方法文章

利用纳米孔技术进行狂犬病病毒快速全基因组测序

DOI：

10.3791/65414

⸱

2023年8月18日

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1School of Biodiversity, One Health & Veterinary Medicine, University of Glasgow, 2Research Institute for Tropical Medicine, 3University of Nairobi, Institute of Tropical and Infectious Diseases, 4Tanzania Industrial Research Development Organization, 5Ifakara Health Institute, 6MRC-University of Glasgow Centre for Virus Research, 7Department of Veterinary Public health, Ahmadu Bello University, 8African Centre of Excellence for Neglected Tropical Diseases and Forensic Biotechnology, Ahmadu Bello University, 9University of Nairobi, Kenya and Center for Epidemiological Modelling and Analysis, University of Nairobi

本文内容

摘要

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

本文介绍了一种利用纳米孔技术对狂犬病病毒（RABV）基因组进行快速且经济高效的表征工作流程。该工作流程旨在支持基于基因组信息的本地化监测，提供有关流行RABV谱系及其在区域系统发育树中位置的信息，以指导狂犬病防控措施的制定。

摘要

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

基因组数据可用于追踪传染病的传播路径和地理扩散情况。然而，在许多中低收入国家（LMICs），用于基因组监测的测序能力仍然有限，而在这些地区，由犬类传播的狂犬病和/或野生动物（如吸血蝙蝠）传播的狂犬病对公共卫生和经济构成了重大威胁。本文介绍了一种基于纳米孔测序技术的快速且经济的“样本到序列到解读”全流程方案。文中简要描述了样本采集和狂犬病诊断的流程，随后详细介绍了优化后的全基因组测序工作流程，包括用于多重聚合酶链式反应（PCR）的引物设计与优化、一种改良的低成本测序文库制备方法、实时及离线碱基识别测序、遗传谱系鉴定以及系统发育分析。本文展示了该工作流程的实际应用，并强调了本地部署中的关键步骤，例如流程验证、引物优化、阴性对照的设置，以及利用公开可用的数据和基因组工具（GLUE、MADDog）进行分类，并将结果置于区域和全球系统发育树中进行比对。该工作流程的周转时间为2至3天，每样本成本在96样本批量运行时为25美元，12样本批量运行时为80美元。我们得出结论：在中低收入国家建立狂犬病毒基因组监测体系是可行的，这将有助于实现“到2030年消除犬传人狂犬病导致的人类死亡”这一全球目标，并加强对野生动物狂犬病传播的监测。此外，该平台还可适配用于其他病原体，有助于构建多功能的基因组监测能力，从而提升对流行病和大流行的应对准备水平。

引言

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狂犬病病毒（RABV）是Rhabdoviridae科中的一种丽沙病毒，可导致哺乳动物发生致命性神经系统疾病1。尽管通过疫苗接种可实现100%预防狂犬病，但在流行地区，该病仍是重要的公共卫生和经济问题。据估计，全球每年约有60,000人死于狂犬病，其中超过95%的病例发生在非洲和亚洲，而犬类是这些地区的主要病毒储存宿主2。相比之下，由于实施犬类疫苗接种，西欧、北美洲以及大部分拉丁美洲地区已成功消除由犬类传播的狂犬病。在这些地区，狂犬病的储存宿主现已局限于野生动物，例如蝙蝠、浣熊、臭鼬和野生犬科动物3。在整个拉丁美洲，普通吸血蝙蝠因在夜间吸血过程中频繁将病毒溢出传播给人类和家畜，已成为狂犬病的重要来源4。全球每年因狂犬病造成的经济损失估计达86亿美元，其中家畜损失约占6%5。

病毒病原体的序列数据结合感染发生的时间和来源信息，可提供有力的流行病学见解6。对于狂犬病病毒（RABV），测序技术已被用于调查疫情暴发的来源7,8，识别与野生动物或家犬相关的宿主关系8,9,10,11,12，以及追踪人类病例的来源13,14。利用系统发育分析开展的疫情调查表明，狂犬病通过一次从加里曼丹或苏拉威西等邻近地方性流行区的引入事件，传入了此前无狂犬病的印度尼西亚巴厘省15。与此同时，在菲律宾，罗马布隆省塔布拉斯岛的疫情被证实源自吕宋主岛的传入16。病毒基因组数据还被用于更深入地理解病原体传播动态，从而为地理上精准实施防控措施提供依据。例如，RABV的基因组特征分析揭示了进化枝的地理聚类现象17,18,19、谱系的共循环20,21,22、人类活动介导的病毒迁移17,23,24以及集合种群动态25,26。

疾病监测是基因组监测的一项重要功能，随着全球为应对 SARS-CoV-2 大流行而大幅提升测序能力，该功能已得到加强。基因组监测已支持对 SARS-CoV-2 关注变异株27,28 及相关应对措施的实时追踪6。测序技术的普及化进展，例如纳米孔测序技术，已推动了更高效且成本更低的人类29,30,31,32 和动物33,34,35 病原体快速测序方案的发展。然而，在许多狂犬病流行国家，病原体基因组监测的实施仍面临障碍，这一点在全球 SARS-CoV-2 测序能力分布不均中已有体现36。实验室基础设施、供应链和技术知识的局限性，使得基因组监测的建立和常规化实施面临挑战。本文中，我们展示了如何在资源有限的环境中部署一种经过优化的、快速且经济的全基因组测序工作流程，用于狂犬病病毒（RABV）的监测。

方案

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本研究获得了坦桑尼亚国家医学研究所医学研究协调委员会（NIMR/HQ/R.8a/vol.IX/2788）、坦桑尼亚区域行政与地方政府部（AB.81/288/01）以及伊法卡拉健康研究所机构审查委员会（IHI/IRB/No:22-2014）；肯尼亚内罗毕大学热带与传染病研究所（P947/11/2019）和肯尼亚医学研究所（KEMRI-SERU；方案编号3268）；以及菲律宾热带医学研究所（RITM）、卫生部（2019-023）的批准。来自尼日利亚的样本测序工作基于作为国家监测工作一部分所收集的存档诊断材料进行。

注意：第1-4节为先决条件。第5-16节描述了狂犬病病毒（RABV）纳米孔测序从样本到序列再到解读的完整工作流程（图1）。在本方案后续需要 瞬时离心的步骤中，均以10,000–15,000 × g 离心5–15秒。

1. 测序与数据分析的计算环境设置

  1. 访问牛津纳米孔技术公司（Oxford Nanopore Technology, ONT）网站37，注册账户以获取纳米孔测序相关资源。
    1. 登录后安装ONT测序及碱基识别软件38。
  2. 打开GitHub39并注册账户。
    1. 前往artic-rabv40和MADDOG代码仓库41，并按照安装说明进行操作。

2. 设计或更新多重引物方案

注意：现有的RABV方案可在artic-rabv资源库中获取40。当针对新的地理区域时，应设计新的方案，或对现有方案进行修改以纳入更多的遗传多样性。

  1. 选择一个基因组参考序列集以代表研究区域的多样性；这通常是一组公开可用的序列（例如来自 NCBI GenBank）或初步的内部数据。按照步骤 2.1.1 使用 RABV-GLUE42（一种狂犬病病毒序列数据资源）来筛选并下载 NCBI 序列及其相关元数据。
    注意：应选择具有完整基因组的参考序列（即无缺口和屏蔽碱基）。建议选择最多 10 条序列作为引物设计的参考序列集。如果可用的序列数据不完整或不能代表研究区域，请参考 补充文件 1 中的建议43,44,45。
    1. 在 RABV-GLUE 中，从 序列数据 下拉菜单中进入 按进化枝划分的 NCBI RABV 序列 页面。点击 狂犬病病毒 (RABV) 链接以访问所有可用数据，或选择特定感兴趣的进化枝。使用筛选功能 添加筛选条件 以符合所需标准（例如来源国家、序列长度）。下载序列和元数据。
  2. 根据 Primal Scheme46 提供的说明，生成用于多重聚合酶链式反应（PCR）的引物方案。建议采用 400 bp 的扩增子长度并设置 50 bp 的重叠区域，以便对低质量样本进行测序。下载并保存所有输出结果（请勿编辑文件或引物名称）。
    注意：该方案将以输入 fasta 文件中的第一条序列为索引，此后将此序列称为“索引参考序列”（图 2）。有关优化引物性能的选项，请参见 补充文件 1。

3. 建立 RAMPART 和 ARTIC 生物信息学分析流程

  1. 参考补充文件2，建立目录结构，以管理RAMPART和ARTIC生物信息学分析流程的输入/输出文件。

4. 生物安全与实验室设置

  1. 在生物安全二级（BSL2）或三级条件下处理可能含有狂犬病病毒的样本。
  2. 确保实验室工作人员已完成狂犬病暴露前疫苗接种，并根据世界卫生组织（WHO）建议3进行免疫水平监测。
  3. 确保实验室已制定专用的标准操作程序和风险评估方案，并符合国家或国际指南要求。
  4. 所需实验室设置：通过物理分隔扩增前与扩增后区域，以最大限度减少污染。在空间有限的实验室或现场实验环境中，可使用便携式手套箱或临时实验工作站以降低污染风险。
  5. 在本方案中，需明确划分以下独立区域：
    1. 样本提取区：设置一个 BSL2/3级生物安全柜或手套箱，用于处理生物材料并进行灭活及RNA提取。
    2. 模板操作区：设置一个BSL1级生物安全柜或手套箱，用于将模板（RNA/cDNA）加入预先配制的反应主混合液中。
    3. 主混合液配制区：设立专用洁净区（BSL1级生物安全柜或手套箱），用于配制试剂主混合液，该区域内不得存在任何模板。
    4. 扩增后操作区：设立独立区域，用于扩增产物操作及测序文库制备。
      ​注意：所有区域在使用前后均应使用表面去污剂清洁，并进行紫外线（UV）灭菌。

5. 野外样本采集与诊断

注意：样本必须由经过培训且已接种免疫的人员在穿戴个人防护装备并遵循所引用的标准操作程序47,48,49的情况下采集。

  1. 收集样本 通过 枕骨入路（即枕骨大孔入路），详见 Mauti 等人的描述50.
  2. 在野外使用快速诊断检测法诊断狂犬病，并在实验室中采用推荐程序进行确认47，例如直接荧光抗体检测（DFA）、直接快速免疫组化检测（DRIT）51,52，或实时逆转录（RT）-PCR53.
  3. 使用已确认阳性的脑组织样本进行RNA提取，或在-20℃冰箱中保存 °C下保存2-3个月或-80 °C 更长时间。使用合适的 DNA/RNA 稳定介质保存 RNA 以用于储存和运输。

6. 样品制备与RNA提取（3小时）

注意：使用适用于样本类型的基于离心柱的病毒RNA提取试剂盒。

  1. 通过将约 200 µL 装满 1.4 mm 陶瓷珠的 2 mL PCR 管填充，制备两根陶瓷珠 管，并对管进行标记。
  2. 向已标记的 PCR 管中加入 RNA 提取试剂盒中提供的推荐体积的裂解缓冲液。
  3. 使用木制涂药棒从经确诊为狂犬病感染的脑组织样本中取一个约 3 mm 的立方体，放入带有样本编号的标记管中，并向标记为阴性对照的管中加入 100 µL 无核酸酶水。
    注意：采用封闭管珠式均质化以限制样本暴露。若不可行，可使用其他合适的机械破碎装置（例如转子式）或手动微型研杵。然而，这些方法在破坏组织方面可能不如在硬质表面上进行珠击有效（某些保存介质中组织样本可能变硬）。
  4. 使用木制涂药棒手动破碎脑组织，然后以最高速度涡旋震荡，直至完全实现组织均质化。
  5. 根据制造商说明对裂解液进行离心，并使用移液器将上清液转移至新的标记微量离心管中。后续步骤仅使用此上清液。
  6. 按照 RNA 提取试剂盒的离心柱操作说明获得纯化的 RNA。
  7. 在此处加入阴性提取对照（NEC），并将其全程用于测序阶段。

7. cDNA 的制备（20 分钟）

  1. 在加样区，根据待处理的样本和对照数量，配制逆转录第一链 cDNA 合成的预混液（额外增加 10% 体积以确保试剂充足；表 1）。此步骤应包含一个无模板对照（NTC）。
  2. 标记 0.2 mL PCR 排管，并向各管中分装 5 µL 预混液。
  3. 将已分装的排管转移至模板区。向每个标记好的管中加入 5 µL RNA，包括 NEC；向 NTC 管中加入 5 µL 无核酸酶水（NFW）。
  4. 按照 表 1 中所述条件，在热循环仪中进行孵育。
    注意：可选暂停点：如必要，cDNA 可在 -20 °C 保存最多 1 个月，但建议直接进行后续 PCR 反应。

8. 引物混合物储备液的制备（1 小时）

注意：仅当从单个引物制备新的储存液时才需要执行此步骤；此后可使用预先配制的储存液。

  1. 在总配液区配制浓度为 100 µM 的引物混合液储备液。
  2. 用 1× TE 缓冲液或无核酸酶水（NFW）将冻干引物重悬，使每种引物浓度为 100 µM。充分涡旋振荡后离心。
    ​注意：在后续步骤中，将各个引物分为两个引物池——奇数编号引物（命名为 Pool A）和偶数编号引物（命名为 Pool B），以避免扩增子重叠区域两侧引物之间的相互作用。这些引物池可生成覆盖目标基因组的、长度为 400 bp 的重叠扩增子。
  3. 将所有奇数编号引物排列在试管架中。取每种引物各 5 µL，加入一个标记为“引物方案名称 - Pool A (100 µM)”的 1.5 mL 微量离心管中，制备引物池储备液。
  4. 对所有偶数编号引物重复上述操作，并标记为“引物方案名称 - Pool B (100 µM)”。
  5. 用分子生物学级水将每个引物池按 1:10 比例稀释，制备成 10 µM 的引物工作液。
    ​注意：将 10 µM 引物稀释液分装成多个 aliquot，冷冻保存，以防降解或污染。

9. 多重 PCR（5 小时）

  1. 在配制区准备两份PCR主混合液，每份对应一个引物池。
    1. 使用终浓度为 0.015 µM 每引物。计算 PCR 反应所需的引物混合物体积（表2）使用以下公式：
      引物混合物体积 = 引物数量 × 反应体积 × 0.015 / 浓度µ引物储备液的浓度（M）
  2. 分装 10 µ在模板区域的已标记 PCR 条形管中，分别加入等量的 Pool A 预混液和 Pool B 预混液. 每个样本中加入 2.5 µ将步骤3所得的cDNA各L分别加入对应的标记引物Pool A和Pool B反应中。多余的cDNA可保存在-20 °C.
  3. 轻轻弹击混匀，短暂离心。
  4. 在指定条件下孵育样品 表2 在PCR仪上。
    ​注意：由于引物数量较多，退火时间较长（5 分钟），且扩增片段较短（400 bp），足以完成延伸，因此该程序未设置专门的延伸步骤。

10. PCR 产物纯化与定量（3.5 小时）

  1. 从此步骤开始，所有操作均应在扩增后区域（post-PCR）进行 面积.
  2. 将固相可逆固定化（SPRI）磁珠从主瓶中分装至微量离心管中。4 ℃保存 °C.
  3. 预热 将 SPRI 磁珠分装至室温（RT；~20） °C）并充分涡旋振荡，直至磁珠完全重悬于溶液中。
  4. 在1.5 mL离心管中，将每个样本的引物Pool A与引物Pool B的PCR产物混合。如有需要，加入水将体积补至25 μL µL.
  5. 加入25 µ向每个样本中加入 SPRI 磁珠 L（磁珠:样本 = 1:1）。通过移液上下吹打或轻弹管壁混匀。
  6. 室温孵育10分钟，期间偶尔倒置或轻弹离心管。
  7. 置于磁力架上，直至磁珠与溶液完全分离。小心移除并弃去上清液，注意不要扰动磁珠沉淀。
  8. 用80%乙醇（预热至室温）洗涤两次。
    1. 加入200 µ加入 L 乙醇至沉淀中。静置 30 秒，以确保珠子充分洗涤。
    2. 小心移除并弃去上清液，注意不要触碰到磁珠沉淀。
    3. 重复步骤 10.8.1–10.8.2，再次洗涤沉淀。
  9. 使用10去除所有乙醇残留 µL型枪头。空气干燥，直至微量乙醇完全挥发（小珠粒情况下很快，约30秒）；此时沉淀应由光亮转为无光泽。注意避免过度干燥（若沉淀出现裂纹，则表示过干），否则会影响DNA回收率。
  10. 将珠子重悬于 15 µ加入NFW并室温（离开磁力架）孵育10分钟。
  11. 返回磁力架，将上清液（纯化产物）转移至新的1.5 mL离心管中。
  12. 在单独的试管中，将每份样品分别制备成1:10稀释液（2 µ产物 L + 18 µL of NFW
    注意：此步骤需格外小心以避免交叉污染。每次只能打开一个扩增子管。分装 18 µ先将 L 的水加入试管中（在洁净的主混合区域进行）。
  13. 使用高灵敏度和高特异性的荧光计测量每个稀释样品的DNA浓度，具体操作参见protocols.io中的描述54,55.

11. 标准化（30 分钟）

  1. 使用归一化模板（补充文件 3）和每个样本的 DNA 浓度（ng/µL），计算在总体积为 5 µL 时获得每个样本 200 fmol 所需的稀释（或原液）样本体积。
  2. 标记新的 PCR 管，并加入计算所得体积的无核酸酶水（NFW）和样本，以获得归一化的 DNA。
  3. 如果需要超过 5 µL 的稀释样本才能获得 200 fmol，则使用未稀释（原液）样本的计算体积。
    ​注意：可选暂停点：此时，纯化后的 PCR 产物可在 4 °C 下保存最多 1 周，或根据需要置于 -20 °C 长期保存。

12. 末端修复与加接头（1.5 小时）

注意：接下来的步骤假设使用纳米孔特异性条形码和连接测序试剂盒中的特定试剂（详见材料表）。该方案适用于不同的化学版本，但用户应根据制造商的说明，谨慎选择兼容的试剂盒。

  1. 末端修复与dA加尾
    1. 根据表3中列出的每个样本设置末端修复反应。根据样本数量（额外增加10%）配制主混合液。移液时需小心，因试剂较为黏稠。
    2. 向每管已标准化的DNA（5 µL）中加入5 µL主混合液，总体积应为10 µL。每次更换吸头，且每次仅打开一个离心管。
    3. 在热循环仪中按照表3所述条件进行孵育。
  2. 加接条形码
    1. 将条形码试剂盒中的条形码分装至PCR条形管中，每管1.25 µL，并记录各样本所分配的条形码。
    2. 向已分配的条形码分装液中加入0.75 µL末端修复后的样本。
    3. 根据样本数量（额外增加10%）配制连接反应主混合液（表4）。
    4. 向末端修复样本与条形码的混合物中加入8 µL连接主混合液，使总反应体积为10 µL。
    5. 在热循环仪中按照表4所述条件进行孵育。
  3. SPRI磁珠纯化及DNA定量
    1. 在室温下解冻短片段缓冲液（SFB），涡旋混匀，瞬时离心后置于冰上。
    2. 将所有加接条形码的样本汇集至一个1.5 mL低吸附微量离心管中。为避免纯化体积过大，可从每个原位条形码反应中汇集12–24个样本（每个10 µL）、最多48个样本（每个5 µL）或最多96个样本（每个2.5 µL）。
    3. 向加接条形码的样本混合物中加入0.4倍体积的SPRI磁珠。轻柔混匀（轻弹或移液），室温孵育5分钟。
    4. 将样本置于磁力架上，直至磁珠完全沉淀且上清液澄清（约2分钟）。小心移除并弃去上清液，注意不要扰动磁珠沉淀。
    5. 用250 µL SFB洗涤两次。
      1. 将离心管从磁力架上取下，用250 µL SFB充分重悬沉淀。孵育30秒，瞬时离心后放回磁力架。
      2. 移除上清液并弃去。
    6. 重复步骤12.3.5 进行第二次SFB洗涤。
    7. 瞬时离心，去除残留的SFB。
    8. 加入200 µL 80%（室温）乙醇浸洗沉淀。小心移除并弃去乙醇，避免扰动磁珠沉淀。室温晾干30秒，或直至沉淀失去光泽。
    9. 在室温下用22 µL无核酸酶水（NFW）重悬沉淀，孵育10分钟。
    10. 将样本置于磁力架上，静置约2分钟，待沉淀完全后小心转移上清液至新的洁净1.5 mL微量离心管中。
    11. 取1 µL进行DNA浓度测定，方法如前所述（步骤10.13）。
      ​注意：可选暂停点：此时文库可在4 °C保存最多1周，或在-20 °C长期保存，但建议继续进行接头连接和测序。

13. 测序（最长48小时）

  1. 准备计算机（另请参阅先决条件部分 1-4）。
    1. 检查是否有足够的存储空间（至少 150 GB），删除数据前确保旧运行数据已备份或转移至服务器，并已安装最新版本的 MinKNOW。
  2. 从冰箱中取出保存的流通池，使其恢复至室温。
  3. 连接接头（1 小时）
    1. 脉冲离心接头混合物和连接酶，然后置于冰上。
    2. 室温下解冻洗脱缓冲液（EB）、SFB 和连接缓冲液。涡旋混匀，短暂离心后置于冰上。
    3. 准备连接接头的混合液（表5），在低吸附管中按指定顺序混合试剂。
      注意：接头连接主混合试剂的替代方案（表5) 可根据实验室的可用情况选择使用。参见 补充文件 3 和 材料表 有关替代方案的列表，请使用计算 补充文件 3 工作表，以计算相当于 200 fmol 的 DNA 文库体积。如果少于 20 µ计算 L，加入 NFW 以补足至 20 µL.
    4. 轻轻弹击混匀，短时离心。室温孵育 20 分钟。
      注意：孵育期间，开始准备流式池（第13.5节）。
  4. 使用 SPRI 磁珠进行纯化（不要像之前纯化步骤中那样使用乙醇）。
    1. 加入0.4倍体积的SPRI磁珠（室温）至样品中。室温孵育10分钟，期间轻轻 flick 混匀数次以促进混合。
    2. 置于磁架上，直至磁珠与溶液完全分离（约5分钟）。移除并弃去上清液，注意不要扰动磁珠沉淀。
    3. 用125洗涤两次 µL of SFB。
    4. 用125 μL溶液完全重悬沉淀 µ用移液器混合 SFB 的 L。静置孵育 30 秒。
    5. 脉冲离心以收集管底液体，然后置于磁铁上。移除上清液并弃去。
    6. 重复步骤 13.4.4–13.4.5，以对沉淀物进行第二次洗涤。
    7. 脉冲离心，去除多余的SFB。
    8. 在15中重悬 µL EB，室温孵育10分钟。
    9. 放回磁架约 2 分钟，然后小心地将溶液转移至一支洁净的 1.5 mL 微离心管中。
    10. 量化 1 µ如步骤10.13中先前所述，取洗脱文库的L
      注意：为获得最佳结果，建议直接进行 MinION 测序；但最终文库可在 4°C 的 EB 缓冲液中保存 °如有需要，可在 4°C 下保存长达 1 周。
  5. 运行流动池质量检查。
    1. 将测序仪连接至笔记本电脑，并打开测序软件。
    2. 选择流动池类型，然后单击 检查流通池 和 开始测试.
    3. 完成后，将显示活性（即存活）孔的总数。新的流式细胞仪应具有 >800 个活性孔；若不符合，请联系制造商更换。
  6. 上样并启动芯片（20 分钟）
    1. 在室温下解冻以下试剂，然后将测序缓冲液、冲洗接头、冲洗缓冲液和上样珠置于冰上。
    2. 涡旋振荡测序缓冲液和冲洗缓冲液，短暂离心后置于冰上。
    3. 脉冲离心冲洗连接物，用移液器吹打混匀，然后置于冰上。
    4. 通过加入30制备流动池预润混合液 µ将冲洗液接头直接连接至流式细胞仪引物试剂盒中的缓冲液管，用移液器吹打混匀。
    5. 使用前应立即用移液器吹打混匀上样珠，因其会迅速沉降。
    6. 在新的离心管中，按照前述方法制备用于测序的最终文库稀释液， 表5.
      注意：使用计算方法在 补充文件 3 工作表，用于计算相当于 50 fmol 的 DNA 文库体积。如果少于 12 µL 被计算后，加入 EB 补足至 12 µL.
    7. 翻回测序仪盖板，顺时针滑动引物启动端口盖，使引物启动端口露出（图3)
    8. 小心去除气泡，将P1000移液器调至200 µL，将吸头插入引液口，转动轮盘直至观察到有少量液体进入移液器吸头（最大旋转至230） µL).
    9. 加入800 µ将 L 的流动池预处理混合液注入流动池 通过 引液口，注意避免产生气泡。
    10. 静置5分钟。
    11. 轻轻抬起样品端口盖，加入 200 µL 的引发混合液注入流动池 通过 使用 P1000 移液器对引物端口进行加样。
    12. 用移液器将文库混合液上下吹打混匀 加样前，确保充分重悬混合液中的加载珠。
    13. 加载 75 µ将文库混合物 L 加入流动池 通过 以逐滴方式将样品加入样品口。确保每滴液体进入样品口后再加入下一滴。
    14. 轻轻盖上样品口盖，确保其 bung 进入样品端口。
    15. 关闭引物端口并重新装上测序装置的盖子。
  7. 测序运行（最长48小时）
    1. 将测序仪连接至笔记本电脑，并打开测序软件。
    2. 点击 开始 然后点击 开始测序.
    3. 点击 新实验 并按照测序软件的图形用户界面（GUI）工作流程设置运行参数。
    4. 输入实验名称和样本编号（例如：rabv_run1），并选择 流动池类型 从下拉菜单中。
    5. 继续选择试剂盒，选用相应的连接测序试剂盒和天然条形码试剂盒。
    6. 继续 运行 选项。除非希望运行在特定小时数后自动停止（运行可在任何时候手动停止），否则请保持默认设置。
    7. 继续 碱基识别. 选择转向 碱基识别开启 或 关闭 根据计算资源（参见计算机设置）。选择 编辑选项 条形码扫描下确保 条形码双端标记 开启。保存并继续至输出部分。
    8. 接受默认设置并继续至最终审核，检查各项参数，并将详细信息记录在工作表中补充文件 3）。点击 开始.
      注意：如果重复使用流通池，请根据运行选项高级部分中的方案调整起始电压 补充文件 3.
    9. 记录初始的活跃通道数——如果该数值显著低于质量控制（QC）检查标准，则重新启动测序软件；若仍然偏低，则重启计算机。
    10. 记录链与单个孔道的初始通道数，以估算孔道占据率。该数值会有所波动，因此提供一个近似值即可。
    11. 在运行过程中进行实时监控。

14. 实时与离线碱基识别

注意：本说明假定已使用 artic-rabv 仓库中提供的现有目录结构，并已遵循本方案的第1和第3节中的先决条件。

  1. 在本地文件系统中，创建一个名为 analysis 的新目录，用于存储所有分析输出结果。为进一步组织文件：创建一个以项目名称命名的子目录 ，并在其中创建一个以运行名称命名的新目录，运行名称使用提供给 MinKNOW 的样本 ID 作为 run_name。可通过以下单条命令完成：
    mkdir -p
    analysis/project_name/run_name
    然后进入该目录：
    cd
    path/analysis/project_name/run_name
  2. 实时碱基识别（Live basecalling）
    注意：要在纳米孔测序过程中实时进行碱基识别，计算机需配备支持 NVIDIA CUDA 的图形处理器（GPU）。请确保已按照 guppy 协议完成 GPU 碱基识别设置的相关操作56。
    1. 在运行设置期间，开启实时碱基识别功能。
    2. 根据以下说明，使用 RAMPART 实时监控测序覆盖度。
    3. 在计算机终端中，激活 artic-rabv conda 环境：
      conda activate artic-rabv
    4. 在 run_name 目录内创建一个用于存放 RAMPART 输出结果的新目录，并进入该目录：
      cd /path/analysis/project_name/run_name
      mkdir rampart_output
      cd rampart_output
    5. 创建一个 barcodes.csv 文件，用于配对条形码与样本名称。该文件每行对应一个条形码，仅列出文库中存在的条形码，并包含“barcode”和“sample”两个标题字段。可参考 artic-rabv 目录中的示例：
      ​analysis/example_project/example_run/rampart_output/barcodes.csv
    6. 启动 RAMPART，提供相应的协议文件夹路径以及 MinKNOW 输出中该运行的 fastq_pass 文件夹路径：
      rampart --protocol /path/rampart/scheme_name_V1_protocol - basecalledPath <插入Fastq_pass文件夹路径>
    7. 打开浏览器窗口，在地址栏输入 localhost:3000 并访问。等待足够数据完成碱基识别后，结果将显示在屏幕上。
  3. 离线碱基识别（运行结束后执行）
    1. 若未启用实时碱基识别，MinKNOW 输出的将是原始信号数据（fast5 文件），此时无法在测序过程中使用 RAMPART。需在运行结束后使用 guppy 将 fast5 文件转换为碱基识别数据（fastq 文件）（参见先决条件步骤 1.1.1 中的设置说明）。随后对碱基识别数据进行事后 RAMPART 分析。
    2. 运行 guppy 碱基识别程序：
      guppy_basecaller -c dna_r9.4.1_450bps_fast.cfg -i /path/to/reads/fast5_* -s /path/analysis/project_name/run_name -x auto -r
      其中，-c 指定碱基识别模型的配置文件，-i 为输入路径，-s 为保存路径，-x 指定使用 GPU 设备进行碱基识别（若使用无 GPU 的 guppy 版本则省略此项），-r 表示递归搜索输入文件。
      注意：可通过将配置文件（.cfg）中的 _fast 替换为 _hac 来切换至高精度碱基识别模式，但耗时将显著增加。

15. 清洗流式池

  1. 如果纳米孔仍具有活性，流动池可清洗后重复用于新文库的测序。清洗操作请参见牛津纳米孔技术公司（ONT）流动池清洗方案57。

16. 分析与解释

  1. 使用 ARTIC 生物信息学流程生成共识序列
    1. 按照 artic-rabv GitHub 仓库40 中 rabv_protocols 文件夹内的详细说明，从原始 fast5 或碱基识别后的 fastq 文件生成共识序列。
      注：如需进一步指导，请参阅 Artic 流程 - 核心流程58。
  2. 可选：分析每个扩增子的平均测序深度。
    1. 参考补充文件 1，调整 artic-rabv 仓库中提供的脚本。简要而言，使用 SAMtools59 生成详细的统计信息，并在 R 中绘制每个核苷酸的覆盖度图。
  3. 使用 GLUE 进行系统发育分析
    1. 在 RABV_GLUE42 中，选择 分析 > 分型与解读 选项卡 > 添加文件，选择包含共识序列的 fasta 文件。
    2. 点击 提交 并等待。分析完成后，显示分析结果 按钮将变为可点击状态，显示分支（clade）和亚分支（subclade）分配结果、每个基因的覆盖度、与参考序列的变异情况以及最近亲缘关系。
    3. 相关背景序列也可在 序列数据 > 按分支分类的 NCBI 序列 部分中识别。
    4. 选择已识别的分支，或点击 狂犬病病毒 (RABV) 以查看所有可用序列。
    5. 根据相关条件（例如来源国家）筛选序列。
    6. 下载这些序列及其相应的元数据用于分析和比较。
  4. 使用 MADDOG41 进行谱系分配
    1. 从 GitHub 拉取 MADDOG 仓库，确保使用的是最新版本。
    2. 在本地 MADDOG 仓库（先前在“前提条件”部分创建）中创建一个以运行名称命名的分配文件夹。
    3. 在该文件夹内添加包含共识序列的 fasta 文件。
    4. 向文件夹中添加一个元数据文件。
      ​注：该文件必须为 CSV 格式，包含四列，分别为 'ID'、'country'、'year' 和 'assignment'，用于记录序列 ID、采样国家和样本采集年份，其中 'assignment' 列应为空。
    5. 在命令行界面中，激活 conda 环境：conda activate MADDOG。
    6. 在命令行界面中，导航至 MADDOG 仓库文件夹。
    7. 首先对序列进行谱系分配，以检查是否存在潜在异常，并判断是否有必要执行更长时间的谱系指定步骤。为此，在命令行中输入：sh assignment.sh。
    8. 当系统提示时，输入 Y，表示您已拉取仓库并正在使用最新版本的 MADDOG。
    9. 当系统提示时，输入 MADDOG 仓库文件夹中包含 fasta 文件的文件夹名称。
    10. 谱系分配完成后，检查文件夹中的输出文件。如果输出结果符合预期 且多个序列被分配至同一谱系，则执行谱系指定步骤。
    11. 若执行谱系指定，请删除刚刚生成的分配输出文件。
    12. 在终端中，进入 MADDOG 仓库文件夹，运行命令：sh designation.sh。
    13. 当系统提示时，输入 Y，表示您已拉取仓库并正在使用最新版本的 MADDOG。
    14. 当系统提示时，输入 MADDOG 仓库文件夹中包含 fasta 文件和元数据的文件夹名称。该命令将输出每条序列的谱系信息、新序列与相关先前序列（来自 16.3.6）的系统发育树、谱系的层级信息，以及潜在新兴谱系和采样不足区域的详细信息。
      注：该方案的完整说明、使用方法及输出解释详见 Campbell 等人60 的研究。
    15. 初始分析完成后，如系统提示是否同时检测新兴和采样不足的谱系，若需要则输入 Y，否则输入 N。
    16. 如系统提示确认新发现的谱系，请输入 Y 并按照生成的 NEXT_STEPS.eml 文件中的说明操作；否则输入 N。

结果

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

本方案中所述的狂犬病病毒（RABV）从样本到测序再到结果解读的工作流程，已在坦桑尼亚、肯尼亚、尼日利亚和菲律宾等地方性流行国家的不同实验室条件下成功应用（图4）。该方案适用于多种类型的样本和不同条件（表6）：新鲜和冷冻的脑组织、经冷链长时间运输的脑组织提取的cDNA和RNA，以及含有脑组织涂片的FTA卡片。

使用 RAMPART 进行实时碱基识别（图5）可近乎实时地生成测序读长，并显示每个样本的覆盖度百分比。这在决定何时终止测序运行并保存流通池以供重复使用时尤为有用。运行时间存在差异，有些样本在2小时内完成，而其他样本则可能需要超过12小时才能达到足够的测序深度（×100）。我们还可以查看扩增效果较差的区域；例如，图6 展示了一次测序运行的快照，其覆盖度谱显示某些扩增子的扩增水平极低，提示引物可能存在潜在问题。通过更深入地分析这些扩增效果不佳的区域，我们已能够识别出引物错配问题，从而为重新设计和优化个别引物提供依据。不同引物组合显示出的错配数量也有所不同。这一点在东非引物组合中比菲律宾引物组合更为明显，这与目标区域的遗传多样性一致，因为东非引物组合旨在捕获更广泛的遗传多样性。

RABV-GLUE42 是一种用于 RABV 基因组数据管理的通用资源，MADDOG60 是一种谱系分类与命名系统，本研究利用这两个系统对获得的 RABV 序列进行汇编和解读。表7展示了使用 RABV-GLUE 确定的各国流行的主要和次要分支。同时，还展示了依据 MADDOG 分类系统对本地谱系进行的更高分辨率的分类。

从样本制备到测序的工作流程：RNA提取、PCR、cDNA合成、生物信息学分析。
图1：狂犬病病毒（RABV）从样本到测序再到结果解读的工作流程。图中概括展示了以下步骤：（A）样本制备，（B）PCR扩增与文库构建，以及（C）测序和生物信息学分析，直至结果分析与解读。请点击此处查看该图的高清版本。

索引参考基因组示意图、引物池A/B、重叠扩增子、正向/反向引物。
图2：引物设计方案示意图。 正向与反向引物对（半箭头）在“索引参考基因组”（深紫色）上的退火位置，这些引物被分配至两个独立的引物池：A（红色）和B（绿色）。引物对生成长度为400 bp的重叠扩增子（蓝色），并沿索引参考基因组按顺序编号，格式为“scheme_name_X_DIRECTION”，其中“X”为数字，表示该引物对扩增的扩增子，“DIRECTION”为“LEFT”或“RIGHT”，分别对应正向或反向引物。X为奇数或偶数分别决定其所属引物池为A或B。请点击此处查看该图的放大版本。

纳米孔流动池示意图；测序装置；标注的端口、SpotON 激活剂、样品盖。
图 3：纳米孔流动池48。 蓝色标签标示了流动池的不同部分，包括覆盖加样孔的引液孔盖（用于加入引液溶液）、覆盖样品孔的 SpotON 样品孔盖（用于逐滴加入样品）、废液口 1 和 2，以及流动池编号。 请点击此处查看该图的放大版本。

显示2021-2022年病毒序列分布的世界地图图表；包括肯尼亚、菲律宾等地区。
图4：显示2021年和2022年使用优化流程进行狂犬病病毒（RABV）测序的地理位置。 气泡的大小和颜色对应每个地点的序列数量，较小且较深的颜色表示数量较少，较大且较浅的颜色表示数量较多。请点击此处查看此图的放大版本。

序列比对、定位与系统发育分析；包含图表的数据可视化仪表盘。
图 5：RAMPART 可视化在网页浏览器中的截图。 根据生物信息学设置，条形码名称已替换为样本名称。上方三个面板显示整个测序运行的汇总图：每个条形码在参考基因组索引上的每个核苷酸位置的比对读段覆盖深度（左上，按条形码着色）、所有条形码随时间累计的比对读段总数（中上）以及每个条形码的比对读段数（右上，按条形码着色）。下方面板显示每个条形码对应的多行图表，从左至右分别为：参考基因组索引上每个核苷酸位置的比对读段覆盖深度（左）、比对读段的长度分布（中）、以及随时间达到 10x、100x 和 1,000x 覆盖深度的参考基因组索引上核苷酸位置所占比例（右）。请点击此处查看此图的放大版本。

基因组位置图；序列读段深度，柱状图，遗传变异分析。
图6：使用本方案对来自菲律宾的狂犬病病毒样本进行测序后获得的全基因组读段覆盖度示例。 图中显示了基因组中每个核苷酸位置的读段覆盖深度，以及用于文库构建的重叠扩增子（1-41）的位置。覆盖深度的峰值对应于扩增子之间的重叠区域。覆盖深度较低的扩增子以红色标出，提示这些区域可能存在技术问题，可能需要优化。 请点击此处查看该图的高清版本。

表1：cDNA制备的主混合液及PCR仪反应条件。 请点击此处下载该表格。

表2：多重PCR的主混合液配方及热循环仪反应条件。 请点击此处下载该表格。

表3：末端修复反应的预混液组成和热循环仪条件。 请点击此处下载该表格。

表4：用于条形码的主混合液及热循环仪条件。 请点击此处下载该表格。

表5：测序用接头连接主混合液及最终文库稀释方案。 请点击此处下载该表格。

表6：使用样本-测序-解读工作流程的不同国家所产生的狂犬病病毒全基因组序列数量及所用样本类型。 请点击此处下载该表格。

表7：通过本工作流程生成的序列，由RABV-GLUE确定的主要和次要进化枝分配，以及由MADDOG确定的谱系分配。 请点击此处下载该表格。

补充文件1：引物方案设计与优化及扩增子测序深度分析。 请点击此处下载该文件。

补充文件 2：计算设置 请点击此处下载该文件。

补充文件 3：狂犬病病毒全基因组测序方案工作表 请点击此处下载该文件。

讨论

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Brunker 等人基于纳米孔测序技术，利用 ARTIC 网络的资源，开发了一种易于获取的狂犬病病毒（RABV）全基因组测序流程6146。本文介绍了一种更新后的流程，涵盖从样本处理、测序到结果解读的完整步骤。该流程详细说明了用于全基因组测序的脑组织样本制备方法，提供了一个生物信息学分析流程以处理测序读长并生成一致性序列，并重点介绍了两种针对狂犬病的特异性工具，用于自动化进行谱系分配和确定系统发育背景。更新后的流程还提供了关于建立适当的计算环境和实验室工作空间的全面指导，并考虑了在不同环境（包括资源有限的地区）中的实施可行性。我们已在四个狂犬病病毒流行但基因组监测能力有限或缺乏的中低收入国家（LMICs）的学术机构和研究机构中成功实施了该流程。该流程已被证明适用于多种不同环境，且不同专业背景的使用者均能理解并操作。

该狂犬病病毒（RABV）测序工作流程是目前最全面且公开可用的方案（涵盖从样本到序列再到结果解读的完整步骤），并特别优化以降低启动成本和运行成本。相较于其他测序平台（如Illumina61），纳米孔测序技术在文库制备和测序过程中的时间和成本显著降低，且随着技术的持续发展，其序列质量和准确性已不断提升，可与Illumina平台相媲美62。

本方案旨在适应多种资源有限的环境。通过参考核心方案中提供的故障排除和修改建议，用户可据此调整工作流程以满足自身需求。在工作流程中加入用户友好的生物信息学工具，是对原始方案的一项重大改进，可为生物信息学经验有限的用户提供快速、标准化的方法，用于在本地环境中解读测序数据。然而，现场（in situ）进行此类分析的能力通常受限于对特定编程和系统发育分析技能的需求，这些技能需要投入大量时间和长期培训才能掌握。尽管这些技能对于全面解读测序数据至关重要，但同样迫切需要提供基础且易于获取的分析工具，以赋能本地“测序带头人”——其核心专长可能集中在湿实验方面——使其能够独立解读并有效掌控自身数据。

由于该方案已在多个国家实施多年，我们现在可以提供如何优化多重引物组合以提高覆盖度并应对累积多样性的指导。我们还努力帮助用户提高成本效益，或便于在特定地区采购试剂，这通常是分子检测方法可持续性面临的主要挑战63。例如，在非洲（坦桑尼亚、肯尼亚和尼日利亚），我们在接头连接步骤中选用平末端/TA连接酶预混液，这种试剂更容易从本地供应商获得，且比其他连接试剂更具成本优势。

根据经验，有多种方法可以降低每个样本和每次运行的成本。减少每次运行的样本数量（例如，从24个减少到12个样本）可以延长流通池在多次运行中的使用寿命，而增加每次运行的样本数量则能最大化利用时间和试剂。在我们的实验中，每三次测序运行中可清洗并重复使用一次流通池，从而额外完成了55个样本的测序。使用后立即清洗流通池，或在无法立即清洗时，每次运行后从废液通道中清除废液，似乎有助于保留可供第二次运行使用的孔数量。结合流通池初始可用孔数，还可优化单次运行方案，以规划在特定流通池中应运行的样本数量。

尽管本工作流程力求尽可能全面，并提供了详细的指导和指引性资源，但该程序仍然较为复杂，对新用户而言可能具有挑战性。建议用户寻求现场培训和支持，最好是在本地进行，或通过外部合作者获得帮助。例如，在菲律宾，已开展一项旨在通过使用牛津纳米孔技术（ONT）加强区域实验室SARS-CoV-2基因组监测能力的项目，该项目已在医疗诊断人员中建立起核心能力，这些能力可直接应用于RABV测序。一些关键步骤（如SPRI磁珠纯化）若无实际操作培训则难以掌握，而低效的纯化可能损坏流动槽并影响测序运行。当在实验室中处理扩增子时，样本污染始终是一个主要问题，且难以彻底消除。特别是样本间的交叉污染，在测序后的生物信息学分析中极难被发现。良好的实验室技术和规范操作至关重要，例如保持工作台面清洁、分离PCR前与PCR后操作区域，以及设置阴性对照，以确保质量控制。纳米孔测序技术的快速发展为常规RABV基因组监测既带来了优势也带来了挑战。纳米孔技术在准确性、可及性及实验方案种类方面的持续改进，拓展并提升了其应用范围。然而，同样的快速发展也使得标准操作程序和生物信息学分析流程难以保持稳定。在本方案中，我们提供了一份文件，以协助用户从较早版本过渡到当前的纳米孔文库制备试剂盒（材料表）。

在中低收入国家（LMICs）中，测序工作面临的一个常见障碍是可及性问题，这不仅包括成本，还涉及能否及时采购耗材（特别是测序试剂，对采购团队和供应商而言相对新颖）、计算资源，以及稳定电力和互联网的获取。本方案以便携式纳米孔测序技术为基础，有助于解决上述诸多可及性难题。我们已在多种环境下成功应用本方案，实现了在目标国家境内完成全部实验流程与数据分析。诚然，设备和测序耗材的及时采购仍具挑战性，在许多情况下，我们不得不从英国携带或运输试剂。然而，在某些地区，我们已能够完全依赖本地供应渠道获取试剂，这得益于对SARS-CoV-2测序工作的投入（例如菲律宾），此类投入已优化了采购流程，并逐步推动病原体基因组学应用的常态化。

通过一次性安装，对稳定互联网连接的需求被降至最低；例如，GitHub 代码仓库、软件下载以及纳米孔测序本身仅需在启动运行时接入互联网（而非全程需要），或在获得公司许可后可完全离线进行。若有移动数据可用，可将手机作为热点连接至笔记本电脑以启动测序运行，随后在运行期间断开网络连接。在常规处理样本时，数据存储需求可能迅速增长，理想情况下应将数据存储于服务器上。否则，固态硬盘（SSD）的价格相对低廉，易于采购。

尽管我们认识到，低收入和中等收入国家（LMICs）在基因组监测方面仍存在障碍，但不断增加对提升基因组可及性和专业能力的投资（例如非洲病原体基因组学倡议 [Africa PGI]）64 表明这一状况将得到改善。基因组监测对于大流行病的防范至关重要6，而通过将狂犬病病毒（RABV）等地方性病原体的基因组监测纳入常规工作，可逐步建立相应能力。在 SARS-CoV-2 大流行期间暴露出的全球测序能力差异，应成为推动变革的催化剂，以解决这些结构性不平等问题。

该RABV样本到序列再到解读的工作流程，包括易于使用的生物信息学工具，有望用于指导防控措施，以实现到2030年消除犬源性狂犬病导致的人类死亡的目标，并最终消除RABV变异株。结合相关元数据，本方案生成的基因组数据有助于在疫情调查期间快速表征RABV，并识别特定国家或地区内流行的谱系60,61,65。本文主要以犬源性狂犬病的实例来说明我们的分析流程；然而，该工作流程也可直接应用于野生动物狂犬病。这种可转移性和低成本特性最大限度地减少了常规测序普及应用的障碍，不仅适用于狂犬病，也适用于其他病原体46,66,67，从而改善疾病管理和防控。

披露

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

作者无任何利益冲突需要披露。

致谢

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

本工作得到了以下资助：Wellcome 基金会 [207569/Z/17/Z, 224670/Z/21/Z]、英国医学研究理事会（MRC）的牛顿基金 [MR/R025649/1] 与菲律宾科学技术部（DOST）联合资助、英国研究与创新组织针对新冠疫情的全球努力项目 [MR/V035444/1]、格拉斯哥大学机构战略支持基金 [204820]、医学研究理事会新研究者奖（KB）[MR/X002047/1]、国际合作伙伴发展基金、DOST-英国文化协会-菲律宾奖学金（CB）、英国国家健康研究所 [17/63/82] GemVi 奖学金（GJ），以及来自格拉斯哥大学 MVLS DTP（KC）[125638-06]、EPSRC DTP（RD）[EP/T517896/1] 和 Wellcome IIB DTP（HF）[218518/Z/19/Z] 的博士生奖学金。我们感谢以下同事和合作者对本研究的支持：Daniel Streicker、Alice Broos、Elizabeth Miranda（兽医学博士）、Daria Manalo（兽医学博士）、Thumbi Mwangi、Kennedy Lushasi、Charles Kayuki、Jude Karlo Bolivar、Jeromir Bondoc、Esteven Balbin、Ronnel Tongohan、Agatha Ukande、Davis Kuchaka、Mumbua Mutunga、Lwitiko Sikana 和 Anna Czupryna。

材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
品牌名称
软件
测序软件
(MinKnow)		Oxford Nanopore Technologieshttps://community.nanoporetech.com/downloads
生物信息学工具包
(孔雀鱼)		Oxford Nanopore Technologieshttps://community.nanoporetech.com/docs/prepare/library_prep_protocols/Guppy-protocol/v/gpb_2003_v1_revao_14dec2018
设备
热循环仪
miniPCR™ mini16 梯度PCR仪		CambioMP-QP-1016-01
匀浆器
(Precellys Evolution Touch 均质器)		Bertin InstrumentsEQ02520-300
冷藏架（0.2–0.5 mL）
(带透明盖的PCR小型冷却器)		BRAND 781260
移液器
（Pipetman L 固定式移液器 F1000L，1000 μL）Gilson 货号：FA10030
（Pipetman L 固定式移液器，100 μL）Gilson 货号：FA10024
（Pipetman L 固定式 F10L，10 μL）Gilson 货号：FA10020
（Pipetman L 固定式 F1L，1 μL）Gilson SKU: FA10025
（Pipetman L 固定式 F20L，20 μL）Gilson SKU: FA10021
（Pipetman L 固定式 F250L，250 μL）Gilson 货号：FA10026
荧光计
(Qubit  4 荧光计) 		赛默飞世尔科技/费舍尔科技Q33238
笔记本电脑 
(任何品牌，约 2 GB 驱动空间，最低 512 GB 存储空间，msi 安装程序 [GPU])
微型离心机
(冷藏离心机)		赛默飞世尔科技/费舍尔科技75004081
涡旋混合器
(基础型漩涡混合器) 		赛默飞世尔科技/费舍尔科技88882011
磁力架
(DynaMag-2 磁力架)		赛默飞世尔科技/费舍尔科学12321D
测序仪
(MinION)		Oxford Nanopore TechnologiesMinION Mk1B
RNA提取 
RNA提取试剂盒
(Qiagen RNEasy Mini Kit 250)		Qiagen74106
RNA稳定试剂 
（RNA later） InvitrogenAM7020
（DNA/RNA保护剂）Zymo ResearchR1100-50
PCR
无核酸酶水
(无核酸酶水 [不  DEPC 处理的)		赛默飞世尔科技/费舍尔科技AM9937
第一链cDNA合成用预混液
(LunaScript RT SuperMix 试剂盒)		New England BiolabsE3010S
DNA扩增预混液
(Q5® 热启动高保真2X预混液 [NEB])		新英格兰生物实验室M0494L
引物（方案）
(定制DNA寡核苷酸)		Invitrogen
SPRI 磁珠纯化
SPRI 磁珠
(Aline Biosciences PCR Clean DX )		CambioAL-AC1003-50
乙醇，纯度绝对 >99.8%（气相色谱）[Riedel-De Haen]默克818760
短片段缓冲液
(SFB 扩展包)		Oxford Nanopore TechnologiesEXP-SFB001
DNA 定量
DNA定量试剂盒
(Qubit® dsDNA HS Assay 试剂盒)		赛默飞世尔科技/费舍尔科技Q32854
DNA 定量检测管
(Qubit™ 检测管		赛默飞世尔科技/费舍尔科学Q32856
末端修复与加接头
(Qubit™ 检测管
末端修复主混合液
（NEBNext Ultra 末端修复/dA加尾模块）		New England BiolabsE7546L
条形码试剂盒
化学 9 Oxford Nanopore Technologies化学 9 
（天然条形码扩展 1-12）EXP-NBD104 
（原生条形码扩展包 13-24） EXP-NBD114 
(原生条形码扩展 96)EXP-NBD196
化学 14Oxford Nanopore Technologies化学 14
（不兼容） （不兼容） 
（Native Barcoding Kit 24 V14）SQK-NBD114.24
（Native Barcoding Kit 96 V14）SQK-NBD114.96
连接反应预混液
（平末端/TA连接酶预混液）		New England BiolabsM0367S
接头连接
连接接头预混液
（NEBNext  快速连接模块新英格兰生物实验室E6056S  
（NEBNext Ultra II 连接模块） New England BiolabsE7595S
（平末端/TA连接酶预混液）New England BiolabsM0367S
接头混合物
化学 9 Oxford Nanopore Technologies化学 9
EXP-AMII001
（接头混合液 II [AMII]）
化学 14Oxford Nanopore Technologies化学 14
EXP-NBA114
（天然适配器 [NA]）
测序 
流动池预处理试剂盒
化学 9 Oxford Nanopore Technologies化学 9
EXP-FLP002
（冲洗缓冲液 [FB]）
（冲洗栓系 [FT]）
化学 14Oxford Nanopore Technologies化学 14
EXP-FLP004
（流动池冲洗 [FCF]）
（流动池连接物 [FCT]）
连接测序试剂盒 
化学 9 Oxford Nanopore Technologies化学 9
SQK-LSK109
接头混合物
（接头混合液 [AMX]）
连接缓冲液
（连接缓冲液 [LNB]）
短片段缓冲液
（短片段缓冲液 [SFB]）
测序缓冲液
（测序缓冲液 [SQB]）
洗脱缓冲液
（洗脱缓冲液 [EB]）
加载珠子
（上样缓冲液 [LB]）
测序锚定
（测序锚定序列 [SQT]）
化学 14Oxford Nanopore Technologies化学 14
SQK-LSK114
接头混合物
（连接接头 [LA]）
连接缓冲液
（连接缓冲液 [LNB]）
短片段缓冲液
（短片段缓冲液 [SFB]）
测序缓冲液
（测序缓冲液 [SB]）
洗脱缓冲液
（洗脱缓冲液 [EB]）
加载珠子
（加载珠 [LIB]）
测序锚定
（流动池连接装置 [FCT]）
文库溶液
（文库溶液 [LIS]）
冲洗缓冲液
（流动池冲洗 [FCF]）
流动池 
化学 9 Oxford Nanopore Technologies化学 9
FLO-MIN106D
（流动池  [R9.4.1]
化学 14Oxford Nanopore Technologies化学 14
FLO-MIN114
（流动池  [R10.4.1]
流动池清洗 
流动池清洗试剂盒
（流动池清洗试剂盒）		Oxford Nanopore TechnologiesEXP-WSH004
耗材 
表面去污剂 
（DNA Away 表面去污染剂，挤压瓶装 [分子生物学级]）赛默飞世尔科技/费舍尔科技7010PK
（RNase Away 表面去污剂，瓶装 [分子生物学级]）赛默飞世尔科技/费舍尔科技7002PK
PCR 8联管 0.2 ml，独立盖
（PCR 8联管条，0.2 ml，带独立平盖，无菌，无DNA酶/RNA酶，无热原，天然色 [Greiner]）		Greiner608281
0.2 ml PCR管
（PCR管，0.2 ml，无色[圆顶盖]，每袋500个，非无菌[Greiner]）		Greiner671201
1000µL型滤芯吸头（500个）
（堆叠 1000µL滤器吸头［500］		赛默飞世尔科技/费舍尔科技11977724
100µL型滤芯吸头（1000）赛默飞世尔科技/费舍尔科学11947724
10µL型滤芯吸头（1000）
（堆叠100）µL滤芯吸头 [1000]		赛默飞世尔科技/费舍尔科技11907724
加强型管  2 ml 离心管  带螺旋盖和O形圈
（Fisherbrand™ 大量试管		赛默飞世尔科技/费舍尔科学15545809
微量离心管（1.5 ml）
（1.5 ml 离心管 [500]）		Eppendorf1229888
DNA LoBind 离心管  (1.5 ml)
（DNA LoBind 管）		赛默飞世尔科技/费舍尔科技10051232
冷冻婴儿标签
手套（S/M/L）
纸巾

参考文献

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Rupprecht, C. E. Rhabdoviruses: rabies virus. Medical Microbiology. , University of Texas Medical Branch. Galveston, TX. (1996).
  2. Rabies. World Health Organization. , Available from: https://www.who.int/news-room/fact-sheets/detail/rabies (2023).
  3. Health Organization, W. orld WHO Expert Consultation on Rabies: WHO TRS N°1012. World Health Organization. , Available from: https://www.who.int/publications-detail-redirect/WHO-TRS-1012 (2018).
  4. Benavides, J. A., et al. Defining new pathways to manage the ongoing emergence of bat rabies in Latin America. Viruses. 12 (9), 1002(2020).
  5. Hampson, K. Estimating the global burden of endemic canine rabies. PLoS Neglected Tropical Diseases. 9 (4), e0003709(2015).
  6. Global genomic surveillance strategy for pathogens with pandemic and epidemic potential, 2022-2032. World Health Organization. , Available from: https://www.who.int/publications-detail-redirect/978924004679 (2022).
  7. Tsai, K. J., et al. Emergence of a sylvatic enzootic formosan ferret badger-associated rabies in Taiwan and the geographical separation of two phylogenetic groups of rabies viruses. Veterinary Microbiology. 182, 28-34 (2016).
  8. Chiou, H. -Y., et al. Molecular characterization of cryptically circulating rabies virus from ferret badgers, Taiwan. Emerging Infectious Diseases. 20 (5), 790-798 (2014).
  9. Sabeta, C. T., Mansfield, K. L., McElhinney, L. M., Fooks, A. R., Nel, L. H. Molecular epidemiology of rabies in bat-eared foxes (Otocyon megalotis) in South Africa. Virus Research. 129 (1), 1-10 (2007).
  10. Scott, T. P. Complete genome and molecular epidemiological data infer the maintenance of rabies among kudu (Tragelaphus strepsiceros) in Namibia. PLoS One. 8 (3), e58739(2013).
  11. Lembo, T., et al. Exploring reservoir dynamics: a case study of rabies in the Serengeti ecosystem. The Journal of Applied Ecology. 45 (4), 1246-1257 (2008).
  12. Coetzee, P., Nel, L. H. Emerging epidemic dog rabies in coastal South Africa: a molecular epidemiological analysis. Virus Research. 126 (1-2), 186-195 (2007).
  13. Ou de Munnink, B. B. First molecular analysis of rabies virus in Qatar and clinical cases imported into Qatar, a case report. International Journal of Infectious Diseases. 96, 323-326 (2020).
  14. Smith, J., et al. Case report: Rapid ante-mortem diagnosis of a human case of rabies imported into the UK from the Philippines. Journal of Medical Virology. 69, 150-155 (2003).
  15. Mahardika, G. N. K., et al. Phylogenetic analysis and victim contact tracing of rabies virus from humans and dogs in Bali, Indonesia. Epidemiology and Infection. 142 (6), 1146-1154 (2014).
  16. Tohma, K., et al. Molecular and mathematical modeling analyses of inter-island transmission of rabies into a previously rabies-free island in the Philippines. Infection, Genetics and Evolution. 38, 22-28 (2016).
  17. Tohma, K., et al. Phylogeographic analysis of rabies viruses in the Philippines. Infection, Genetics and Evolution. 23, 86-94 (2014).
  18. Saito, M., et al. Genetic diversity and geographic distribution of genetically distinct rabies viruses in the Philippines. PLoS Neglected Tropical Diseases. 7 (4), e2144(2013).
  19. Biek, R., Henderson, J. C., Waller, L. A., Rupprecht, C. E., Real, L. A. A high-resolution genetic signature of demographic and spatial expansion in epizootic rabies virus. Proceedings of the National Academy of Sciences. 104 (19), 7993-7998 (2007).
  20. Reddy, G. B., et al. Molecular characterization of Indian rabies virus isolates by partial sequencing of nucleoprotein (N) and phosphoprotein (P) genes. Virus Genes. 43, 13-17 (2011).
  21. David, D., Dveres, N., Yakobson, B. A., Davidson, I. Emergence of dog rabies in the northern region of Israel. Epidemiology and Infection. 137 (4), 544-548 (2009).
  22. Benjathummarak, S. Molecular genetic characterization of rabies virus glycoprotein gene sequences from rabid dogs in Bangkok and neighboring provinces in Thailand, 2013-2014. Archives of Virology. 161 (5), 1261-1271 (2016).
  23. Denduangboripant, J., et al. Transmission dynamics of rabies virus in Thailand: implications for disease control. BMC Infectious Diseases. 5, 52(2005).
  24. Talbi, C., et al. Phylodynamics and human-mediated dispersal of a zoonotic virus. PLoS Pathogens. 6 (10), e1001166(2010).
  25. Bourhy, H., et al. Revealing the micro-scale signature of endemic zoonotic disease transmission in an African urban setting. PLoS Pathogens. 12 (4), e1005525(2016).
  26. Zinsstag, J., et al. Vaccination of dogs in an African city interrupts rabies transmission and reduces human exposure. Science Translational Medicine. 9 (421), (2017).
  27. Yakovleva, A., et al. Tracking SARS-COV-2 variants using Nanopore sequencing in Ukraine in 2021. Scientific Reports. 12, 15749(2022).
  28. Mannsverk, S., et al. SARS-CoV-2 variants of concern and spike protein mutational dynamics in a Swedish cohort during 2021, studied by Nanopore sequencing. Virology Journal. 19, 164(2022).
  29. Soufi, M., et al. Fast and easy nanopore sequencing workflow for rapid genetic testing of familial Hypercholesterolemia. Frontiers in Genetics. 13, 836231(2022).
  30. Cabibbe, A. M. Application of targeted next-generation sequencing assay on a portable sequencing platform for culture-free detection of drug-resistant tuberculosis from clinical samples. Journal of Clinical Microbiology. 58 (10), 00632(2020).
  31. Xu, Y., et al. Nanopore metagenomic sequencing of influenza virus directly from respiratory samples: diagnosis, drug resistance and nosocomial transmission, United Kingdom, 2018/19 influenza season. Euro Surveillance. 26 (27), 2000004(2021).
  32. Stubbs, S. C. B., et al. Assessment of a multiplex PCR and Nanopore-based method for dengue virus sequencing in Indonesia. Virology Journal. 17, 24(2020).
  33. Croville, G., et al. Rapid whole-genome based typing and surveillance of avipoxviruses using nanopore sequencing. Journal of Virological Methods. 261, 34-39 (2018).
  34. Theuns, S., et al. Nanopore sequencing as a revolutionary diagnostic tool for porcine viral enteric disease complexes identifies porcine kobuvirus as an important enteric virus. Scientific Reports. 8, 9830(2018).
  35. O'Donnell, V. K., et al. Rapid sequence-based characterization of African swine fever virus by use of the Oxford Nanopore MinION sequence sensing device and a companion analysis software tool. Journal of Clinical Microbiology. 58, 01104-01119 (2019).
  36. Brito, A. F. Global disparities in SARS-CoV-2 genomic surveillance. Nature Communications. 13, 7003(2022).
  37. ONT login/register. Oxford Nanopore Technology. , Available from: https://nanoporetech.com/login-register (2023).
  38. Software Downloads. Oxford Nanopore Technology. , Available from: https://community.nanoporetech.com/downloads (2023).
  39. GitHub. , Available from: https://github.com/ (2023).
  40. Brunker, K. Artic-rabv. , Available from: https://github.com/kirstyn/artic-rabv (2022).
  41. Campbell, K. MADDOG: Method for Assignment, Definition and Designation of Global Lineages. , Available from: https://github.com/KathrynCampbell/MADDOG (2022).
  42. Campbell, K. RABV-GLUE. Centre for Virus Research. , Available from: https://github.com/KathrynCampbell/MADDOG (2022).
  43. Itokawa, K., Sekizuka, T., Hashino, M., Tanaka, R., Kuroda, M. Disentangling primer interactions improves SARS-CoV-2 genome sequencing by multiplex tiling PCR. PLoS ONE. 15 (9), e0239403(2020).
  44. Davis, M. W., Jorgensen, E. M. ApE, A plasmid editor: A freely available DNA manipulation and visualization program. Frontiers in Bioinformatics. 2, 818619(2022).
  45. Döring, M., Pfeifer, N. openPrimeR: Multiplex PCR primer design and analysis. , (2023).
  46. Quick, J. Multiplex PCR method for MiniON and Illumina sequencing of Zika and other virus genomes directly from clinical samples. Nature Protocols. 12 (6), 1261-1276 (2017).
  47. Laboratory Techniques in Rabies. World Health Organization. 1, Available from: https://apps.who.int/iris/bitstream/handle/10665/310836/9789241515153-eng.pdf (2018).
  48. Lembo, T. Partners for Rabies Prevention. The blueprint for rabies prevention and control: a novel operational toolkit for rabies elimination. PLoS Neglected Tropical Diseases. 6 (2), e1388(2012).
  49. Terrestrial Manual Online Access. World Organization for Animal Health. , Available from: https://www.woah.org/en/what-we-do/standards/codes-and-manuals/terrestrial-manual-online-access/ (2023).
  50. Mauti, S. Field postmortem rabies rapid immunochromatographic diagnostic test for resource-limited settings with further molecular applications. Journal of Visualized Experiments. (160), e60008(2020).
  51. Patrick, E., et al. Enhanced rabies surveillance using a direct rapid immunohistochemical test. Journal of Visualized Experiments. (146), e59416(2019).
  52. Lembo, T., et al. Evaluation of a direct, rapid immunohistochemical test for rabies diagnosis. Emerging Infectious Diseases. 12 (2), 310-313 (2006).
  53. Marston, D. A., et al. Pan-lyssavirus real time RT-PCR for rabies diagnosis. Journal of Visualized Experiments. (149), e59709(2019).
  54. Brunker, K. DNA quantification using the Qubit fluorometer. , Available from: https://www.protocols.io/view/dna-quantification-using-the-qubit-fluorometer-bc6vize6 (2020).
  55. Quick, J. DNA quantification using the Quantus fluorometer. , Available from: https://www.protocols.io/view/dna-quantification-using-the-quantus-fluorometer-7pzhmp6 (2020).
  56. Guppy protocol. Nanopore Community. , Available from: https://community.nanoporetech.com/protocols/Guppy-protocol/v/gpb_2003_v1_revaq_14dec2018 (2023).
  57. Flow Cell Wash Kit (EXP-WSH004). Nanopore Community. , Available from: https://community.nanoporetech.com/protocols/flow-cell-wash-kit-exp-wsh004/v/wfc_9120_v1_revh_08dec2020 (2023).
  58. Core Pipeline - arctic pipeline. , Available from: https://artic.readthedocs.io/en/latest/minion/ (2023).
  59. Samtools. , Available from: https://www.htslib.org (2023).
  60. Campbell, K., et al. Making genomic surveillance deliver: A lineage classification and nomenclature system to inform rabies elimination. PLoS Pathogens. 18 (5), e1010023(2022).
  61. Brunker, K., et al. Rapid in-country sequencing of whole virus genomes to inform rabies elimination programmes. Wellcome Open Research. 5, 3(2020).
  62. Bull, R. A., et al. Analytical validity of nanopore sequencing for rapid SARS-CoV-2 genome analysis. Nature Communications. 11, 6272(2020).
  63. Okeke, I. N., Ihekweazu, C. The importance of molecular diagnostics for infectious diseases in low-resource settings. Nature Reviews. Microbiology. 19 (9), 547-548 (2021).
  64. Inzaule, S. C., Tessema, S. K., Kebede, Y., Ouma, A. E. O., Nkengasong, J. N. Genomic-informed pathogen surveillance in Africa: opportunities and challenges. The Lancet Infectious Diseases. 21 (9), 281-289 (2021).
  65. Kennedy, L. Integrating contact tracing and whole-genome sequencing to track the elimination of dog-mediated rabies: an observational and genomic study. eLife. , (2023).
  66. Pallerla, S. R. Diagnosis of pathogens causing bacterial meningitis using Nanopore sequencing in a resource-limited setting. Annals of Clinical Microbiology and Antimicrobials. 21, 39(2022).
  67. Quick, J. Real-time, portable genome sequencing for Ebola surveillance. Nature. 530 (7589), 228-232 (2016).

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