = 50 μm。缩写:SL2 = 扫描镜头;TL2 = 镜筒透镜。 请点击这里查看此图的较大版本.

图 7:3D 磁珠样品的相机图像。 该图像显示了 1 nm 磁珠，成像模块设置为 0°，并在插入柱面透镜之前由圆形光束照亮。比例尺 = 50 μm。 请点击这里查看此图的较大版本.

图 8:正确聚焦在 SL2 和 TL2 之间的中间平面上的正网格测试目标。 整个场域的平坦网格表示 SL2 和之前组件的对齐良好。比例尺 = 30 μm。缩写:SL2 = 扫描镜头;TL2 = 镜筒透镜。 请点击这里查看此图的较大版本.

图 9:3D 磁珠样品的相机图像。 该图像显示 1 nm 磁珠正确聚焦在 SL2 和 TL2 之间的中间平面上。比例尺 = 30 μm。缩写:SL2 = 扫描镜头;TL2 = 镜筒透镜。 请点击这里查看此图的较大版本.

图 10:正网格测试目标，覆盖了大小一致的黄色方块以匹配网格的正方形。 （A） 左侧聚焦的网格。（B） 网格聚焦在右侧。黄色方块与 FoV 两侧的网格框的大小相匹配。比例尺 = 30 μm。 缩写 = FoV = 视场。 请点击这里查看此图的较大版本.

4. 对齐倾斜光片

1. 取下 O1，然后将双磨砂玻璃对准笼重新插入其位置。确认光束在两个磨砂玻璃盘上准直并居中。
2. 将柱面透镜 1 （CL1） 拧入旋转透镜卡口。将 CL1 安装到光路中，并旋转安装座，使光束沿垂直于光学台的方向扩展。调整 CL1 的倾斜度和横向位置，使光束在前部居中，并在两个磨砂玻璃盘上保持居中位置。
3. 将柱面透镜 2 （CL2） 拧入旋转透镜卡口，并将 CL2 以正确的距离安装到光路中，与 CL1 形成 4f 系统。将 CL2 旋转到与 CL1 相同的方向，使光束沿垂直于光学台的方向拉伸并准直。使用测试卡测量圆柱形梁轮廓在多个位置的高度，以确保梁准直。调整 CL2 的倾斜度和横向位置，如步骤 4.2 中执行。
4. 将柱面透镜 3 （CL3） 拧入旋转透镜卡口，并将 CL3 以正确的距离安装到光路中，以形成与 L3 的 4f 系统。将 CL3 旋转到与 CL1 和 CL2 相同的方向，以便光束向下聚焦到焦平面处的水平片材轮廓。调整 CL3 的倾斜度和横向位置，如步骤 4.2 中执行。
5. 插入狭缝:使用四个 4 英寸笼杆和 CL3 笼架安装座，将狭缝垂直安装在 CL3 和 L3 之间的焦平面处，用尺子测量。使用拉伸激发光束轮廓来调整狭缝的高度和横向位置，直到它位于光束的中心。
6. 重新插入O1，安装荧光染料测试样品，并用激发光片照亮样品。在相机传感器处，确认 0° 光片显示为薄的垂直片（图 11A）。
7. 取出荧光染料测试样品，将O1擦拭干净。让光片在 O1 上方畅通无阻地扩展。使用电动平移载物台控制，将 M1 平移到 柱面透镜上，将光片的角度设置为相对于 O1 光轴的大约 60°。
   注意:至关重要的是，光片必须向正确的方向倾斜，以便与类似倾斜的成像平面对齐（图12）;如果系统的布局与此特定设计不同，则可以通过几何光线追踪确定倾斜的正确方向。
   注意: 作为参考，在此设置中，将 M1 2.647 mm 朝向狭缝将灯片设置为正确的倾斜度。
8. 重新插入荧光染料测试样品以对倾斜的片材进行成像。确保光片在相机上保持垂直光束形状，但更宽更暗（图 11B）。
9. 使用载物台轴向平移样品，使荧光染料在FoV中心和屏幕右侧之间的五个不同深度处被光片照亮。保存每张图片。
10. 在斐济打开图像。对于每个图像，选择" 线条"工具，然后从 FoV 中心到光页中心绘制一条水平线。要测量位移，请转到 分析 |测量 以查看线条的长度。然后，绘制光片的位移作为样品深度的函数，以计算 O1 上方光片的角度。
11. 稍微翻译 M1。重复步骤4.9和步骤4.10，直到光片与O1光轴成60°角，与成像平面的角度相匹配。

图 11:荧光染料测试样品的相机图像，由正确形状的光片照亮。 （A） 片材呈 90°，沿 O1 的光轴笔直向上，以及 （B） 倾斜至 30°（与 O1 的光轴成 60°）。比例尺 = 50 μm。 缩写:O1 = 物镜。 请点击这里查看此图的较大版本.

图 12:光片倾斜的正确方向，以与 O1 的成像平面对齐。 缩写:O1-O3 = 物镜。 请点击这里查看此图的较大版本.

5. 微调成像和数据收集系统

1. 安装 3D 磁珠载玻片，并与载物台轴向平移样品，直到磁珠填满相机上的 FoV。
2. 使用 xy 级和笼式平移级调整 O3，旨在最大限度地减少像差并优化图像中的信噪比（图 13）。
3. 调整O1的校正环，旨在最大限度地减少像差并优化图像中的信噪比。

图 13:由正确形状的光片照亮的 3D 磁珠样品（1 μm 磁珠）的相机图像。 （A） 片材呈 90°，沿 O1 的光轴垂直向上，以及 （B） 与 O1 的光轴倾斜 30°。黄色框表示 FoV 中平坦、一致且可用的部分 （80 μm x 80 μm），并且可以在其中捕获可靠的数据。比例尺 = 50 μm。 缩写: O1 = 物镜;FoV = 视场。 请点击这里查看此图的较大版本.

6. 校准系统的放大倍率

1. 将正栅测试靶安装在样品台上，并用明场光照射。
2. 将网格滑轨与载物台轴向平移，使网格滑轨成为焦点。将网格的中心置于焦点。
3. 捕获并保存图像，然后在斐济打开它。
4. 在斐济使用 线工具 和 测量功能 来准确测量两条网格线之间的距离（以像素为单位）。将该值除以已知距离 （10 μm），以确定像素到微米的校准。
5. 使用测量的像素大小和像素的已知大小使用公式 （1） 计算系统的放大倍率 （M）。
   （一）

7. 采集体积扫描

1. 放置样品。
   1. 打开相机预览、振镜、函数发生器、电源、载物台和激发激光器。
   2. 挂载样品，然后单击函数发生器上的 FSK 按钮以设置三角波。要查找样本，请使用函数发生器设置以下内容: 400 mV 峰峰值幅 度（使用 "放大 "按钮）、 0 偏移 （使用 "偏移 "按钮）和 200 mHz 频率。使用 "微管理器"窗口 设置 100 毫秒的曝光时间。
   3. 手动滚动 z 轴，直到到达采样平面。优化 z 设置 ，以便体积扫描的所需区域在一个周期内通过屏幕。
2. 选择扫描参数。
   1. 通过目视检查预览在扫描期间是否处于焦点状态，确保峰峰值振幅设置正确。如果图像质量在接近扫描的一端比另一端下降得更快，请在函数发生器上编辑偏移量，将扫描中心移向更好的区域。
   2. 在 Micromanager 程序中，选择曝光时间，然后单击 Multi-D Acq. 以打开 Multi-Dimensional Acquisition 窗口。使用"计数"框选择帧数，这将设置总采集时间。帧之间的间隔（帧速率）将由曝光时间设置，除非在"间隔"框中指定了更长的间隔。在函数发生器上，将频率设置为三角波函数周期的一半（单向线性扫描）以创建全体积扫描。
      注意:如果帧速率和频率太低，则体积扫描将获取太少的帧，并且低帧数将在后期处理中产生可见伪影。作为参考， 图 13 由扫描中的 ~100 帧 组成， 图 14 由 ~800 帧组成。在选择参数时，考虑样品本身也很重要。确保设置曝光时间，使样品充分激发但不饱和。激发激光强度也可以调节到此目的。如果用户要采集一系列体积扫描以表征 3D 时变过程，请确保扫描时间尺度超过系统的时间尺度动态。
3. 收集视频:获取一个延时摄影，该延时摄影至少捕获三角波完全上升或下降的持续时间，对应于对音量进行一次完整扫描。

8. 后处理程序

1. 去歪斜体积图像堆栈
   1. 校正体积扫描以将倾斜平面中的图像堆栈转换为实际 xyz 坐标中的一系列图像。
      注:有许多关于光片图像后处理和开源软件的优秀指南，用于执行现有体积扫描的校正，以及在采集期间执行校正和保存校正图像²⁴。
   2. 要纠偏体积扫描，请获取以下两个参数:两个帧之间的实际距离（以像素为单位）和帧平面与 x-y 平面之间的角度（θ 由倾斜光片的角度设置（在本系统中为 30°）。帧之间的距离将取决于成像光学元件和采集设置。
2. 查找 d 参数
   1. 每次系统大幅重新对齐时校准帧之间的距离。使用一堆荧光珠图像执行此校准，因为这些图像最容易用于诊断问题。
   2. 获取一堆图像，并使用 对 d 参数的任何初始猜测运行纠偏代码。在 ImageJ 中打开纠偏图像堆栈，然后滚动浏览堆栈。如果 d 的设置与它的真实值相去甚远，请注意，珠子在 x 或 y 中会显得人为地拉长，并且当用户滚动浏览 z 中的帧时，单个珠子似乎会在 xy 平面中移动（而不是从同一中心点聚焦和散焦）。多次循环访问 d 参数，直到这些问题不再明显。
   3. 一旦 d 参数看起来相当接近真实值，则沿 x 和 y 方向计算图像堆栈的最大强度投影。请注意，直径接近衍射极限的磁珠可能在 z 中呈拉长，但理想情况下它们不应呈圆锥形或沿对角线拉长。微调纠偏参数，直到这些条件在新的迭代中没有实质性改进。作为参考， 图 13 中所示的数据在 d = 2.50 像素处被校正， 图 14 中的数据在 d = 1.0 像素处被校正。
      注意:帧之间的距离将线性地取决于扫描幅度、频率和帧速率。

Results

我们对嵌入结冷胶中的 1 μm 珠子进行了体积扫描。 图 14 显示了沿 x、y 和 z 方向的纠偏体积扫描的最大强度投影。

图 14:结冷胶中 1 μm 荧光珠的体积成像。 显示了纠偏体积扫描的最大强度投影。比例尺 = 30 μm。 请点击这里查看此图的较大版本.

我们已经演示了使用单物镜、光片显微镜通过对微管紫苑样品进行体积扫描来表征重组的细胞骨架网络。简而言之，罗丹明标记的紫杉醇稳定的微管通过GTP从重组的二聚体聚合而成;然后，聚合后，将基于链霉亲和素的驱动蛋白运动簇与 ATP 混合到样品中，以获得 6 μM 微管、0.5 μM 驱动蛋白二聚体和 10 mM ATP 的最终浓度。有关制备紫杉醇稳定微管和驱动蛋白运动簇的广泛方案和指南，请访问Mitchson实验室和Dogic实验室网站^25,26。将样品轻轻移液到显微镜载玻片中，密封，并在成像前静置8小时，以使运动活动停止，使样品达到类似于紫苑的稳定结构状态。

对重建细胞骨架系统的研究最常使用共聚焦或落射荧光显微镜对标记的细丝进行成像。然而，这两种技术在对密集的3D样品进行成像的能力方面都受到限制²⁷。虽然通过将样品限制为准 2D ^28,29，基于体外细胞骨架的活性物质研究取得了很大进展，但细胞骨架网络本质上是 3D 的，目前的许多努力在于了解只能在 3D 样品中出现的影响^29,30，因此产生了对高分辨率 3D 成像的需求。

图 15:通过单物光片显微镜促进重组细胞骨架样品的 3D 可视化。 （A） 在徕卡 DMi8 激光扫描共聚焦显微镜上采集的荧光微管紫苑图像。这些图像显示了 z 扫描的不同平面。比例尺 = 30 μm。 （B） 在同一样品的单物镜光片设置上执行的体积扫描的反卷积纠积图像。比例尺 = 30 μm。此处的纠偏图像区域对应于 图13B中所示的可用FoV（黄色框）。虽然共聚焦器擅长对盖玻片附近的单平面进行成像，但由于来自成像平面下方的额外信号，荧光样品的密度在较高平面成像时会带来复杂性。光片通过仅照亮成像平面来规避这个问题，从而允许在z的不同平面上进行均匀清晰的成像。缩写:SOLS = 单物镜光片;FoV = 视场。 请点击这里查看此图的较大版本.

在图 15 中，我们演示了重组的微管网络的体积成像，该微管网络通过驱动蛋白运动簇收缩成紫菀状结构。如先前的研究^28,31所示，这些3D结构倾向于向中心致密，从而产生明亮的荧光区域，这些荧光区域在信号中占主导地位。在盖玻片附近的成像平面（低z水平）中，共聚焦显微镜（图15A）可以分辨紫菀外围周围的单丝，由于来自上方的失焦荧光信号，朝向中心的额外背景。然而，在z轴上移动几微米会迅速降低图像质量，因为紫菀的失焦致密部分在成像平面的信号中占主导地位。光片的单平面照明（图15B）消除了来自成像平面上方和下方的紫菀密集部分的失焦信号，从而允许平面之间的图像质量相当。光片能够产生高质量、可靠的体积扫描数据，这为在重组的细胞骨架系统中可视化和表征 3D 现象提供了可能性。

Discussion

关于该协议的两个重要细节是系统的总成本以及预期的构建和对齐时间。虽然确切的成本是可变的，但我们可以很容易地估计，这个 SOLS 或类似的 DIY 系统的 多总 成本将在 85,000 美元的范围内。我们注意到，此估算考虑了所有组件的零售价格，因此通过采购二手组件可能会大大降低整体价格。就构建时间而言，如果所有组件都可用且准备就绪，那么期望光学经验不足的用户在 1-2 个月内构建和对齐整个 SOLS 系统是合理的。尽管该协议很长且很复杂，但我们相信书面手稿中的细节量与视频协议相结合，应该使该协议简单明了且易于遵循。

该协议中有两个关键步骤。首先，振镜的位置决定了许多透镜的位置，因为它是三个独立的 4f 透镜对的一部分。至关重要的是，振镜必须与 O1 和 O2 的后焦平面共轭并正确居中，以确保倾斜不变扫描。其次，图像质量对 O2 和 O3 相对于彼此的对齐极为敏感。在这里，必须注意确保，首先，O3 到 O2 的对准角度与激发光片的倾斜度相匹配，从而在类似倾斜的 FoV 上提供最大平坦的照明。其次，O3 必须放置在正确的轴距处，以保持具有尽可能大面积的平坦 FoV。第三，O3 必须放置在与 O2 的正确横向距离处，以最大限度地通过 O2-O3 接口的信号。

就可用的 FoV 而言，该系统实现了平坦、可靠的视场，并在 80 μm x 80 μm 区域内提供一致的照明。该区域小于相机提供的最大 FoV，因此可用 FoV 由图 13 中的黄色框表示。在分辨能力方面，该系统沿 x 轴实现了 432 nm 的最小可分辨距离，沿 y 轴的最小可分辨距离为 421 nm，这是通过找到高斯拟合的平均 sigma x 和 y 在良好的 FoV 中与点扩散函数 （PSF） 乘以 2 来测量的。我们注意到，该系统在总数值孔径方面没有进行优化，这意味着如果用户希望分辨率高于该系统所达到的水平，则还有显著改进的余地。对于这种类型的SOLS构建，有许多兼容的物镜选项，其中许多选项有助于提高系统分辨率，但缺点是成本更高，FoV更小，或者继电器接口^8,11,13,20的对准技术更复杂。另外，如果用户需要更大的视场效应，则合并第二个振镜以允许2D扫描将实现这一目标，但需要将额外的光学元件和控制机制集成到设计³²中。我们在网站页面上提供了有关系统修改的更多详细信息，以及有关设计过程的其他有用资源^{的链接 23}.

除了改进这种特定设计的特定组件外，在此构建中添加其他高分辨率显微镜技术或模式是非常可行的。其中一项改进是合并多波长照明，这将涉及将额外的激发激光器对准原始激发路径⁸。此外，由于这种类型的 SOLS 设计使样品易于接近，因此向显微镜添加其他功能（包括但不限于光学镊子、微流体和流变测量）相对简单 ^2,33。

与已发布的无数光片指南相比，该协议提供了一定程度的说明，没有丰富光学经验的用户可能会发现有帮助。通过使具有传统样品载玻片安装功能的用户友好型 SOLS 构建可供更多受众使用，我们希望能够进一步扩展基于 SOLS 的研究在仪器已经或可能使用的所有领域的应用。即使SOLS仪器的应用数量迅速增长，^{数量为2,34,35}，我们相信SOLS型仪器的许多优点和利用仍未得到探索，并对此类仪器向前发展的可能性表示兴奋。

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
1" 平凹透镜 f = -50 mm	Thorlabs	LC1715-A-ML	用于对准激光器 预计成本：49.5 美元
1" 消色差双合透镜 f = 100 mm （x3）	Thorlabs	AC254-100-A-ML	L2、L4 和对准激光器 估计成本：342.42 美元
1" 消色差双合透镜 f = 125 mm	Thorlabs	AC254-125-A-ML	SL2 估计成本：114.14 美元
1" 消色差双合透镜 f = 150 mm	Thorlabs	AC254-150-A-ML	L3 预计成本：114.14 美元
1" 消色差双合透镜 f = 150 毫米	Thorlabs	AC254-150-A-ML	TL2 估计成本：114.14 美元
1" 消色差双合透镜 f = 45 毫米	Thorlabs	AC254-045-A-ML	L1 估计成本：114.14 美元
1" 消色差双合透镜 f = 75 毫米	Thorlabs	AC254-075-A-ML	SL1 估计成本：114.14 美元
1" 柱面透镜 f = 100 mm	Thorlabs	LJ1567RM	CL3 估计成本：117.62 美元
1" 柱面透镜 f = 200 mm	Thorlabs	LJ1653RM	CL2 估计成本：111.22 美元
1" 柱面透镜 f = 50 mm	Thorlabs	LJ1695RM	CL1 估计成本：117.62 美元
1" 安装针孔，30 µm 针孔直径	Thorlabs	P30K	估计成本：77.08 美元
1 英寸银镜 （x3）	Thorlabs	PF10-03-P01	M1、M2，一个用于对准 估计成本：168.78 美元
2 英寸椭圆镜	Thorlabs	PFE20-P01	M3 估计成本：179.98 美元
2 英寸柱架 （x11）	Thorlabs	PH2	用于定制激光支架、ND 轮、安全屏 预计成本：98.45 美元
2 英寸柱 （x47）	Thorlabs	TR2	用于定制激光支架和光学组件 估计成本：277.3 美元
3 英寸柱 （x4）	索拉布斯	TR3	用于 M3 支架和其他支架 预计成本：24.6 美元
3" 柱架 （x4）	Thorlabs	PH3	估计成本：38.48 美元
30 至 60 mm 笼式适配器	Thorlabs	LCP33	安装 O1 估计成本：45.42 美元
30mm 笼式滤镜轮	Thorlabs	CFW6	安装 ND 滤镜 估计成本：172.36 美元
30mm 笼式板 （x6）	Thorlabs	CP33	构建对准笼和对准激光器 估计成本：114.54 美元
30mm 直角运动镜支架 （x3）	Thorlabs	KCB1	安装 M1 和 M2 以及对准激光器 预计成本：463.95 美元
4 英寸立柱支架 （x30）	Thorlabs	PH4	预计成本：320.1 美元
561 nm 激光器和电源	Opto Engine LLC	MGL-FN-561-100mW	激发激光器 预计成本：6000 美元
60mm 笼板 （x2）	Thorlabs	LCP01	安装 TL1 和 M3 支架 预计成本：88.52 美元
60mm 直角运动镜安装	Thorlabs	KCB2	安装 M3 预计成本：187.26 美元
90°Flip Mount	Thorlabs	TRF90	用于对准激光器 预计成本：95.5 美元
带外部 C 接口螺纹和内部 SM1 螺纹的适配器	Thorlabs	SM1A9	将镜筒连接到相机 预计成本：20.96 美元
带外部 SM1 螺纹和内部 C 接口螺纹的适配器	Thorlabs	SM1A10	将镜筒透镜连接到镜头接口 预计成本：21.82 美元
带外部 SM1 螺纹和内部 M25 螺纹 （x2） 的适配器	Thorlabs	SM1A12	安装 O1 和 O2 估计成本：47.06 美元
带外部 SM1 螺纹和内部 M26 螺纹的适配器	Thorlabs	SM1A27	安装 O3 估计成本： $22.38
Alignment Disk	Thorlabs	SM1A7	估计成本：20.45 美元
对准激光器	BISKEE		https://www.amazon.com/Tactical-Presentation-Teaching-Interactive-Adjustable/dp/B09B1VXPNM 预计成本：16.98 美元
Autoluorescent 塑料滑轨，红色	Chroma	92001	预计成本：20 美元
光束快门	索拉布斯	SM1SH1	阻挡激光 预计成本：65.8 美元
笼式旋转支架 （x3）	Thorlabs	CRM1T	安装 CL1-3 预计成本：282.15 美元
笼式系统杆 1" （x8）	Thorlabs	ER1	安装 M3 和 O1 预计成本：44.8 美元
笼式系统杆 3" （x2）	Thorlabs	ER3	安装 O3 预计成本：14.28 美元
笼式系统杆 4" （x4）	Thorlabs	ER4	安装狭缝 预计成本：30.76 美元
笼式系统杆 8" （x2）	Thorlabs	ER8	用于镜筒镜头对准 估计成本：25.3 美元
笼式系统杆 12" （x8）	Thorlabs	ER12	用于对准笼 估计成本：145.36 美元
相机	Andor	Zyla 4.2 sCMOS	估计成本：~14,000 美元
夹紧叉 （x35）	Thorlabs	CF125	夹紧柱安装 估计成本：338.8 美元
盖板玻璃，22 x 22 毫米	康宁	2850-22	玻片样品 预计成本：265 美元
二向色性	AVR	DI01-R405/488/561/635-25x36	分割激发/发射路径 估计成本：965 美元
燕尾榫平移阶段	Thorlabs	DT12	平移针孔 估计成本：90.55 美元
发射过滤器	Thorlabs	FELHO600	估计成本：140.99 美元
磨砂玻璃对准盘 （x2）	Thorlabs	DG10-1500-H1	对于对准笼和中间平面 估计成本：75.14 美元
函数发生器	惠普	HP 33120A 15 MHz	控制振镜 估计成本：900 美元
检流计 - 1D 大光束直径系统	Thorlabs	GVS011	估计成本：1715.78
美元 检流计电源	Siglent	SPD3303C	估计成本：300 美元
Gelrite	Research Products International	G35020-100.0	用于 3D 珠子样品的结冷胶 估计成本：68.25 美元
FIJI 软件	开源		下载 https://imagej.net/software/fiji/downloads 预计成本：免费
加热板/搅拌器	Corning	6795-220	用于制备样品溶液 预计成本：550 美元
K-Cube 有刷电机控制器	Thorlabs	KDC101	驱动器 Z825B 估计成本：757.51 美元
安装	Thorlabs	KM100S	安装二向色性 估计成本：92.01 美元
Kinesis Software	Thorlabs		从 https://www.thorlabs.com/newgrouppage9.cfm?objectgroup_id=10285 下载预计费用：免费
激光阻挡器	索拉布斯	LB1	用于 ND 滤镜反射 预计成本：57.65 美元
支架	定制		3D 打印 预计成本：N/A
激光安全屏 （x2）	Thorlabs	TPS4	用于阻挡杂散激光 预计成本：92.02 美元
激光扫描镜筒透镜	Thorlabs	TTL200MP	TL1 估计成本：1491 美元
镜头支架 （x10）	Thorlabs	LMR1	安装所有镜头和额外的对准镜。 预计成本：164.7 美元
磁性尺	Thorlabs	BHM4	检查对准 预计成本：52.74 美元
Micro-Manager 软件			从 https://micro-manager.org/Download_Micro-Manager_Latest_Release 开源下载预计费用：免费
显微镜载玻片	Thermo Fisher Scientific	12550400	对于载玻片样品 估计成本：123.9 美元
显微镜载物台	ASI	FTP-2000 带定制部件	精细翻译样品 预计成本：~16,000 美元
迷你涡旋混合器	VWR	10153-688	样品制备 预计成本：152.64 美元
电动执行器	Thorlabs	Z825B	微调 M1 预计成本：729.07
美元 安装标准光圈 （x2）	Thorlabs	ID20	至少 2 个用于对齐 预计成本：118.02
美元 ND 滤镜套装	索拉布斯	NDK01	降低激发强度 估计成本：726.73 美元
物镜 1	尼康	Plan Apo 60X/ 1.20 WI	O1 预计成本：~15,000 美元
物镜 2	尼康	TU Plan Fluor 100X/0.90	O2 估计成本：~6,000 美元
物镜 3	Mitutoyo	Plan Apo HR 50X/0.75	O3 估计成本：~6,800 美元
OPM 歪斜校正软件	开源		用于图像处理。从 https://github.com/QI2lab/OPM 下载预计成本：免费
光电二极管功率传感器	Thorlabs	S121C	用于测量激光强度 预计成本：379.68 美元
正网格畸变目标	Thorlabs	R1L3S3P	明场对准 估计成本：267.87 美元
功率计 数字控制台	Thorlabs	PM100D	用于测量激光强度 预计成本：1245.48 美元
罗丹明 6G	Thermo Scientific	J62315.14	用于荧光涂层载玻片样品 估计成本：27.7 美元
直角夹具		RA90	用于 M3 支撑和下翻镜 预计成本：32.46 美元
RMS 螺纹笼板 （x2）	索拉布斯	CP42	用于对准激光器 估计成本：70.56 美元
剪切板 2.5-5.0 毫米	Thorlabs	SI050P	预计成本：182.85 美元
剪切板 5.0-10.0 毫米	Thorlabs	SI100P	估计成本：201.47 美元
剪切板 10.0-25.4 毫米	Thorlabs	SI254P	估计成本：236.42 美元
剪切板观察屏幕	Thorlabs	SIVS	估计成本：337.74 美元
带 1-3 毫米板的剪切干涉仪	Thorlabs	SI035	用于检查准直 估计成本：465.85 美元
滑入式耳罩领 （x35）	Thorlabs	R2	保持柱高 预计成本：208.25
美元 Slit	Thorlabs	VA100	预计成本：294.64
美元 开槽镜筒，3"	Thorlabs	SM1L30C	用于对准激光器 估计成本：77.45 美元
方镜，1 x 1 英寸			https://www.amazon.com/Small-Square-Mirror-Pieces-Mosaic/dp/B07FBNMDC1/ref=asc_df_B07FBNMDC1/?tag=hyprod-20&linkCode=df0&hva did=642191768069&hvpos=&HVne TW=G&hvrand=1336734911900437 4691&HVPone=&HVPtwo=&hvqmt= &hvdev=c&hvdvcmdl=&hvlocint=& hvlocphy=9031212&hvtargid=pla-1 943952718742&gclid=Cj0KCQiA6L yfBhC3ARIsAG4gkF_AYBpn5EdGL q3mc-RU-nanT5vM4ac9r3-obbzqJoWKPkIPIJU6e1caAjWmEA Lw_wcB&th=1 预计成本：14.76 美元
可堆叠镜筒 1/2 英寸 （x3）	Thorlabs	SM1L05	安装 CL1-3 估计成本：40.86 美元
可堆叠镜筒 1 英寸	Thorlabs	SM1L10	安装 O3 估计成本：15.41 美元
可堆叠镜筒 2 英寸 （x2）	Thorlabs	SM1L20	对于相机路径 估计成本： $35.7
镶钉底座适配器 （x37）	Thorlabs	BE1	将立柱支架安装到工作台上 估计成本：400.71 美元
平移镜头支架 （x3）	Thorlabs	LM1XY	精细平移针孔、O2 和 O3 估计成本：441 美元
带标准千分尺的平移台 （x2）	Thorlabs	PT1/M	TS1-2 估计成本：647.54 美元
旅行手册平移台	Thorlabs	CT1A	O3 笼式平移支架 预计成本：497.3 美元
镜筒透镜	尼康	MXA20696	TL3 预计成本：359 美元
白色安装 LED	Thorlabs	MNWHL4	明场光源 预计成本：171.28 美元
			总估计成本：84,858.98 美元
			作者指出，许多零件都是买来的二手的。在这里，我们试图反映所有商品的零售价格，因此通过购买特定使用过的商品，尤其是更昂贵的商品，可以大大降低总成本。
可选组件
Grasshopper3 USB3	FLIR&	nbsp;GS3-U3-23S6C-C	用于对准过程中的诊断检查。可以使用 Acquisiton 相机，但之后需要重新校准。 估计成本：1089 美元