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可定制单物镜光片荧光显微镜的设计与构建用于细胞骨架网络的可视化

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DOI：

10.3791/65411

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2024年1月26日

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1W.M. Keck Science Department, Scripps College, 2W.M. Keck Science Department, Claremont McKenna College, 3Department of Physics and Biophysics, University of San Diego, 4W.M. Keck Science Department, Pitzer College

本文内容

摘要

本方案详细描述了如何构建单物镜光片荧光显微镜，并用于观察细胞骨架网络。

摘要

重建的细胞骨架复合物已成为研究非平衡态软物质的有价值模型系统。要准确捕捉这些三维致密网络的动力学行为，需要进行光学切片，这通常与荧光共聚焦显微镜相关联。然而，近年来光片荧光显微镜（LSFM）的发展使其成为一种成本较低且有时性能更优的替代方案。为了使对光学技术不太熟悉的细胞骨架研究人员也能使用LSFM，我们提供了一步一步的初学者指南，介绍如何利用现成组件构建一台多功能的光片荧光显微镜。为了能够使用传统的载玻片样品进行样品装载，该LSFM采用单物镜光片（SOLS）设计，即使用同一个物镜完成激发光照射和发射光收集。我们对SOLS各个组件的功能进行了足够详细的描述，以便读者能够修改仪器并根据自身特定需求进行设计。最后，我们通过可视化驱动蛋白驱动的微管网络中的星状结构，展示了该定制SOLS仪器的应用。

引言

光片荧光显微镜（LSFM）是一类高分辨率荧光成像技术，其激发光被塑造成一个薄片状光平面1,2，包括选择性平面照明显微镜（SPIM）、扫描共焦对准平面激发显微镜（SCAPE）以及斜面显微镜（OPM）3,4,5,6,7。与其他显微技术（如落射荧光显微镜、全内反射荧光显微镜（TIRFM）或共聚焦显微镜）不同，LSFM的光毒性极低，仅对正在成像的样本平面进行照明，因此可实现长时间尺度的样本观测8,9,10。因此，LSFM技术特别适用于对三维样本进行长时间动态成像，甚至可对共聚焦显微镜难以穿透的较厚样本进行成像。基于上述优势，自2004年首次提出以来，LSFM已成为许多生理学家、发育生物学家和神经科学家的首选成像技术，广泛用于对完整生物体（如活体斑马鱼和Drosophila胚胎）的可视化研究3,4,6,11。在过去的二十年中，LSFM的优势被不断拓展，用于在越来越小的尺度上解析结构与动态过程，涵盖组织11,12、细胞乃至亚细胞水平，并广泛应用于活体（in vivo）和体外（in vitro）研究13,14,15,17。

尽管文献中已有成功应用的报道，但商用LSFM系统的高昂成本（撰写本文时约为25万美元）18,19限制了该技术的广泛应用。为了使DIY构建成为研究人员可行的替代方案，已有多个构建指南被发表8,13,20,21，其中包括开放获取项目OpenSPIM22。然而，迄今为止，光学经验有限的研究人员只能使用早期的LSFM设计，而这些设计与传统的载玻片装载样品不兼容（图1A）。近期的单物镜光片成像（SOLS）实现方式使用同一个物镜完成激发和检测（图1C），从而克服了兼容性方面的限制5,6,8,13,20。然而，SOLS设计在获得多功能性的同时，也因需要额外两个物镜将物平面中继、去倾斜并重新成像到相机上进行成像（图1D），导致构建复杂性显著增加。为了便于研究人员使用复杂的SOLS类系统，本文提供了一套逐步指南，涵盖一种兼容载玻片的SOLS系统的整体设计、构建、光路准直过程及使用方法，即使仅具备基础光学课程知识的研究人员亦可受益。

尽管该实验方案本身简洁明了，但在准备步骤中，读者必须参考其他资源，以深入了解设计或硬件相关的具体细节。然而，如果读者打算遵循本设计的具体参数，则可能无需理解如何选择特定的光学元件。

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图 1：不同 LSFM 配置的特点。（A）早期 LSFM 设计中常见的双正交物镜装置。在此配置中，样品被置于毛细管或凝胶圆柱体内，无法与传统的载玻片封片技术兼容。（B）SOLS 光片设计的示意图，显示以下部分：（C）在样品平面（O1）处同时用于激发和发射光收集的单个物镜；该设计允许将传统载玻片置于上方，以及（D）SOLS 发射光路中的中继物镜系统。O2 收集发射光并缩小图像，O3 将成像平面以正确的倾斜角度投射到相机传感器上。缩写：LSFM = 光片荧光显微镜；SOLS = 单物镜光片系统；O1–O3 = 物镜。请点击此处查看该图的高清版本。

方案

1. 准备对齐

  1. 在开始搭建之前，进行必要的文献调研，以明确预期的应用场景（例如，需要成像的荧光染料、所需的成像体积、分辨率要求等）。特别请参考下文的代表性结果部分，判断是否应采用本文所述的精确设计。如果适用，请跳至步骤1.2；如果不适用，请参考Sheunglab SOLS构建指南23中关于硬件选型的建议和指导。
    注意：用户可在讨论部分找到有关该系统具体技术参数的更多信息。
  2. 根据材料表中列出的详细清单，收集所有必要的光学、光机和电子元件。对于对系统进行修改的用户，请收集所有等效部件。
  3. 按照图2A所示构建准直激光装置。使用剪切板检查光束是否已准直。
  4. 按照图2B所示构建双面磨砂玻璃盘准直笼结构。
  5. 制备涂有荧光染料的测试样品。
    1. 通过逐渐将1 mL蒸馏水加入0.2 g冻干粉末中，直至完全溶解，制备饱和的罗丹明染料溶液。涡旋混合以均质化。
      注意：该溶液对光敏感。尽管在制备过程中无需特殊防护，但溶液制备完成后应储存在避光区域。
      警告：操作罗丹明粉末时务必佩戴手套和口罩。
    2. 用移液器吸取10 µL溶液，滴加到测试载玻片中央。
    3. 将一块22 mm × 22 mm的盖玻片覆盖在液滴上，确保荧光层尽可能薄。
    4. 用透明指甲油封片。
      注意：该样品对光敏感。为延长样品使用寿命，不使用时应将其储存在避光区域。
  6. 制备3D微珠样品（嵌入凝胶中的1 µm微珠）。
    1. 使用双面胶带在载玻片上构建一个高为三层胶带、宽为4–5 mm的垂直通道。
    2. 将一块22 mm × 22 mm的盖玻片置于载玻片中央的胶带上。用力按压胶带区域，确保胶带与盖玻片之间形成良好密封。
    3. 使用剃须刀片去除多余的胶带。
    4. 通过逐渐将去离子水加入1 g结冷胶粉末中，制备125 mL饱和结冷胶溶液。该溶液在室温下呈固态，在65 °C时呈液态。
    5. 取1 mL结冷胶溶液加入微量离心管中。将水浴容器置于加热板上加热至65 °C，并将微量离心管加热至结冷胶明显呈现黏稠状态。
    6. 在温热的结冷胶溶液中制备10 µL、稀释比例为1:1,000的微珠溶液。
    7. 小心地将溶液用移液器注入腔室直至充满。用牙签在通道两端各涂抹少量环氧树脂，完全覆盖开口以实现密封。为确保密封效果良好，需目视检查两端，确认环氧树脂已轻微渗入通道两端。

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图 2：准直工具的照片。 （A）准直激光器。AL1：准直透镜 1，−50 mm；AL2：准直透镜 2，100 mm （B）双面磨砂玻璃盘准直笼式组件。缩写：RMS CP = RMS 螺纹笼式安装板；SM1 CP = SM1 螺纹笼式安装板。 请点击此处查看该图的放大版本。

2. 调整激发光路

  1. 在光学平台上勾画出显微镜的布局。尽可能准确地测量所有距离。
    注意：请参考 图3 了解系统中各组件的位置。
  2. 将激发激光器安装到平台上。将两个光阑设置为与激光光路相同高度，并将其安装在镜片1（M1）后方预定孔位线上相距约2-3英尺的位置。使用这些光阑确保激光束与平台表面平行，并且在光学平台的孔位线上居中。
    注意：为保护眼睛，请佩戴激光防护眼镜，并使用激光安全挡板遮挡任何杂散激光束以确保安全。在所有组件被永久固定之前，数小时量级的漂移是可能的。每天工作结束时，在光路对准的最远端设置一个光阑，以便次日返回时快速目视检查是否存在漂移。振动、光学平台浮置不当以及气流是造成光学漂移最常见的原因。
  3. 将激光快门尽可能靠近激发激光器安装。在对准时使用该快门快速阻断激光，而不是反复开关激光器。
  4. 将中性密度（ND）滤光片组装到ND滤光轮中（ND 0.5、1.0、2.0、3.0、4.0以及一个空白位），并安装在激光快门之后。
  5. 将电动执行器安装在一个平移台（TS1）上，然后将该平移台置于M1位置下方。确保平移台沿激光光路所经过的同一排孔位轴向移动。初始安装时，将平移台置于其行程范围的中间位置。
    1. 在接下来的步骤2.6–2.10中，依次将反射光学元件插入光路，以引导激光沿平台上所绘制的路径传播。使用一对设定为精确高度的光阑定义期望的出射光路，并指导每个反射元件的放置与对准。对于每个元件，调节其支架的高度和位置，确保入射光束击中元件中心。然后旋转支架底座，使光束沿平台上绘制的光路传播，穿过两个光阑，并使用每个支架背面的调节旋钮微调出射光束的倾斜角度。
      注意：每个元件对准到正确高度后，应在支杆上加装一个紧固套环以固定高度。
  6. 将M1安装并校准在TS1上方。
  7. 将二向色镜安装并校准在平台上。
  8. 按照制造商说明，将振镜（galvo）连接至电源和函数发生器。
  9. 安装振镜，使激光精确入射到镜面中心。开启振镜电源，然后按下并按住波形发生器上的AM按钮，将镜面倾斜设置为0 V直流电流（即行程中心）。随后，将振镜对准两个光阑。
  10. 安装并校准镜片2（M2）。
  11. 将大尺寸柱面镜插入柱面镜支架中。使用1英寸笼杆，在镜片3（M3）上方连接一个30–60 mm的笼式适配器。使用镜架上的旋钮初步调平M3镜面的倾斜角度。
  12. 将双面毛玻璃对准笼安装到M3上方的笼式适配器中；每次使用对准笼进行对准时，务必拧紧笼式适配器上的固定螺丝以固定对准笼。将M3安装到平台上，调节其高度和位置，使光束大致居中于两个毛玻璃对准盘上。将M3夹紧在平台上，并在M3两侧使用支杆座、3英寸支杆、90°夹具和2英寸支杆，通过镜架两侧的螺纹孔提供额外支撑。使用镜架背面的旋钮微调光束。
    注意：激发光路中的所有反射元件现已设定完毕，不应再触碰。
  13. 将透镜1（L1）安装到平台上。对于所有透镜的初始安装，使用螺纹式透镜对准靶，使入射光束在透镜前端居中。调节透镜1（L1）的倾斜角度和横向位置，使光束在M3上方对准笼的两个毛玻璃板上均居中。
  14. 将透镜2（L2）安装至其对应位置，与L1构成4f系统。沿轴向移动L2以获得准直光束，并使用激发激光器和剪切板检查准直状态。调节L2的倾斜角度和横向位置，使光束在M3上方两个毛玻璃盘上均居中。
  15. 将针孔安装到xy平移支架中。将该支架安装在一个一维平移台上，以实现精细的轴向调节。将针孔及其平移台安装在支杆和支杆座上，并放置在L1与L2之间的共焦焦点处。手动调节针孔，直到可通过针孔看到激光光斑。
  16. 在针孔后立即安装功率计传感器，并使用功率计数字控制台上的波长按钮选择激发激光器的波长。调节针孔的xy位置以最大化透射率，并获得接近TEM00模式的光束轮廓。然后使用一维平移台调节针孔的轴向位置，进一步最大化透射率。
  17. 将透镜4（L4）安装到其对应位置，并调节支架至正确高度。沿轴向调节L4，使激发光束聚焦在振镜表面。调节L4的倾斜角度和横向位置，使光束在M3上方两个毛玻璃盘上均居中。
  18. 将透镜3（L3）安装到其对应位置，并调节支架至正确高度。使用激发激光器和剪切板检查L3与L4的准直状态。调节L3的倾斜角度和横向位置，使光束在M3上方两个毛玻璃盘上均居中。
  19. 暂时移除L3。将扫描透镜1（SL1）安装到平台上，并使用剪切板测量，调节其轴向距离，使其与L4构成准直望远镜系统。调节SL1的倾斜角度和横向位置，使光束在M3上方两个毛玻璃盘上均居中。
  20. 重新插入L3。安装管镜1（TL1），并使用激发光束和剪切板对SL1与TL1进行准直。调节TL1的倾斜角度和横向位置，使光束在M3上方两个毛玻璃盘上均居中。
  21. 使用适配环，将物镜1（O1）旋入M3上方的笼式板中。暂时移除SL1，让光束射向天花板。调节O1在笼式系统中的高度（轴向距离），直到天花板上形成艾里斑，然后继续调节直至艾里斑尺寸最小化。
  22. 在O1就位后，将样品台安装至适当位置。

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图3SOLS 系统内各组件的位置 (A) SOLS 系统的示意图，所有组件均已标注。B) 光学平台上物理SOLS系统的俯视图，不包括样品台区域。C) 样品台区域的俯视图（扩展部分 图3B）。激发光路以绿色表示，发射光路以红色表示。各透镜的焦距：L1：100 mm；L2：45 mm；CL1：50 mm；CL2：200 mm；CL3：100 mm；L3：150 mm；L4：100 mm；SL1：75 mm；TL1：200 mm；SL2：150 mm；TL2：125 mm；TL3：200 mm。参见 材料清单 有关更详细的部件规格，请参见相关文档。缩写：SOLS = 单物镜光片；ND Wheel = 可变中性密度滤光轮；L1-L4 = 平凹消色差透镜；CL1-CL3 = 柱面透镜；M1-M3 = 反射镜；TS1-TS2 = 平移台；DM = 二向色镜；Galvo = 扫描检流计；SL1-SL2 = 扫描透镜；TL1-TL2 = 管镜；O1-O3 = 物镜；EF = 发射滤光片。 请点击此处以查看此图的放大版本。

3. 调整发射光路

  1. 设置准直激光器。
    1. 在激发激光器旁边、与激光器等高的位置安装两个空的笼式平台。通过将准直激光器的笼杆滑入这两个笼式平台的空孔中，来固定准直激光器。确保激光器可通过按住电源按钮（例如用胶带固定）或连接开关的方式保持开启状态。
    2. 移除O1，并重新插入磨砂玻璃准直笼。使用一个运动学镜架和一个下垂镜来将准直光束与激发光束路径对齐。
    3. 使用功率计，在小孔后通过微调两个反射镜使准直光束信号最大化。确保光束在磨砂玻璃准直笼上始终保持居中。
  2. 移除准直笼，重新插入O1。将方形反射镜放置在O1的样品台上，并沿轴向调节反射镜位置，直到二向色镜后的光束轮廓尺寸最小化。
  3. 在发射光路中安装一个光阑，并向后放置足够距离，以便能够无阻碍地插入扫描透镜2（SL2）、管镜2（TL2）和物镜2（O2）。将该光阑与准直激光器对齐。在光阑后至少1英寸处安装一个磨砂玻璃盘，并确保其也与激光光束对齐。
  4. 根据使用直尺从振镜测量的距离，将SL2插入正确位置。调节SL2的倾斜角度和横向位置，使入射准直光束在SL2上居中，且出射光束穿过光阑和磨砂玻璃盘。
  5. 根据使用直尺从SL2测量的距离，将TL2插入正确位置。调节TL2的倾斜角度和横向位置，使入射准直光束在TL2上居中，且出射光束穿过光阑和磨砂玻璃盘。
  6. 将TS2安装到光学平台上。确保该平台沿O2的光轴方向移动。
  7. 将O2旋入xy平移镜架中。在xy镜架下方连接一个支撑杆，以便将O2安装到平移台上。使用旋入式靶标将O2后端中心对准红色激光。
  8. 调节O2的xy调节旋钮及其倾斜角度，使红色准直光束穿过光阑和磨砂玻璃盘。
  9. 将准直激光器移至O1上方，并向下指向发射光路。打开激光器，确保该光束在发射光路中的所有透镜上均保持居中。
  10. 共轭O1和O2的瞳平面：打开光阑并移除磨砂玻璃盘，使从O2出射的准直光束无遮挡地传播至远处表面或墙壁（>0.5 m）（图4）。调节TS2，直到光束在表面上形成一个小的艾里斑，然后继续调节TS2以最小化艾里斑的尺寸。
    注意：强烈发散的光束表明O2位置不正确。但由于该光束经过两个物镜，少量发散是固有的。因此，艾里斑是最佳判断依据。
  11. 优化振镜以实现倾斜不变扫描：按下波形发生器上的FSK按钮，为振镜选择三角波信号，并设置为低频（~1 Hz）。在相同的远距离表面或墙壁上观察准直光束。
    注意：如果振镜位置不正确，光束会随着振镜运动而在表面上水平扫动。可通过手动微调振镜底座的倾斜角度和xy位置，直到肉眼无法察觉光束位移为止。
  12. 通过在0°成像来检查系统质量。
    1. 将O3旋入xy平移镜架中。将一个1英寸透镜筒旋入笼式平移台，并将xy平移台旋入该筒中。使用两根笼杆将笼式平移台前端连接至一个笼式平台，并将该平台安装在支撑杆上。将物镜3（O3）安装在接近O2前端（~4-5 mm）且角度为0°的位置，并调节高度以匹配。
    2. 根据直尺测量结果，在SL2与TL2之间的共焦平面上安装一个磨砂玻璃准直盘。将丙烯酸荧光测试载玻片安装到样品台上，并用激发激光照射载玻片。从O3后端观察，调节O3的高度和轴向位置以找到发射光，然后沿轴向调节O3，直到发射光充满后孔径（图5）。
    3. 将两根8英寸笼杆旋入O3平移台后端。将带有安装磨砂玻璃盘的笼式平台滑入笼杆上，然后使用xy镜架微调O3，确保发射光从O3出射时居中。随后移除笼杆。
    4. 在相机传感器的大致位置安装一个磨砂玻璃盘，并调节其高度和位置以对准发射光。
    5. 将管镜3（TL3）旋入一个笼式平台，并紧接在O3后方安装。使TL3与入射发射光居中，然后调节TL3的倾斜角度，使出射光对准磨砂玻璃盘。
    6. 根据使用直尺测量的距离，将相机安装在距管镜的正确位置。
    7. 将两个2英寸透镜筒和发射滤光片旋接到相机上。
    8. 重新安装SL2与TL2之间的共焦平面上的磨砂玻璃准直盘。安装荧光染料测试样品，并用激发光束照射样品。
    9. 打开相机，然后在连接的计算机上启动Micromanager程序。点击实时进入实时预览模式。点击自动一次设置初始曝光参数，然后根据成像需要重置曝光时间。
      注意：除非在相机开启之后启动，否则Micromanager无法正常运行。
    10. 调节O3镜架上的xy平移旋钮，直到玻璃准直盘上的小孔位于视场（FoV）中心。使用笼式平移台沿轴向调节O3，直到小孔清晰对焦；边缘应显得锐利（图6）。
    11. 成像荧光微珠以检查系统质量。
      1. 移除磨砂玻璃准直盘，安装三维微珠样品，并用激发光束照射样品。
      2. 调节样品相对于O1的高度，直到荧光微珠在视场中心形成一个圆形区域。
      3. 使用xy平台和轴向平移台微调O3的位置，直到点扩散函数（PSFs）呈圆形（表明像差最小）且明亮（表明信噪比良好）（图7）。如果仅靠调节O3无法实现此效果，则O1与O2之间的光学系统很可能未最佳对齐；请执行下方步骤3.13中的诊断检查。
      4. 如果可以获得圆形PSFs，则跳过诊断步骤，进入成像系统的倾斜调节。
  13. 如有需要，执行诊断检查。
    注意：一旦获得良好的PSFs，其余诊断步骤可跳过。
    1. 在O1上方安装明场（BF）光源。将正向网格测试靶标安装在样品台上，轴向高度与对准反射镜相同。使10 µm网格居中，并用BF光源照射网格。
    2. 在相机上成像该网格，并平移样品直至网格清晰对焦。利用网格图像确认整个视场（FoV）的平面性：若不平坦，网格将出现扭曲和弯曲。为纠正不良网格图像，调节O3的xyz位置和倾斜角度，然后相应地调节TL3和相机。
      注意：若能获得平坦网格，则重复步骤3.12.10，然后进入成像系统的倾斜调节。
    3. 在正确距离处设置对准相机或成像相机，使SL2将图像聚焦到传感器上。在中间像平面成像网格靶标（图8）。如果该网格也发生倾斜，则O1与SL2之间的光学系统很可能未最佳对齐，需重新检查。在继续之前，必要时优化对齐。
      注意：如果相机无法安装在SL2与TL2之间，可在SL2后使用额外反射镜将图像偏转90°至相机。
    4. 检查中间像平面的PSFs：在检查网格后，另一个良好的诊断方法是在同一中间像平面检查PSFs。该平面上的良好图像（类似于图7但放大倍数不同）（图9），表明通过SL2的对齐良好。
      注意：若在中间像平面能获得平坦网格和圆形PSFs，则重复步骤3.13.2，然后步骤3.12.10，再进入成像系统的倾斜调节。
  14. 将O3成像子系统倾斜至30°。
    1. 移除O3、TL3和相机。
    2. 根据平台上的刻线作为参考，将O3以30°角重新插入O2的光轴方向。
    3. 在SL2与TL2之间的共焦平面上安装一个磨砂玻璃准直盘。将丙烯酸荧光测试载玻片安装到样品台上，并用激发激光照射载玻片。再次从O3后端观察，调节O3的高度和轴向位置以在30°下找到发射光，然后沿轴向调节O3，直到发射光充满后孔径。
    4. 从SL2与TL2之间移除磨砂玻璃准直盘，以获得更强的发射信号。
    5. 将两根8英寸笼杆旋入O3平移台后端。将带有安装磨砂玻璃盘的笼式平台滑入笼杆上，然后使用xy镜架微调O3，确保发射光从O3出射时居中。随后移除笼杆。
    6. 在相机传感器的大致位置安装一个磨砂玻璃盘，并调节其高度和位置以对准发射光。
    7. 将TL3紧接在O3后方安装。使TL3与入射发射光居中，然后调节TL3的倾斜角度，使出射光对准磨砂玻璃盘。
    8. 为更精确设定TL3与相机之间的距离，小心旋下O3，并安装准直激光器，使其经TL3聚焦到相机上。必要时使用中性密度（ND）滤光片，使激光强度<1 mW。启动相机实时预览，并沿轴向调节TL3，使相机上的激光光斑最小化。
    9. 重新安装SL2与TL2之间的共焦平面上的磨砂玻璃准直盘。安装荧光染料测试样品，并用激发光束照射样品。调节O3镜架上的xy平移旋钮，直到玻璃准直盘上的小孔位于相机视场内。调节笼式平移台以沿轴向移动O3，直到小孔清晰对焦；确保小孔外观与0°时相似。
    10. 在相同轴向高度重新安装正向网格测试靶标，并用BF光源照射网格。确认由于30°倾斜，仅有一个垂直截面处于对焦状态。再次利用网格图像确认即使在离焦状态下，整个视场（FoV）仍保持平面性。当载玻片沿轴向平移时，确认视场中对焦部分（网格靶标）在屏幕上水平移动，同时网格方格保持大小一致（图10）。
      注意：由于样品处成像平面的倾斜，网格在x平面上可能略微拉伸。

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图4：激光入射-激光出射技术。 将一束准直的测试光束从O1前端射入，并观察从O2出射的光束在远处表面上的光斑。如果所有组件均以正确距离对准，则光束将在远处表面形成一个微小的艾里斑。所有缩写均与图3中相同。请点击此处查看该图的放大版本。

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图 5：利用发射光进行准直。（A）安装在O2后焦平面（BFP）后方螺纹目标上的丙烯酸荧光片所发出的发射光。（B）通过O3后端目视寻找发射光。缩写：O2-O3 = 物镜；BFP = 后焦平面。请点击此处查看该图的放大版本。

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图6：正确聚焦的磨砂玻璃准直盘在相机成像中的图像。 该圆盘放置在扫描透镜（SL2）与管镜（TL2）之间的中间像平面处。比例尺 = 50 µm。缩略语：SL2 = 扫描透镜；TL2 = 管镜。 请点击此处查看该图的放大版本。

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图7：三维微珠样品的相机图像。 该图像显示了直径为1 nm的微珠，在插入柱面透镜前，成像模块设置为0°，并由圆形光束照射。比例尺 = 50 µm。 请点击此处查看该图的放大版本。

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图8：正交网格测试靶标在SL2与TL2之间的中间像面处正确聚焦。 整个视场内网格平坦，表明SL2及之前各光学组件对准良好。比例尺 = 30 µm。缩写：SL2 = 扫描透镜；TL2 = 管状透镜。 请点击此处查看该图的放大版本。

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图9：3D微珠样品的相机图像。 图像显示1 nm微珠在SL2与TL2之间的中间平面上正确聚焦。比例尺 = 30 µm。缩写：SL2 = 扫描透镜；TL2 = 管状透镜。 请点击此处查看该图的放大版本。

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图10：阳性网格测试靶标，叠加大小一致的黄色方块以与网格中的方格对齐。（A）左侧网格处于焦平面内。（B）右侧网格处于焦平面内。黄色方块在视场（FoV）两侧均与网格单元大小匹配。比例尺 = 30 µm。缩写：FoV = 视场。请点击此处查看该图的放大版本。

4. 调整斜向光片

  1. 移除 O1，将双面磨砂玻璃准直套管重新插入原位。确认光束在两片磨砂玻璃圆盘上均呈准直且居中。
  2. 将柱面透镜1（CL1）旋入旋转透镜架中。将CL1安装至光路中，并旋转透镜架，使光束在垂直于光学平台的方向上展宽。调节CL1的倾斜角度和横向位置，使光束在前表面中心对准，并在两片磨砂玻璃盘上均保持居中位置。
  3. 将柱面透镜2（CL2）旋入旋转透镜架，并将CL2安装至光路中，与CL1保持适当距离以构成4f系统。旋转CL2至与CL1相同的方向，使光束在垂直于光学平台的方向上展宽并准直。使用测试卡片在多个位置测量柱面光束轮廓的高度，以确认光束已准直。参照步骤4.2的方法，调节CL2的倾斜角度和横向位置。
  4. 将柱面透镜3（CL3）旋入旋转透镜架，并将CL3安装至光路中适当位置，使其与L3构成4f系统。旋转CL3至与CL1和CL2相同的方向，使光束在焦平面处聚焦成水平片状光束轮廓。按照步骤4.2的方法调节CL3的倾斜角度和横向位置。
  5. 插入狭缝：使用四根4英寸笼杆和CL3笼式安装座，将狭缝垂直安装在CL3与L3之间的焦平面位置，该位置需用直尺测量确定。利用拉伸后的激发光光束轮廓调节狭缝的高度和横向位置，直至狭缝居中于光束中心。
  6. 重新插入O1，安装荧光染料测试样品，并用激发光片照射样品。在相机传感器上确认 0° 光片呈现为一条细长的垂直薄片（图11A).
  7. 移除荧光染料测试样品，擦净O1。让光片在O1上方无遮挡地扩展。使用电动平移台控制装置，移动M1 朝向 将柱面透镜用于调节光片的角度至大致 60° 相对于 O1 的光轴。
    注意：光片必须向正确方向倾斜，以与同样倾斜的成像平面对齐图12）；如果系统的布局与此特定设计不同，可通过几何光线追踪确定正确的倾斜方向。
    注意：作为参考，在此设置中，将 M1 向狭缝方向移动 2.647 mm 可使光片达到正确的倾斜角度。
  8. 将荧光染料测试样品重新插入，以对倾斜的光片进行成像。确保光片在相机上保持垂直的光束形状，但更宽且更暗淡（图11B) .
  9. 将样本沿轴向移动载物台，使荧光染料在视场中心至屏幕右侧之间的五个不同深度位置被光片照射。保存每幅图像。
  10. 在 Fiji 中打开图像。对于每幅图像，选择 线条工具，并从视场中心向光片中心绘制一条水平线。为测量位移，前往 分析 | 测量 测量线条的长度，然后绘制光片位移随样品深度的变化关系图，以计算光片在O1上方的角度。
  11. 轻微移动 M1。重复步骤 4.9 和步骤 4.10，直至光片的角度 60° 与O1的光轴成一定角度，与成像平面的角度相匹配。

figure-protocol-10
图11：由正确成形的光片照射荧光染料测试样品所拍摄的相机图像。（A）光片位于90°，沿O1光轴垂直向上；（B）倾斜至30°（即与O1光轴成60°）。比例尺 = 50 µm。缩写：O1 = 物镜。请点击此处查看该图的放大版本。

figure-protocol-11
图12：光片倾斜的正确方向，以与O1的成像平面对齐。 缩写：O1-O3 = 物镜。 请点击此处查看此图的放大版本。

5. 成像与数据采集系统的精细优化

  1. 安装3D微珠载玻片，并通过载物台沿轴向移动样品，直至微珠充满相机视野。
  2. 调节O3，使用xy载物台和笼式平移装置，尽量减少像差并优化图像的信噪比（图13）。
  3. 调节O1的校正环，尽量减少像差并优化图像的信噪比。

figure-protocol-12
图13：由正确成形的光片照明的3D微珠样品（1 µm微珠）的相机图像。 （A）光片沿O1物镜光轴垂直入射（90°），以及（B）光片相对于O1物镜光轴倾斜30°。黄色框标示出视场中平坦、均匀且可用的部分（80 µm × 80 µm），在此区域内可可靠地采集数据。比例尺 = 50 µm。缩写：O1 = 物镜；FoV = 视场。 请点击此处查看该图的高清版本。

6. 校准系统的放大倍数

  1. 将正性网格测试靶标安装在样品台上，并用明场光照 illumination。
  2. 通过载物台沿轴向移动网格载玻片，使网格载玻片聚焦，调整至网格中心清晰对焦。
  3. 捕获并保存图像，然后在 Fiji 中打开该图像。
  4. 在 Fiji 中使用直线工具和测量功能，精确测量两条网格线之间的像素距离。将该值除以已知距离（10 µm），以确定像素与微米之间的校准比例。
  5. 利用测得的像素尺寸和已知的像素实际尺寸，通过公式（1）计算系统的放大倍数（M）。
    figure-protocol-13     (1)

7. 获取三维扫描图像

  1. 放置样品。
    1. 打开相机预览、振镜、函数发生器、电源、载物台和激发激光器。
    2. 安装样品，然后在函数发生器上点击 FSK 按钮以设置三角波。为找到样品，使用函数发生器设置以下参数：400 mV 峰峰值幅度 （使用 Ampl. 按钮）、0 偏移量（使用 Offset 按钮）和 200 mHz 频率。在 Micromanager 窗口 中设置 100 ms 曝光时间。
    3. 手动调节 z 轴，直到达到样品平面。优化 z 轴设置，使体积扫描的目标区域在一个周期内完整通过屏幕。
  2. 选择扫描参数。
    1. 通过肉眼观察预览图像在整个扫描过程中的聚焦情况，确认峰峰值幅度设置是否正确。如果图像质量在接近扫描一端时比另一端更早下降，则调整函数发生器上的偏移量，将扫描中心移向成像质量更好的区域。
    2. 在 Micromanager 程序 中选择 曝光时间，然后点击 Multi-D Acq. 以打开 多维采集窗口。使用 Count 框 选择 帧数，从而设定 总采集时间。帧间间隔（帧率）由曝光时间决定，除非在 Interval 框 中指定了更长的间隔。在 函数发生器 上设置 频率，使一个三角波周期的一半完成一次完整的体积扫描（即单向线性扫描）。
      注意：如果帧率和频率过低，则体积扫描采集的帧数不足，导致后期处理中出现明显的伪影。作为参考，图13 的扫描包含约 100 帧，而 图14 包含约 800 帧。选择参数时还必须考虑样品本身的特性。确保曝光时间设置能使样品充分激发但不饱和，也可相应调节激发激光强度。若用户正在采集一系列体积扫描以表征三维空间中随时间变化的过程，需确保扫描的时间尺度大于系统的动态时间尺度。
  3. 视频采集：采集一段延时视频，至少覆盖三角波完整上升或下降的一个周期，对应一次完整的体积扫描。

8. 后处理步骤

  1. 校正体积分层图像堆栈
    1. 对体积扫描图像进行校正，将倾斜平面中的图像堆栈转换为真实 xyz 坐标系中的一系列图像。
      注意：目前已有许多关于光片显微图像后期处理的优秀指南，以及可用于校正现有体积扫描图像的开源软件；此外，也可在采集过程中实时完成校正并保存已校正的图像24。
    2. 为校正体积扫描图像，需获取以下两个参数：两帧之间的实际像素距离（d），以及帧平面与 x-y 平面之间的夹角（θ 由倾斜光片的角度决定（本系统中为 30°）。帧间距离取决于成像光学系统和采集设置。
  2. 确定 d 参数
    1. 每次系统发生显著重新对准时，均需重新校准帧间距离。使用荧光微珠的图像堆栈进行此校准，因为微珠最便于用于诊断问题。
    2. 采集一组图像堆栈，并使用对 d 参数的任意初始估计值运行校正代码。在 ImageJ 中打开校正后的图像堆栈，并逐层浏览。若 d 参数设定值与真实值相差较大，则会观察到微珠在 x 或 y 方向上出现人为拉长的现象，且当用户沿 z 方向滚动帧时，单个微珠会在 xy 平面内发生位移（而非围绕同一中心点聚焦和离焦）。需多次迭代调整 d 参数，直至上述问题不再明显。
    3. 当 d 参数接近真实值后，沿 x 和 y 方向计算图像堆栈的最大强度投影。需注意，直径接近衍射极限的微珠在 z 方向上可能呈现拉长现象，但理想情况下不应呈现圆锥形或对角线方向拉长。继续微调校正参数，直至进一步迭代无法显著改善上述标准。作为参考，图13 所示数据在 d = 2.50 像素 条件下完成校正，图14 所示数据在 d = 1.0 像素 条件下完成校正。
      ​注意：帧间距离与扫描振幅、频率和帧率呈线性关系。

结果

我们对嵌入在结冷胶中的1 µm微珠进行了体扫描。图14展示了沿x、y和z方向去倾斜体扫描的最大强度投影。

figure-results-1
图14：明胶糖中1 µm荧光微珠的体积成像。 显示的是去倾斜校正后的体积扫描最大强度投影图像。比例尺 = 30 µm。 请点击此处查看该图的放大版本。

我们已展示了使用单物镜光片显微镜通过对微管星状体样品进行三维扫描，来表征重建的细胞骨架网络。简言之，将罗丹明标记的、紫杉醇稳定的微管通过GTP从重建的二聚体中聚合而成；随后，在聚合完成后，将基于链霉亲和素的驱动蛋白马达簇与ATP一同加入样品中，终浓度分别为6 µM微管、0.5 µM驱动蛋白二聚体和10 mM ATP。有关紫杉醇稳定微管和驱动蛋白马达簇制备的详细方案与指南，可参见Mitchson实验室和Dogic实验室网站25,26。样品被轻柔地移入显微镜载玻片中，密封后静置8小时再进行成像，以确保马达活性停止，使样品达到类似星状体的稳定结构状态。

重建细胞骨架系统的研究最常采用共聚焦或落射荧光显微镜对标记的纤维进行成像。然而，这两种技术在成像高密度三维样品方面的能力均存在局限性27. 尽管在该领域已取得诸多进展 体外 通过将样品限制在准二维条件下进行基于细胞骨架的活性物质研究28,29，细胞骨架网络本质上是三维的，而当前许多研究致力于理解那些仅在三维样本中才会出现的效应29,30因此需要高分辨率的三维成像。

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图15：单物镜光片显微镜促进重建细胞骨架样本的三维可视化。（A）在Leica DMi8激光扫描共聚焦显微镜上获取的荧光微管星状体图像。图像显示了z轴扫描中不同焦平面的视图。比例尺 = 30 µm。（B）同一样本在单物镜光片显微系统上进行三维扫描后经去卷积和去倾斜校正的图像。比例尺 = 30 µm。此处的去倾斜图像区域对应于图13B中所示的有效视场（黄色框）。尽管共聚焦显微镜在盖玻片附近单个焦平面的成像方面表现优异，但由于成像平面上方存在来自下方的额外荧光信号，当对较高z平面成像时，荧光样本的密度会引发成像干扰。光片显微技术通过仅照亮成像平面，避免了这一问题，从而实现了在不同z平面内均一清晰的成像效果。缩写：SOLS = 单物镜光片显微（single-objective light-sheet）；FoV = 视场（field of view）。请点击此处查看该图的放大版本。

在图15中，我们展示了由驱动蛋白马达簇将重建的微管网络收缩成星状结构后的三维成像结果。如先前研究28,31所示，这些三维结构往往向中心区域变得更加致密，导致荧光信号在中心区域占主导地位，呈现明亮的荧光区域。在靠近盖玻片的成像平面（较低的z层面），共聚焦显微镜（图15A）能够分辨出星状结构边缘的单根微丝，但由于来自上方的离焦荧光信号，在中心区域会附加产生背景信号。然而，当z方向移动数微米后，由于成像平面上下密集部分的离焦信号在成像平面中占主导地位，图像质量迅速下降。光片的单平面照明（图15B）消除了成像平面上下方星状结构致密区域的离焦信号，从而在不同成像平面之间实现了可比的图像质量。光片成像技术生成高质量、可靠的三维扫描数据的能力，为可视化和表征重建细胞骨架系统中的三维现象提供了可能。

讨论

关于本方案，有两个重要细节：系统的总体成本以及预计的搭建与调试时间。尽管确切成本会有所变动，但我们可较为准确地估计，该系统 整体上 该SOLS或类似DIY系统的成本约为85,000美元。需指出的是，此估算基于所有组件的零售价格，若采购二手组件，总体成本可大幅降低。在组装时间方面，若所有组件均已备齐并可立即使用，即使缺乏光学经验的操作者，也通常可在1至2个月内完成整个SOLS系统的搭建与光路校准。尽管本实验方案篇幅较长且操作复杂，但我们认为，结合详尽的文字描述与配套视频协议，该方案应能被快速、顺利地实施。

本方案中有两个关键步骤。首先，由于振镜参与了三个独立的4f透镜组，其位置决定了多个透镜的布局。必须确保振镜与物镜O1和O2的后焦平面共轭，并且正确居中，以实现倾斜不变的扫描。其次，成像质量对O2与O3之间的相对对准极为敏感。在此过程中，必须注意以下三点：第一，O3相对于O2的对准角度必须与激发光片的倾斜角度相匹配，从而在整个同样倾斜的视场（FoV）内提供尽可能平坦的照明；第二，O3必须放置在合适的轴向距离上，以维持一个尽可能大面积的平坦视场；第三，O3必须与O2保持适当的横向距离，以最大化通过O2-O3界面的信号。

在可用视场（FoV）方面，该系统在80 µm × 80 µm区域内实现了平坦且可靠的视场，照明均匀一致。该区域小于相机提供的最大视场，因此可用视场由图13中的黄色框标示。在分辨能力方面，该系统在x轴方向达到的最小可分辨距离为432 nm，在y轴方向为421 nm，该数值是通过对良好视场内点扩散函数（PSFs）的高斯拟合得到的平均sigma x和y值乘以2计算得出的。需要指出的是，该系统的总数值孔径（NA）并未进行优化，这意味着如果用户需要高于本系统当前水平的分辨能力，则仍有显著的提升空间。针对此类单物镜光片显微镜（SOLS）的构建，存在多种兼容的物镜选项，其中许多物镜可提高系统分辨率，但代价是成本更高、视场更小，或在中继界面处需要更复杂的对准技术8,11,13,20。此外，若用户希望获得更大的视场，可通过引入第二个振镜实现二维扫描以达成此目标，但这需要在设计中集成额外的光学元件和控制机械结构32。我们已在网站页面上提供了有关系统改进的更多详细信息，并附有与设计过程相关的其他有用资源链接23。

除了改进该特定设计的各个组件外，将其他高分辨率显微技术或功能模式整合到此系统中也是完全可行的。其中一项改进是引入多波长激发照明，这需要将额外的激发激光器与原始激发光路进行准直8。此外，由于此类单物镜光片显微镜（SOLS）设计可保持样品的可及性，因此向显微镜中添加其他功能——包括但不限于光镊、微流控和流变测量——相对简便2,33。

与已发表的众多光片显微镜指南相比，本方案提供的说明更为详尽，即使缺乏光学经验的用户也能轻松理解。通过向更广泛的用户群体提供一种用户友好且支持传统样品载玻片安装的单物镜光片显微镜（SOLS）构建方法，我们希望进一步拓展SOLS技术在各类研究领域中的应用前景，无论这些领域当前是否已使用或尚未引入该仪器。尽管SOLS仪器的应用正迅速增加2,34,35，但我们认为，SOLS类仪器的诸多优势和潜在用途仍有待探索，并对这类仪器未来的发展前景充满期待。

披露

作者无任何利益冲突需要披露。所有研究均在不存在可能被解释为利益冲突的商业或财务关系的情况下进行。

致谢

本工作由美国国家科学基金会（NSF）RUI 奖项（DMR-2203791）对 J.S. 的资助支持。我们感谢杨斌博士和Manish Kumar博士在光路准直过程中提供的指导。我们感谢Jenny Ross博士和K. Alice Lindsay提供驱动蛋白分子的制备说明。

材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
1" 平凹透镜 f = -50 mmThorlabs LC1715-A-ML用于激光准直
预估成本：49.5美元
1" 消色差双胶合透镜 f = 100 mm（x3）ThorlabsAC254-100-A-MLL2、L4 和校准激光器
预估成本：342.42美元
1" 消色差双合透镜 f = 125 mmThorlabsAC254-125-A-MLSL2
预估成本：114.14 美元
1" 消色差双合透镜 f = 150 mmThorlabsAC254-150-A-MLL3
预估成本：114.14 美元
1" 消色差双合透镜 f = 150 mmThorlabsAC254-150-A-MLTL2
预估成本：114.14美元
1" 消色差双合透镜 f = 45 mmThorlabsAC254-045-A-MLL1
预估成本：114.14 美元
1" 消色差双胶合透镜 f = 75 mmThorlabsAC254-075-A-MLSL1
预估成本：114.14美元
1" 柱面透镜 f = 100 mmThorlabsLJ1567RMCL3
预估成本：117.62美元
1" 柱面透镜 f = 200 mmThorlabsLJ1653RMCL2
预估成本：111.22 美元
1" 柱面透镜 f = 50 mmThorlabsLJ1695RMCL1
预估成本：117.62美元
1" 安装式针孔， 30 µm 针孔直径ThorlabsP30K预估成本：77.08美元
1" 银镜（x3）ThorlabsPF10-03-P01M1、M2，各一个，用于准直
预估成本：168.78 美元
2" 椭球面反射镜ThorlabsPFE20-P01M3
预估成本：179.98 美元
2" 支架杆（x11）ThorlabsPH2用于定制激光安装架、中性密度滤光轮和安全屏蔽屏
预估成本：98.45美元
2" 帖子（x47）ThorlabsTR2用于定制激光安装架和光学元件
预估成本：277.3美元
3" 支柱（x4） Thorlabs TR3用于 M3 支架及其他安装部件
预估成本：24.6美元
3" 支架座（x4）Thorlabs PH3预估成本：38.48 美元
30 至 60 毫米笼式适配器 ThorlabsLCP33用于安装 O1
预估成本：45.42美元
30 mm笼式滤光轮ThorlabsCFW6安装中性密度滤光片
预估成本：172.36美元
30 mm笼板（x6）ThorlabsCP33搭建准直笼式系统与准直激光器
预估成本：$114.54
30毫米直角运动学镜片安装座（x3）ThorlabsKCB1用于安装 M1 和 M2 以及校准激光器
预估成本：463.95美元
4" 支架座（x30）ThorlabsPH4预估成本：320.1 美元
561 nm 激光器与电源 Opto Engine LLCMGL-FN-561-100mW激发激光器
预估成本：6000美元
60毫米笼式板（x2）ThorlabsLCP01安装 TL1 和 M3 支架
预估成本：88.52美元
60 mm 直角运动学镜片支架ThorlabsKCB2安装 M3
预估成本：187.26 美元
90° 翻转安装Thorlabs TRF90用于激光准直
预估成本：95.5美元
带外置C型接口螺纹和内置SM1螺纹的转接器Thorlabs SM1A9连接镜头筒与相机
预估成本：20.96美元
带外置SM1螺纹和内置C型接口螺纹的转接器Thorlabs SM1A10将管镜连接至透镜支架
预估成本：21.82 美元
带外SM1螺纹和内M25螺纹的转接头（x2）ThorlabsSM1A12安装物镜 O1 和 O2
预估成本：47.06美元
带外SM1螺纹和内M26螺纹的转接器ThorlabsSM1A27用于安装 O3
预估成本：22.38 美元
对齐圆盘Thorlabs SM1A7预估成本：20.45 美元
对准激光器BISKEEhttps://www.amazon.com/Tactical-Presentation-Teaching-Interactive-Adjustable/dp/B09B1VXPNM
预估成本：16.98 美元
自荧光塑料载玻片，红色 Chroma92001预估成本：$20
光束快门 Thorlabs SM1SH1用于阻断激光光束
预估成本：65.8美元
笼式旋转支架（x3）ThorlabsCRM1T安装 CL1-3
预估成本：282.15 美元
笼式系统杆 1" (x8)Thorlabs ER1安装 M3 和 O1
预估成本：44.8美元
笼式系统杆 3" (x2)Thorlabs ER3用于安装 O3
预估成本：14.28 美元
笼式系统杆 4" (x4)Thorlabs ER4安装狭缝
预估成本：30.76美元
笼式系统杆 8" (x2)Thorlabs ER8用于管镜对准
预估成本：25.3美元
笼式系统杆 12" (x8)ThorlabsER12用于对准笼架
预估成本：145.36美元
相机AndorZyla 4.2 sCMOS预估成本：约 14,000 美元
夹紧叉（x35）ThorlabsCF125用于固定后置支架
预估成本：338.8美元
盖玻片，22 × 22 mm 康宁2850-22用于载玻片样品
预估成本：265美元
二向色镜 AVRDI01-R405/488/561/635-25x36用于分离激发/发射光路
预估成本：965美元
dovetail 平移台ThorlabsDT12针孔
预估成本：90.55美元
发射滤光片ThorlabsFELHO600预估成本：140.99 美元
磨砂玻璃校准盘（x2）ThorlabsDG10-1500-H1用于对准笼式系统和中间像平面
预估成本：75.14美元
函数发生器Hewlett-PackardHP 33120A 15 MHz控制振镜扫描器
预估成本：900美元
检流计 - 一维大光束直径系统ThorlabsGVS011预估成本：1715.78美元
振镜电源SiglentSPD3303C预估成本：300美元
GelriteResearch Products InternationalG35020-100.0用于3D微球样品的结冷胶
预估成本：68.25美元
FIJI 软件开源从 https://imagej.net/software/fiji/downloads 下载
预估成本：免费
加热板/搅拌器康宁6795-220用于配制样品溶液
预估成本：550美元
K-Cube 有刷电机控制器ThorlabsKDC101Drives Z825B
预估成本：757.51美元
运动学支架ThorlabsKM100S安装二向色镜
预估成本：92.01美元
Kinesis SoftwareThorlabs 从 https://www.thorlabs.com/newgrouppage9.cfm?objectgroup_id=10285 下载
预估成本：免费
激光光束阻断器 Thorlabs LB1用于中性密度滤光片的反射
预估成本：$57.65
激光器支架定制3D打印
预估成本：不适用
激光安全屏（x2）Thorlabs TPS4用于阻断杂散激光
预估成本：92.02美元
激光扫描管镜ThorlabsTTL200MPTL1
预估成本：1491美元
透镜支架（x10） ThorlabsLMR1用于安装所有透镜及额外的对准反射镜。
预估成本：164.7 美元
磁性标尺ThorlabsBHM4检查对齐
预估成本：52.74美元
Micro-Manager 软件 开源从 https://micro-manager.org/Download_Micro-Manager_Latest_Release 下载
预估成本：免费
显微镜载玻片Thermo Fisher Scientific 12550400适用于载玻片样品
预估成本：123.9美元
显微镜载物台 ASIFTP-2000 及定制部件用于精细平移样品
预估成本：约 16,000 美元
迷你涡旋混匀器 VWR10153-688用于样品制备
预估成本：152.64美元
电动执行器ThorlabsZ825B精细调节 M1
预估成本：729.07美元
安装式标准光圈（x2）ThorlabsID20至少 2 个用于对齐
预估成本：118.02 美元
中性密度滤光片组 ThorlabsNDK01 为降低激发光强度
预估成本：726.73美元
物镜 1Nikon Plan Apo 60X/1.20 WIO1
预估成本：约 15,000 美元
物镜 2NikonTU Plan Fluor 100X/0.90 O2
预估成本：约 6,000 美元
物镜 3MitutoyoPlan Apo HR 50X/0.75O3
预估成本：约 6,800 美元
OPM 去倾斜软件开源用于图像处理。从 https://github.com/QI2lab/OPM 下载
预估成本：免费
光电二极管功率传感器Thorlabs S121C用于测量激光强度
预估成本：379.68 美元
正向网格畸变标靶ThorlabsR1L3S3P明场校准
预估成本：267.87美元
数字功率计控制台Thorlabs PM100D用于测量激光强度
预估成本：1245.48 美元
罗丹明 6GThermo Scientific J62315.14用于荧光标记的载玻片样品
预估成本：27.7美元
用于支架的直角夹Thorlabs RA90用于 M3 支撑和翻转镜
预估成本：32.46美元
RMS螺纹笼板（x2） Thorlabs CP42用于激光准直
预估成本：70.56美元
剪切板 2.5-5.0 mmThorlabsSI050P 预估成本：182.85 美元
剪切板 5.0-10.0 mmThorlabsSI100P预估成本：201.47美元
剪切板 10.0-25.4 mmThorlabsSI254P预估成本：236.42美元
剪切板观察屏ThorlabsSIVS预估成本：337.74 美元
1–3 mm 板的剪切干涉仪ThorlabsSI035用于检查准直
预估成本：465.85美元
滑套式柱套（x35）Thorlabs R2为保持支架高度
预估成本：208.25美元
狭缝ThorlabsVA100预估成本：294.64美元
带槽透镜管，3"Thorlabs SM1L30C用于激光准直
预估成本：77.45美元
方形镜，1 x 1"https://www.amazon.com/Small-Square-Mirror-Pieces-Mosaic/dp/B07FBNMDC1/ref=asc_df_B07FBNMDC1/?tag=hyprod-20&链接代码=df0&hva
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q3mc-RU-nanT5vM4ac9r3-obbzqJoWKPkIPIJU6e1caAjWmEA
Lw_wcB&th=1
预估成本：14.76美元
可堆叠透镜管 1/2" (x3)ThorlabsSM1L05安装 CL1-3
预估成本：40.86美元
可堆叠透镜管 1"ThorlabsSM1L10用于安装 O3
预估成本：15.41美元
可堆叠透镜管 2" (x2)ThorlabsSM1L20用于相机光路
预估成本：35.7美元
带齿底座适配器（x37）Thorlabs BE1将支架安装到平台上
预估成本：400.71美元
平移透镜架（x3）ThorlabsLM1XY用于微调针孔，O2 和 O3
预估成本：441美元
带标准千分尺的平移台（x2）ThorlabsPT1/MTS1-2
预估成本：647.54美元
旅行手册翻译阶段ThorlabsCT1AO3 笼式平移架
预估成本：497.3美元
管镜尼康MXA20696TL3
预估成本：359美元
白色安装式LEDThorlabs MNWHL4明场光源
预估成本：171.28 美元
      总估算成本：$84,858.98
      作者指出，许多部件是购买的二手货。本文中，我们已尽量反映所有物品的零售价格，因此通过购买二手物品（尤其是较昂贵的物品）可大幅降低总成本。 
可选组件
Grasshopper3 USB3FLIR GS3-U3-23S6C-C用于对准过程中的诊断检查。也可使用采集相机，但之后需要重新对准。
预估成本：1089美元

参考文献

  1. Girkin, J. M., Carvalho, M. T. The light-sheet microscopy revolution. Journal Optics. 20 (5), 053002(2018).
  2. You, R., McGorty, R. Light sheet fluorescence microscopy illuminating soft matter. Frontiers in Physics. 9, 760834(2021).
  3. Fuchs, E., Jaffe, J. S., Long, R. A., Azam, F. Thin laser light sheet microscope for microbial oceanography. Optics Express. 10 (2), 145-154 (2002).
  4. Huisken, J., Swoger, J., Del Bene, F., Wittbrodt, J., Stelzer, E. H. K. Optical sectioning deep inside live embryos by selective plane illumination microscopy. Science. 305 (5686), 1007-1009 (2004).
  5. Dunsby, C. Optically sectioned imaging by oblique plane microscopy. Optics Express. 16 (25), 20306-20316 (2008).
  6. Bouchard, M. B., et al. Swept confocally-aligned planar excitation (SCAPE) microscopy for high-speed volumetric imaging of behaving organisms. Nature Photonics. 9 (2), 113-119 (2015).
  7. Smith, C. W., Botcherby, E. J., Wilson, T. Resolution of oblique-plane images in sectioning microscopy. Optics Express. 19 (3), 2662-2669 (2011).
  8. Yang, B., et al. Epi-illumination SPIM for volumetric imaging with high spatial-temporal resolution. Nature Methods. 16 (6), 501-504 (2019).
  9. Wu, Y., et al. Simultaneous multiview capture and fusion improves spatial resolution in wide-field and light-sheet microscopy. Optica. 3 (8), 897-910 (2016).
  10. Sahasrabudhe, A., Vittal, V., Ghose, A. Peeping in on the cytoskeleton: Light microscopy approaches to actin and microtubule organization. Current Science. 105 (11), 1562-1570 (2013).
  11. Kumar, M., Kishore, S., Nasenbeny, J., McLean, D. L., Kozorovitskiy, Y. Integrated one- and two-photon scanned oblique plane illumination (SOPi) microscopy for rapid volumetric imaging. Optics Express. 26 (10), 13027-13041 (2018).
  12. Kim, J., et al. Oblique-plane single-molecule localization microscopy for tissues and small intact animals. Nature Methods. 16 (9), 853-857 (2019).
  13. Sapoznik, E., et al. A versatile oblique plane microscope for large-scale and high-resolution imaging of subcellular dynamics. eLife. 9, e57681(2020).
  14. Bernardello, M., Marsal, M., Gualda, E. J., Loza-Alvarez, P. Light-sheet fluorescence microscopy for the in vivo study of microtubule dynamics in the zebrafish embryo. Biomedical Optics Express. 12 (10), 6237-6254 (2021).
  15. Shelden, E. A., Colburn, Z. T., Jones, J. C. R. Focusing super resolution on the cytoskeleton. F1000Res. 5, F1000 Faculty Rev-998 (2016).
  16. Wulstein, D. M., Regan, K. E., Garamella, J., McGorty, R. J., Robertson-Anderson, R. M. Topology-dependent anomalous dynamics of ring and linear DNA are sensitive to cytoskeleton crosslinking. Science Advances. 5 (12), (2019).
  17. Sheung, J. Y., Garamella, J., Kahl, S. K., Lee, B. Y., McGorty, R. J., Robertson-Anderson, R. M. Motor-driven advection competes with crowding to drive spatiotemporally heterogeneous transport in cytoskeleton composites. Frontiers in Physics. 10, 1055441(2022).
  18. Zeiss Lightsheet 7. Light-Sheet Multiview Imaging of Living and Cleared Specimens. Zeiss. , Available from: https://www.zeiss.com/microscopy/en/products/light-microscopes/light-sheet-microscopes/lightsheet-7.html (2023).
  19. Zeiss Lattice Lightsheet 7. Long-Term Volumetric Imaging of Living Cells. Zeiss. , Available from: https://www.zeiss.com/microscopy/en/products/light-microscopes/light-sheet-microscopes/lattice-lightsheet-7.html (2023).
  20. Kumar, M., Kishore, S., McLean, D. L., Kozorovitskiy, Y. Crossbill: An open access single objective light-sheet microscopy platform. bioRxiv. , (2021).
  21. Olarte, O. E., Andilla, J., Gualda, E. J., Loza-Alvarez, P. Light-sheet microscopy: A tutorial. Advances in Optics and Photonics. 10 (1), 111-179 (2018).
  22. Pitrone, P. G., et al. OpenSPIM: An open-access light-sheet microscopy platform. Nature Methods. 10 (7), 598-599 (2013).
  23. Sheung Lab, Single Objective Light Sheet Microscope (SOLS) Guide. Sheung Lab. , Available from: https://sites.google.com/view/sheunglab/microscopy/single-objective-light-microscope-sols (2023).
  24. Lamb, J. R., Ward, E. N., Kaminski, C. F. Open-source software package for on-the-fly deskewing and live viewing of volumetric lightsheet microscopy data. Biomedical Optics Express. 14 (2), 834-845 (2023).
  25. Harvard University. Mitchison Lab. , Available from: https://mitchison.hms.harvard.edu/home (2023).
  26. Research at Dogic Lab. , Available from: http://dogiclab.physics.ucsb.edu/research/ (2023).
  27. Watkins, S. C., St. Croix, C. M. Light sheet imaging comes of age. Journal of Cell Biology. 217 (5), 1567-1569 (2018).
  28. Ndlec, F. J., Surrey, T., Maggs, A. C., Leibler, S. Self-organization of microtubules and motors. Nature. 389 (6648), 305-308 (1997).
  29. Sanchez, T., Chen, D. T. N., DeCamp, S. J., Heymann, M., Dogic, Z. Spontaneous motion in hierarchically assembled active matter. Nature. 491 (7424), 431-434 (2012).
  30. Berezney, J., Goode, B. L., Fraden, S., Dogic, Z. Extensile to contractile transition in active microtubule-actin composites generates layered asters with programmable lifetimes. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 119 (5), e2115895119(2022).
  31. Kim, K., et al. Isomorphic coalescence of aster cores formed in vitro from microtubules and kinesin motors. Physical Biology. 13 (5), 056002(2016).
  32. Millett-Sikking, A., et al. High NA single-objective lightsheet. , (2019).
  33. Bourgenot, C., Saunter, C. D., Taylor, J. M., Girkin, J. M., Love, G. D. 3D adaptive optics in a light sheet microscope. Optics Express. 20 (12), 13252-13261 (2012).
  34. Bernardello, M., Gualda, E. J., Loza-Alvarez, P. Modular multimodal platform for classical and high throughput light sheet microscopy. Scientific Reports. 12 (1), 1969(2022).
  35. Crombez, S., Leclerc, P., Ray, C., Ducros, N. Computational hyperspectral light-sheet microscopy. Optics Express. 30 (4), 4856-4866 (2022).

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